Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологически активные вещества фитопатогенного гриба Helminthosporium teres Sac.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиологически активные вещества фитопатогенного гриба Helminthosporium teres Sac."

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ им. В. Ф. КУПРЕВИЧА

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Надежда Викторовна

УДК 581.192

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА

HELMINTHOSPORIUM TERES SAC.

03.00.12 ■—физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 1993

Работа выполнена б лаборатории физиологии больного растения Института экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купревича АН Беларуси.

Научный руководитель: доктор биологических наук А.П.Вояыяеп

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.П.Деева кандидат биологических наук Г.Н.Еанбанович

Ведущая организация: Главный ботанический сад РАН

Защита состоится Л^¡4-0 1993 года в часов

на заседании специализированного ученого совета ло присуждению ученой степени кандидата биологических наук ( К 006.04.01 ) при Институте экспериментальной ботаники кы. В.Ф.Купревича АН Беларуси по адресу: 220072, г. Мдаск-ГСП, ул. Ф.Скорины, 27.

СТ. диссертацией коею ознакомиться б Центральной научной библиотеке иы. Я.Коласа АН Беларуси.

Аагореферат разослан "ЛГ" 1993 года

Ученый секретарь

И.В.Рогульченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актгалщссп таим. #*топатогеиимв грибы накосят большой ущерб урока* сельскохозяйственных раетеяяЯ. Иногда окк еюдят на нет все ■ усилия селекционеров, превращая высокопродуктивные сорта растений в свои противоположное». Стабилизация урояая от действия неблагоприятных факторов ( в том числе к грябноЯ инфекция ) остается одной яа основных задач современного сельского хозяйства.

Достижение втой целя может идти несколькими путями: посредством повняения устойчивости сельскохозяйственных культур нля ослабления агрессивного потенциала п гогенов, нля тем я другим способом« одновременно. В любом случае при реяеияи такой задачи полезши будет вкяснекне регулятормнх механизмов поражения и аецятн раетеинЯ от патогенов.

Вопрос» взаимодействия растений-хозяев я их патогенов давно привлекает внкмаянв фятопатофиаиологов на уровне основного обкома ( Купревяч, 1947; Сухорукое, 1952; Рувим, Арциховская, 1960; Андреев, 1979; Серова я др., 1982; 1986 ), общих и специфических токсинов ( внляппов н др., 1980; Някуленко, Чканнков, 1987 ), эа-цнтшх веществ ( Крукванк, Перри и, 1968; ЫетлицкиЙ, Озерецхов-екая, 1973; Волинец я др., 1991), витаминов и гормонов ( Купревяч, 1947; ра£3| 1976; Казни н др., 1980; Умиов н др., 1980; Чигрин и др., 1981; Чкаников и др.,.1964 ). К хотя общность гормонального комплекса вмсаях растений н фнтопатогенных грибов известна ( Муромцев, Апястикова, 1973; Рубяи я др., 1975; Филиппов н др., 1980 ), роль их в патогенеза до снх пор не совсем ясна. Что же ка сается грива н. **геа • физиологически актнвкке вечества (ФАВ) его совсем не изучены, хотя вредоносность вызываемой им сетчатой пятнястоетя ячменя все больно беепохоит растениеводов.

Целя я задачи исследования. Цел» работа являлось изучение характера выделения грибом u.t«rt« * процессе развития и выяснение их роля во вааимодействкн патогена с растением-хозяином (ячменем).

Конкретные задачи сводились к следующему:

1. Определять динамику накопления биомассы патогеном H.ter«a.

2. Идентифицировать 9AJB культуральной жидкости и мицелия гриба.

3. Изучить характер изменения компонентною состава и соде] канне ФАВ в процессе роста гриба.

4. Исследовать патогенную активность культуральной жидкости гриб» ы.tarca и ее отдельных фракций.

5. Определять роль экзогенного воздействия SAB ка р&авнтно гриба в культуре и сетчатого гельмиитослорнова на растениях ячиэпя.

Научная новизна работа. Впервые выделены в идентифицированы ФАВ гормональной н фенольноИ природы в культуральной жидкости к иицедии гриба B.t«r«e . Изучен их состав к содеряаяке в процессе развития патогена. Ешнлена связь роста и развития гриба с изменена ем состава н содержания CAB. Установлена роль этих всчеств в проявлении грибом патогенных свойств. Если цитоккгаш в основной регулировал» «сгетативкьй рост шщелия я к&коплзнао его биомассы, то переход гриба б споромовегаш к форыяровшы» Еизиаспособшх кокздиЗ бил связан прездо всего с уровней содсргазшя АБК с фемолыш соединение, обуславливая помаенае его внрулситностя.

Теоротч^оскья и практическая поккость работу. Получ®зшао кокгз A&iusjo раскрывают псануа роль {¡AB гормональной с фзиояьиоЗ природа в процессах сопрякстюго развитая гриба п.teres, и формаровагая его патогекшх свойств. Зканыо CAB гриба н.terca в роли их в развито ккцеляя и икфекциокшх структур ужазиаает иа ерхкцютиадыдта воакоя-кость регулирования с поноем} аткх еосдккгнай вгоишотновениЛ рас-теетя-ховяака в иьтогеиа с цельв скждаси юрздоноскостс последнего и получения высококачветвшаюго спорового интервала для использования в сслекцнк да устойчивость-ячменя ж гслььзитосиориогу.

Апробьщия работу» Результаты: исследования долояеки на Всесовз-нии конференциях ."^ииохого-бйОхи^чсгкяо основа имзуштста расте-ий£ х грибкам бодезвдМ растений", "Ляигтаровакяе в скге-

бнровашке роста иикрооргок>5зуов",. Пуцмно t IS39; на Второй съогдо Всесовзного общества ^зиологоа/растениа, Шнсб, 1990.

ГСгйлик&ши . По теме дйссс&тааик опубликовано 5 научке: работ.

Структура работу. Диссертация сострит па введения, обзора литературы, описания, объектов и"методов исследования, выводов и списка литературы, включающего 183 источкика, на кях 103 - на русской и 80 - ювдйтзрашшх/языках. Диссертация изложена ка 1ЬЭ страницах, включает 26 таблиц и 20 рисунков.

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали компоненты пато-систеш: ячмень - гриб Hilainthoiporlua teree Saee.( возбудитель сетчатого гельминтослориоза), представлявших собой ленинградскую

популяция гриба я равные ло устойчивости сорта Ячменя ( Надя - восприимчивый; Заверений - ередивустойчивый ; Им 1192 - устойчивый).

Экстракцию ЗАВ иа культуралыюй жидкости и мицелия гриба проводили методом систематического анализа { Волынеп, i960), последовательно получал sgapiqn» 1 рН 3,0 ), атилацетатнуя ( рИ 3,0 ) и м-бутамольнув фракции ( рН 3,0 и 7,3 ).

Для группомЯ идентификации 9АВ использовали двумерную восхо-дкэог» хроматогрефш на бунаге, качественные реакция я биотесты.

Хрояатографярованке яфярной фракции проводили а системах растворителей: I - нэопропиловый спирт - аммишс - сода (12:1:1) и II - Ь%-я уксуекая кислота; этпла^агатной: III - нэопропнловыЯ* спирт - аммпак (8:2) и I - изопропиловый спирт - аммиак - вода (12:1:1); бутанольноВ: 1У - бутаноя - аегиак (10:7) и II - 5%-л уксусная кнслота ( для цятокиняноа ) и У - БУВ (4:1:5) и II -5%-я уксус кал кислота ( для фгнодьных коньсгатов ).

При хроматогр&фаровакяк в тонком слоа принаняли сияуфодовиа пгастаакя ит г254 с састеканя растворителей: для ауксинов: БУВ (24:10:10) ( Бзхпзр ы др., 1589 ); для цитокитшоа: хлороформ -катагсол (9:1) ( Цуаыаантоэ, 1937 ); для АВК: хпорофора - этил-ацетат - укеуекая кислота (ICÛ:IC!0:I) ( Еепгасвал и др., 1990 ).

Биозогпчоекая активность ауксииов определялась по методу Бояркша ( 1974 ), яепольэуа пзвикцу Цяроиовевая 809. Стандартность волеопталеЯ пгаххдо проаарялй па основании кривой распределения ( Драят», 1965 ).

Бйояогпчесиуп акпмйоеА габбвраялинов оцэняваля при помоги ■ йотода Иуроацева я АгететиховоЗ (1973) на проростках карликового гороха сорта Пионер; АЕК ± на тесте по прорастанию семян горчицм сарептской ( Николаева, Далфцкая/1963 ) и цитокинмнов с помощью амараитуе-теста ( Biddlngton, Thomas, 1973 )•

Содержание ауксинов я гяббераллмно» рассчитывали на основа» тая биологической активности.

Идентификацию м количественное определение цитокинкноа осуществлял! методом жидкостной хроматография ( Белинская м др., 1969; 1990) на системе приборов для ВЭХХ фирмы ькв (Швеция).

Определение содержания АБК проводили методом ВЭЯХ, используя регистрирующий интегратор фирмы ьщ е калибровкой по внешнему ставдарту, где расчет велся по типовым программам с учетом выхода я площади пик» веществ ( Белинская и др., 1990 /.

Содержанке феыольных соединения определяли епвктрофотометриче-ски ( Мастаков к др., 1971 ). Расчет содержания свободшх фанолышх соединения вели по кофейное, a феколышх коньвгагов - по хлорогено-вой кислотам.

Заражение ячменя гелмоштоспориозноЯ инфехциеЯ осуществляли в условиях светокультуры посредством опрыскивания еуспенэиеЯ кокя-дий в концентрации 5-8 тыс.срор/ыл воды н последующим содержанием растений во влажной к&мере в твчокае 43 час ( uirr ,1382 ), a также в результате опрыскивания цела растеинЯ ячменя культуралькоЯ жид-костьв ( опыты la ríro J в иакссзния ка отрезки листьев ячкекя кудьтуралыюй еидхост.и и es $рищхй в объеие, соотвбтствувден ICO tu ( опыты ir tí tro ) ( Афаиасенхо, I960 ).

Роль ЗЦДОГОШШХ U ЭКЗОГОНШХ OAS И КХ CUCCC2 В В&¥ОГСНЗ&0

гелыяштоспориоаа сцоюБи« по росту иицолкя грмЙа п.teres на сидкой С твердой средах S присутствии О па ЕСЦССГВ, ft TS£SC ПЭ XSpSS-твру поражения и спорообразования ( Hartly at al., I9US }.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЩДЕННЕ

I. Характеристика и особенности роста гриба H.teren.Pocr eu-целия гриба н.terco изучали на жидкой сродо Чапека до 40-дковкого возраста. В теченае первых 3-5 днеЗ наблюдался придошай роет гриба. До 20-ЗО-дневного возраста грвб активно рос, ваполкля весь объеу культуральноВ еидкости. При »той цаот кацелия игаснялся от белого к сероиу. К 40-дигвноцу возрасту гриба з&лыггавался рост к начинался лизис ыицегаи. В днншнке роста патогена ваделоно 4 периода, соответствующие 4-ы фаза» роста гриба ( рае. I ).

Первая ( латентная 1 - от прорастания *скидке до ускоренного роста мицелия. Она продолжалась 8-10 дней.

Вторая ( экспоненциальная ) характеризовалась наиболее быстром ростом и пропорциональный нарастанием кассы мицелия во вршзня ( 10-22 суток ). В третьей фазе замедленного роста ( 23-32 суток) отмечалось снижение скорости роста и накопления биомаесы гриба.

На четвертой заключительной фазе ( 33-40 суток 1 рост мицелия прекращался совсем. К концу ее наступало спорообразование.

Сходны* вид имела кривая учета массы сухого вецества в зависимости от возраста гриба H.tcrai ( см. ряс. I ).

I

14,0 12,0

10,0

8,0

6,0 4,0 2,0

0,4; 0,2

о

В

отя.ед

0,700

0,600

0,500 0,400

0,300

0,140 0,130

0,120 0,110

8 12 16 20 24

28 з£ Ж' Й

Воэраст, еут.

Рис. 1. Криви* роете гриба H.ttreano ветчине мает сухого (I) и емрого (2) вецества мицелия

-Ч

Y

Л

г

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 оо 38

Воараст.,сут.

Рис. 2. Содержание ауксинов (а) и гиббереллинов (б) в кулыуральноЯ жидкости гриба H.tar«a 7

Идентификация, состав и содержание физиологически активных вещедтв гриба H.terea. ФАВ изучали одновременно • культуральной жидкости и мицелии гриба по единой схеме. вклвчавцеЖ их обнаружение и идентификацию, определение состава и содержания в процессе роста н развития, т.е. в онтогенезе.

Ауксины. В эфирной фракции культуральной жидкости после двумерного разделения на бумаге i системах растворителей I и II било обнаружено 3 пятна, которые по флуоресценции, качественный реакциям и хроматографнческой подвижности отнесены с свободным ауксинам. Они стимулировали рост отрезков колеоптилей пгэиици на I3-I6S. В ихцелил гриба еыявл-но только одно соединение, соотастетвуЕчео по Rf ауксину I культуральной жидкости.

До 10-дновного возраста триба H.terts еукеша но обкарупо-, patia.ii образ«:, с&к и в период формирование конидий (35-40 суток). Основным компонентов Сило соединенно I, приеутствуагцге на всех остальних фазах роста гриба.

Соде^ж&ние ьухсииоз в культуральной жидкости, рассчитанное в мкг/экв.ИУК/л, невелико. Око us прогнало 0,163 кгг/осз.л. ш било максимальным в возрасто 20-22 суток ( ряс. 2 ). В мгцсляи гриба былп обнаружена следи ИУК.

Риббсредяиит;. В зтклгцстатнои иавлгчеши es культуральной жидкости и мицелия гряба Н.teres при хро^атографарованаи на бумаге в системах растворителей III п I обиаругсет еоотаотствешю 6 я 4 пятна, oTKQcaicii® по кошлокеу прлзнасов ( Вогхисц, Пыьчо-нко, 1973 ) ж свободз&а гиббереллинаа. Кокьвгьти гнббереллаков & н-бутанольнои экстракте отсутствовали. Вес сгободшз гкбборгилиш, кроме 1сцсстса <4, достовсрга стимулировали рост эпнеотйлс2 горохй сорта Пионер, иногда весьма еуцэствакмо ( tsa 53-1432

Состав габберелликов колебался от 3 коетопоктов ( совраст 10 суток ) до 5 ( кктсмсквньй рост к спороиозсгае ). Обspan компонентами для кяцолия к культуральной жидкости бия соединения 1,2,4 и 6, т.е. в основном слабо- н сильноподвгзша всцестса.

В то же время, содержание гнбберилликов в культуральной падкости, судя по биологической активности, достигало максимума о возрасте 22 суток ( в конце фааи интенсивного роста ) и превыгаво 0,7 мхг/экв.л. ПС , тогда как в осгальнмв периоды око практически не изменялось ( см. рис. 2 Гиббереллинм мицелия содержались

в ■

Рис. 3. Идентификация цитокииино» а кульгуральной жидкости (б) и мицелии (в) гриба нЛягвя по времени удержания на колонке; а - контроль; I - зеа1 нрибозид; 2 - изопвнтениладвнинрибоэид; 3 -зеатмн; 4 - цигидрозеатин; 5 - иао-пентениладенин

в следовых количествах.

Цитокииины. В объединение! н-бутанольной фракции культураль-ио! жидкости при равделении двумерным восходящим способом на бумаге в растворителях 1У и II выявлено & вецеств, которые по флуоресценции я совокупности хроматографкческнх данных бмли отиесвны щ цитокининаы. В н-бутанольном акетракте гриба присутствовало только одно соединение, тождественное цитокикяну I культуральиой жидкости,

Дальнвйиуг идентификация цитокининсв проводили методами тонкослойной и высокоэффективно! жидкостной хроматографии. Методом ТСХ с и сп оль 8 с рани ей метчиков были обнаружеш в культуральноЯ дидкое-ти зватин, аеатинрибозид, иаопентеннладенин с 0,1(0,3; 0,9 соответственно. Методом ВЗЮ по времени удерзшшя на колонке бил» в идентифицированы в дополнение к вышеописанным цятокякянам также

дигидроаватин и изопентекиледенинрибозид ( рис. 3 ). Наиболее выроненный пик прииздлекал веатинрябозяду как для культуралькоб еед-кости, так и мицелия. В мицелии обнаружено только 2 цзтокишша: веатинриб( ид и изопеитеннладенянрибозид.

Состав цитокишаюв увеличивался в процессе развития гриба. Гак, только I цитекннки ( веатинрябоенд ) обнаружен в 10- и 32-дневных культурах. Наиболее полны! набор ех ( четыре ) каблвдал-ся в период интенсивного роста гриба ( 20 суток ). В начале и конце развития гриба они не выявлены.

Максимальное содержание цнтокинянов в культуральио! жидкости, определенное с помощью ВЗЯХ, приходилось на 21-е сутки культи, вирования гриба и составляло 706,19 мкг/л ( ряс. 4 ). Основной вклад в суммарное содержание цх то кики ною го комплекса вносил аеа-тинрибозид, количество которого к втоку возрасту достигало 679,56 мкг/л;

В мицелии содержание ци то кики нов было иевкачитель»шм я достигало 0,393 мкг/л ( см. рис. 4 ).

Результаты определения содержания цитокининов с помоцьа биотеста давали картину, ся одну» с данными, получении« е яомоцм ВЭК. Однако содержание было ниже ( максимум 251,7 мкг/л ), что, по-видимому, евязано с неодинаково! активности) раашх компонентов к биотесту.

Абслизовая кислота. Для обнаружения АБК использовали ефирцув фракцию культуральной жидкости я мицелия гриба. С помаяьа метода

Возраст,cyr.

Рве, -4. Динамика накопления цхтоккнннов а культу-

Возраст, су».

Ряе. 5. Динамика накопления АБК в культурально* лад-кости CI) я «целик (2) гриба, 3) - бнотее»

II

тонкослойной хроматографии на пластинках 811иГ«1 ОТ-25* по положению нетчика определяли зону фятогормона (КГ 0,6 ). ДальнеЯщув идентификации АБК осуществляли е помощь» ВЭКХ по временя удержания на колонке, которое соответствовало 4,38 мин. для жультураль-ноЯ жидкости и 4,37 мин. для мицелия ( рис. 6 ).

Содержание АБК определяли методом жидкостной, хроматографии на колонке. Фитогормон не выл обнаружен.до 10-дневного вовраста. Наибольшее его количество ( 446 мхг/л ) достигало к 29-му дне культивирования гриба ( ряс. 6 ). Для мицелия характерно низкое содержание ДБК; в период с 21- по 32-е сутки роста гриба оно составляло 0,044 мхг/л,- 0,21 мкг/л. В другие периоды роста этот фитогормон отсутствовал ( см. рис. 5 ).

Данные по содержания АБК, полученные с помоцьв биотеста ( семена горчицы сарептекоЯ ) показывали сходшЯ характер накопления АБК грибом в культуре.

Таким образом, н.«вгм 1 процессе роста продуцировал значительное количество АБК, содержание которой, учитывая локальное накопление в тканях растения-хоаяина, может достигнуть больвой величины.

Еенольные соединения. Культуральнуо жидкость и ыицелиЯ гриба н.игеа анализировали на наличие фенольных соединения, для выделения и идентификации которых использовали эфирную м н-бута-нольную фракции. В кислой фракции эфирного экстракта иа культу-ральноЯ жидкости хроматографически ( на бумаге ) в системах растворителей I и II было показано присутствие 14 свободных фенольных соединения, тогда как в мицелии - только 3.

В н-бутанольно* фракции культуральноЯ жидкости гриба темя же методами выявлено 17 фенольных коньвгатов и 5 - в мицелии.

С помоцью качественных реакция, растворимости и хроматографе-ческоЯ подвижности на бумаге в системах растворителеЯ 1-У была доказана фенольная природа компонентов свободноЯ и коньвгирован-ноЯ фракция. Дальнейшее сравнение их свойств со своЯствами известии свободных и коньвгкрованных фенольных соединений высвкх растений показали их разный характер. Тем не менее их можно отнести к свободным фенолкарбоновым кислотам и их эфирам.

Состав свободных фенольных соединений сильно колеблется по фазам роета гриба. До т4-дневиого возраста они не были обнаруже-

ны в культур», а максималыаЛ набор их ( 12-13 компонентов ) достигал в период с 22 по 36-е сутки развития, т.е. в фазах замедленного роста н стационарной.

Что касаемся фамолиых конъвгагов, то они не выявлены до Ii-дневного возраста. Среди этих веществ обнаружен всего один компонент, присутствующий на всох фазах развития гриба. Наиболее шрота коыпонснтшЯ состав фенолышх кокьвгатов ( 7-8 соединена ) характерен для захлзчятзльпса стационарной фазы роста гриба ( 32-40 -о сутки ).

Q дянанакз БЦДЭЛС1КЯ свободных фснольних соединений било об-■ каруземо 2 еааскауаа: з 22- и <0-днэеном возрастах, содержание которых составляло соответственно 52, 18j 70,17 мг/л культурадь-еой "пдеосгз. Одг.:1 из иаксяаумов приходился па период наиболее пптегеяакого роета гр:гба, а ЕтороЗ - tsa период полного прскрз-цекяя роста кпцеляя ( ряс. 7 ),

Hircnxessta Еонызгирсзаккнх фигольпах соедииагетЗ насколько отгзчалось от даиайята глзоплггаа сгободг-ас СС. Било обнаружено 3 какегцука: пзргиЗ ( 17 д::сП ) праодатсл на ранний эт«л роста гряба, зторсЯ - г.а гоигц фаги шгге:!СИЕИого роста ггдцелня (23 дет ) п трзткЗ - па споронопаняе гряба ( дпсЗ ). ПоследшШ Lsascruya - кзаболса згичитглыкЗ, еотсроиу соответствовало со-дгргакяе 120,47 кг/л культурадькоЗ гядеосгз ( сз. рас. 7 ).

В цзлоа ко2::о огаатать, что диигйяга содерзания свободных £кюяъхих сосдинэгпЗ а ах кокьзгагэв с1од::д,н ockobi&s иакеэтгу-12J их накоплена соспздезт.

Слсдозатолько, соетаэ а содерхапзв QAB тееко связащ с фор-«яроезняеа гятцзпя п пиф^итхокных структур граба H.terea . На качавыих стадиях развитое рзгуляторы роста не саявленн, т.к., по-вядгасиу, эегэдетвяв ех гаэкого содерзания она полноегьп расходуйся а процессах рост?. гриба. В фазо кнтемеявиого роста патогена пзбыточкоэ полкчегтво ауксинов а фвиольких конъегатов ви-доляотея во впгзгэ среду, обаепечавая бгагеприятцуз экологическую няцу для гриба: октавацпэ и стабаяизацяэ продудяруслих ферментов ( Вольгаец и др., IS9I J, разнягчекке клеточных стенок растения в пряток пятатольках вецаетя в патогену ( ПэлесэП,. 1982 ). Иакеямальноа содержание гормонов отмечается в конце фазы интенсивного роета гряба, а замедленное н полное прекращение выделения ях в среду роста происходит на фоне резкого падения

4,57

4,39

4,37

\

l .6

5,79

Рис. 6. Идентификация АБК в мицелии (61 и в культу-раг.ьной жидкости гриба H.tcr*4> а - метчик АБК

м г/л

КО

120 IC0

5 80 i

а «»

о tf

s « 20

/

10 12 14 16 18 20 22 24 2b 28 30 32 34 96 38

Возраст, сут.

hic. 7. ;\инамяха накопления свободных (I) и коныпги-реванш* (2Î фенольных соединений в процессе роста грибя H.terea 14

уровня гормонов я прогресоярувдего накопления ингибиторов ( АБК п фенолмох соединений )'

Определенна патогенныйtw^Cf» отдельных ДрмспиИ культура-льной жидкости ГС.tarn«. Сначала определяли характер поражения ячменя суспензй! спор в искусственных условиях. Признает болезни на листьях проявились через 3-5 дкеЗ. При этоы листья устойчивого сорта Км П92 поражалась слабо ( 1-1,5 балла ): отмечались то-чечше неярозн без хлорозного окруаеняя. Листья ячменя сортов Ведя и ЗаяерсккЗ бияя похрита теккньга пятнана э виде итрюсов, окаймленных хлорозкоЯ тяакья ( 3-4 балла ).

В опытах la rltra патогеикыэ свойства культуральноЗ жидкости граба аеелздопалп на отрезках лястьеа ячменя. В целом получили еходяуэ картину яая и пря аараяекан растения спорами, однако псрамкав оказалось зк&чнтедько слабев у всех трех сортов. Ездкко, ото евгиако с тем, что в яультуральней кядкостя пойж-о асцоета, изеуцях патогекиуэ кагруаку, содерзатся и проткводеЗет-вуЕ^аа па кошокэктм ( вгянокислота, белкя, вятакинн м др. ).

Для пыяеиэюш роли SAB гряба ПЛегоа в патогенезе ячменя из культуральноЛ ейдкосгн кзделялн отдельное фракцаи, которная действовали ¡'.а отрезки дястьвв гсагяя. Характер и степень пора-явная вавяеала нэ только от природа эветрацвлетлярных веществ, но я от возраста гриба. Мэяекмзльноо пораяэкяе ткансЯ ячменя шзнважи компоненты в-бутаиолькоЗ фраяцки, содержащей цктостнн-kj и фэиольнза вокызгаги в еозраете 15, 22 я 30 суток, я налови-кали характер порззекня спорает гриба. В иеньвеЗ степени нвду-цароваля пораденяе всдества этйлоцетатвоЯ фракции { гябберелла-121 ) о возрасте 22 дкеЗ, кокпошнты афзрной фракция ( ауксины ) практически нэ сшивали признаков гелькзнтоспориоза.

Изучение родя экзогенных 5Aß в патогенезе гольминтоспорио-за ячменя. В дальнейшем к отдельным фракциям культуральной жид-иостн гриба добавляла SAB в той iun виой комбинации и деЯетвова-ли на отрезки листьев ячменя. Добавление и эфирной фракции НУК ( ГО-6- 10 U ), АБК ( Ю-4« ) я п-кувлровоа кислоты ( 10 мг/л) не измедло степени поражения.

Совместное внесение гибберелловов кислоты ( 10 - 10~°Ы ) и »тилацетатной фракции усиливало степень поражения листьев в сторону увеличения кекрова.

Однако наиболее сильное заболевание вызывали компоненты н-бутанольиой фракции совместно с цитокининаым ( 10'^- 10" II ). При атом степень пор&кедая возрастала с 2-2,5 до 3-4 баллов, а пораженный участок закивал практически во поверхность отрезка листа в виде ярко вырешенного покрова

В то же время внесение свободных фенольшх соединений снижало патогенность бутаиолыгай фракции. При внесении хе комбинации ФАВ: п-кумаровой кислоты, эсатина и ааатенрябозида признаков заболевания не было обнаружено совсси. Такое дгйетглв экзогенных фенольных соединений можно было ожидать, т.к. она на тоздостввн-ки эндогенным фенолам гриба, обнаруженным в культуральной жидкости к, согласно ииевсршся литературно дагзаы (Ecalbhaslüarea о.а 1963 ), внполшшт в растошшх зецитцуп роль, т.е. подавляв? развитие инфекции.

Наряду с опытами la vitro роль окзогегавзх О AB в патогенезе гелыяштоспориоэа изучали н па цешх растениях ячшня. Действие pasim веществ я юс екесоЗ гл проявлена® болезни было пводккхго-вым. Наиболее выраженное влиякя® оказталн свободны«! ( фзруловая и кофейная кислоты ) »г коиьюгировамшэ ( хлорогеновал кислота ) феиолькыв соединения. Ош^каадое в отдельности ( концентрация

усиливали признаки поражения ячысия в ускоряли кх проявление на всех исследуешх сортах ячменя ' 2-3 балла ). При внесении же комплекса фанолышх соединений поршшяе было более ' сильным ( 4 балла ), быстрым { ta 3-4-й день ) и всеобщи».

Совместное внесение цитокякинов в фенолькых соединений ускоряло и усиливало проявление болезни на растениях всех сортов, но в иенызей степени, чем в предвдущеа случае. Заболевание проявлялось раньие, чем в контролышх растениях, одкахо листья долгое время оставались зеленшля.

Сходное влияние на течете гельмингоспориоза ячменя оказывала смесь ГКд с цитохикннами, однако степень м скорость поражения растений снижалась ( до 60-70Í ).

Комбинация ИУК, АБК к фенольдох соединений вызывала хиш> слабое поражение растений восприимчивых сортов.

Следовательно, экзогенные фенолыше соединения и цитокикиш способ», усиливать развитие гельмкнтоспориоза ячменя в опытах tüTltr« и la rir» , тогда как другие i AB были менее активны

или совсем не оказывали влияния на развитие болезни.

Влияние экзогенных физиологически активных веществ на iioct гриба н.tarea, Влияние ®АВ на рост гриба выясняли на твердой и жидкой средах. Наиболее активными соединениями на агариэоланиой среде были цитокинины и фенольные соединения, причем они оказывали на рост мицелия гриба и спороношенно противоположное действие. Если цитокинины в концентрациях 0,01-1 иг/л активизировали рост мицелия и задеряивали или даже прекращали спорообразование, то фенольные соединения (хлорогеиовал, феруловая и кофейная кислоты) в концентрациях I-TC0 ыг/л и ЛЕК ( 0,01-1,0 ыг/л ) ингиби-ровали рост мицелия и ускоряли спорообразование на 3-4 суток. В контроле оно наступало на 6-ые сутки.

Существенным образом отличалось и качество споровой продукции гриба. Споры, сформированные под влиянием фенольннх соединений и /БК, характеризовались более крутыми размерами, повшен-ноЯ жизнеспособностью и вирулентностьв. Заражение такими спорами ячменя сорта Зазерский сшивало бо^83 сильное г.орадение растения на 3-4-е сутки, в то враля как спорн из других вариантов - только на 6-7-0 сутки поело инокуляции.

КУК и ГК в испытуемых концентрациях практически не оказывали влияния на рост мицелия н спорообразование гриба.

Примерно такая яе картина сохранялась по накоплении массы мицелия при вырацивании гриба на жидкой среде, но выражена значительно слабее.

Таким образец, приведенные данше хорошо согласуйся с результатами определения содержания АЕК, фенольных соединения и питомников в культуральной жидкости гриба п. temo-Ее-»и накопление питокинннов отаечмось в фазе интенсивного роста гриба, то основной максимум с содержании свободных и конъвгированяш фенольных соединения и высокий уровень АБК приходится на период спорообразования.

вывода

I. Впервые выделен* и иденпфптированн из культуральной жидкости и .'.целия гриба Uelaintbosporlun tor«o See«, комплексным методом ауксины, гиббереллины, абсцизиш и фенольные соединения. Ауксины, гнббереллины и абецкзины обнаружены > свободной, а пито-

кинины и фенольные соединения в свободной и коныогированной формах .

2. С.помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии по времени удержаний на Колонке и хроматографирования с метчиками

на бумаге идентифицированы среди цитокининов гриба зеатин, зеатин-рибозид, дигидрозеатин, изопентениладенин и его рибозид, а среди абсцизинов - АБК. 3 ауксиновом комплексе выявлено три компонента) в гиббереллиновом - 6 компонентов и в фенольном - 31 индивидуальное соединение. Установлено, что фенольные соедииения гриба отличаются по структуре от фенольных соединений ячменя, т.е. являются для растения-хозяина чужеродными.

3. Показана изменчивость состава ФАВ в процессе роста гриба. До 10-дневного возраста они не обнаружены в мицелии и культуральной жидкости, в фазе интенсивного роста мицелия выявлены преимущественно ауксины, гнббереллины и цитокинины, & в фазах замедленного роста и заключительной (стационарной) - главным образом АБК и фенольные соединения.

4, Установлено, что максимальное накопление ауксинов, гиббе-реллинов и цитокининов в культуральной жидкости гриба Н. tere* приходится на завершающий период интенсивного роста мицелия и достигает соответственно 0,161; 0,720; 705 мкг/л. Самый высокий уровень абсцизовой кислоты и фенольных со динений наблюдается в период полного прекращения роста гриба и составляет соответственно 440 мкг/л И 120 мг/л. На всех фазах роста H.terea ФАВ в мицелии либо отсутствует, либо их содержание было на 1-2 порядка ниже, чем в культуральной жидкости; что, по-видимому, характерно для фитопатогенных грибов.

5, Обнаружено, что культуральная жидкость гриба, ее отдельные фракции и комбинации их с ФАВ способны поражать растения ячменя в опытах in Tltro. Hin riro. Функции факторов усиления па-тогенности выполняют в основном цитокинины и коньюгированные фенольные соединения. Ауксины, гиббереллиш и свободные фенольные соединения не оказывают прямого влияния на степень поражения растений гельминтослориозом.

Б. Экзогенные ФАЗ в эндогенной или близкой к ней концентрациях оказывают разное влияние на рост мицелия и спорообразование rj-иба НДвгм Дитокин- ш сильно стимулируют рост мицелия гриба

и полностью иди в значительной мере задерживают спорообразование. АБК и особенно фенольные соединения ингибируют рост шщелия, заметно ускоряют спорообразование и повышают патогенную активность спор патогена. Ауксина и гиббереллины не оказывают существенного влияния на эти процессы.

7. Знание SAB фитопатогенного гриба H.tere«H роли их в развитии ьяцелия и формировании инфекционных структур могут служить основой для направленного регулирования взаимоотношений растения-хозяина и патогена, с целью снижения вредоносности последнего и получения высококачественного спорового материала для использования в селекции на устойчивость ячменя к гельминтоспориозу.

СШССК РАБОТ .ОПУЕХИКОВАНКЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волынеп А.П., Пяеничная I.A., Афанасьева Н.В. Физиологически активные вещества гельминтоспориозных грибов.// Сб. Физио-лого-биохкмические основы июунитета растений к грибным болезням. Уфа.- 1988,- C.I3.

2. Волынец А.П., Афанасьева Н.В. Цитокинини футспатогенного гряба Я.tarea.// ДАН БССР.- I9S9.- Г.ЗЗ, Ш.- С. 744-746.

3. Валынец А.П., Афанасьева Н.В. Абсцызовая к1слота як иаг-msáu 1вдуктар латагенвзу.// Becql АН БССР. Сер.б1ял.н.- 1990.-С. 28-30.

4. Афанасьева Н.В., Валынец А.П., Абухов1ч Я.М. 31з!ялаг1ч-на ахтыутая рэчывы ф1талатагеннага грибу H.teree.// Becul АН БССР. Сер.б1ял.н.- 1990.- 56.

5.Волынец А.П., Афанасьева Н.В. Эндогенные регуляторы роста гриба.// Тез. докл. II съезда Всес. общества физиологов растений (24-29 сент. 1990 г.), Минск.- С. 21.

Подппсшэ в BS&IB ЛМЗ'АОс&вз.г 60x841/16 ■Умчая-л 0„ дЪ. Тираж /00 ааЗаказ ШШ Госзасванятава Saasa Беларусь.