Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические основы регуляции синтеза антимикробных пептидов у Diptera, Calliphoridae на клеточном и организменном уровне

ВАК РФ 03.02.05, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические основы регуляции синтеза антимикробных пептидов у Diptera, Calliphoridae на клеточном и организменном уровне"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВ Андрей Юрьевич

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ У DIPTERA, CALLIPHORIDAE НА КЛЕТОЧНОМ И ОРГАНИЗМЕННОМ УРОВНЕ

03.02.05 — энтомология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

21 фев т

005545422

Санкт-Петербург — 2014

005545422

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Сергей Иванович Черныш Санкт-Петербургский государственный университет

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Елена Борисовна Виноградова Зоологический институт РАН

Доктор биологических наук, профессор Владимир Николаевич Кокряков Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Ведущее учреждение:

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН

Защита состоится « 2014 г. в /6 ^часов на заседании

совета Д.212.232.08 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 133

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького СПбГУ

Автореферат разослан « /^У» ф ¿¿^2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Балеева Н. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Мясные мухи семейства Calliphoridae являются традиционным объектом энтомологических исследований. Их изучение внесло значительный вклад в развитие физиологии, экологии, морфологии и других разделов общей энтомологии (Виноградова, 1984). Интерес к мухам-каллифоридам обусловлен той ролью, которую многие представители данного семейства играют в жизни и хозяйственной деятельности человека. В частности, хорошо известно, что синантропные виды мясных мух, в силу своей пищевой специализации, являются одними из основных переносчиков бактериальных инфекций. Питаясь экскрементами и трупами животных, мухи-каллифориды переносят множество патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Paraluppi et al., 1996; Sukontanson et al., 2000; Habeeb, Mahdi, 2012). Менее известно, что мясные мухи представляют большой интерес в качестве объекта технической энтомологии. Личинки некоторых видов издавна используются в медицине как средство лечения инфицированных ран и язв (Sherman et al., 2000; Sherman, 2009). Находят они применение также в системах утилизации отходов мясной и рыбной промышленности (Колтыпин, 1977).

Особый интерес с точки зрения задач как общей, так и прикладной (технической) энтомологии представляет изучение иммунной системы мух-каллифорид. В основе их устойчивости к бактериальным инфекциям, наряду с другими механизмами, лежит способность синтезировать и накапливать в гемолимфе антимикробные пептиды. Особенности жизненной стратегии синантропных мух привели к возникновению комплексов антимикробных пептидов, эффективных в отношении патогенов человека. Прежде всего, это касается постоянного компонента их среды обитания - кишечной палочки и других энтеробактерий (Черныш, Гордя, 2011).

Целью исследования являлось изучение механизмов регуляции синтеза антимикробных пептидов в процессе иммунного ответа личинок мух-каллифорид. Этот вопрос является ключевым дая понимания стратегий адаптации данной группы насекомых к обитанию в экстремальной с точки зрения контаминации потенциально опасными микроорганизмами среде. Для достижения цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

• Оценка влияния различных факторов инфекционной и неинфекционной природы на титр антимикробных пептидов в гемолимфе личинок;

• Сравнение состава антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами при воздействии на личинку септических и асептических раздражителей;

• Изучение спектра бактерицидной активности антимикробных пептидов личинки;

• Разработка культуры жирового тела - модели для изучения механизмов регуляции синтеза антимикробных пептидов in vitro;

• Сравнение состава антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами in vivo и in vitro-,

• Поиск в организме личинки соединений, влияющих на синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела;

• Оценка возможностей использования культуры жирового тела в качестве продуцента биологически активных веществ.

Научная новизна. В настоящей работе впервые доказано прямыми экспериментами in vitro, что источником пептидных антибиотиков в организме личинок мух-каллифорид является жировое тело, которое активно выделяет антимикробные компоненты в гемолимфу в ответ на микробную инвазию, механическое повреждение покровов либо при стрессе. Установлено, что состав продуцируемых клетками жирового тела антимикробных пептидов не зависит от природы повреждения и включает дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды. Комплекс этих пептидов обладает выраженной активностью в отношении энтеробактерий, а также условно-патогенных обитателей кожных покровов человека и животных. В гемолимфе личинок мух-каллифорид обнаружены неизвестные ранее растворимые факторы, необходимые для запуска синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела и выделяемые, по-видимому, клетками покровного эпителия при повреждении. Впервые показано, что синтез антимикробных пептидов жировым телом находится под контролем т. н. «гормонов стресса», которые оказывают прямой дозозависимый эффект на активность иммунокомпетентных клеток. Разработанную автором технологию культивирования жирового тела предложено использовать в технической энтомологии для получения фармакологически активных веществ, предназначенных для лечения бактериальных инфекций человека и животных.

Практическая ценность. Изучение механизмов регуляции синтеза пептидных антибиотиков у мух-каллифорид не только расширяет представления об организации иммунной системы беспозвоночных, но и решает ряд прикладных задач, связанных с разработкой принципиально новых антимикробных препаратов. Дело в том, что комплексы антимикробных пептидов мясных мух обладают уникальной способностью блокировать развитие лекарственной устойчивости у бактерий, и это выгодно отличает их от большинства современных антибиотиков (Черныш, Гордя 2011). Однако ввиду многокомпонентное™ антимикробных комплексов, их получение для практических нужд известными методами химического или биологического синтеза на данный момент представляет значительные трудности. Разработанная автором методология органной культуры жирового тела

2

предлагает новое решение этой проблемы, позволяя получать антимикробные комплексы с использованием стандартного оборудования, используемого в клеточной инженерии.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены на XIII съезде Русского энтомологического общества (Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.) и Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 16-20 мая 2011 г.). По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в отечественных рецензируемых журналах, и создано одно изобретение «Способ получения комплекса антимикробных пептидов насекомого» (26 декабря 2013 г. подана заявка №2013157808 на выдачу патента РФ).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, выводов, списка сокращений и списка литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и содержит 2 таблицы. Список литературы включает 240 работ, из них - 210 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Обзор литературы

В данной главе обобщены литературные данные по организации иммунной системы насекомых, в частности - мух семейства СаШрЬопёае, и рассмотрена роль антимикробных пептидов в иммунном ответе. Особое внимание уделено физиологии жирового тела -основного места синтеза эндогенных антибиотиков у насекомых. Индукция синтеза антимикробных пептидов имеет место при септическом заражении и при воздействии ряда чрезвычайных раздражителей неинфекционной природы. Распознавание поверхностных структур патогена осуществляется либо непосредственно рецепторами иммуноцита, либо через систему плазматических молекул-посредников, передающих информацию о заражении иммунокомпетентной клетке. Результатом ядерного сигналинга является синтез клеткой бактерицидных молекул, разнообразие которых у мух-каллифорид сводится к 4-ём семействам: дефензинам, цекропинам, диптерицинам и пролин-богатым пептидам. При воздействии чрезвычайных раздражителей синтез антимикробных пептидов у мясных мух опосредован нейроэндокринной системой и, по-видимому, регулируется т. н. «гормонами стресса»: биогенными аминами, аднпокинетическим гормоном и экдистероидами.

Глава II. Материал и методы

Объектами исследований в данной работе служили мухи семейства Calliphoridae: Calliphora vicina, Calliphora vomitoria, Luculia sericata и Lucilia caesar. В опытах использовали диапаузирующих личинок мух этих видов.

Иммунный ответ индуцировали проколом кутикулы насекомых тонкой иглой (минуция 00), смоченной в концентрированной суспензии клеток кишечной палочки Escherichia coli штаммов D31 и М17 (2x10й клеток/мл) либо кокка Micrococcus luteus штамма А270 (2х10" клеток/мл), а также смеси этих бактерий. В качестве других стрессорных агентов использовали раздражающую лигатуру и термический ожог. В первом случае личинок перевязывали хлопковой нитью на уровне I сегмента тела. Во втором - прижигали препаровальной иглой, прокаленной над пламенем спиртовки. Для выявления роли нейроэндокринной системы в иммунном ответе некоторым личинкам перед воздействием стрессорного фактора накладывали лигатуру, изолирующую иммунокомпетентные клетки от кольцевой железы. Гемолимфу собирали через прокол кутикулы спустя сутки после индуцирования иммунного ответа и центрифугировали в течение 5 минут при 70 g для отделения плазмы.

Жировое тело и покровы личинки инкубировали в солевом растворе, изотоничном и изоосмотичном по составу гемолимфе диапаузирующей личинки С. vicina'. 10,93 г NaCl; 1,57 г KCl; 0.83 г СаСЬ; 0,15 г MgCh на 1 литр деионизированной воды. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин из расчета соответственно 100 ЕД и 100 мкг на 1 мл среды либо норфлоксацин из расчета 30 мкг на 1 мл среды. Культуру иинкубировали при комнатной температуре. Жизнеспособность клеток оценивали методом включения красителя трипанового синего.

В ряде случаев плазму и культуральную жидкость подвергали фракционированию методами избирательной тепловой денатурации (нагревание при температуре +100 °С в течение 2 минут), твердофазной экстракции на картриджах SepPak с сорбентом С18 (Waters), ультрафильтрации на концентраторах Centricon (Amicon) и обращено-фазовой жидкостной хроматографии на колонках Chemco Pak С18 (4x100мм, Chemco) и Vydac С18 (5x250мм, Waters).

Количественное содержание бактерицидных соединений в цельных либо фракционированных плазме и культуральной жидкости анализировали методом агаровых пластинок (Lambert et al., 1989); качественный состав антимикробных пептидов оценивали с помощью метода ионизации в электроспрее (ESI).

Статистическая обработка данных включала вычисление среднего арифметического и ошибки среднего. Достоверность количественных различий между разными вариантами

4

опыта определяли с помощью критерия Стьюдента для независимых выборок, парного критерия Стьюдента и однофакторного дисперсионного анализа. Достоверность качественных различий оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни. Различия принимались за достоверные, если вероятность ошибки была меньше 0.05.

Глава III. Индукция синтеза антимикробных пептидов in vivo

Синтез пептидных антибиотиков в организме личинок всех исследованных мух-каллифорид носит индуцибельный характер. Индукция антимикробной активности иммуноцитов насекомого имеет место при бактериальном заражении, а также при воздействии ряда факторов неинфекционной природы.

Контроль Септическая Асептическая индукция

индукция

Травмогенная индукция Нейрогенная индукция

Рис. I. Индукция антимикробной активности в гемолимфе личинок СаШрИога утпа в ответ на действие факторов инфекционной и неинфекционной природы. Достоверность различий при Р: *<0.05, **<0.01, «*<0.001.

В ряде случаев активация иммунокомпетентных клеток — это автономный процесс, реализуемый без вмешательства нейроэндокринной системы. Для явлений такого рода нами предложен термин «травмогенная индукция» (Рис. 1). Примером травмогенной индукции является септическая индукция синтеза антимикробных пептидов. Так, введение смеси

5

грамположительных и грамотрицательных бактерий приводит к увеличению антимикробной активности гемолимфы личинок. При этом изоляция клеток жирового тела от кольцевой железы не вносит существенных изменений в динамику синтеза антибиотиков. Примечательно, что титр как антиграмположительных, так и антиграмотрицательных пептидов, выделяемых иммунокомпетентными клетками личинки в ответ на заражение M.luteus или E.coli, не зависит от природы иммуногена.

Особого внимания заслуживает другой тип травмогенной индукции антимикробной активности - в ответ на стерильное повреждение покровов (травму). Его природа до сих пор остается нераскрытой. Возникает парадокс: антиген отсутствует, но, несмотря на это, продуцирование антимикробных пептидов иммуноцитами усиливается. Участие гормонов в иммунном процессе, по-видимому, в этом случае также исключено: изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринной системы не влияет на иммунный ответ.

Альтернативный механизм активации синтеза антимикробных пептидов, требующий обязательного участия со стороны нейроэндокринной системы, получил название пейрогенной индукции (Рис. 1). В данной работе представлены экспериментальные доказательства существования этого феномена у синей мясной мухи C.vicina. Установлено, что при воздействии на личинку таких стрессорных факторов как хроническое механическое раздражение и термический ожог титр антимикробных пептидов в гемолимфе насекомого повышается. При этом изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринного комплекса полностью блокирует иммунную реакцию. Таким образом, участие мозга и кольцевой железы является необходимым условием формирования иммунного ответа при воздействии чрезвычайных раздражителей (стрессе).

Хроматографический анализ умеренно гидрофобного экстракта гемолимфы инфицированных и лигатурированных на уровне I сегмента тела личинок показал, что распределение антимикробной активности в образцах идентично: в обоих случаях антиграмположительная активность представлена одним кластером, антиграмотрицательная — тремя. Таким образом, на основании данных хроматографического картирования нами сделан вывод о том, что качественный состав пептидных антибиотиков, выделяемых иммунокомпетентными клетками в ответ на стрессорное воздействие и при септической травме, один и тот же. По-видимому, иммунная реакция клеток жирового тела стереотипна и не зависит от типа раздражения. Различается лишь титр бактерицидных молекул: количество антибиотиков, синтезируемых иммуноцитами при стрессе, несколько уступает содержанию соответствующих антимикробных пептидов в гемолимфе инфицированных личинок.

Глава IV. Индукция синтеза антимикробных пептидов in vitro

В данной главе проведен анализ качественного и количественного состава антимикробных пептидов, выделяемых жировым телом личинки C.vicina, и рассмотрено влияние ряда факторов на интенсивность синтеза бактерицидных молекул in vitro.

Первоочередной задачей явилась разработка модели, в которой возможен синтез антимикробных пептидов иммунокомпетентными клетками in vitro. Мы остановили свой выбор на первичной культуре жирового тела, где культуральной средой служит сбалансированный солевой раствор, лишенный белковых компонентов либо содержащий экзогенный белок. Экспериментальным путем подобраны оптимальные условия культивирования жирового тела. Предлагаемое культивирование можно охарактеризовать как глубинное (суспензионное), динамическое, аэробное, закрытое периодическое. Отработанная схема стерилизации культуры подразумевает внесение в среду дополнительных стерилизующих агентов: стрептомицина и пенициллина либо норфлоксацина.

Согласно результатам экспериментов, антимикробная активность жирового тела интактной личинки крайне низка. Жировое тело насекомых, предварительно инфицированных бактериями, продуцирует антимикробные пептиды более активно.

Интенсивный синтез антимикробных пептидов жировым телом in vitro возможен лишь при добавлении в культуру аминокислот (гидролизата лактальбумина). Активаторами синтеза пептидных антибиотиков являются также растворимые факторы покровов и термически обработанной плазмы интактных (неинфицированных) личинок. Изучение прямого влияния гормонов на антимикробную активность жирового тела in vitro позволило выявить стимулирующий эффект низких концентраций а-экдизона, а также высоких доз адипокинетического гормона и биогенного амина - октопамина - на синтез бактерицидных белков.

Согласно данным хроматограф ического картирования, качественный состав антимикробных пептидов, синтезируемых жировым телом in vitro, в основном, идентичен составу антибиотиков, экстрагированных из гемолимфы инфицированной личинки. Об этом свидетельствует одинаковое распределение антимикробной активности по хроматографическим фракциям культуральной жидкости и плазмы. Другим косвенным доказательством сходного состава антибиотиков, продуцируемых жировым телом in vivo и in vitro, является схожий спектр их бактерицидной активности.

Что касается количественных характеристик синтеза антимикробных пептидов, суточный выход антибиотиков в культуре клеток жирового тела, сопоставим с количеством бактерицидных молекул, синтезируемых иммуноцитами in vivo. Но, поскольку предлагаемая

7

методика культивирования жирового тела позволяет поддерживать антимикробную активность продуцента на высоком уровне в течение более чем одной недели, суммарный выход бактерицидных белков in vitro на порядок выше, чем in vivo (в перерасчете на одно жировое тело).

Глава V. Поиск факторов активации жирового тела и изучение их свойств

Добавление плазмы либо экстракта покровов личинки C.vicina в культуру жирового тела приводит к активации клеток жирового тела и накоплению антимикробных пептидов в культуральной среде. Мы объясняем это явление действием на иммунокомпетентные клетки гуморальных факторов, локализованных в плазме и покровах личинки.

В ходе исследований в плазме гемолимфы травмированных личинок обнаружен растворимый фактор активации, введение которого в инкубационную среду резко повышает антимикробную активность жирового тела. Предварительный анализ показал, что фактор активации является термостабильным, гидрофильным соединением с молекулярной массой менее 3 кДа, специфичным для мух семейства Calliphoridae.

Согласно результатам исследований, покровы личинки C.vicina также являются источником факторов активации клеток жирового тела. Как и плазматический фактор активации, фактор активации жирового тела, локализованный в покровах, является термостабильным соединением.

Глава VI. Обсуждение

Антимикробные пептиды играют ключевую роль в защите личинок мух-каллифорид от патогенной микрофлоры. Установлено, что индукция синтеза антимикробных пептидов в организме личинки может протекать по двум сценариям. В одном случае иммунный ответ реализуется независимо от нейроэндокринной системы (травмогенная индукция), в другом -является результатом влияния мозга и кольцевой железы на активность иммунокомпетентных клеток (нейрогенная индукция). Мы склонны считать, что выбор сценария определяется степенью повреждения покровов личинки (Рис. 2).

При сквозном повреждении активируются регуляторные факторы покровов и плазмы, запускающие синтез антимикробных пептидов в жировом теле (Рис. 2, 3-4). Причем, по-видимому, в плазме присутствует не одно, а несколько соединений с иммуномодуляторной активностью: одни имеют гидрофильную, а другие - гидрофобную природу. Что касается регуляторных факторов, локализованных в покровах личинки, то их источником, вероятно, являются живые клетки гиподермы, а не кутикулярный матрикс. Это предположение

основано на том факте, что содержание иммуномодуляторных факторов в культуральной среде покровов возрастает прямопропорционально времени инкубирования тканей. Характерно, что накопление фактора активации жирового тела в культуре покровов происходит уже в течение получаса - настолько короткий временной интервал наводит на мысль о депонировании активационного фактора в эпителиальных клетках.

Рис. 2. Предлагаемая схема индукции синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела в организме личинки Calliphora vicina. За пределами рамки - септическая индукция (экстраполяция литературных данных Hultmark, 1993; Royet, 2004 и Wang, Ligoxygakis, 2006 по дрозофиле): I - через активацию каскада сериновых цротеаз (СП], С! Ь) и фактора Spätzle (SPZ), 2 - путем прямого воздействия патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (ПАМП) на клетки жирового тела. В пределах рамки -асептическая индукция (по результатам данного исследования), опосредованная регуляторными факторами: 3 - эпителиоцитов (РФЭП), 4 - плазмы (РФ™), 5 - гормонами кольцевой железы (КЖ).

Результаты предварительного анализа свойств травмогенных индукторов антимикробной активности жирового тела С.vicina, указывают на уникальность обнаруженных соединений. На сегодняшний день известен лишь один эндогенный фактор активации синтеза

антимикробных пептидов - белок Spätzle мухи-дрозофилы, однако ни его молекулярная масса, ни видоспецифичность не согласуются с таковыми фактора C.vicina.

Контаминация раны приводит к дополнительной активации иммунокомпетентных клеток при травме за счет прямого либо опосредованного распознавания поверхностных структур патогена (Рис. 2, 1-2). Индукция синтеза пептидных антибиотиков у мясных мух протекает в три этапа. Вначале происходит прямое или опосредованное распознавание бактериальных паттернов клетками жирового тела, затем - поглощение жировым телом из гемолимфы аминокислот, на заключительном этапе — собственно выделение иимунокомпетентными клетками антимикробных пептидов в гемолимфу.

При воздействии чрезвычайных раздражителей, не сопровождающемся сквозным повреждением покровов, сигнал о раздражении воспринимается механорецепторами и передается в мозг личинки. Следствием активации нейросекреторных клеток мозга является выброс гормонов, депонированных в кардиальных телах - эти гормоны стимулируют клетки жирового тела к выработке пептидных антибиотиков (Рис. 2, 5). На первом этапе активация синтеза антимикробных пептидов, по-видимому, неспецифична и является «побочным действием» биогенных аминов и адипокинетического гормона. Впоследствии синтез пептидных антибиотиков попадает под контроль экдистероидов, главным образом, а-экдизона, который поддерживает высокий титр эндогенных антибиотиков в гемолимфе, обеспечивая выживание насекомого в экстремальных условиях. Не исключено, что у насекомых действие экдистероидов подчинено правилу «два гормона - две функции»: ß-экдизон определяет протекание морфогенетических процессов, в то время как его предшественник - а-экдизон - является гормоном стресса и определяет состояние неспецифической резистентности насекомого к чрезвычайным раздражителям.

Выводы

1. Адаптация мух семейства Calliphoridae к среде обитания, максимально насыщенной бактериями, включает многоуровневую систему защиты внутренней среды от бактериальных инфекций. Важным элементом этой защиты служит способность синтезировать и накапливать в гемолимфе комплекс антимикробных пептидов в ответ на микробную инвазию, механическое повреждение покровов и различные стрессорные воздействия.

2. Вне зависимости от природы повреждения, качественный состав антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами личинки, остается неизменным. В этом отношении иммунный ответ.у мух-каллифорид носит неспецифический характер.

3. Комплекс антимикробных пептидов Calliphora vicina обладает широким спектром антибактериальной активности. В частности, он токсичен для представителей кишечной микрофлоры человека и животных - кишечной палочки и других энтеробактерий, а также условно-патогенных обитателей кожных покровов (Staphilococcus aureus, Micrococcus luteus). Высокий уровень антимикробной защиты в сочетании с особенностями пищевой специализации делает мясных мух одним из наиболее частых переносчиков кишечных и кожных инфекций. Поэтому изучение механизмов иммунитета мух-каллифорид представляет самостоятельный интерес с точки зрения проблем медицинской энтомологии.

4. Наряду с чувствительными к комплексу антимикробных пептидов бактериями обнаружены устойчивые формы, принадлежащие главным образом к родам Bacillus и Listeria, среди которых встречается много энтомопатогенных бактерий. Чувствительность к антимикробным пептидам, по-видимому, служит важным фактором формирования энтомопатогенной микрофлоры и должна учитываться при разработке энтомоцидных препаратов бактериальной природы.

5. В настоящей работе впервые доказано прямыми экспериментами in vitro, что источником антимикробных пептидов в гемолимфе личинок мух-каллифорид является жировое тело.

6. Качественный состав антимикробных пептидов, синтезируемых клетками жирового тела in vitro, совпадает с составом в гемолимфе личинок и включает, по данным хроматографии, масс-спектрометрии и биологического тестирования, дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды. Количество антимикробных пептидов, синтезируемых жировым телом in vitro, на порядок превышает их максимальное содержание в гемолимфе личинок в период активного иммунного ответа.

7. Исследования in vitro позволили обнаружить в гемолимфе личинок С. vicina неизвестные ранее растворимые факторы, необходимые для запуска синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела. Одним из таких факторов является термостабильное соединение с молекулярной массой менее 3 кДа, выделяемое, по-видимому, клетками покровного эпителия личинок при повреждении. Этот фактор оказывает активирующее действие на клетки жирового тела других видов каллифорид и отличается от аналогичного фактора, выделенного ранее из гемолимфы личинок дрозофилы и имеющего молекулярную массу около 23 кДа.

8. Уровень синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела С. vicina находится под контролем нейроэндокринной системы. В частности, на уровень синтетической активности оказывает значительное влияние концентрация гормона а-экдизона: низкие концентрации гормона активируют синтез, а высокие — оказывают

противоположное действие. Адипокинетический гормон и октопамин в высоких концентрациях активируют синтез антимикробных пептидов в жировом теле.

9. Разработанный метод культивирования клеток жирового тела мух-каллифорид, помимо решения исследовательских задач в области физиологии насекомых, в перспективе может быть использован в технической энтомологии для получения фармакологически активных веществ, предназначенных для лечения бактериальных инфекций человека и животных.

Список публикаций по теме диссертации

1. Яковлев А. Ю., Гордя Н. А. Влияние гормонов на синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела синей мясной мухи Calliphora vicina R.-D. (Díptera, Calliphoridae) // Энтомологическое обозрение. — 2012. — Т. 91, № 3. — С. 498-505.

2. Яковлев А. Ю. Индукция синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела личинки Calliphora vicina R.-D. (Díptera, Calliphoridae) // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. — 2011. — Т. 47, № 6. — С. 461-468.

3. Гордя Н. А., Несин А. П., Симоненко Н. П., Яковлев А. Ю., Черныш С. И. Нейрогенная и септическая индукция синтеза пептидных антибиотиков у личинок мухи Calliphora vicina R.-D. (Díptera, Calliphoridae) // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. — 2011. — Т. 47, №2, —С. 165-171.

4. Черныш С. И., Гордя Н. А., Тулин Д. В., Яковлев А. Ю., Барабанова А. А., Аникин В. Б., Плескач В. А. Пептиды иммунной системы насекомых в иммунотерапии инфекций и опухолей // Российский иммунологический журнал. — 2008. — Т. 2, № 2-3. — С. 206.

5. Яковлев А. Ю. Регуляция синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела личинки Calliphora vicina R.-D. (Díptera, Calliphoridae) // Тезисы Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 16-20 мая 2011 г.). —СПб., 2011. —С. 181.

6. Яковлев А. Ю. Органная культура жирового тела личинки Calliphora vicina R.-D. -источник белков медицинского назначения // Тезисы 14 Международной школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.). — Москва, 2010. — С. 309.

7. Яковлев А. Ю. Органная культура жирового тела личинки Calliphora vicina R.-D. как новое направление в биотехнологии // Методология и организация инновационной деятельности в сфере высоких технологий. — СПб., 2010. — С. 64-67.

8. Черныш С. И., Гордя Н. А., Несин А. П., Симоненко Н. П. Тулин Д. В., Яковлев А. Ю. Иммунная система насекомых как источник новых лекарственных веществ. //

12

Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в «Наукограде». — СПб., 2008, —С. 119-126.

9. Черныш С. И., Гордя Н. А., Яковлев А. Ю. Гормональная регуляция стресса и резистентности к повреждения у насекомых. // Стратегии адаптаций наземных членистоногих к неблагоприятным условиям среды. — СПб., 2007. — С. 336-382.

10. Яковлев А. Ю. Иммуномодулирующие факторы в гемолимфе Calliphora vicina R.-D. (Díptera, Calliphoridae) // Тезисы докладов XIII съезда Русского энтомологического общества «Проблемы и перспективы общей энтомологии» (Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.). — Краснодар, 2007. — С. 417-418.

11. Тулин Д. В., Яковлев А. Ю. Особенности организации фенолоксидазной системы личинок мясной мухи Calliphora vicina R.-D. (Díptera, Calliphoridae) // Тезисы докладов XIII съезда Русского энтомологического общества «Проблемы и перспективы общей энтомологии» (Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.). — Краснодар, 2007. — С. 366.

12. Гордя Н. А., Яковлев А. Ю. Роль гормонов в регуляции синтеза антимикробных пептидов у личинок Calliphora vicina R.-D. (Diptera, Calliphoridae) // Тезисы докладов XIII съезда Русского энтомологического общества «Проблемы и перспективы общей энтомологии» (Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.). —Краснодар, 2007. — С. 81.

13. Яковлев А. Ю. Регуляция клеточных и гуморальных защитных механизмов во время диапаузы и постдиапаузного развития насекомых на примере Calliphora vicina R.-D. (Díptera, Calliphoridae) и Ctenucha phegea (Lepidoptera, Ctenuchidae) // Студенты, аспиранты - малому наукоемкому бизнесу. — СПб., 2005.

Подписано в печать 11.02.2014г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 3387.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, 1-я линия В.О., д.28 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@rnail.ru http://www.Iemaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлев, Андрей Юрьевич, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

0420'i 456989

ЯКОВЛЕВ Андрей Юрьевич

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ У DIPTERA, CALLIPHORIDAE НА КЛЕТОЧНОМ И ОРГАНИЗМЕННОМ УРОВНЕ

03.02.05 - энтомология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

научный руководитель: доктор биологических наук, заведующий лабораторией биофармакологии и иммунологии насекомых СПбГУ Сергей Иванович Черныш

Санкт-Петербург - 2014

Оглавление

Введение...........................................................................................................5

Глава I. Обзор литературы.....................................................................................9

1.1. Иммунная система насекомых.......................................................................9

1.1.1. Распознавание «чужого».......................................................................10

1.1.2. Элиминация «чужого»..........................................................................11

1.1.2.1. Фагоцитоз...................................................................................12

1.1.2.2. Инкапсуляция и образование морул...................................................13

1.1.2.3. Коагуляция гемолимфы..................................................................14

1.1.2.4. Цитотоксическая реакция................................................................15

1.1.2.5. Меланизация...............................................................................16

1.1.2.6. Антимикробные пептиды................................................................18

1.2. Антимикробные пептиды насекомых..............................................................19

1.2.1. Структурное разнообразие антимикробных пептидов...................................20

1.2.1.1. Цекропины..................................................................................20

1.2.1.2. Пептиды, содержащие дисульфидные связи........................................21

1.2.1.3. Пептиды с регулярно повторяющимися аминокислотами.......................22

1.2.2. Механизм действия антимикробных пептидов...........................................23

1.2.3. Жировое тело и его роль в синтезе антимикробных пептидов........................24

1.2.4. Другие источники антимикробных пептидов.............................................25

1.2.5. Индукция синтеза антимикробных пептидов.............................................26

1.2.6. Роль эпителия и гемоцитов в индукции синтеза антимикробных

пептидов клетками жирового тела..................................................................28

1.2.6.1. Роль эпителия в индукции синтеза пептидных антибиотиков..................28

1.2.6.2. Роль гемоцитов в индукции синтеза пептидных антибиотиков................29

1.2.7. Синтез антимикробных пептидов у СаШркога У1ста....................................30

1.3. Взаимодействие иммунной и нейроэндокринной системы...................................31

1.3.1. Структурная организация нейроэндокринной системы.................................31

1.3.2. Основные гормоны насекомых................................................................32

1.3.2.1. Экдистероиды..............................................................................32

1.3.2.2. Ювенильный гормон......................................................................32

1.3.2.3. Адипокинетический гормон............................................................33

1.3.2.4. Биогенные амины.........................................................................33

1.3.3 Иммуно-нейроэндокринные взаимодействия..............................................33

1.3.4. Влияние нейроэндокринной системы на иммунные процессы

у Calliphora vicina...................................................................................35

1.3.5. Роль гормонов в регуляции иммунных процессов у насекомых........................36

Глава II. Материал и методы....................................................................................38

11.1. Биологический материал..............................................................................38

11.2. Методы...................................................................................................39

11.2.1. Микрохирургические вмешательства.......................................................39

11.2.1.1. Инфицирование насекомых.............................................................39

11.2.1.2. Наложение лигатур и термическое воздействие...................................39

11.2.1.3. Сбор гемолимфы и отделение плазмы................................................40

11.2.1.4. Отделение покровов......................................................................40

11.2.1.5. Выделение жирового тела...............................................................41

11.2.1.6. Определение жизнеспособности культивируемых клеток.......................41

11.2.2. Методы концентрации и очистки веществ.................................................41

11.2.2.1. Избирательная денатурация под действием температуры........................41

11.2.2.2. Метод твердофазной экстракции......................................................42

11.2.2.3. Метод ультрафильтрации...............................................................42

11.2.2.4. Хроматографическое фракционирование...........................................42

11.2.2.5. Масс-спектрометрия.....................................................................43

11.2.3. Анализ антимикробной активности материала...........................................43

11.2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных................................45

Глава III. Индукция синтеза антимикробных пептидов in vivo.........................................46

III. 1. Эффект инфицирования..............................................................................47

111.2. Эффект стрессорного воздействия................................................................50

Ш.2.1. Эффект лигатурного стресса.................................................................50

III.2.2. Эффект термического ожога..................................................................52

111.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vivo....................................53

111.4. Заключение..............................................................................................57

Глава IV. Синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела in vitro.......................61

IV. 1. Разработка органной культуры жирового тела.................................................61

IV. 1.1. Выбор базового состава культуральной среды..........................................61

IV. 1.2. Выживаемость культивируемых клеток...................................................65

IV. 1.3. Индукция антимикробной активности in vitro...........................................67

IV. 1.3.1. Роль «фактора плазмы» в активации жирового тела.............................68

IV. 1.3.2. Роль «фактора покровов» в активации жирового тела..........................70

IV. 1.3.3. Роль гормонов в активации жирового тела........................................72

IV. 1.4. Стерилизация культуры жирового тела....................................................74

IV. 1.5. Температура культуральной среды.........................................................79

IV. 1.6. Перемешивание культуры....................................................................79

IV. 1.7. Газообмен в культуре жирового тела......................................................81

IV. 1.8. Геометрические параметры культуральной ячейки....................................83

IV. 1.9. Продолжительность цикла культивирования.............................................85

IV.2. Количественные характеристики метода получения антимикробных пептидов

in vitro..................................................................................................87

IV.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vitro...................................89

IV.4. Заключение.............................................................................................95

Глава V. Поиск факторов активации жирового тела и изучение их свойств........................97

V.l. Термостабильность факторов активации жирового тела......................................97

V.l.l. Термостабильность факторов активации, локализованных в плазме................97

V.1.2. Термостабильность факторов активации, локализованных в покровах.............98

V.2. Молекулярная масса факторов активации жирового тела.....................................99

V.3. Хроматографические характеристики факторов активации жирового тела..............101

V.4. Видоспецифичность факторов активации жирового тела....................................102

V.5. Заключение.............................................................................................104

Глава VI. Обсуждение...........................................................................................105

VI. 1. Травмогенная индукция синтеза антимикробных пептидов................................105

VI.2. Нейрогенная индукция синтеза антимикробных пептидов.................................111

VI.3. Органная культура жирового тела в иммунологии и биофармакологии

насекомых.......................................................................................117

VI.3.1. Органная культура жирового тела как инструмент для изучения механизмов

индукции антимикробной активности...............................................117

VI.3.2. Органная культура жирового тела как перспективный источник белков

медицинского назначения..............................................................119

Выводы............................................................................................................122

Список употребляемых в работе сокращений............................................................124

Список литературы.............................................................................................125

Введение

Мясные мухи семейства Calliphoridae распространены во всех зоогеографических регионах планеты. Из приблизительно 1000 видов, представленных в мировой фауне мух-каллифорид (Schumann, 1986), большинство является синантропными (Дербенева-Ухова, 1961). Научный и практический интерес к мясным мухам обусловлен той ролыо, которую многие представители данного семейства, в силу своей пищевой специализации, играют в жизни и хозяйственной деятельности человека.

Имаго мясных мух потребляют белковую и углеводную пищу. Углеводы служат мухе источником энергии при длительных физических нагрузках, главным образом - при полете. Питаясь нектаром и пыльцой, мясные мухи участвуют в опылении диких и сельскохозяйственных растений. Белковый субстрат необходим, главным образом, для размножения, а также для созревания яиц и их откладки. Пищей мухам служат разлагающиеся мясо, рыба, молочные продукты, трупы и экскременты различных животных. Благодаря развитой системе органов чувств, мухи способны определять местонахождение пищи на расстоянии нескольких километров и залетать в поисках пищи в глубокие шахты, пещеры, тоннели и колодцы (Виноградова, 1991).

Характер питания личинок крайне разнообразен (Гапонов, 2003). Большинство мух-каллифорид на личиночной стадии является сапрофагами, развиваясь на трупах животных, сыром и вареном мясе, рыбе, гниющих растительных остатках и в экскрементах животных. Вместе с тем, широкое распространение получили различные формы паразитизма. В роли хозяев личинок мясных мух выступают черви, моллюски, насекомые, амфибии, птицы и млекопитающие. Особой формой паразитизма у мух-каллифорид является питание мягкими тканями хозяина, сопровождаемое образованием миазов. В ряде случаев миазообразование принимает облигатный характер. Отдельные представители семейства перешли к гематофагии и хищничеству. Такой широкий спектр личиночного питания определяет санитарную роль мясных мух в природных и антропогенных биоценозах как утилизаторов животной и растительной органики. Мухи развиваются крайне быстро - масса тела питающейся личинки на протяжении суток может возрастать в сотни раз! Это связано с калорийностью и быстрым разложением пищевого субстрата. Как следствие, переработка мухами органических остатков происходит с высокой скоростью, что делает перспективным применение мясных мух в системах утилизации отходов мясной и рыбной промышленности (Колтыпин, 1977). Склонность личинок мух-каллифорид к некрофагии нашла отражение в судебной энтомологии. Известно, что мясные мухи колонизируют трупы еще на стадии раннего микробного разложения - это обстоятельство позволяет по собранным на трупе

личинкам, используя методику ретроспективного анализа, установить время наступления смерти человека (Марченко, 1980).

Питаясь трупами и экскрементами животных, мухи-каллифориды на разных стадиях жизненного цикла контактируют с множеством патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: бактерий, вирусов, цист простейших и яиц гельминтов. Этим объясняется большое количество распространяемых мясными мухами трансмиссивных заболеваний: туберкулеза, паратуберкулеза, полиомиелита, бруцеллеза, туляремии, ботулизма, инфекционного конъюнктивита, гнойных и кишечных инфекций (Богоявленский, Прокопович, 1942; Сухова, 1950; Сухова, 1951; Дербенева-Ухова, 1952; Лярский и др., 1985). Санитарно-эпидемиологическое значение мясных мух сделало их классическим объектом медицинской энтомологии и способствовало детальному изучению биологии, экологии и фауны отдельных представителей семейства (Виноградова, 1984; 1991).

Становление мясных мух как эффективных механических переносчиков инфекционных заболеваний было бы невозможным без наличия развитой иммунной системы, защищающей насекомое от паразитов, главным образом, от бактерий, концентрация которых в окружающей среде крайне высока. Подавляющая часть бактериальной микрофлоры покровов мясных мух представлена энтеробактериями (Escherichia sp., Klebsiella sp., Providencia sp., Citrobacter sp., Proteus sp. и др.), а также условно-патогенными обитателями кожных покровов человека и животных, в основном, стафилококками разных видов (Daniel et al., 1990; Paraluppi et al., 1996; Sukontanson et al., 2000; Habeeb, Mahdi, 2012).

Существенный вклад в защиту личинок мясных мух от бактерий вносит экзосекрет, который насекомые выделяют в окружающую среду при питании. Экзосекрет содержит комплекс ферментов, растворяющих некротические ткани, а также бактерицидные компоненты, действие которых приводит к стерилизации субстрата (Крутикова, Черныш, 2013). Разжиженная пиша затем поглощается личинками. Такая стратегия мясных мух нашла отражение в медицине и привела к формированию целого направления - биохирургии -основанного на использовании личинок мух в качестве средства лечения инфицированных ран и язв (Sherman et al., 2000; Sherman, 2009). По сути, «личиночная терапия» представляет собой создание контролируемого миаза и сводится к устранению некротически измененных клеток и стерилизации раневой поверхности, что приводит к заживлению раны.

Ключевую роль в защите внутренней среды от патогенных микроорганизмов играют антимикробные пептиды - это касается всех многоклеточных животных (Кокряков, 1999), и мясные мухи не являются исключением (Dimarcq et al., 1988; Chernysh et al., 2000; Cerovsky et al., 2010). Основным местом синтеза антимикробных пептидов у насекомых служит жировое тело (Hoffmann, Reichhart, 2002), которое активно выделяет пептидные антибиотики в

гемолимфу при травмировании покровов или в ответ на микробную инвазию. Особенности жизненной стратегии синантропных мух привели к возникновению целых комплексов антимикробных пептидов, эффективных в отношении патогенов человека. Прежде всего, это касается постоянного компонента их среды обитания - кишечной палочки, а также других энтеробактерий (Черныш, Гордя, 2011).

Несмотря на то, что структура и свойства антимикробных пептидов некоторых мух-каллифорид известны, физиологические механизмы регуляции синтеза этих молекул и, соответственно, включения в систему антиинфекционного иммунитета, до сих пор остаются неясными. Между тем, этот вопрос является ключевым для понимания стратегий адаптации данной группы насекомых к обитанию в экстремальной с точки зрения контаминации потенциально опасными микроорганизмами среде. Его изучение, в свою очередь, невозможно без понимания физиологии жирового тела как основного продуцента антимикробных компонентов у мух-каллифорид.

Целью настоящего исследования являлось изучение механизмов регуляции синтеза антимикробных пептидов в процессе иммунного ответа личинок мух-каллифорид. Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

• Оценка влияния различных факторов инфекционной и неинфекционной природы на титр антимикробных пептидов в гемолимфе личинок;

• Сравнение состава антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами при воздействии на личинку септических и асептических раздражителей;

• Изучение спектра бактерицидной активности антимикробных пептидов личинки;

• Разработка культуры жирового тела - модели для изучения механизмов регуляции синтеза антимикробных пептидов in vitro;

• Сравнение состава антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами in vivo и in vitro;

• Поиск в организме личинки соединений, влияющих на синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела;

• Оценка возможностей использования культуры жирового тела в качестве продуцента биологически активных веществ.

Автор искренне благодарит своего научного руководителя - Черныша Сергея Ивановича -за чуткое руководство и полезные советы при написании диссертации, а также коллег по лаборатории биофармакологии и иммунологии насекомых СПбГУ: Гордя Н. А., Тулина Д. В., Симоненко II. П., Несина А. П., Кругликову А. А., Никитина О. М. - за помощь в организации исследовательской работы. Отдельную благодарность автор выражает

заведующему лабораторией общей патологии Института экспериментальной медицины РАМН Кокрякову Владимиру Николаевичу, а также сотрудникам лаборатории: Берлову М. Н. и Цветковой Е. В. (сейчас - с.н.с. кафедры биохимии СПбГУ), - за помощь в проведении аналитических исследований.

Работа осуществлена при финансовой поддержке Совета по грантам при Президенте РФ для государственной поддержки ведущих научных школ (грант НШ-3332.2010.4) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.

Глава I. Обзор литературы 1.1. Иммунная система насекомых

Насекомые, достигшие наивысшего уровня эволюционного развития среди беспозвоночных животных, имеют сложную координированную систему защиты от патогенных микроорганизмов. Покровы стенки тела, кишки и трахей являются надежной механической преградой для проникновения паразитов из окружающей среды в полость тела насекомого. В случае повреждения барьерного эпителия чужеродные объекты попадают в гемоцель и становятся мишенью для клеточных и гуморальных факторов гемолимфы.

Основными структурными элементами, участвующими в формировании клеточного иммунного ответа у насекомых, являются фиксированные и