Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антимикробные факторы в контроле внешней и внутренней среды мясных мух

ВАК РФ 03.02.05, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Антимикробные факторы в контроле внешней и внутренней среды мясных мух"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

АНТИМИКРОБНЫЕ ФАКТОРЫ В КОНТРОЛЕ ВНЕШНЕЙ И ВНУТРЕННЕЙ СРЕДЫ МЯСНЫХ МУХ (DIPTERA, CALLIPHORIDAE)

03.02.05 - энтомология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

КРУГЛИКОВА Анастасия Анатольевна

2 7 ФЕВ 2014

005545421

Санкт-Петербург - 2014

005545421

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Сергей Иванович Черныш Санкт-Петербургский государственный университет

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Сергей Яковлевич Резник Зоологический институт РАН

Доктор биологических наук, профессор Владимир Николаевич Кокряков Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Ведущее учреждение:

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН

Защита состоится « 24 » ¿УуОеУ)^_ 2014 г. в /е часов на заседании

совета Д.212.232.08 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 133

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького СПбГУ

Автореферат разослан « » _2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук А/ О Баяеева Н. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследований. В естественных местообитаниях основными конкурентами личинок мух являются микроорганизмы, грибы и бактерии. В целях адаптации к меняющимся условиям окружающей среды и защиты пищевого субстрата экзосекрет этих насекомых, по всей видимости, должен содержать антимикробные и фунгицидные соединения. Некоторые виды насекомых, как и позвоночные, выделяют на поверхность слизистых оболочек антимикробные пептиды. Для растений и грибов характерно использование вторичных метаболитов в качестве защиты от вредителей и патогенов, а также в борьбе с конкурентами. Антимикробные пептиды, как известно, являются важнейшим элементом в иммунной системе насекомых, и, в основном, синтезируется клетками жирового тела, выделяясь в гемолимфу. Однако, у личинок Ь. яепсаШ подобные особенности иммунного ответа до сих пор не были исследованы.

Мухи вида Ь. аепсаш имеют огромное экономическое и клиническое значение, поскольку являются факультативными паразитами, вызывающими кожные миазы прежде всего у овец несмотря на то, что могут поражать и других диких и домашних животных и человека. Однако, эта особенность жизненного цикла личинок мух может быть использована человеком в собственных интересах. На сегодняшний день огромное количество публикаций посвящено выдающимся эффектам личиночной терапии, по сути являющейся искусственно индуцированным миазом, главные из которых очищение, дезинфекция и быстрое заживление хронических ран, зачастую не поддающихся лечению методами традиционной медицины. Достоверно известно, что личинки эффективно очищают раны, зараженные таким опасным патогеном, как метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (МЯБА), который является возбудителем одной из госпитальных инфекций и относится к группе бактерий, устойчивых почти ко всем ныне существующим антибиотикам. Поэтому эффективность хирургических личинок и компонентов, синтезируемых ими, в отношение МЯЗА, имеет огромное значение.

Кроме того, личинки многих мух, особенно личинки СаШрЬопс1ае, питаются на разлагающихся субстратах и являются пассивными переносчиками огромного количества патогенных бактерий. Поэтому исследование антимикробных компонентов у разных видов мух представляется особенно актуальным.

Цель работы: изучение факторов гуморального и клеточного иммунитета личинок ЬисШа

эепсШа и их роли в контроле внешней и внутренней среды.

Для выполнения целей работы были поставлены следующие задачи:

• Исследование состава и титра антибактериальных компонентов в экзосекрете и гемолимфе иммунизированных личинок Lucilia sericata.

• Исследование состава и титра фунгицидных компонентов в гемолимфе и экзосекрете личинок Lucilia sericata, а также в экзосекрете личинок Musca domestica и Calliphora vicina.

• Исследование клеточных защитных механизмов личинок Lucilia sericata: описание основных типов гемоцитов; изменение состава гемоцитов в ходе развития; иммунологические реакции гемоцитов.

Научная новизна. В работе впервые был проведен сравнительный анализ двух защитных систем личинок L. sericata, выполняющих основные функции: временное блокирование роста сапрофитных микроорганизмов в окружающей среде (функция защиты пищевого субстрата) и уничтожение патогенов, проникших в гемолимфу (функция иммунологической защиты). В гемолимфе личинок зеленой мясной мухи впервые были описаны диптерицины и пролин-богатые пептиды. В экзосекрете были обнаружены пептидные компоненты и низкомолекулярные соединения. Удалось выяснить, что общим антимикробным фактором гемолимфы и экзосекрета является диптерицин, остальные компоненты экзосекрета и гемолимфы личинок отличаются по структуре и биологической активности. Важной отличительной особенностью экзосекрета является наличие низкомолекулярных соединений с анти-MRSA активностью. В работе были описаны их антибиотическая активность, хроматографическая подвижность и определены молекулярные массы.

Практическая ценность. На сегодняшний день хирургические личинки применяются в медицине для лечения хронических ран. Обобщение уже известных и получение новых данных о механизмах действия личинок в ране представляет собой неоспоримую ценность. Экзосекрет личинок зеленой мясной мухи в отличие от гемолимфы подавляет рост и развитие полирезистентного штамма MRSA. Таким образом, экзосекрет является потенциальным источником новых лекарственных средств, способных бороться с возбудителями различных бактериальных заболеваний, в том числе с одной из самых распространенных госпитальных инфекций, с MRSA. Ценной особенностью антибиотических компонентов как экзосекрета, так и гемолимфы, выгодно отличающей их от синтетических антибиотиков, является способность не вызывать развития устойчивости у бактерий.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции «Ломоносов-2010» (Москва, 12 - 15 апреля 2010 г.), 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино,

19 - 23 аперля 2010 г.), VII Всероссийской межвузовской конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 20 - 23 апреля 2010 г.), Международной научной школе для молодежи «Методология и организация инновационной деятельности в сфере высоких технологий» (Санкт-Петербург, 22 - 27 сентября 2010 г.) и Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 16-20 мая 2011 г.). По теме диссертации опубликовано 7 работ из них 3 статьи в отечественных рецензируемых журналах и одна монография.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах, включает введение, семь глав, заключение и список литературы, содержит 28 рисунков и 18 таблиц. Список литературы состоит из 166 источников, из них - 158 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава I. Литературный обзор.

В данной главе собраны и обобщены данные по организации и функционированию иммунной системы насекомых. Иммунитет насекомых представляет собой две взаимодействующие системы клеточной и гуморальной защиты. Клеточный иммунный ответ представлен реакциями фагоцитоза и образованием узелков и капсул в ответ на чужеродную инвазию. Гуморальный иммунитет сочетает в себе действия факторов, обеспечивающих коагуляцию гемолимфы и функционирование фенолоксидазной системы и каскад антимикробных пептидов, индуцируемый септической травмой. В отдельный раздел выделяется эпителиальный иммунный ответ и описание защитных факторов, которые синтезируются клетками эпителия насекомого и в некоторых случаях могут выделяться в виде экзосекрета. Экзосекрет личинок L. sericaía, которые активно используются в биохирургии, обладает рядом важных особенностей, к ним относятся очищение, дезинфекция и быстрое заживление хронических ран. Особое внимание было уделено исследованиям, посвященным антибактериальным свойствам экзосекрета.

Глава II. Материалы и методы.

Объектами исследований послужили мухи Lucilia sericaía, Calliphora vidria и Musca domestica. Экзосекрет собирали у активно питающихся личинок, гемолимфу - у диапаузирующих. Иммунный ответ у диапаузирующих личинок индуцировали проколом кутикулы иглой, смоченной в суспензии бактериальных клеток.

Гемолимфу иммунизированных и интактных личинок собирали через прокол кутикулы спустя сутки с момента иммунизации. Собранную гемолимфу центрифугировали 8 мин при 3000 об/мин и комнатной температуре. Сбор экзосекрета производили путем добавления дистиллированной воды к 150-220 г. стерильных личинок

Накапливающийся экзосекрет пропускали через бумажные фильтры, центрифугировали 10 мин при 7000 об./мин и +10 °С и очищали бактериальными фильтрами Millipore (0,22 мкм).

Бактерицидную активность образцов определяли при помощи стандартного метода определения зон ингибирования роста бактерий. В экспериментах использовали бактерий видов: Micrococcus luteus А270, Escherichia coli D31, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Listeria monocytogenes EGD, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphilococcus aureus 203, MRSA ATCC 33591 и E. coli 774.1. Для определения фунгицидной активности анализируемый образец добавляли в питательную среду, мицелий наносили в центр чашки Петри микологической иглой. За развитием грибных колоний следили в течение нескольких дней. В экспериментах использовали грибы видов: Aspergillus versicolor, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Cladosporium sphaerospermum, Trichoderma viride, Pénicillium fuscum.

Для дополнительной очистки и концентрации образцов использовали метод твердофазной экстракции на картриджах с сорбентом Cl8 и обратнофазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию на хроматографе Gold System. При хроматографии использовали колонку Ascentic Cl8 (10x250мм). Элюирование проводили при линейном градиенте ацетонитрила от 0 до 50 % за 50 мин, регистрируя изменение поглощения при 225 им.

Для масс-спектрометрического анализа использовали метод ионизации при атмосферном давлении в электроспрее (ESI-TOF=electrospray ionization-time of flight) и ионизацию лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI-TOF= matrix assisted lazer desorption ionization-time of flight).

Статистическая обработка включала вычисление среднего арифметического и ошибки среднего.

Исследования живых гемоцитов осуществлялись с помощью метода дифференциально-интерференционного контраста по Номарскому. Изображения гемоцитов были получены с использованием цифровой видеокамеры Digital CDSP, установленной на микроскопе Jenamed.

Глава III. Фунгицидная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucifia

sericata.

В данной главе представлены результаты исследования фунгицидной активности гемолимфы L. sericata и экзосекретов L. sericata, С. vicina и М. domestica на уровне цельных экстрактов. Затем экзосекрет L. sericata подвергли очистке описанными выше методами и определили ряд биохимических характеристик его фунгицидных

компонентов, локализовав их в определенных хроматографических фракциях. В результате удалось выяснить, что

• гемолимфа интактных и иммунизированных личинок L. sericata проявляет фунгицидную активность по отношению к С. sphaerospermum и подавляет спорообразование у A. flavus',

• экзосекрет личинок L. sericata проявляет избирательную активность по отношению к некоторым видам грибов, таких как С. sphaerospermum и Т. viride\

• экзосекрет М. domestica подавляет рост A. flavus и A. niger; экзосекрет С. vicina - А. flavus, грибы вида Р. fuscum оказались не чувствительны к действию экзосекрета любого из использованных видов мух;

• гидрофобная фракция экзосекрета L. sericata подавляет рост и спорообразование С. sphaerospermum, гидрофильная - Т. viride\

• хроматографические фракции экзосекрета L. sericita, которые элюируются с колонки при концентрациях ацетонитрила от 6 % до 13% и 16%, характеризуются фунгицидной активностью по отношению к С. sphaerospermum.

Глава IV. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia

sericata.

Активность гемолимфы интактных личинок значительно ниже (10,7±1,8 - Е. coli', 14,9±2,4 - М. luteus; здесь и далее: зона ингибирования бактериального роста в мм2) активности гемолимфы иммунизированных личинок (73,6±5,0 - Е. colv, 210,2±16,8 - М. luteus), это связано с индуцибельным характером синтеза бактерицидных пептидов.

Экзосекрет личинок L. sericata в значительных концентрациях (60 мг/мл) проявляет антибактериальную активность, которая сконцентрирована в гидрофобной фракции. При этом эффективнее подавляет рост грамположительных бактерий (115,1 ± 67,2 - М. luteus) по сравнению с ростом грамотрицательных (26,1 ± 2,7 - Е. coli).

Спектр активности экзосекрета L. sericata шире, чем у гемолимфы, он подавляет рост 10 видов бактерий из 11, используемых в эксперименте (за исключением E.faecalis), в то время как гемолимфа кроме М. luteus и Е. coli ингибирует В. megaterium и S. aureus.

Согласно данным хроматографии титр антиграмположительных компонентов в гемолимфе L. sericata и С. vicina примерно одинаков, титр веществ с антиграмотрицательной активностью у L. sericata значительно ниже, чем у С. vicina, и практически совпадает с таковым в экзосекрете L. sericata. Хроматографическая фракция гемолимфы, проявляющая ингибирующую активность в отношении S. aureus, элюируется с колонки при 30% ацетонитрила. Ahth-MRSA активность проявляют фракции экзосекрета, элюируемые с колонки при 3 - 5% ацетонитрила.

Глава V. Масс-спектрометрический анализ.

Полученные в результате масс-спектрометрического анализа данные сопоставлялись с описанными молекулярными массами антимикробных пептидов в гемолимфе С. vicina. В исследуемых фракциях гемолимфы С. vicina, соответствующих 30% и 33% ацетонитрила были обнаружены дефензины массой 4031 Да, диптерицины — 9032 Да, Р-пептиды - 2988 Да и, возможно, цекропины - 4189 Да. В гемолимфе L. sericata также были найдены массы, соответствующие дефензинам 3844, 4062 и 4117 Да, Р-пептидам - 3043 Да. Для определения состава антимикробных пептидов экзосекрета были объединены фракции с одинаковой активностью (30%+31%; 32%+33%). В результате были обнаружены пептиды, молекулярные массы которых не совпадают с известными антимикробными пептидами: 6466, 6633, 5772, 8631 Да и полипептиды, массы которых незначительно отличаются от известных масс диптерицинов из гемолимфы С. vicina: 8882 Да и 9025 Да. Фракция гемолимфы L. sericata, подавляющая Е. coli, содержит пептиды, которые, возможно, относятся к диптерицинам, хотя их массы (7582 Да и 8032 Да) значительно отличаются от масс диптерицинов С. vicina. Масс-спектрометрия позволила обнаружить множество неизученных пептидов, даже в гемолимфе достаточно хорошо исследованного вида С. vicina.

Кроме высокомолекулярных компонентов в гемолимфе и экзосекрете L. sericata были обнаружены низкомолекулярные соединения. Хроматографические фракции экзосекрета, подавляющие развитие MRSA, содержат только низкомолекулярные соединения (325-1017 Да). Совпадений в этих компонентах гемолимфы и экзосекрета не обнаружено. Ahth-MRSA фракции включают только один общий компонент, молекулярная масса которого 524 Да. Кроме того, обнаружены молекулярные массы, присутствующие в двух фракциях одновременно: 325 Да в 4 % и 5 %, 365 Да в 3 % и 5 %, 396, 493, 598 и 652 Да в 3 % и 4 %. Таким образом, на данном этапе исследования в хроматографических фракциях экзосекрета, подавляющих рост MRSA, были обнаружены один общий компонент и четыре компонента, присутствующих одновременно в двух фракциях.

Глава VI. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilla sericata.

Гемолимфа личинок L. sericata характеризуется следующими типами гемоцитов: • прогемоциты - базовый тип клеток для остальных гемоцитов, присутствуют в гемолимфе в значительных количествах до стадии опустошения зоба;

стабильные гиалиновые клетки, которые являются предшественниками тромбоцитоидов и появляются в гемолимфе молодых личинок, а затем полностью исчезают к стадии пустозобой личинки,

• нестабильные гиалиновые клетки, аналог кристаллических клеток дрозофилы, содержат профенолоксидазу и исчезают из гемолимфы после опустошения зоба;

• тромбоцитоиды - предшественники клеточных пластинок и «голых ядер»;

• веретеновидные клетки, которые появляются на поздних стадиях развития личинки, при подготовке к пупаризации и наряду с пластинками принимают участие в образовании сетей;

• плазматоциты, основные фагоцитирующие клетки, представлены двумя генерациями, ювенильные плазматоциты до стадии очищения зоба и поздние плазматоциты после опустошения зоба.

При попадании в гемолимфу чужеродных частиц быстро запускаются реакции фагоцитоза и инкапсуляции с участием плазматоцитов и тромбоцитоидных фрагментов.

Глава VII. Обсуждение

В настоящей работе были исследованы особенности адаптаций личинок мух к меняющимся условиям окружающей среды, а именно взаимоотношения насекомых с конкурентными микроорганизмами за питательный субстрат, и сопоставление механизмов кондиционирования, используемых личинками, в контроле внешней и внутренней среды. Для этого были изучены фунгицидные и антибактериальные свойства экзосекрета и гемолимфы личинок L. sericata и соотнесены с данными по другим видам мух, и исследованы особенности клеточных защитных реакций личинок.

Известно, что насекомые синтезируют фунгицидные белки, которые иногда действуют синергично с антимикробными пептидами, используют вторичные метаболиты, например кутикулярные спирты и жирные кислоты в борьбе с патогенными грибами. Однако, особенности действия экзосекрета личинок мясных мух в отношении грибов не были изучены в достаточной мере. Стоит отметить, что экзосекрет личинок характеризуется фунгистатическим действием. Вероятно, быстро развивающимся личинкам падальных мух достаточно подавлять конкурирующие с ними за пищевой субстрат мицелиальные грибы, не оказывая фунгицидного эффекта. На уровне цельных экстрактов экзосекреты L. sericata, С. vicina и М. domestica обладают определенной ингибирующей активностью в отношении грибов, но спектр действия их не широк. Впервые, в данной работе была охарактеризована хроматографическая подвижность фунгицидных компонентов экзосекрета L. sericata. Благодаря этому удалось выяснить, что за фунгистатические и антибактериальные свойства экзосекрета ответственны разные компоненты.

Полученные результаты по анализу антибактериальной активности хорошо соотносятся с литературными данными. Несколько независимых исследовательских групп

пришли к выводу, что экзосекрет характеризуется широким спектром антибактериальной активности и эффективнее ингибирует рост грамположительных бактерий, в том числе МЯБА. В настоящей работе в экзосекрете впервые были обнаружены диптерицины, неопределенные антимикробные пептиды, массы которых пока не удалось соотнести с уже известными, и анти-МЛ-БА компонент массой 524 Да.

Помимо гуморальных защитных механизмов были описаны основные типы гемоцитов личинок Ь. $ег1са1а и иммунные реакции с их участием. Многие исследователи стремятся применять к разным отрядам насекомых общую классификацию гемоцитов, разработанную при изучении гемолимфы чешуекрылых. Однако, со временем накапливающиеся данные по различным видам насекомых продемонстрировали несостоятельность применения лишь одной классификации. У И. melanogaster, например, описано всего 4 типа клеток, а у личинок СаШрЬопёае - 8. Гемоцитарная формула личинок мясных мух напрямую зависит от их жизненного цикла: состав гемолимфы значительно отличается у питающихся и готовящихся к пупаризации личинок. Клеточные защитные механизмы у личинок-каллифорид представляют собой многоступенчатый процесс. Реакция фагоцитоза тромбоцитоидов и ювенильных плазматоцитов начинается в первые секунды после инвазии. Затем плазматоциты осуществляют инкапсуляцию чужеродных объектов. И на более поздних этапах включаются механизмы гуморальной защиты, синтезируются и выделяются в гемолимфу антимикробные, фунгицидные соединения.

Заключение

Обобщая полученные результаты, следует в заключение подчеркнуть, что личинки Ь. зег1са1а обладают, по крайней мере, тремя уровнями защиты. Первый уровень представлен определенными типами гемоцитов, тромбоцитоидами и фагоцитирующими плазматоцитами. Реакция этих гемоцитов начинается в первые секунды после инвазии. Второй уровень - это нодуляция и инкапсуляция чужеродных объектов, а также медленный фагоцитоз. И, наконец, третий уровень представлен гуморальными механизмами защиты - выработкой антибактериальных и фунгицидных пептидов и низкомолекулярных соединений. Антимикробные соединения, синтезируемые личинками Ь. зепсМа, выполняют две основные функции — уничтожение патогенов, проникших в гемолимфу (функция иммунологической защиты), и временное блокирование роста сапрофитных микроорганизмов в окружающей среде (функция защиты пищевого субстрата). Функция иммунологической защиты обеспечивается каскадом реакций на микробную инвазию, конечным звеном которого служит индукция синтеза и секреции в гемолимфу антимикробных пептидов клетками жирового тела. Функция защиты

пищевого субстрата обеспечивается выделением в окружающую среду экзосекрета, содержащего антимикробные метаболиты, источником которых, по-видимому, служат слюнная железа и кишечный эпителий.

В состав экзосекрета, как нам удалось установить, входят пептиды аналогичные или идентичные антимикробным пептидам гемолимфы (диптерицины), высокомолекулярные соединения (вероятно, также пептидной природы), отличные от известных компонентов гемолимфы, и низкомолекулярные соединения, главной особенностью которых является способность подавлять рост метициллин-устойчивого золотистого стафилококка in vitro. Было выявлено, что фракции экзосекрета, ингибирующие MRSA, включают один общий компонент, молекулярная масса которого 524 Да. Природа низкомолекулярных компонентов остается неизвестной, однако в качестве рабочей гипотезы можно предположить, что они относятся к вторичным метаболитам, функционально сходным с антибиотиками микробного происхождения. В пользу этой гипотезы свидетельствует тот факт, что известные антибиотики микробного происхождения также выполняют функцию подавления пищевых конкурентов. Если эта гипотеза найдет в будущем подтверждение, то экзосекрет личинок L. sericata и других двукрылых-сапрофагов может оказаться ценным источником для поиска новых природных антибиотиков.

Выводы

1. Трофические связи, характерные для зеленой мясной мухи Lucilia sericata (питание мертвыми и живыми тканями млекопитающих) обусловили формирование двух антимикробных комплексов, используемых личинками при контакте с микробиотой: комплексы гемолимфы и экзосекрета.

2. Антимикробный комплекс гемолимфы L. sericata, как и других мух-каплифорид, формируется в процессе иммунного ответа личинок на инфекцию и включает представителей трех известных семейств антимикробных пептидов - дефензинов, дипетрицинов и Р-пептидов. В его составе также обнаружены и частично охарактеризованы методами хроматографии и масспектрометрии неизвестные ранее пептиды и низкомолекулярные соединения с антибактериальной активностью.

3. Экзосекрет, выделяемый во внешнюю среду слюнными железами и кишечником в период активного питания личинок L. sericata, обладает выраженной антибактериальной и антифунгальной активностью и содержит как пептиды, так и низкомолекулярные компоненты с антимикробной активностью.

4. Общим антимикробным компонентом гемолимфы и экзосекрета L. sericata является пептид диптерицин, участвующий как в иммунном ответе, так и пищевых реакциях личинок. На примере диптерицина можно видеть уникальный механизм адаптации к обитанию в агрессивном микробном окружении - секреции компонента иммунного ответа в окружающую среду для подавления потенциальных патогенов и пищевых конкурентов.

5. Другие антимикробные компоненты гемолимфы и экзосекрета, по данным хроматографического, масспектрометрического и микробиологического анализа, различаются по структуре и биологической активности.

6. Антифунгальная активность экзосекрета L. sericata обусловлена компонентами двух типов: гидрофобные соединения, относящиеся к диптерицинам и, вероятно, другим катионным пептидам и гидрофильные соединения неизвестной природы.

7. Высокая антифунгальная активность является общим свойством экзосекрета не только L. sericata, но и личинок других видов сапротрофных двукрылых, в частности копронекрофага Calliphora vicina и пантофага Musca domestica. Это обстоятельство указывает на важное адаптивное значение противогрибковых компонентов экзосекрета двукрылых-сапробионтов с различной пищевой специализацией.

8. Наряду с растворимыми комплексами гемолимфы и экзосекрета, защита личинок L. sericata от патогенных микроорганизмов включает эффективную систему клеточного иммунитета. Изученные в данной работе структурно-функциональные характеристики гемоцитов L. sericata аналогичны описанным в литературе характеристикам гемоцитов С. vicina и других видов мух-каллифорид.

9. Поскольку личинки L. sericata широко используются в медицине для лечения инфицированных ран, результаты настоящей работы, в сочетании с исследованиями других авторов, служат экспериментальной основой дальнейшего развития этого метода биотерапии. В частности, они показывают, что свойства экзосекрета личинок делают этот метод перспективным для лечения не только бактериальных, но и грибковых инфекций.

10. Изучение спектра антимикробной активности и состава экзосекрета L. sericata позволило также обнаружить вещества, активно подавляющие рост мультирезистентных к антибиотикам форм золотистого стафилококка S. aureus. Учитывая исключительно важное клиническое значение вызываемых этими формами заболеваний, дальнейшие исследования в этом направлении представляют самостоятельный интерес.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Крутикова А. А. Антимикробные компоненты экзосекрета хирургических личинок Lucilia sericata (Meigen) (Díptera, Calliphoridae) / А. А. Кругликова, С. И. Черныш // Энтомологическое обозрение.- 2011.- Т. 90, №3.- С. 504-513.

2. Кругликова А. А. Антимикробные факторы гемолимфы и экзосекрета личинок Lucilia sericata (Meigen) (Díptera, Calliphoridae) / А. А. Кругликова // Журнал эволюционной биохимии и физиологиию.- 2011,- Т. 47, №6,- С. 453-460.

3. Кругликова А. А. Хирургические личинки и история их медицинского применения / А. А. Кругликова, С. И. Черныш // Энтомологическое обозрение.-2013,-Т. 92, №1,-С. 12-23.

4. Кругликова А. А. Хирургические личинки Lucilia sericata как источник новых антимикробных соединений / А. А. Кругликова // Материалы Международной конференции «Ломоносов-2010»,.- С. 53

5. Кругликова А. А. Антимикробные факторы гемолимфы и экзосекрета личинок Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae) / А. А. Кругликова // Сборник тезисов 14 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века»,- 2010.- С. 145.

6. Кругликова А. А. Поиск новых подходов к лечению бактериальных и грибковых инфекций на основе изучения антимикробных соединений хирургических личинок Lucilia sericata / А. А. Кругликова // Материалы VII Всероссийской межвузовской конференции молодых ученых.- 2010.- С. 58.

7. Кругликова А. А. Биохирургия. Хирургические личинки как источник новых антимикробных соединений / А. А. Кругликова // Москва: LAP, 2010.- 84 с.

Подписано в печать 11.02.2014г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 3386.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, 1-я линия В.О., д.28 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кругликова, Анастасия Анатольевна, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

04201457037 На правах рукописи

¿V ■

КРУГЛИКОВА Анастасия Анатольевна

АНТИМИКРОБНЫЕ ФАКТОРЫ В КОНТРОЛЕ ВНЕШНЕЙ И ВНУТРЕННЕЙ СРЕДЫ МЯСНЫХ МУХ (DIPTERA, CALLIPHORIDAE)

03.02.05 - энтомология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель доктор биологических наук Сергей Иванович Черныш

Санкт-Петербург 2014

\

Оглавление

Оглавление.....................................................................................................................................2

Введение.........................................................................................................................................4

Глава I. Литературный обзор.......................................................................................................7

1.1. Иммунная система насекомых...........................................................................................7

1.1.1. Клеточный иммунный ответ.......................................................................................7

1.1.1.1. Фагоцитоз...............................................................................................................8

1.1.1.2. Образование узелков и капсул.............................................................................9

1.1.2. Гуморальный иммунный ответ.................................................................................10

1.1.2.1 .Антимикробные пептиды....................................................................................11

1.1.2.2. Коагуляция гемолимфы......................................................................................16

1.1.2.3. Фенолоксидазная система..................................................................................18

1.1.2.4. Эпителиальный иммунный ответ......................................................................19

1.2. Личиночная терапия.........................................................................................................21

I.2.1. Антибактериальные свойства экзосекрета..............................................................24

Глава II. Материалы и методы исследования...........................................................................29

II. 1. Биологический материал.................................................................................................29

II. 1.1. Краткая характеристика основного модельного объекта исследования Lucilia

sericata..................................................................................................................................29

II. 1.2. Методика лабораторного содержания....................................................................29

II.2. Методы..............................................................................................................................30

11.2.1. Инфицирование насекомых.....................................................................................30

II.2.1.1. Получение бактериальной суспензии для иммунизации...............................30

11.2.2. Сбор гемолимфы.......................................................................................................30

11.2.3. Сбор экзосекрета.......................................................................................................30

11.2.4. Анализ антимикробной активности........................................................................31

11.2.5. Анализ фунгицидной активности............................................................................32

11.2.6. Методы концентрации и очистки исследуемых образцов....................................32

11.2.6.1. Метод твердофазной экстракции.....................................................................32

11.2.6.2. Хроматографическое фракционирование........................................................33

11.2.7. Масс-спектрометрия.................................................................................................33

11.2.8. Методы исследования живых гемоцитов...............................................................34

11.2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных......................................34

Глава III. Фунгицидная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata.....35

III. 1. Фунгицидная активность гемолимфы личинок Lucilia sericata.................................35

Ш.2.Фунгицидная активность цельного экзосекрета личинок Lucilla sericata, Calliphora

vicina, Musca domestica...........................................................................................................36

111.2.1. Фунгицидная активность экзосекрета Lucilia sericata.........................................36

111.2.2. Фунгицидная активность экзосекрета Calliphora vicina......................................39

111.2.3. Фунгицидная активность экзосекрета Musca domestica......................................40

111.3. Фунгицидная активность фракционированного экзосекрета личинок Lucilia sericata......................................................................................................................................41

111.3.1. Фунгицидная активность гидрофобной фракции экзосекрета............................41

111.3.2. Фунгицидная активность хроматографических фракций экзосекрета..............42

111.4. Выводы............................................................................................................................43

Глава IV. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia

sericata..........................................................................................................................................45

IV. 1. Антибактериальная активность цельных экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia

sericata......................................................................................................................................45

IV.2. Антибактериальная активность гидрофобных фракций экзосекрета и гемолимфы

личинок Lucilia sericata...........................................................................................................48

IV.3. Антибактериальная активность хроматографических фракций экзосекрета и

гемолимфы личинок Lucilia sericata......................................................................................52

IV.4. Выводы............................................................................................................................57

Глава V. Масс-спектрометрический анализ.............................................................................58

Глава VI. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata...............84

VI. 1. Основные типы гемоцитов Lucilia sericata..................................................................84

VI.2. Иммунологические реакции гемоцитов.......................................................................92

VI.3. Выводы............................................................................................................................93

Глава VII. Обсуждение...............................................................................................................94

VII. 1. Фунгицидная активность гемолимфы и экзосекрета личинок Lucilia sericata.......94

VII.2. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

...................................................................................................................................................97

VII.3. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata................101

Заключение.................................................................................................................................106

Выводы.......................................................................................................................................109

Список литературы....................................................................................................................111

/

Введение

В естественных местообитаниях основными конкурентами личинок мух являются микроорганизмы, грибы и бактерии. Для личинок мясных мух характерно внекишечное пищеварение, при котором питательный субстрат подвергается предварительной обработке пищеварительными ферментами (Виноградова, 1984).

Поскольку среда обитания личинок мух крайне агрессивна, экзосекрет этих насекомых, по всей видимости, должен содержать антимикробные и фунгицидные соединения. Некоторые виды насекомых, как и позвоночные (Weinbergl et al., 1998; Selsted et al., 1992), выделяют на поверхность слизистых оболочек антимикробные пептиды. Так у дрозофилы антимикробные пептиды обнаружены в нескольких видах эпителия, которые потенциально контактируют с окружающей средой; к ним относятся респираторный, пищеварительный, репродуктивный тракты, мальпигиевы сосуды и ротовые органы (Tzou et al., 2000). Для растений и грибов характерно использование вторичных метаболитов в качестве защиты от вредителей и патогенов, а также в борьбе с конкурентами (Seigler, 1999; Баринова и др., 2008). Для животных такие механизмы менее характерны. Но известно, что часть азота выделяется личинками мясных мух в форме аллантоина, образующегося в результате расщепления мочевой кислоты (Виноградова, 1984), который увеличивает значение рН, что косвенным образом подавляет развитие целого ряда микроорганизмов (Thomas et al., 1999).

Антимикробные пептиды, как известно, являются важнейшим элементом в иммунной системе насекомых, обеспечивая высокую устойчивость к широкому спектру патогенов и паразитов (Bulet et al., 1999; Hoffmann, 1995). Большинство из них индуцибельны, характеризуются небольшим молекулярным весом и являются катионными молекулами (Hoffmann, 1995). Большая часть антимикробных пептидов синтезируется клетками жирового тела и выделяется в гемолимфу (Trenszec et Faye, 1988). Известно, что для дрозофилы, так же как и для млекопитающих, характерна тканеспецифичная продукция антимикробных пептидов (Tzou et al., 2000). Однако, у личинок L. sericata подобные особенности иммунного ответа до сих пор не были исследованы.

Мухи вида L. sericata имеют огромное экономическое и клиническое значение, поскольку являются первичными факультативными паразитами, вызывающими кожные миазы прежде всего у овец несмотря на то, что могут поражать и других диких и домашних животных и человека (Hall et Hall, 1995). Однако, эта особенность жизненного цикла личинок мух может быть использована человеком в собственных интересах. На

сегодняшний день огромное количество публикаций посвящено выдающимся эффектам личиночной терапии, главные из которых очищение, дезинфекция и быстрое заживление хронических ран, зачастую не поддающихся лечению методами традиционной медицины (Nigam et al., 2006а,b; Sherman, 2003; Whitaker et al., 2007). Достоверно известно, что личинки эффективно очищают раны, зараженные таким рпасным патогеном, как метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (MRSA) (Jaklic et al., 2008; Steenvoorde et Jukema, 2004). Также показана активность экзосекрета личинок в отношение MRSA в экспериментах in vitro (Bexfield et al., 2004; Kerridge et al., 2005; Thomas et al., 1999). Метициллин-устойчивый штамм Staphylococcus aureus является возбудителем одной из госпитальных инфекций и относится к группе так называемых «antibiotic-resistant superbugs» (Kerridge et al., 2005), т.е. к группе бактерий, устойчивых почти ко всем ныне существующим антибиотикам. Поэтому эффективность хирургических личинок и компонентов, синтезируемых ими, в отношение MRSA, имеет огромное значение.

Кроме того, личинки многих мух, особенно личинки Calliphoridae, питаются на разлагающихся субстратах и являются пассивными переносчиками огромного количества патогенных бактерий (Fischer et al., 2004; Habeeb et Mahdi, 2012; Paraluppi et al., 1996). Поэтому исследование антимикробных компонентов у разных видов мух представляется особенно актуальным.

Цель работы: Изучение факторов гуморального и клеточного иммунитета личинок Lucilia sericata и их роли в контроле внешней и внутренней среды.

Для выполнения целей работы были поставлены следующие задачи:

• Исследование состава и титра антибактериальных компонентов в экзосекрете и гемолимфе иммунизированных личинок Lucilia sericata.

• Исследование состава и титра фунгицидных компонентов в гемолимфе и экзосекрете личинок Lucilia sericata, а также в экзосекрете личинок Musca domestica и Calliphora vicina.

• Исследование клеточных защитных механизмов личинок Lucilia sericata: описание основных типов гемоцитов; изменение состава гемоцитов в ходе развития; иммунологические реакции гемоцитов.

Автор выражает благодарность за помощь и содействие в проведении экспериментов и написании работы научному руководителю Сергею Ивановичу Чернышу, сотрудникам лаборатории биофармакологии и иммунологии насекомых: Тулину Д. В., Яковлеву А. Ю., Гордя Н. А., Несину А. П., Симоненко Н. П., Кинд Т. В.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной программы поддержки ведущих научных школ (проект НШ-3332.2010.4) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.

Глава I. Литературный обзор 1.1. Иммунная система насекомых

Насекомые, достигшие наивысшего уровня эволюционного развития среди беспозвоночных животных, имеют сложную систему защиты от патогенных микроорганизмов. Покровы стенки тела, кишки и трахей являются надежной механической преградой для проникновения паразитов из окружающей среды в полость тела насекомого. Однако в случае повреждения покровов чужеродные объекты могут попадать в гемолимфу. Попавшие в гемолимфу патогены становятся мишенью для клеточных и гуморальных факторов сложной координированной системы защиты.

В основе клеточного иммунитета лежат реакции, реализуемые клетками гемолимфы насекомых - гемоцитами. Ключевым эффекторным звеном гуморального иммунитета являются цитотоксические молекулы, образующиеся в ходе реакций, опосредуемых ферментом - фенолоксидазой, а также целый спектр антимикробных пептидов.

1.1.1. Клеточный иммунный ответ

Основными структурными элементами, участвующими в формировании клеточного иммунного ответа насекомых, являются клетки кроветворной ткани, перикардиальные клетки, фиксированные и свободноживущие клетки гемолимфы -гемоциты. Гемоциты представляют собой гетерогенную популяцию клеток, принимающих активное участие в иммунных реакциях. На сегодняшний день существует множество классификаций гемоцитов насекомых и есть мнение, что единой системы деления гемоцитов на группы нет (Тулин, Чага, 2003). Традиционно у насекомых выделяют шесть типов гемоцитов: прогемоциты, плазматоциты, гранулоциты, сферулоциты, цистоциты и эноцитоиды; эта классификация основана на исследованиях гемлимфы чешуекрылых (Gupta, 1985; Lackie, 1988; Price et Ratcliffe, 1974; Ratcliffe et Rowley, 1981).

Прогемоциты являются базовым типом клеток, из которых дифференцируются все остальные гемоциты (Lackie, 1988).

Плазматоциты представляют собой чаще всего агранулярные клетки, обычно специализированные на выполнении фагоцитарных функций. Практически все эти клетки содержат лизосомальные ферменты. В некоторых плазматоцитах выявляется пероксидазная и эстеразная активность, а у представителей отрядов Odonata и Coleóptera -

еще и фенолоксидазная активность. Определенная часть этих клеток способна синтезировать лектины (Lackie, 1988).

Гранулоциты - клетки со специфическими включениями в цитоплазме метаболического характера. Эти клетки высвобождают содержимое гранул, например, в процессе капсулообразования. Доказанной функцией гранулярных гемоцитов бабочек является фагоцитоз, кроме того они первыми контактируют с чужеродным объектом в гемолимфе и секретируют содержимое своих гранул (Ribeiro et Brehelin, 2006). У личинок Calliphoridae настоящих гранулярных клеток не обнаружено, поскольку включения плазматоцитов имеют доказанное катаболическое происхождение (Тулин, Чага, 2003; Кинд, 2007).

Сферулоциты - большие округлые клетки, которые содержат небольшое количество крупных включений, сферул. О функциях этих клеток ничего неизвестно (Lackie, 1988; Ribeiro et Brehelin, 2006).

Чаще всего к группе эноцитоидов относят клетки, содержащие фенолоксидазу (Ribeiro et Brehelin, 2006). У дрозофилы это хорошо описанные кристаллические клетки (Lemaitre et Hoffmann, 2007).

Цистоциты иногда описывают как коагулоциты. Они содержат большое количество гранул, которые активно высвобождаются при препарировании. Возможно, это определенный тип гранулоцитов, принимающих участие в коагуляции гемолимфы (Price et Ratcliffe, 1974; Ratcliffe et Rowley, 1981).

Результатом гемоцитарных защитных реакций является изоляция «чужого» от внутренней среды организма в результате фагоцитоза либо образования многоклеточных узелков и капсул вокруг патогена.

1.1.1.1. Фагоцитоз

Фагоцитоз является первым механизмом защиты насекомых от патогенов. Он является специализированной формой рецептор-опосредованного эндоцитоза. Фагоцитироваться могут разнообразные нерастворимые субстанции, от инертных частичек (тушь, латекс) до мелких биологических объектов, таких как бактерии.

Фагоцитирование чужеродной частицы - это многоступенчатый процесс. Первым этапом фагоцитоза является аггрегация гемоцитов в месте повреждения. Далее происходит прикрепление фагоцита к частице и ее распознавание. Этап распознавания является ключевым в формировании иммунного ответа. При встрече с чужеродным агентом гемоциты могут использовать весь «арсенал» рецепторов, способных связываться с инородными телами, в том числе и рецепторы, экспрессированные после индукции

какого-либо сигнала. Распознавание антигенов осуществляется при помощи специфических рецепторов к основным микробным детерминантам, расположенных на поверхности клетки, либо гуморальных факторов, выполняющих роль опсонинов. В качестве опсонинов у насекомых были идентифицированы следующие соединения: лектины, гемолин (входит в состав иммуноглобулинового семейства), ЛПС-связывающий белок, белок, распознающий грамотрицательные бактерии, белок, распознающий пептидогликаны и тиоэфир-содержащий белок а-ТЕР1, близкий к а2-макроглобулину позвоночных (Bulet et al., 1999; Schmidt et al., 2001). Исследования показали, что некоторые из этих факторов действительно усиливают фагоцитоз, образование узелков и капсул. Например, у Anopheles gambiae а-ТЕР1 связывается с грамотрицательными бактериями, и подавление этого фактора с помощью интерферирующей РНК приводит к снижению фагоцитоза бактерий гемоцитами (Lavine, 2002). Связывание антигена с рецептором запускает процесс передачи сигнала в ядро иммуноцита. Следствием этого является образование клеткой псевдоподий, поглощение чужеродной частицы и образование фагосомы (Hoffman et Lemaitre, 2007). Механизм, по которому идет уничтожение патогена внутри фагосомы, до конца не изучен. Есть основания полагать, что поглощенные бактерии элиминируются под действием активных соединений кислорода и азота, выделяемых в фагосому.

1.1.1.2. Образование узелков и капсул

Более сложным механизмом изоляции патогена является образование капсул, или инкапсуляция. Формирование капсул может происходить также вокруг собственных поврежденных тканей насекомого - процесс, лежащий в основе регенерации. Этот процесс осуществляется при согласованном учас