Физико-химические и биологические свойства матрикса на основе бактериального полимера для биоискусственных органов и тканей

Егорова, Валентина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические и биологические свойства матрикса на основе бактериального полимера для биоискусственных органов и тканей
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические и биологические свойства матрикса на основе бактериального полимера для биоискусственных органов и тканей"

На правах рукописи

УДК 577.3

ЕГОРОВА ВАЛЕНТИНА АЛЕКСАНДРОВНА

Физико-химические и биологические свойства матрикса на основе бактериального полимера для биоискусственных органов и тканей

03.00.02. - биофизика 14.00.41 - трансплантология и искусственные органы

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре Физики живых систем МФТИ, в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ «Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов» Росздрава.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Виктор Иванович Севастьянов доктор медицинских наук, профессор Нина Андреевна Онищенко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

Скалецкий Николай Николаевич

кандидат физико-математических наук, доцент

Перевозчиков Николай Филиппович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Защита состоитсяЭ2$2005 г. вТ&час.РАтн. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук

В.Е. Брагин

¿СОЬ-Ч

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Трансплантация стволовых клеток, а также дифференцированных клеток органов и тканей является наиболее перспективным направлением в современной трансплантологии и обещает стать мощным инструментом в лечении разнообразных заболеваний. Актуальной остается разработка технологий, позволяющих прицельно доставлять жизнеспособные клетки в патологический очаг, удерживать их там и создавать им условия для нормального функционирования. Ряд протоколов предписывает введение суспензии клеток в кровяное русло или в очаг поражения. Данные методики имеют ряд ограничений и недостатков, наиболее существенными из которых являются сложность контроля локализации клеток в месте повреждения и их низкая жизнеспособность. Трансплантация клеток на биостабильных или биоде^радируемых имплантатах-носителях (матриксах, каркасах) может существенно повысить эффективность данного способа восстановления функций жизненно важных органов и тканей.

Имплантируемые матриксы с иммобилизованными клетками, имитирующие структуры и функции нативных биологических структур, стали называть биоискусственными (гибридными) органами и тканями.

Одной из ключевых проблем в создании биоискусственных органов и тканей является разработка двухмерных (пленочных) и трехмерных (губки, гели) матриксов. Существенным недостатком известных по открытой печати зарубежных матриксов (Ое{£гаРо1/Ыс® - композит полиоксиалканоатов с полиуретанами, У1сп1™ - сополимер молочной и гликолевой кислот, синтетический гетерогенный гель №игоце1™ - полимер [1Ч-(2-гидроксипропил)-метакриламида], РигаМайх™ на основе олигопептидных фрагментов) является то, что они полностью или частично состоят из синтетических полимерных материалов. Это, несомненно, отрицательно влияет на их биологическую безопасность, увеличивает вероятность образования рубцовых тканей и опухолей, что и сдерживает их внедрение в клиническую практику.

Наибольший интерес для разработки биоискусственных систем представляют полимеры природного происхождения и их производные: альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры бактериального происхождения. Многие биополимеры, обладая высокой биосовместимостью, являются также и высокоэффективными биостимуляторами. При имплантации они расщепляются на более простые соединения, которые выводятся из организма либо принимают активное участие в метаболизме на клеточном уровне.

Одними из перспективных полимеров медицинского назначения являются полиэфиры бактериального происхождения:, гомополимеры Р-оксимасляной кислоты (полиоксибутират) и оксийктановой кислоты, а также

двухкомпонентные сополимеры (3-оксибутирата и Р-оксивалерата, обладающие термопластичностью и биодеградируемостью, а также широким набором физико-химических и физико-механических свойств. Область применения бактериальных полимерных материалов для медико-биологических целей включает изготовление шовных и перевязочных материалов, биосовместимых покрытий для имплантатов, контролируемых систем доставки лекарственных веществ и др.

Известны единичные попытки использования бактериальных полимеров в качестве носителей для культивирования и трансплантации клеток органов и тканей. Однако полиоксибутират и его сополимеры относятся к гидрофобным материалам, что отрицательно влияет на прикрепление и пролиферацию клеток. Кроме того, общеизвестными недостатками образцов гомополимера и сополимеров являются хрупкость и недостаточная эластичность, существенно ограничивающие их применение.

Нами было высказано предположение, что введение в состав бактериального полимера высокомолекулярного гидрофильного агента улучшит механические свойства и повысит гидрофильность материала без ухудшения биосовместимых свойств биополимера.

Цель работы

Целью работы является разработка и исследование физико-химических и биологических свойств биодеградируемого матрикса на основе бактериального полимера для трансплантации клеток.

Основные задачи работы

Исходя из поставленной цели, задачи работы сводились к следующему:

1. Разработка технологии получения пленочного биодеградируемого матрикса;

2. Исследование физико-химических свойств матрикса;

3. Доказательство биосовместимости матрикса в соответствии с межгосударственными стандартами ГОСТ Р ИСО 10 993;

4. Исследование в условиях in vitro влияния матрикса на процессы прикрепления и пролиферации культур фибробластов и стволовых клеток животных;

5. Доказательство возможности применения матрикса для восстановительной клеточной терапии в экспериментальных моделях на животных.

Научная новизна разработки

1. Разработан биополимерный пленочный матрикс, состоящий из бактериального сополимера и высокомолекулярного гидрофильного пластификатора. Матрикс получил название ЭластоПОБ.

2. Установлено наличие водородных связей между молекулами сополимера и пластификатора, что приводит к увеличению эластичности матрикса.

3. В экспериментах in vitro и in vivo доказана высокая биосовместимость лабораторных образцов ЭластоПОБ.

4. В экспериментальных моделях на животных продемонстрирована эффективность применения матрикса для восстановительной клеточной терапии.

Практическая значимость

Назначение матрикса

- Субстрат, выполняющий функции подложки и питательной среды, для культивирования клеток тканей человека и животных в условиях in vitro-,

- Имплантируемый биодеградируемый матрикс для биоискусственных органов и тканей, временно выполняющий функции каркаса и питательной среды для клеток тканей различной природы (стволовые клетки, кардиомиоциты, нервные клетки, гепатоциты, хондроциты, р-клетки, фибробласты и др.).

Возможная область применения

Приоритетной областью применения пленочного биодеградируемого матрикса на основе полимера бактериального происхождения является использование его для культивирования стволовых и преддиференцированных клеток с последующей трансплантацией.

Апробаиня работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на межинститутских семинарах Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов (2003, 2004, 2005 гг.); Российском научно-техническом семинаре по биоматериалам IX научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника» 18-24 сентября 2004, Судак, Украина; 1-м Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века», 12-15 апреля 2005 г., Москва; ХП-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», 18-22 апреля 2005, Москва.

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 7 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключение и выводы.

Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков, 16 таблиц, список литературы из 181 наименования, из них 30 российских и 151 иностранное.

Содержание работы Материалы и методы исследования

1. Материалы и реагенты для изготовления матрикса

Основным компонентом разрабатываемого матрикса был высокоочшценный двухкомпонентный сополимер Р-оксибутирата и p-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ) с долей оксивалерата 20+30 мол. %, полученный в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики Сибирского отделения РАН (зав. лаб. д.б.н., проф. Т.Г. Волова). Полимеры синтезированы бактериями Ralstonia eutropha В5786 в автотрофных стерильных условиях роста. Молекулярная масса ПОБ-со-ПОВ, ММ = 295 000-360 000 Да, кристалличность 50-60%.

Вторым компонентом матрикса являлся высокомолекулярный гидрофильный пластификатор (ВГП) - полиэтиленгликоль (ПЭГ). ММ = 2000 Да (Merck, Германия).

В качестве растворителя был выбран метилен хлорид (дихлорметан, СН2С12) ОСЧ (Синтактон, Россия).

2. Методы оценки физико-химических свойств образцов матриксов

2.1. Метод сканирующей электронной микроскопии

Для исследования морфологии поверхности образцов матриксов использовали сканирующий электронный микроскоп JSM Т-330 (JEOL, Япония).

2.2. Метод атомно-силовой микроскопии

Шероховатость поверхности образцов исследовали совместно с лабораторией ксенотрансплантации ФГУ НИИТиИО (зав. лаб., д.б.н., проф. А.Г. Тоневицкий) с применением метода атомно-силовой микроскопии. Измерения проводили на зондовом микроскопе Solver Р47Н (NT-MDT, Москва).

2.3. Метод Фурье-ИК спектроскопии многократно нарушенного полного внутреннего отражения

ИК спектры образцов матриксов получали с применением Фурье-ИК спектрометра "Perkin-Elmer 1720 X" (США) в диапазоне от 4000 до 400 см'1.

2.4. Метод контактного угла смачивания для определения гидрофильности поверхности матриксов

Для определения изменения степени гидрофильности поверхности пленочных образцов исследуемых матриксов использовали метод контактного угла смачивания.

2.5. Метод исследования физико-механических свойств матриксов

Физико-механические свойства исследуемых образцов матриксов изучали в Институте биофизики Сибирского отделения РАН на приборе Instron 1122.

2.6. Спектрофотометрический метод регистрации высвобождения высокомолекулярного гидрофильного пластификатора

Высвобождение высокомолекулярного гидрофильного пластификатора (ВГП) из полученных образцов пленочных матриксов в плазму крови человека проводили с использованием спектрофотометра "Cecil СЕ 5502" (Великобритания). В качестве маркера высвобождения использовали шиконин (Calbiochem®, Merck, Германия) (0.01% от веса полимера).

3. Методы оценки медико-биологических свойств матриксов

Медико-биологические свойства образцов матриксов на основе сополимера ПОБ-со-ПОВ исследовали совместно с сотрудниками Испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий (зав. лаб. д.б.н. Н.В. Перова) Центра по исследованию биоматериалов (руководитель д.б.н., проф. В.И. Севастьянов) в соответствии с национальными стандартами ГОСТ Р ИСО 10993.5-99 и ГФ-Х1.

Подготовка образцов матриксов к исследованиям

Исследованиям подвергали пленки на основе ПОБ-со-ПОВ и полученные из них экстракты. Экстракты готовили, помещая образцы матрикса в экстрагирующие среды (физиологический раствор, фосфатный буфер, бидистиллированная вода, культуральная среда) из расчета 3 см2 образца на 1 мл жидкости. Затем инкубировали при 37° С в течение 72 ч. В качестве контроля использовали экстрагирующий раствор. Для каждого образца матрикса (не менее 3-х образцов из партии) готовили по 3 экстракта.

3.1. Санитарно-химические испытания предполагают исследования свойств экстрактов, приготовленных из изделия, и позволяют определить выход в экстракт непредельных продуктов деструкции материалов, входящих в состав матриксов. Вытяжки анализировали методами рН-метрии и ультрафиолетовой спектроскопии. Контролем служил раствор фосфатного буфера (NaCl - 8.3 г/л; NaH2P04 -2Н20 - 0.528 г/л; Na2HP0412H20 - 5.993 г/л, pH 7.4).

3.2. Медико-биологические исследования Токсикологические испытания

3.2.1. Испытания в условиях in vitro

Цитотоксичность образцов матриксов оценивали по результатам теста «Семя крупного рогатого скота», а также на фибробластах мыши линии L929.

Гемолитическое действие экстракта было проверено на изолированных эритроцитах человека.

3.2.2. Испытания в условиях in vivo

Раздражающий эффект, реакции общей анафилаксии и сенсибилизирующее действие образцов матриксов оценивали на кроликах, морских свинках и белых крысах соответственно.

Испытания на пирогенность

Пирогенность образцов исследовали на кроликах согласно ГФ-Х1 (Государственная Фармакопея, 1987).

Испытания на стерильность

Испытания на стерильность образцов матриксов производились согласно ГФ-XI методом прямого посева на тиогликолевую среду и среду Сабуро.

3 J Исследование гемосовместимых свойств

3.3.1 Количество и морфология адгезированных тромбоцитов

Количество и морфологию адгезированных на поверхности образцов тромбоцитов изучали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ, Jeol Т-330, Япония).

Количественными параметрами метода были: 1) относительный показатель адгезированных тромбоцитов (ОПАТ), характеризующий общее количество тромбоцитов, адгезированных на исследуемой поверхности; 2) относительный показатель адгезированных тромбоцитов для каждого из четырех классов клеток 1 - не активированные, без признаков распластывания и псевдоподий, 2 - клетки с псевдоподиями, 3 - полностью распластанные, 4 - агрегаты. (ОПАТф, i = 1, 2, 3, 4). Значения ОПАТ и ОПАТ(1) вычисляли относительно поверхности полиэтилена низкой плотности (ПЭНП) по формулам:

2^0бр Jyj обр

ОПАТ =------; ОПАТ(1) =------------------, (i = 1,2,3,4)

Nrowi N,roHn х ОПАТ

где №6р и Nn3Hn - количество клеток на поверхности образцов ЭластоНОЪ™ или ПОБ-со-ПОВ и ПЭНП, соответственно.

3.3.2 Спектрофотометрический метод определения степени активации системы комплемента

Спектрофотометрический метод определения степени активации системы комплемента поверхностью материала заключается в регистрации изменения суммарной активности комплемента после контакта сыворотки крови человека с исследуемым образцом. Количественными критериями метода являются: константа скорости индуцированной активации системы комплемента (¿ИНД1 см" V1) и относительная константа скорости индуцированной активации системы комплемента (А^щщ):

1п(тобр1/2/т1/2) ^

— . ¡¿Л*

ИНД j л ИНД 5

St ¿ст

л ИНД

где To6pi/2, Ti/2 - время полулизиса эритроцитов барана комплементом сыворотки после инкубации с образцом и в контрольной кювете (без образца) соответственно, выраженное в с; S - площадь поверхности образца в см2; t -время инкубации, с; ¿"^„щ,, k"¡im - константы скорости индуцированной активации системы комплемента исследуемого образца и стандарта, соответственно. В качестве стандарта использовали купрофан.

4. Методы исследования биологической функциональности матриксов in vitro и in vivo

Оценку биологической функциональности образцов пленочных матриксов в условиях in vitro и in vivo проводили совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии стволовых клеток ФГУ НИИТиИО (зав. лаб. д.м.н., проф. H.A. Онюценко).

4.1. Культивирование стволовых клеток костного мозга крыс на образце матрикса

Забор клеток костного мозга крыс породы Вистар для получения мезе нхимальных стволовых клеток (МСК) и затем из них фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток (ФМСК) с последующим их культивированием выполняли в лаборатории биотехнологии стволовых клеток ФГУ НИИТиИО.

Стерильный образец матрикса помещали на дно чашки Петри из полистирола с культуральной средой, ФМСК засевали из расчета ~5х103 клеток/см2. В качестве контроля использовали такие же чашки Петри из полистирола (Corning-Costar, США). Визуальный контроль проводили ежедневно с использованием фазово-контрастной микроскопии (Nikon, Япония).

4.2. Оценка роста и распластывания фибробластов мыши линии L929 на поверхности матрикса с использованием метода конфокальной микроскопии

Количество и морфологию культивируемых на поверхности матриксов фибробластов мыши линии L929 проводили с использованием конфокального микроскопа ConfoScan3 (Nidek Technologies, Италия). Подсчитывали количество и площадь объектов с помощью программы NAVIS Cell Count для ConfoScan3.

4.3. Экспериментальные модели in vivo механических повреждений скелетной мышцы крыс и глубоких ожоговых ран

Для оценки эффективности использования пленочных матриксов на основе ПОБ-со-ПОВ в восстановительной клеточной терапии было разработано две экспериментальные модели in vivo: механических повреждений скелетной мышцы и глубоких ожоговых ран крыс.

Экспериментальная модель механических повреждений скелетной мышцы крыс

Работа выполнена на 20 крысах породы Вистар массой 250-300 г. Животные были разделены на 4 группы. Животным 1-й группы (5 крыс) производили имплантацию пленочного образца матрикса (далее - «пленки») на неповрежденные грудные мышцы. Во II-й группе производили имплантацию пленок на поврежденные (резецированные) участки грудных мышц (5 крыс). В Ш-й (5 крыс) и IV-й группах (5 крыс) на поврежденные грудные мышцы справа и слева от грудины имплантировали пленки с иммобилизованными мезенхимальными клетками костного мозга. Различие между III -й и IV -й группами состояло в том, что в IV -й группе мезенхимальные клетки дополнительно обрабатывали 5-азацитидином, способствующим дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток в миогенном направлении.

Биопсию мышц и прилегающих к ним пленок осуществляли через 4 недели после трансплантации.

Гистологические срезы биоптатов окрашивали гематоксилином и эозином. Оценивали характер и выраженность воспалительной и репаративной реакции в поврежденной и неповрежденной мышечной ткани. В процессе подготовки гистологических препаратов применяли хлороформ, вследствие этого мембраны растворялись, и на микропрепаратах в местах их прежней локализации визуализировались щелевидные полости.

Экспериментальная модель глубоких ожоговых ран

Глубокий термический ожог кожи моделировали на 35 крысах-самцах линии Вистар массой 300 - 350 г. Под эфирным наркозом у животных создавали ожог прикладыванием к коже металлической пластинки, через которую циркулировала вода, нагретая до 91.1° С. Время экспозиции пластины через влажную салфетку 8 с.

Животные были разделены на 3 группы: I - крысы с глубоким термическим ожогом и трансплантацией аллогенных ФМСК в виде клеточной суспензии (10 крыс), II - трансплантацией аллогенных ФМСК, иммобилизованных на матриксах (10 крыс), III - крысы с глубоким термическим ожогом без применения клеточной терапии (10 крыс, контрольная группа - спонтанная регенерация). В отдельную группу (5 крыс) вошли животные, на которых были отработаны оптимальные условия ведения ожоговых ран под матриксом с иммобилизованными ФМСК.

Контроль эффективности клеточной терапии осуществляли визуально, планиметрическим, гистологическим и гистохимическим методами на 1, 3, 7, 15 и 30 сутки после трансплантации клеток на ожоговую поверхность.

Для морфологического исследования процессов заживления ран, брали биоптаты из зоны ожогового повреждения в указанные сроки и готовили криостатные срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

Материалы и клеточные объекты

Получение ФМСК костного мозга крыс осуществляли в соответствии с методикой, описанной в п. 4.1. Культивирование стволовых клеток костного мозга крыс на образце матрикса in vitro.

Идентификацию трансплантированных клеток в биоптатах осуществляли с помощью рекомбинантного делецированного аденовируса, содержащего ген LacZ из E.Coli, который продуцирует бактериальную ß-галакгозидазу в живой клетке.

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Microsoft Exel. Находили средние значения вариант и среднеквадратичные отклонения. Достоверность различий определяли, используя критерий t- Стьюдента с уровнем значимости 0.05 и 0.01.

Результаты

1. Состав и методика изготовления двухмерного эластичного биодеградируемого полимерного материала на основе бактериальных полимеров

1.1. Приготовление эластичных пленок

Образцы матриксов были изготовлены в лабораторных условиях в Центре по исследованию биоматериалов методом полива из 1% раствора сополимера ПОБ-со-ПОВ с различными добавками ВГП в метилен хлориде на чашки Петри. Полученные матриксы сушили при комнатной температуре в вакуумном шкафу. Все исследуемые матриксы имели вид пленок толщиной 70-80 мкм.

В качестве пластификаторов были апробированы следующие хорошо известные биосовместимые соединения: полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилпирролидон (ПВП), плюроник F-127, плюроник F-68. Добавление ПВП в состав матрикса приводило к получению жестких, хрупких и непрозрачных пленок. Плюроник F-127 и плюроник F-68 являются сополимерами поли(этилен оксида) и поли(пропилен оксида) и менее гидрофильными соединениями, чем ПЭГ. По результатам сравнительного анализа в качестве гидрофильного агента был выбран ПЭГ.

Концентрацию ПЭГ в пленках варьировали от 10% до 50% от веса полимера с шагом 10%. Пленки, содержащие 30% и 50% ПЭГ оказались очень хрупкими, поэтому для дальнейших исследований были выбраны композиции, содержащие 10% и 20% ПЭГ.

Результаты исследования высвобождения ПЭГ в плазму крови человека показали, что образец матрикса, содержащий 20 вес.%, дольше сохраняет эластичные и гидрофильные свойства, по-видимому, за счет связывания ПЭГ молекулами сополимера.

Пленка ПОБ-со-ПОВ, содержащая 10% ПЭГ, по гидрофильности практически не отличась от пленки из исходного сополимера, контактные углы смачивания равны 84.3 ± 1.7 и 85.6 ± 0.6, соответственно. Предварительные эксперименты по культивированию стволовых клеток костного мозга крысы на поверхности пленок из исходного сополимера, ПОБ-со-ПОВ с 10% ПЭГ и ПОБ-со-ПОВ с 20% ПЭГ показали, что на поверхности пленки, содержащей 20% ПЭГ, количество адгезированных клеток выше, чем на исходном сополимере, без добавления пластификатора и пленке, содержащей 10% ПЭГ.

Таким образом, на основании полученных результатов, для дальнейших исследований был выбран образец, представляющий собой прозрачную пленку на основе высокоочищенного сополимера полиоксибутирата и оксивалерата с включением оксивалерата 20+30 мол.% и высокомолекулярного гидрофильного пластификатора - ПЭГ, 20% от веса сополимера.

Рисунок 1. Стерильный образец ЭластоПОБ.

Введение ПЭГ в объем бактериального сополимера позволило повысить гидрофильность образцов. Значения контактного угла смачивания по воде уменьшились с 85.6 ± 0.6 до 75.2 ± 0.8 по сравнению с образцами из сополимера ПОБ-со-ПОВ. Исследование эластичных свойств пленки показало, что модуль Юнга снизился с 0.7 ГПа до 0.6 ГПа. Пленочный матрикс получил название ЭластоПОБ (Рис. 1). При проведении всех дальнейших экспериментов одновременно исследовали пленки из исходного сополимера ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ одинаковой толщины и изготовленные из одной партии сополимера.

2. Морфология и физико-химические свойства ЭластоПОБ

Морфология ЭластоПОБ

Сканирующая электронная микроскопия

Электронномикроскопические исследования не выявили различий в структуре поверхности ЭластоПОБ и сополимера ПОБ-со-ПОВ (Рис. 2).

Рисунок 2. Микрофотографии поверхностей: А - ПОБ-со-ПОВ; Б - ЭластоПОБ. Маркер - 5 мкм. Сканирующий электронный микроскоп Т-330 (ШОЬ, Япония).

Атомно-силовая микроскопия

АСМ-анализ поверхности ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ показал, что данные образцы отличаются шероховатостью поверхности. Шероховатость поверхности ЭластоПОБ составляет 53.76 ± 2.68 нм, это ниже, чем у исходного сополимера (82.37 ±4.11 нм). Известно, что на поверхность гомогенного ПОБ и его сополимеров клетки адгезируют плохо. Это объясняют гидрофобностью поверхности полимеров. Однако перед посевом рекомендуется проинкубировать образцы в дистиллированной воде или культуральной среде, что влияет на прикрепление клеточных культур. АСМ-анализ поверхности исходного ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ на воздухе и после инкубации в течение 1 часа в дистиллированной воде и культуральной среде показал, что после инкубации образцов ЭластоПОБ в дистиллированной воде шероховатость поверхности становится равной 13.50 ± 0.67 нм, что сопоставимо с шероховатостью традиционно используемого для культивирования клеток полистирола - 15 нм. Шероховатость же исходного ПОБ-со-ПОВ остается достаточно высокой и равной 50.67 ± 2.53 нм. Инкубация образцов ЭластоПОБ в культуральной среде уменьшает шероховатость с 53.76 ± 2.68 нм до 9.30 ± 0.46 нм. Инкубация матрикса в дистиллированной воде или культуральной среде приводит, таким образом, к снижению шероховатости субстрата, что изменяет характер взаимодействия с клеточными культурами, в частности, способствует адгезии клеток.

Результаты исследования структуры методом ИК-спектроскопии МШшО

На рисунке 3 представлены ИК-спектры МНПВО исходного сополимера ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ. Видно, что в обоих спектрах присутствуют интенсивная линия поглощения с максимумом вблизи 1720 см"', отвечающая карбоксильным группам (-С=0-) в сополимере ПОБ-со-ПОВ. В исходном сополимере также присутствуют слабая линия поглощения с максимумом вблизи 1680 см'1, отвечающая карбоксильным группам, образующим водородные связи. При добавлении ПЭГ (20% от веса полимера) интенсивность линии поглощения 1680 см'1 возрастает, что свидетельствует о дополнительном образовании водородных связей между сополимером и высокомолекулярным гидрофильным пластификатором.

Рисунок 3. ИК-спектры исходного сополимера ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ.

3. Медико-биологические свойства ЭластоПОБ

Санитарно-химические исследования экстрактов показали, что изменение значения рН экстракта из образцов по сравнению с рН контрольного раствора составило в среднем 0.020 + 0.003 ед. рН (п = 9), при допустимом ± 0.2 ед. рН. Максимальное значение оптической плотности экстракта в диапазоне длин волн 220-360 нм, равное 0.12 ± 0.02 не превысило порогового значения ±

0.30.

Результаты медико-биологических испытаний

1. Испытания в условиях in vitro

Индекс токсичности экстракта на суспензионной кратковременной культуре подвижных клеток составил 100 % при допустимых значениях 70-120 %; морфология клеток фибробластов мыши была аналогичной контролю,

визуально плотность клеток на поверхности ЭластоПОБ не отличалась от контроля.

Степень гемолиза изолированных эритроцитов в присутствии экстрактов составила 0.02 % при допустимом значении показателя не более 2.0 ± 0.2 %.

2. Испытания в условиях in vivo.

Раздражающего эффекта слизистой при закапывании в глаз кролика нет. По оценочной шкале реакция соответствовала 0 степени.

Исследование реакций общей анафилаксии и активной кожной анафилаксии на морских свинках показало отсутствие аллергических реакций анафилактического типа.

Сенсибилизирующего действия на белых крысах не выявлено, реакция дегрануляции тучных клеток отрицательная. Образцы стерильны.

3.3. Исследования на гемосовместнмость

3.3.1 Количество и морфология адгезированных тромбоцитов

Качественно мы не обнаружили существенных различий в количестве адгезированных тромбоцитов. Однако при количественной обработке оказалось, что общее количество адгезированных тромбоцитов (в относительных единицах ОПАТ) на поверхности ЭластоПОБ меньше, по сравнению с образцами ПОБ-со-ПОВ, 0.55 ± 0.05 и 0.76 ± 0.07 (Рис. 4).

3.5 г

Рисунок 4. Значения ОПАТ, для четырех морфологических классов тромбоцитов, адгезированных на поверхности ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ: 1 - не активированные, 2 - с псевдоподиями, 3 - распластанные, 4 - агрегаты, 5 - общее количество клеток.

Более существенные различия между исходным и модифицированным полимером наблюдаются в морфологии адгезированных тромбоцитов, отражающей степень активации клеток чужеродной поверхностью. Видно (см.

рис. 4), что на поверхности ЭластоПОБ относительное количество не активированных тромбоцитов (ОПАТ^) = 2.77 + 0.30) выше, чем на поверхности ПОБ-со-ПОВ (ОПАТ(1) = 1.89 ± 0.20) за счет уменьшения доли клеток с псевдоподиями и распластанных клеток. Так, относительное количество клеток с псевдоподиями (ОПАТ^) изменяется с 1.18 ± 0.10 для ПОБ-со-ПОВ до 0.95 ± 0.09 для ЭластоПОБ, соответствующие значения для распластанных клеток составляют 0.71 + 0.07 и 0.39 ± 0.03.

В то же время, доля агрегатов на поверхности ЭластоПОБ и ПОБ-со-ПОВ равны в пределах ошибки метода (0.99 ± 0.09 и 0.94 + 0.09), соответственно.

3.3.2 Активация системы комплемента

Как видно из таблицы 1, исследуемые образцы пленок из сополимера полиоксибутирата ПОБ-со-ПОВ обладают слабой активирующей способностью относительно системы комплемента. Несколько большая активация системы комплемента поверхностью ЭластоПОБ (¿°™И1|Д = 0.81 ± 0.10), обусловленная присутствием ВГП, намного меньше уровня отбора гемосовместимых медицинских изделий (^стнИнд< 1.50 относительно купрофана).

Таблица 1

Значение абсолютной и относительной констант скорости индуцированной активации системы комплемента (п=3).

Материал kUHi х ИТ6, см'2с1 шотн * инд

Купрофан 1.74 + 0.1 1.00+0.08

ПОБ-со-ПОВ 1.1810.1 0.51 ±0.07

ЭластоПОБ 1.45 ± 0.2 0.81 ±0.10

Из результатов проведенных токсикологических и санитарно-химических испытаний следует, что ЭластоПОБ соответствует требованиям, предъявляемым к изделиям для длительного контакта с внутренней средой организма, включая контакт с кровью.

§4. Биологическая функциональность ЭластоПОБ in vitro и in vivo

4.1. Культивирование стволовых клеток костного мозга крыс и фибробластов мыши линии L929 на образце ЭластоПОБ in vitro

4.1.1. Культивирование фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крыс породы Вистар на образце ЭластоПОБ

Микрофотография (Рис. 5) иллюстрирует положительный результат применения матрикса ЭластоПОБ для культивирования фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крыс (ФМСК). Было отмечено, что ФМСК распластывались и пролиферировали, на поверхности сополимера ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ, образовывая через 9 дней культивирования монослой, как и на чашке Петри из полистирола.

Морфологических отличий от клеток, культивируемых на полистироле и на поверхностях ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ отмечено не было.

Рисунок 5 Стволовые клетки костного мозга крыс линии Вистар на поверхности А - ПОБ-со-ПОВ, Б - ЭластоПОБ Ув х200 Время культивирования 9 дней Фазово-контрастный микроскоп (Nikon, Япония)

4.1.2. Культивирование фибробластов мыши линии L929 на образце ЭластоПОБ

Результаты культивирования фибробластов мыши линии L929 на поверхности ПОБ-со-ПОВ, ЭластоПОБ и двух контролей - культурального полистирола (ПС) и стекла показали, по прошествии 3 часов после посева клетки хорошо прикреплялись к поверхности всех субстратов, кроме ПОБ-со-ПОВ. При промывке образцов ПОБ-со-ПОВ перед фиксацией, клетки легко смывались. Через 24 часа фибробласты на поверхности ПОБ-со-ПОВ имели вытянутую веретеновидную форму, в отличие от ЭластоПОБ и двух контролей, где клетки были распластаны. Через 48 часов визуально существенных различий в плотности и морфологии клеток на поверхности всех образцов не было. На 3-й сутки наблюдали визуальное увеличение количества фибробластов на поверхности ПС по сравнению с поверхностью стекла, ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ.

По результатам количественной обработки были построены кривые роста -зависимости изменения параметров роста фибробластов от времени (Рис. 6) Кривая роста клеток, культивируемых на поверхности стекла лежит заметно ниже кривой для ПС, это говорит о том, что на стекле фибробласты растут заметно медленнее, чем на ПС. Кривая роста фибробластов на поверхности ПОБ-со-ПОВ практически совпадает с контролем на стекле. Для образцов ЭластоПОБ профиль кривой роста в экспоненциальной фазе достигает профиля кривой роста фибробластов на поверхности культурального ПС. Таким образом, можно заключить, что фибробласты мыши линии L929 хорошо прикрепляются и пролиферируют на поверхности ЭластоПОБ, по сравнению с ПОБ-со-ПОВ и стеклом, рост сопоставим с ростом клеток на культуральном полистироле, традиционно используемом для культивирования клеточных культур.

1800

"S 1400

S 1200

¡5 800 I 600

E 400

1000

1600

200

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Время, ч

-♦-полистирол -«-стекло ПОБ-со-ПОВ (30% ОВ) -*-ЭластоПОБ

Рисунок 6. Кривые роста фибробластов мыши линии L929, культивированных на поверхности ПОБ-со-ПОВ, ЭластоПОБ и контролен - кулмурального ПС и стекла.

4.2 Функциональные свойства ЭластоПОБ in vivo

4.2.1. Восстановительная терапия механических повреждений скелетной мышцы крыс

Морфологических отличий, а также разницы в пролиферативной активности МСК на поверхности ЭластоПОБ, обработанных и не обработанных 5-азацитидином не выявлено.

Клетки, иммобилизованные на поверхности ЭластоПОБ, через 1 месяц были идентифицированы в окружающих матрикс тканях по продукту активности бета-галактозидазы. Это свидетельствует о том, что трансплантированные клетки покинули матрикс, но жизнеспособны и продолжают оказывать свое регулирующее воздействие на процессы репарации поврежденных мышц.

Было установлено, что через 1 месяц после трансплантации в группах I и II (без клеток) вокруг матрикса ЭластоПОБ образовывалась рыхлая соединительная ткань, содержащая большое количество клеток соединительной ткани и макрофагов. В отдельных участках встречаются гранулемы вокруг инородных тел (частично резорбированная мембрана) с гигантскими многоядерными клетками (ГМК), что согласуется с данными литературы. В

биоптатах мышц из Ш-й группы, в отличие от 1-й и П-й групп, встречались только единичные ГМК, иногда наблюдалась воспалительная инфильтрация.

В препаратах мышц 1У-й группы были обнаружены только единичные ГМК. В окружающих мембрану тканях содержались лимфоидные клетки. Наблюдался выраженный неоангиогенез в участках поперечно-полосатой мышцы, прилегающих к матриксу со стороны покрытия его иммобилизованными клетками (Рис. 7).

Рисунок 7. Участок мышцы с имплантированным матриксом, на котором были иммобилизованы мезенхимальные клетки костного мозга, обработанные 5-азацитидином 1 -интакгаая мышца; 2 - участок с большим количеством микрососудов; 3 - место расположения матрикса и окружающий его вал из клеток. Окраска: гематоксилин-эозин. Ув х100 (на выноске Ув. х400).

Из проведенных экспериментов в условиях т vivo можно заключить, что мезенхимальные клетки костного мозга оказывают значительное влияние на течение воспалительного процесса в поврежденной скелетной мышце: тормозят образование фиброзной капсулы вокруг матрикса и его биодеградацию, активно способствуют миграции клеток лимфоидного ряда в очаг воспаления. Мезенхимальные клетки костного мозга, обработанные 5-азацитидином, стимулируют ангионеогенез в поврежденной скелетной мышце.

Данное исследование подтверждает целесообразность методики иммобилизации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на пленочных матриксах ЭластоПОБ с последующей имплантацией полученной конструкции. Такой подход оптимизирует функциональную активность клеток (создавая адекватную пространственную ориентацию).

4.2.1. Восстановительная терапия глубоких ожоговых ран

При исследовании динамики заживления ожоговых ран было установлено, что в 1-й и П-й группах под влиянием клеточной терапии темп уменьшения площади ожоговых поверхностей был более высоким по сравнению с Ш-й (контрольной) группой, и эта разница становилась заметной на 3-й сутки, но более отчетливой и достоверной (р<0.01) на 7-е сутки изучения раневого процесса (Рис. 8). Сравнительное гистологическое исследование тканей

ожоговой поверхности на 7-е сутки во всех трех группах животных подтвердило различия в интенсивности регенерационного процесса.

Срок после моделирования ожога, сутки

Контроль

Аллогенные ФМСК в суспензии

Аллогенные ФМСК, иммобилизованные на матриксе

Рисунок 8. Динамика уменьшения площади ожоговой раны после трансплантации аплогенных ФМСК (см. обозначения на рисунке). * - р < 0,01 по сравнению с опытными группами; ** - р < 0,05 по сравнению с суспензией ФМСК.

На 15-е сутки наблюдения (Рис. 8), различия в заживлении ран между группами животных, которым была проведена клеточная терапия, и контрольной группой становились еще более отчетливыми. Так в 1-й и П-й группе площадь ожоговой поверхности к указанному сроку становилась значительно меньше (р< 0.01), чем в Ш-й группе, и это указывало на важную роль трансплантированных клеток в ускорении темпа регенерации ожоговых ран, которая происходила за счет их краевой эпителизации.

Хотя, на 30-е сутки достоверные различия в скорости заживления ран между 1-й и П-й группами отсутствовали, тем не менее в этих группах темп регенерации по-прежнему оставался достоверно более высоким (р<0.01) по сравнению с Ш-й группой (площадь раневой поверхности составляла менее 10 см2, тогда как в контроле - около 20 см2).

Таким образом, при сравнительном исследовании динамики заживления ожоговых ран был отмечен более высокий темп заживления ран при трансплантации на ожоговую поверхность аллогенных ФМСК по сравнению с

экспериментами без клеточной терапии. Это выражалось в ускорении смены фаз регенераторного процесса: сокращались сроки периода клеточной инфильтрации и ускорялся темп неоангиогенеза и разрастания сосудистой сети, а также образования грануляционной ткани. Регенераторный процесс в ожоговых ранах без применения клеточной терапии также имел место, но темп его был резко замедлен. Можно сделать вывод о том, что иммобилизованные на поверхности матрикса ЭластоПОБ ФМСК способствуют более ранней активизации репаративных процессов в ожоговых ранах, по сравнению с клетками в суспензии. Это связано с их исходно более высокой функциональной активностью, обусловленной создавшимися в монослое клеток адекватными межклеточными взаимодействиями.

Полученные экспериментальные данные исследования функциональных свойств пленочного матрикса in vitro и in vivo позволяют рекомендовать ЭластоПОБ в качестве носителя предварительно культивированных стволовых клеток для доставки жизнеспособных клеток в патологический очаг, удержания их там и оптимизации условий их лечебного воздействия в местах повреждения тканей.

Заключение

Основным результатом проведенной работы явилась разработка и исследование пленочного биодеградируемого матрикса ЭластоПОБ, состоящего из высокоочищенного сополимера поли(оксибутирата-со-оксивалерата) с включением оксивалерата 20-30% и полиэтиленгликоля.

Медико-биологические исследования показали высокую биосовместимость матрикса ЭластоПОБ. Результаты токсикологических и санитарно-химических испытаний, испытаний на пирогенность и стерильность дали основание сделать предположение о сохранении биосовместимых свойств матрикса в течение всего периода его функционирования.

Положительные результаты культивирования фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крыс и фибробластов мыши линии L929 на образцах ЭластоПОБ в условиях in vitro показали, что разработанный пленочный матрикс выполняет роль каркаса и поддерживает прикрепление и пролиферацию клеток.

Результаты экспериментов in vivo на моделях механических повреждений скелетной мышцы и глубоких ожоговых ран крыс с использованием ЭластоПОБ доказали возможность применения матрикса ЭластоПОБ как носителя для трансплантации аутологичных и аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.

На основании решения Ученого Совета ФГУ Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Росздрава от 30 апреля 2004 г., протокол № 2, постановили: разрешить клиническое исследование биополимерного матрикса ЭластоПОБ с аутологичными стволовыми клетками.

Преимуществами разработанного матрикса ЭластоПОБ перед пленочными имплантируемыми системами на основе полимеров и сополимеров молочной и гликолевой кислот, являются, в первую очередь, способность к безопасной для организма биодеградации без изменения рН окружающих тканей и длительное сохранение своих механических и функциональных свойств.

Представляется перспективной разработка трехмерных высокопористых систем и микрокапсул для доставки клеток органов и тканей, а также для контролируемого высвобождения биологически активных и лекарственных веществ на основе бактериальных полимеров.

Выводы

1. Разработан биодеградируемый пленочный материал ЭластоПОБ на основе бактериального сополимера поли(оксибутирата-со-оксивалерата) с ММ = 295 000-360 ООО Да и полиэтиленголя с ММ = 2000 Да в качестве высокомолекулярного гидрофильного пластификатора.

2. Показано, что введение в состав сополимера 20 мас.% полиэтиленгликоля позволило уменьшить контактный угол смачивания с 85.6 ± 0.6 до 75.2 + 0.8.

3. Методом инфракрасной спектроскопии многократно нарушенного полного внутреннего отражения выявлено наличие водородных связей между молекулами сополимера и полиэтиленгликоля, что сопровождается увеличением эластичности матрикса - уменьшением модуля Юнга с 700 ±35 МПа до 600 ± 30 МПа.

4. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что на воздухе шероховатость поверхности ЭластоПОБ незначительно отличается от шероховатости исходного сополимера, но после инкубации в дистиллированной воде и культуральной среде снижается с 53.76 ± 2.68 нм до 13.50 ± 0.67 нм и 9.30 ± 0.46 нм, соответственно.

5. В экспериментах in vitro и in vivo, проведенных в соответствии с межгосударственными стандартами ГОСТ Р ИСО 10 993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий» доказаны высокие био- и гемосовместимые свойства образцов ЭластоПОБ.

6. В экспериментах по культивированию мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крыс и фибробластов мыши линии L929 установлено, что процессы прикрепления и пролиферации клеток на поверхности ЭластоПОБ сопоставимы с поведением клеток на поверхности культур ального полистирола.

7. В экспериментальных моделях восстановительной терапии механических повреждений скелетной мышцы крыс (20 крыс породы Вистар) и глубоких ожоговых ран (35 крыс породы Вистар) показана эффективность применения ЭластоПОБ для восстановительной клеточной терапии. Иммобилизованные на ЭластоПОБ мезенхимальные клетки костного мозга пролифериругот в

культуре, после трансплантации мигрируют в окружающие ткани и остаются жизнеспособными по меньшей мере в течение 1 месяца.

Практические рекомендации

Имеющиеся экспериментальные данные позволяют рекомендовать пленочный материал ЭластоПОБ для дальнейшего исследования в качестве биодеградируемого имплантируемого матрикса для трансплантации клеток различной природы (стволовые клетки, кардиомиоциты, нейрональные клетки, гепатоциты, хондроциты, ß-клетки, фибробласты и др.).

Перед использованием матрикса для культивирования клеток, с целью улучшения адгезии ЭластоПОБ рекомендуется выдержать в течение 1-2 часов в дистиллированной воде или культуральной среде.

При использовании матрикса ЭластоПОБ для клеточной терапии ожоговых ран с применением мезенхимальных стволовых клеток, необходимо иметь в виду, что через несколько суток после наложения на рану иммобилизованных клеток имеется вероятность скопления жидкости под матриксом из-за закупорки ее пор белковыми веществами, которые продуцируются клетками в процессе их культивирования. Таким образом, во избежание развития возможных осложнений матрикс следует удалять с поверхности ран не позднее, чем на 3-й сутки после наложения.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Egorova V.A.. Nemets Е.А., Krasheninnikov М.Е., Onishchenko N.A., Shishatskaya E.I., Volova T.G., Sevastianov V.l., Matrix on the basis of polyhydroxybutyrate copolymers for bioartificial tissues, Advanced Research Workshop (NATO Science Program) "Macromolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering Systems", Abstracts (8-11 November, 2003, Sofia, Bulgaria), 2003, p.15.

2. Севастьянов В.И., Егорова В.А.. Немец E.A., Перова Н.В., Онищенко H.A., Биодеградируемый биополимерный материал ЭластоПОБ™ для клеточной трансплантации, Перспективные материалы, 2004, № 3, с. 35-41.

3. Севастьянов В.И., Егорова В.А.. Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко H.A., Медико-биологические свойства биодеградируемого материала ЭластоПОБ™, Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2004, №2, с. 47-52.

4. Егорова В.А., Немец Е.А., Беломестная З.М., Перова Н.В., Разработка и доклинические исследования биодеградируемого пленочного материала ЭластоПОБ® для трансплантации клеток, (доклад на IX научно-технической конференции с участием зарубежных специалистов "Вакуумная наука и техника", 18-24 сентября, 2004, Судак, Украина), 2004, с. 255-259.

5. Расулов М.Ф., Севастьянов В.И., Зайденов В.А., Перова Н.В., Егорова В.А.. Богатырев С.Р., Ускорение регенерации при трансплантации алло- и аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на

поверхность ожоговых ран, (доклад на Третьем всероссийском конгрессе патофизиологов, 9-12 ноября, 2004, Москва), 2004, с. 336.

6. Егорова В.А.. Перова Н.В., Немец Е.А., Онищенко H.A., Севастьянов В.И., Биодеградируемый материал ЭластоПОБ® на основе бактериальных полимеров для реконструктивной хирургии (доклад на XII российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», 18-22 апреля, 2005, Москва, Россия), 2005, с. 660-661.

7. Расулов М.Ф., Севастьянов В.И., Егорова В.А.. Богатырев С.Р., Зайденов В.А., Потапов И.В., Онищенко H.A., Сравнительное изучение динамики заживления глубоких ожоговых ран при использовании аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, иммобилизированных на биодеградируемых мембранах или снятых с культурального пластика, Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 2005, №2, с. 20-23.

№16509

РНБ Русский фонд

2006-4 12382

Заказ №342. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.rii

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Егорова, Валентина Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

§ 1. Разновидности матриксов для тканевой инженерии.

1.1. Имплантируемые матриксы.

1.1.1. Иммуноизолирующие системы.

1.1.2. Открытые системы.

1.2. Экстракорпоральные системы.

§ 2. Биодеградируемые полимерные материалы для биоискусственных органов и тканей.

2.1. Синтетические биодеградируемые материалы.

2.2. Материалы природного происхождения.

2.3. Полиоксибутират и его сополимеры.

2.3.1. Физико-химические свойства.

2.3.2. Биодеградация.

2.3.3. Биосовместимые свойства.

2.3.4. Изделия на основе полиоксибутирата и их применение в медицине.

§ 3. Модифицирование полимерных материалов для тканевой инженерии.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

§1. Материалы.

§2. Методы оценки физико-химических и физико-механических свойств образцов матриксов.

2.1. Метод сканирующей электронной микроскопии.

2.2. Метод атомно-силовой микроскопии.

2.3. Метод Фурье-ИК спектроскопии многократно нарушенного полного внутреннего отражения.

2.4. Метод контактного угла смачивания для определения гидрофильности поверхности матриксов.

2.5. Метод исследования физико-механических свойств матриксов.

2.6. Спектрофотометрический метод регистрации высвобождения высокомолекулярного гидрофильного пластификатора.

§3. Методы оценки медико-биологических свойств матриксов.

3.1. Санитарно-химические испытания.

3.2. Медико-биологические исследования.

3.2.1. Испытания в условиях in vitro.

3.2.2. Испытания в условиях in vivo.

3.2.3. Испытания на стерильность.

3.3 Исследование гемосовместимых свойств.

3.3.1. Количество и морфология адгезированных тромбоцитов.

3.3.2. Спектрофотометрический метод определения степени активации системы комплемента.

§4. Методы исследования биологической функциональности матриксов in vitro и in vivo.

4.1. Культивирование стволовых клеток костного мозга крыс на образце матрикса.

4.2. Оценка роста и распластывания фибробластов мыши линии L929 на поверхности матрикса с использованием метода конфокальной микроскопии.

4.3. Экспериментальные модели in vivo механических повреждений скелетной мышцы крыс и глубоких ожоговых ран.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

§1. Состав и методика изготовления пленочного биодеградируемого матрикса.

1.1. Приготовление эластичных пленок.

1.2. Выбор оптимального состава.

§2. Морфология и физико-химические свойства ЭластоПОБ.

§3. Медико-биологические свойства ЭластоПОБ.

3.1. Санитарно-химические испытания.

3.2. Медико-биологические исследования.

3.3. Исследования на гемосовместимость.

§4. Биологическая функциональность ЭластоПОБ in vitro и in vivo.

4.1. Культивирование стволовых клеток костного мозга крыс и фибробластов мыши линии L929 на образце ЭластоПОБ in vitro.

4.2 Функциональные свойства ЭластоПОБ in vivo.

4.2.1. Восстановительная терапия механических повреждений скелетной мышцы крыс.

4.2.2. Восстановительная терапия глубоких ожоговых ран.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические и биологические свойства матрикса на основе бактериального полимера для биоискусственных органов и тканей"

Актуальность работы

Анализ работ в области трансплантологии и искусственных органов, появившихся к концу XX - началу XXI столетия, дает основание говорить о том, что ученые пока не пришли к формированию искусственной биосовместимой поверхности, аналогичной по своим свойствам, например, интиме кровеносных сосудов. Исследователи также далеки от создания искусственных органов на основе только синтетических материалов с заданными и контролируемыми свойствами. В связи с этим, в последние годы основной акцент сделан на использование технологий генной и клеточной (в зарубежной литературе - тканевой) инженерии для разработки материалов и имплантатов, наделенных структурой и функцией биологических тканей. Такие имплантаты и системы стали называть биоискусственными или гибридными [37, 38, 125]. Биоискусственные системы представляют собой сочетание биостабильного или биодеградируемого матрикса (каркаса, носителя) на основе материалов различной природы и нативных биологических структур (например, биологически активных молекул, факторов роста клеток, белков плазмы крови, функционирующих клеток различных органов и тканей) [5, 28].

Одной из ключевых проблем в создании биоискусственных материалов и органов является разработка двухмерных (пленочных) и трехмерных (губки, гели) матриксов {синонимы: матрицы, каркасы, носители). Существенным недостатком известных по открытой печати зарубежных матриксов (DegraPol/btc® - композит полиоксиалканоатов с полиуретанами [139], Vicril™ - сополимер молочной и гликолевой кислот [67], синтетический гетерогенный гидрогель Neurogel™ - полимер [Ы-(2-гидроксипропил)~ метакриламида] [165] и PuraMatrix™ на основе олигопептидных фрагментов) [180] является то, что они полностью или частично состоят из синтетических полимерных материалов. Это, несомненно, отрицательно влияет на их биологическую безопасность, увеличивает вероятность образования рубцовых тканей и опухолей, что и сдерживает их внедрение в клиническую практику.

Трансплантация стволовых клеток, а также дифференцированных клеток органов и тканей является наиболее перспективным направлением в современной трансплантологии и обещает стать мощным инструментом в лечении разнообразных заболеваний. Актуальной остается разработка технологий, позволяющих прицельно доставлять жизнеспособные клетки в патологический очаг, удерживать их там и создавать им условия для нормального функционирования. Ряд протоколов предписывает введение суспензии клеток в кровяное русло или в очаг поражения [15, 16, 24, 29]. Данные методики имеют ряд ограничений и недостатков, наиболее существенными из которых являются сложность контроля локализации клеток в месте повреждения и их низкая жизнеспособность [96]. Трансплантация клеток на имплантатах-носителях может существенно повысить эффективность данного способа восстановления функций жизненно важных органов и тканей [28].

Наибольший интерес для разработки биоискусственных систем представляют полимеры природного происхождения и их производные: альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры бактериального происхождения. Многие биополимеры, обладая высокой биосовместимостью, являются также высокоэффективными биостимуляторами. При имплантации они расщепляются на более простые соединения, которые выводятся из организма, либо принимают активное участие в метаболизме на клеточном уровне.

Одними из перспективных полимеров медицинского назначения являются полиэфиры бактериального происхождения: гомополимеры Р~ оксимасляной кислоты (полиоксибутират) и оксиоктановой кислоты, а также двухкомпонентные сополимеры р-оксибутирата и Р-оксивалерата, обладающие термопластичностью и биодеградируемостью, а также широким набором физико-химических и физико-механических свойств. [5]. Область применения бактериальных полимерных материалов для медико-биологических целей включает изготовление шовных и перевязочных материалов, биосовместимых покрытий для имплантатов, контролируемых систем доставки лекарственных веществ и др.

Известны единичные попытки использования бактериальных полимеров в качестве носителей для культивирования и трансплантации клеток органов и тканей [5, 49, 155]. Однако полиоксибутират и его сополимеры относятся к гидрофобным полимерам, что отрицательно влияет на прикрепление и пролиферацию клеток. Кроме того, общеизвестными недостатками образцов гомополимера и сополимеров являются хрупкость и недостаточная эластичность, существенно 01раничивающие их применение.

Цель работы

Основные задачи работы

Исходя из поставленной цели, задачи работы сводились к следующему:

1. Разработка технологии получения пленочного биодеградируемого матрикса;

2. Исследование физико-химических свойств матрикса; и

Научная новизна разработки

3. В экспериментах in vitro и in vivo доказана высокая биосовместимость лабораторных образцов ЭластоПОБ.

Практическая значимость

Назначение матрикса

- Субстрат, выполняющий функции подложки и питательной среды, для культивирования клеток тканей человека и животных в условиях in vitro;

Возможная область применения

Приоритетной областью применения пленочного биодеградируемого матрикса на основе полимера бактериального происхождения является использование его для культивирования стволовых и предиференцированных клеток с последующей трансплантацией.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на межинститутских семинарах Центра по исследованию биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов (2003, 2004, 2005 гг.); Российском научно-техническом семинаре по биоматериалам IX научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника» 18-24 сентября 2004, Судак, Украина; 1-м Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века», 12-15 апреля 2005 г., Москва; XII-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», 18-22 апреля 2005, Москва.

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 7 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Егорова, Валентина Александровна

ВЫВОДЫ

1. Разработан биодеградируемый пленочный материал, получивший название ЭластоПОБ, на основе бактериального сополимера поли(оксибутирата-со-оксивалерата) с ММ = 295 000-360 ООО Да и полиэтиленголя с ММ = 2000 Да в качестве высокомолекулярного гидрофильного пластификатора.

5. В экспериментах in vitro и in vivo, проведенных в соответствии с межгосударственными стандартамм ГОСТ Р ИСО 10 993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий» доказаны высокие био- и гемосовместимые свойства образцов ЭластоПОБ.

6. В экспериментах по культивированию мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крыс и фибробластов мыши линии L929 установлено, что процессы прикрепления и пролиферации клеток на поверхности ЭластоПОБ сопоставим с поведением клеток на поверхности культурального полистирола.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Егорова, Валентина Александровна, Москва

1. Бабаева А.Г. Лимфоциты как регуляторы пролиферации и дифференци-ровки клеток нелимфоидных органов. Вестн. Акад. Мед. Наук. СССР, 1990, №2, с. 43-45.

2. Биосовместимость, Под ред. В.И. Севастьянова, М., «ИЦ ВНИИ геосистем», 1999, 366 с.

3. Волков А., Синтетические биоматериалы на основе полимеров органических кислот в тканевой инженерии, обзоры on-line, 7 февраля, 2005, http://celltranspl.ru/iournal/publications/.

4. Волова Т.Г., Калачева Г.С., Константинова В.М., Способ получения ге-терополимера Р-оксимасляной и |3-оксивалериановой кислот, Патент РФ, № 2051968 (приоритет от 08.01.1992), БИ., 1996, №3.

5. Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И., Полиоксиалканоаты (ПОА) биоразрушаемые полимеры для медицины (под ред. В.И. Шумакова), Новосибирск, Изд. СО РАН, 2003, 330 с.

6. ГОСТ Р ИСО 10993.1-99, Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования.

7. ГОСТ Р ИСО-10993.4-99, Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4 Исследование изделий, контактирующих с кровью.

8. ГОСТ Р ИСО 10993.5-99, Изделия медицинские: Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксич-ность: методы in vitro.

9. ГОСТ Р ИСО 10993.6-99, Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследование местного действия после имплантации.

10. Ю.ГОСТ Р ИСО 10993.10-99, Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 10. Исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия.

11. Государственная Фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа/ МЗ СССР.- 11-е изд., доп. -М.: Медицина, 1987.-336с.

12. Н.Миронов B.JL, Основы сканирующей зондовой микроскопии. Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений, РАН, Институт физики микроструктур, Нижний Новгород, 2004, 114с.

13. Потапов И.В. Трансплантация фетальных кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в криоповрежденный миокард. Дисс., к.м.н., М., 2003 г., 114 с.

14. Сборник руководящих методических материалов по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий на их основе медицинского назначения. Минздрав России, М. 1987.

15. Севастьянов В.И., Биосовместимые материалы медицинского назначения. Перспективные материалы, 1995, № 5, с. 41-55.

16. Севастьянов В.И., Новое поколение материалов медицинского назначения. Перспективные материалы, 1997, № 4, с. 56-60.

17. Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко Н.А., Медико-биологические свойства биодеградируемого материала ЭластоПОБ™, Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2004, №2, с. 47-52.

18. Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко Н.А., Биодеградируемый биополимерный материал ЭластоПОБ™ для клеточной трансплантации, Перспективные материалы, 2004, № 3, с. 3541.

19. Скалецкий Н.Н., Онищенко Н.А., Клеточная трансплантация: достижения и перспективы, Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2001, №3-4, с. 94-102.

20. Трансплантология, Под ред. В.И. Шумакова. М., Медицина, 1995.

21. Хилькин A.M., Шехтер А.Б., Истранов Л.П., Леменев В.Л., Коллаген и его применение в медицине, Москва, «Медицина», 1976, 210 с.

22. Шумаков В.И., Севастьянов В.И., Биополимерные матриксы для искусственных органов и тканей. Здравоохранение и медицинская техника. №4, 2003, с. 30-33.

23. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Дифферен-цировка стромальных клеток костного мозга в кардиомиоцитоподобные клетки различных видов млекопитающих. Бюлл. Эксп. Биол. И Мед., 2003; 135(4), с. 393-396.

24. Abe Н., Marsubara I., Doi Y., Physical properties and enzymatic degradabil-ity of polymer blends of bacterial poly(R)-3-hydroxybutyrate. stereoisomers, Macromol., 1995, Vol. 28, pp. 844-853.

25. Allemann F., Mizuno S., et al., Effect of hyaluronan on engineered articular cartilage extracellular matrix gene expression in 3-dimensional collagen scaffolds. J. Biomed. Mater. Res., 2001, Vol. 55, pp. 13-19.

26. Anderson J.M., Biomaterials and medical implant science: Present and future perspectives: a summary report, J. Biomed. Mater. Res., 1996, Vol. 32(2), pp. 143-147.

27. Baptist J.N., Ziegler J.B., Method of making absorbable surgical sutures from poly beta hydroxy acid, US Patent № 3 229 766, 1995.

28. Behrend D., Nishan C., Kunzer C., Sass M., Schmitz K.P., Resorbable scaffold for tissue engineering, Proc. Europen Medical and Biological Engineering Conference, Med. Biol. Eng. Comput., 1999, Vol. 37 (Suppl.), pp. 15101511.

29. Bioartiflcial Organs, Science Medicine and Technology, A. Prokop, D. Hunkeler, A, Cherrington (eds.), The New York Academy of Sciences, N.Y., 1997, Vol. 831.

30. Bioartificial organs II, Technology, medicine and materials, eds. D. Hunkeler, A. Prokop, A. Cherrington, R. Rajotte, M. Sefton, Annals of the New York

31. Academy of Sciences, 1999, Vol. 875.

32. Bioartificial organs III, Tissue Sourcing, immunoisolation and clinical trials, eds. D. Hunkeler, A. Cherrington, A. Prokop, R. Rajotte, Annals of the New York Academy of Sciences, 2001, Vol. 944.

33. Boeree R., Dove J., Knowles J., Hastings G., Development of a degradable composite for orthopedic use: mechanical evaluation of a hydroxyapatite -polyhydroxybutyrate composite material, Biomaterials, 1993, Vol. 14, pp. 793-796.

34. Borkenhagen M., Stoll R.C., Suter U.W., Aebischer P., In Vivo performance of anew biodegradable polyester system used as a nerve guidance channel, Biomaterials, 1998, Vol. 19(23), pp. 2155-2165.

35. Braun K., Kuttler В., H. Jahr, H.J. Hahn, Prevention of complement-mediated cytotoxicity against rat islets by encapsulation in a cellulose sulfate membrane, Horm. Metabol. Res., 1987, Vol. 19, pp. 345-347.

36. Brissova M., Lacik I., Powers A.C., Anilkumar A.C., Wang Т., Control and measurement of permeability for design of microcapsule cell delivery system. J. Biomed. Mater. Research, 1998, Vol. 39, pp. 61-70.

37. Chang P.L., Encapsulation for Somatic Gene Therapy, Annals of the New York Academy of Sciences, 1999, Vol. 875, pp. 146-158.

38. Clark P., Connolly P., Curtis A.S.G., Dow J.A.T., Wilkinson C.D.W., Cell guidance by ultrafine topography in vitro, J. Cell Sci., 1991, Vol. 99, pp. 7377.

39. Сох M.K., Properties and applications of polyhydroxyalkanoates, in Biodegradable plastics and polymers (Y. Doi, K. Fukuda, eds.), Amsterdam: Elsevier, 1994, pp. 120-135.

40. Dalby M.J., Riehle M.O., Johnstone H.J.H., Affrossman S., Curtis A.S.G., Polymer demixed nano-topography: control of fibroblast spreading and proliferation, Tissue Engineering, 2002, Vol. 8, pp. 1099-1108.

41. Davies M.C., Short R.D., Khan M.A., Watts J.F., Brown A., Eccles A.J., Humphrey P., Vickerman J.C., Vert M.A., A XPS and SSIMS analysis of biodegradable biomedical polyesters, Surface & Inter. Analysis, 1989, vol. 14, pp. 115-120.

42. Davies S., Tighe В., Cell attachment to gel-spun polyhydroxybutyrate fibers, Polym. Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem.), 1995, Vol. 36, pp. 103104.

43. Demetriou A.A., Rozga I., Podesta L., et at., Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver, Scand. J. Castroenterol., 1995, Vol. 30, (Suppl. 208), pp. 111-117.

44. Dhoot N.O., Tobias C.A., Fisher I., Wheatley M.A., Peptide-modified alginate surface as a growth permissive substrate for neurite outgrowth, J Biomed Mater Res, 2004, Vol. 71A(2), pp. 191-200.

45. Dixit V., Artificial cells containing hepatocytes as a bioartificial liver, Pap. Joint Meet. 9th World Congr. Int. Soc Artif. Organs and 20th Congr. Eur. Soc. Artif. Organs, (4-8 July, 1993, Amsterdam), Int. J. Artif. Organs, 1993, Vol.16 (6), p. 368.

46. Doi Y., Kawaguchi Y., Nakamura S., Hiramitsu M., Yoshida Y., Kimura H., Synthesis and degradation of poly hydroxyalkanoates, FEMS Microbiol.

47. Rev., 1992b, Vol. 1-3, pp. 103-108.

48. Doillon С .J., Silver F.H., Collagen based wound dressing: Effect of hyaluronic acid and fibronectin on wound healing, Biomaterials, Vol 7(86), pp. 3-8.

49. Duvernoy O., Malm Т., Ramstrom J., Bowald S., A biodegradable patch used as pericardial substitute after cardiac surgery: 6- and 24- month evaluation with CT, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1995, Vol. 43(5), pp. 271-274.

50. Engelberg I., Kohn J., Physico-chemical properties of degradable polymers used in medical application: a comparative study, Biomaterials, 1991, Vo. 12, pp. 292-304.

51. Fialkov J.A., Holy C.E., Shoichet M.S., Davies J.E., In vivo bone engineering in a rabbit femur J. Cranoifac. Surg., 2003, Vol. 14(3), p. 324-332.

52. Flendrig L.M., te Velde A.A., Chamuleau R.A.F.M., Semipermeable hollow fiber membranes in hepatocyte bioreactors: a prerequisite for a successful bioartificial liver? J. Artif. Organs, 1997, Vol. 21(11), pp. 1177-1181.

53. Galbraith C.G., Sheetz M.P., Forces on adhesive contacts affect cell function. Curr Opin Cell Biol. 1998; Vol. 10(5), pp. 566-571.

54. Gleissner M., Bornemann R., Stemerowicz R., Meissler M., Neuhaus P., Gerlach J.C., Immunoisolation of hybrid liver support systems by semipermeable membranes, Int. J. Artif. Organs, 1997, Vol. 20(11), pp. 644-649.

55. Gogolewski S., Javanovic M., Perren S.M., Dillon J.G., Hughes M.K., tissue response and in vivo degradation of selected polyhydroacids: Polylactides

56. PLA), poly(3-hydroxybutyrate) (PHB), and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHB/PHV), J. Biomed. Mater. Res., 1993b, Vol. 27, pp. 1135-1148.

57. Goissis G., Suzigan S., Parreira D.R., Preparation and characterization of collagen-elastin matrices from blood vessels intended as small diameter vascular grafts, Artif. Organs, 2000, Vol. 24, pp. 217-223.

58. Grande D.A., Halberstadt C., Naughton G., Schwart R., Manji R., Evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts, J. Biomed. Mater. Res., 1997, Vol. 34 (2), pp. 211-220.

59. Grassie N., Murray E.J., The thermal degradation of poly(-D-)-f3-hydroxybutyric acid: Part I — Identification and quantitative analysis of products, Polym. Degrad. and Stability, 1984, Vol. 6, pp. 47-61.

60. Griffith L.G., Biomaterials, Chapter 2, WTEC Panel on Tissue engineering research, Final report (L.V. Mclntire, H. Greisler, L. Griffith, P.C. Johnson, D,J. Mooney, M. Mrksich, N.L. Parenteau, D. Smith), January, 2002, pp. 711.

61. Guan L., Davies J.E., Preparation and characterization of a highly macropo-rous biodegradable composite tissue engineering scaffold, J Biomed Mater Res, 2004, Vol. 71 A(3), pp. 480-487.

62. Hasircii V., Biodegradable biomedical polymers, In: Biomaterials and Bioen-gineering Handbook (D.L. Wase, ed.), New York: Marcel Dekker, 2000a, pp. 141-155.

63. Hazari A., Johanson-Ruden G., Junemo-Bostron K., Ljungberg C., Terenghi G., Green C., Wiberg M., A new resorbable wraparound implant as an alternative nerve repair technique, J. Hand Surg., 1999, Vol. 24B, pp. 291-295.

64. Hey wood H.K., Sembi P.K., Lee D.A., Bader D.L., Cellular utilization determines viability and matrix distribution profiles in chondrocyte-seeded alginate constructs, Tissue Engineering, 2004, Vol. 10 (9/10), pp. 1467-1479.

65. Ho M.-H., Kuo P.-Y., Hsieh H.-J., Hsieh T.-Y., Hou L.-T., Lai J.-Y., Wang D.-M., Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods, Biomaterials, 2004, Vol.25, pp. 129-138.

66. Hocking P.J., Marchessault R.H., Biopolyesters. In: Chemistry and technology of biodegradable polymers (G.J. Griffin, ed.), Glasgow: Blacky, 1994, pp. 48-96.

67. Hong S.R., Jeon H.W., et al, Cultivation of fibroblasts in gela-tin/glycosaminoglycans sponges for artificial skin, International symposium biomaterials and drug delivery systems. August 20 (Sun.) — 22 (Tue.), 2000, Korea, pp. 142.

68. Hu Y., Winn S.R., Krajbich I., Hollinger J.O., Porous polymer scaffolds surface modified with arginine-glycine-aspartic acid enhance bone cell attachment and differentiation in vitro, J Biomed Mater Res, 2003, Vol. 64A(3), pp.583-590.

69. Hua L. K., Sumio M., Takao S., Long-term maintenance of liver-specific functions in three-dimensional culture of adult rat hepatocytes with a porousgelatin sponge support, Biotechnol. and Appl. Biochem., 1995, Vol. 21 (1), pp. 19-27.

70. Hudson T.W., Liu S.Y., Schmidt C.E., Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing, Tissue Engineering, 2004, Vol. 10 (9/10), pp. 1346-1358.

71. Hughes R.D., Williams R., Use of bioartificial and artificial liver support devices. Semin. Liver Dis., 1996, Vol. 16, pp. 435-444.

72. Jacek R., Morsiani E., LePage E., Moscioni A.D., Todd G., Demetriou A.A., Isolated hepatocytes in a bioartificial liver: A single group view and experience, Biotechnol. and Bioeng., 1994, Vol. 43 (7), pp. 645-653.

73. Jain K., Yang H., B.-R. Cai, et al. Rubin. Retrievable, replaceable, macroen-capsulated pancreatic islets xenografts, Transplantation, 1995, Vol. 59, pp. 319-324.

74. Jauregui H.O., Chowdhury N.R., Chowdhury J.R., Use of mammalian liver cells for artificial liver support, Cell Transplant., 1996, Vol. 5, pp. 353-367.

75. Kang C.E., Gemeinhart E.J., Gemeinhart R.A., Cellular alignment by grafted adhesion peptide surface density gradients, J Biomed Mater Res, 2004, Vol. 71A(3), pp. 403-411.

76. Karageorgiou V., Meinel L., Hofinann S., Malhotra A., Volloch V., Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells, J Biomed Mater Res, 2004, Vol. 71A(3), pp. 528-537.

77. Karp J.M., Shoichet M.S., Davies J.E., Bone formation on two-dimentional poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) films and three-dimentional PLGA tissue engineering scaffolds in vitro, J Biomed Mater Res, 2003, Vol. 64A(2), pp. 388-396.

78. Khor E., Methods for the collagen treatment of collagenous tissues for bio-protheses, Biomaterials, 1997, Vol. 18, pp. 95-105.

79. Kim B.-S., Baez C.E., Atala A., Biomaterials for tissue engineering, World J. Urol., 2000, Vol. 18(4), p. 2-9.

80. Kostopoulos I., Karring Т., Guide bone regeneration in mandibular defects in rats using bioresorbable polymer, Clin. Oral. Impl. Res., 1994a, Vol. 5, pp. 66-74.

81. K6se G.T., Ber S., Hasirci V., Poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvaleric acid) based tissue engineering matrices, J. Mater. Sci. Mater. Med., 2003 Vol. 14, pp. 121-126.

82. Krejci-Papa N., Hoang A., Hansbough J., Fibroblast sheets enable epithe-lialization of sounds that do not support keratinocye migration, Tissue Eng., 1999, Vol. 5(6), pp. 555-562.

83. Kuroyanagi Y., Yamada N., et al., Tissue-engineered product: allogeneic cultured dermal substitute composed of spongy collagen with fibroblasts, Artif. Organs, 2001, Vol. 25, pp. 180-186.

84. Lacik A., Brissova M., Anilkumar A.C., Powers A.C., Wang Т., New capsule with tailored properties for encapsulation of living cells, J. Biomed. Mater. Research, 1998, 39, pp. 52-60.

85. Lanza R.P., Chick W., Pancreatic islets transplantation. Vol. Ill: Immuno-isolation of the Pancreatic Islets, R.G. Landes Co. Austin, 1994. (36)

86. Lee J., Morgan J.R., Tompkins R.G., Yarmush M.L., The importance of proline on long-term hepatocyte function in a collagen gel sandwich configuration: Regulation of protein secretion, Biotechnol. and Bioeng., 1992, Vol 40 (2), pp. 298-305.

87. Levee M.G., Lee G.-M., Paek S.-H., Palsson B.O., Microencapsulated human bone marrow cultures:A potential culture system for the clonal outgrowth of hematopoietic progenitor cells, Biotechnol. and Bioeng., 1994, Vol. 43 (8), pp. 734-739.

88. J. Liu, S. Naik, H. Santangini, D. Trenkler, D. Wolf, H.O. Jauregui, Comparison of immortalized porcine and rat hepatocytes. Hepatology, 1996, Vol. 24(4), Pt.2, 197A, p. 284.

89. Lowson M.A., Barralet J.E., Wang L., Shelton R.M., Triffitt J.T., Adhesion and growth of bone marrow stromal cells on modified alginate hydrogel, Tissue Engineering, 2004, Vol. 10 (9/10), pp. 1480-1491.

90. Lukinska Z.B., Bonfield W., Morphology and ultrastructure of the interface between hydroxyapatite polyhydroxybutyrate composite implant and bone, J. of Mater. Sci.: Materials and Medicine, 1997, Vol. 8, pp. 379-383.

91. Ma Z., Gao Ch., Shen J., Surface modification of poly-L-lactic acid (PLLA) membrane by grafting acrylamide: an effective way to improve cyto-compatibility for chondrocytes, J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2003, Vol. 14(1), pp. 13-25.

92. Macrae R.M., Wilkinson J.F., The influence of cultural conditions on poly-P-hydroxybutyrate synthesis in Bacillus megaterium, Proc. R. Phys. Edin. 1958, Vol. 27, pp. 73-78.

93. Madison L.L., Huisman G.W., Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalcanoates): From DNA to plastic, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1999, Vol. 63, pp. 21-53.

94. Malm Т., Bowald S., Bylock A., Buch C., Prevention of postoperative pericardial by closure of the pericardium with absorbable polymer parches. An experimental study, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1992b, Vol. 104(3), pp. 600-607.

95. Maquet V., Jerome R., Design of macroporous biodegradable polymer scaffolds for cell transplantation, Porous materials for tissue engineering (eds.: Dean-Mo Liu, Vivek Dixit), materials Science Forum, 1997, Vol. 250, pp. 15-42.

96. Marchand R., Woerly S., Bertrand L., Valdes N., Evaluation of two cross-linked collagen gels implanted in the transected spinal cord, Brain Res. Bull., 1993, Vol. 30(3-4), pp. 415-422.л

97. Mergaert J., Webb A., Anderson C., Wouters A., Swings J., Microbial degradation of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in soils, Appl. Environ. Microbiol., 1993, Vol. 59, pp. 32333238.

98. Merone A., Severino G., Capone C., Saggiomo G., The Treatment of face burns with Jaloskin, Annals of Burns and Fire Disasters, 2001, Vol. XIV(4), pp. 178-180.

99. Moran J.M., Pazzano D., Bonassar B.S., Bonassar L.J., Characterization of polylactic acid polyglycolic acid composites for cartilage tissue engineering, Tissue Engineering, 2003, Vol. 9 (1), pp. 63-70.

100. Motoyuki S., Kazuhiro I., Akiyoshi S., Yasuyuki S., Long-term culture of primary rat hepatocytes with high albumin secretion using membrane-supported collagen sandwich, Cytotechnology, 1993, Vol. 11 (3), pp. 213218.

101. Mueller S.M., Schneider Т.О., et al. a-Smooth muscle actin and contractile behavior of bovine meniscus cells seeded in type I and type II collagen-GAG matrices, J. Biomed. Mater. Res., 1999, Vol. 45, pp. 157-166.

102. Natsume Т., О. Ike, et al. Porous collagen sponge for esophageal replacement. J. Biomed. Mater. Res., 1993, Vol. 27, pp. 867-875.

103. Naughton G., Tissue engineering: new challenges, ASAIO J., 1998, Vol. 44, pp. 115-116.

104. Nelson Т., Kaufman E., Kline J., Sokoloff I., The extraneutral distributionof y-hydroxybutyrate, J. Neurochem., 1981, Vol. 37, pp. 1345-1348.

105. Ohshima N., Yanagi K., Miyoshi H., Packed-bed type reactor to attain high density culture of hepatocytes for use as a bioartificial liver, Artificial Organs, 1997, Vol. 21, pp. 1169-1176.

106. Peters M.C., Mooney D.J., Synthetic extracellular matrices for cell transplantation, Porous materials for tissue engineering, eds.: Dean-Mo Liu, Vivek Dixit, Materials Science Forum, 1997, Vol. 250, pp. 43-52.

107. Pinney E., Liu K., Sheeman В., et al., Human three-dimensional fibroblast cultures express angiogenic activity, J Cell Physiol., 2000, Vol. 183(1), pp. 74-82.

108. Pi§kin E., Biomaterials in different forms for tissue engineering: an overview, Porous materials for tissue engineering (eds.: Dean-Mo Liu, Vivek Dixit), Materials Science Forum, 1997, Vol. 250, pp. 1-14.

109. Poirer Y., Nawrath C., Somerville C., Production of polyhydroxyalka-noates, a family of biodegradable plastics and elastomer in bacteria and plants, Bio-Technol., 1995, Vol. 13, pp. 142-150.

110. Ponticiello M.S., Schinagl R.M., Kadiyala S., Barry P., Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. J. Biomed. Mater. Res., 2000, Vol.52 (2), pp. 246-255.

111. Prior J.J., Powers N., Delustro F., Efficacy of a novel hemostatic agent inanimal models of impaired hemostasis. J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Bio-mater.), 2000, Vol. 53, pp. 252-257.

112. Ranussi C.S., Moghe P.V., Substrate microtopography can enhance cell adhesive and migratory resposiveness to matrix ligand density, J. Biomed. Mater. Res., 2001, Vol. 54, pp. 149-161.

113. Rouxhet L., Legras R., Schneider Y.-J., Interactions between biodegradable polymer poly(hydroxybutyrate-hydroxyvalerate), proteins and macrophages, Macromol. Symp., 1998, Vol. 130, pp. 347-366.

114. Saad В., Matter S., Ciardelli G., et al. Interactions of osteoblasts and macrophages with biodegradable, and highly porous polyesterurethane foam and its degradation products. J. Biomed. Mater. Res., 1996, Vol. 32, pp. 355366.

115. Sambanis A., Engineering Challenges in the Development of an Encapsulated Cell System for Treatment of Type 1 Diabetes, Diabetes Technology and Therapeutics, 2000, Vol. 2(1), pp. 81-89.

116. Schacht E., Bogdanov В., et al., Biodegradable gelatin hydrogels for biomedical applications, International symposium biomaterials and drug delivery systems, Aug. 20 (Sun) 22 (Tue), 2000, Korea, pp. 32-33.

117. Sevastianov V.I., Tseytlina E.A., The activation of the complement system by polymer materials and their blood compatibility. J. Biomed. Mater. Res., 1984, Vol. 18, pp. 969-978.

118. Sevastianov V.I., Perova N.V., Shishatskaya E.I., Kalacheva G.S., Volova T.G., Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood. J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2003, V. 14(10), pp. 1029-1042.

119. Shahar A., Reuveny S., David Y., Budu C., Shainberg A., Cerebral neurons, skeletal myoblasts and cardiac muscle cells cultured on macroporous beads, Biotechnol. and Bioeng., 1994, Vol. 43 (8), pp. 826-831.

120. Shapiro L., Cohen S., Novel alginate sponges for cell culture and transplantation. Biomaterials, 1997, Vol. 18, pp. 583-590.

121. Shih H.-N., Fang J.-F., Chen J.-H., Yang Ch.-L., Chen Y.-H., Sung T.-H., Shih L.-Y., Reduction in experimental peridural adhesion with the use of crosslinked hyaluronate/collagen membrane, J Biomed Mater Res, 2004, Vol. 71B(2), pp. 421-428.

122. Shoichet M.S., Li R.H., White M.L., Winn S.R., Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose, Biotechnol. Bioeng., 1996, Vol. 50, pp. 374-381.

123. Singhvi R., Stephanopoulos G., Wang Daniel I.C, Effects of substratum morphology on cell physiology, Biotechnol. and Bioeng., 1994, Vol. 43 (8), pp. 764-771.

124. Steinbtichel A., Valentin H.E., Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids, FEMS Microbiol. Lett., 1995, Vol. 128, pp. 219-228.

125. Stevenson W.T.K., Sefton M.V., Development of polyacrylate microcapsules, in Fundamentals of Animal Cell Encapsulation, M.F.A. Goosen (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1993, pp. 143-181.

126. Strand B.L., Morch Y.A., Syvertsen K.R., Espevik Т., Skjak-Brsek G„ Microcapsules made by enzymatically tailored alginate, J. Biomed. Mater. Res., 2003, Vol.64A (3), pp. 540-550.

127. Sudesh K., Abe H., Doi Y., Synthesis, structure and properties of polyhy-droxyalcanoates: biological polyesters, Prog. Polym. Sci., 2000, Vol. 25, pp. 1503-1555.

128. Sun Y.-L., Ma X., Zhou D., Vacek I., Sun A.M., Porcine pancreatic islets: Isolation, microencapsulation, and xenotransplantation, Artif. Organs, 1993, Vol. 17, pp. 727-733.

129. Sussman N.L., Gislason G.T, Conlin C.A., Kelly J.H., The hepatic extracorporeal liver assist device: initial clinical experience. Artif Organs, 1994, Vol. 18, pp. 390-396.

130. Sussman N.L., Lake J.R., Treatment of hepatic failure—1996, Current concepts and progress toward liver dialysis, Am. J. Kidney Dis., 1996, Vol. 27, pp. 605-621.

131. Tan W., Desai M.S., Desai T.A., Microfluidic patterning of cells in extracellular matrix biopolymers: effect of channel size, cell type, and matrix composition on pattern integrity, Tissue Engineering, 2003, Vol. 9 (2), pp. 255268.

132. Tao S.L., Desai T.A., Microfabricated drug delivery systems: from particles to pores, Advanced drug delivery reviews, 2003, Vol. 55, pp. 315-328.

133. Toba Т., Nakamura Т., Matsumoto K., Fukuda S., Yoshitani M., Ueda H., Hori Y., Shimizu Y., Influence of dehydrothermal crosslinking on the growth of PC-12 cells cultured on laminin coated collagen, Asaio Journ., 2002, V 48 (l),pp. 17-20.

134. Tohill M.P., Mann D.J., Mantovani C.M., Wiberg M., Terenghi G., Green fluorescent protein is a stable morphological marker for Schwann cell transplants in bioengineered nerve conduits, Tissue Engineering, 2004, Vol. 10 (9/10), pp. 1359-1367.

135. Tomita S, Li RK, Weisel RD et al. Autologous transplantation of bone marrow cell inproves damaged heart function. Circulation 1999; 100 (suppl II):II-247—11-256.

136. Toolan B.C., et al. Effect of growth-factor-enhanced culture on a chondro-cyte-collagen implant for cartilage repair, J. Biomed. Mater. Res., 1996, Vol.31, pp. 273-280.

137. Toworfe G.K., Composto R.J., Adams C.S., Shapiro I.M., Ducheyne P., Fibronectin adsorption on surface-activated poly(dimethylsiloxane) and its effect on cellular function, J Biomed Mater Res, 2004, Vol. 71 A(3), pp. 449461.

138. U.S. Patent: 5, 863, 551. January 26, 1999, Organogel Canada LTEE. (10)

139. Ueda H., Tabata Ya., Polyhydroxyalkanoate derivatives in current clinical applications and trials, Advanced drug delivery reviews, 2003, Vol. 55, pp. 501-518.

140. Van Kooten Th.G., Spijker H.T., Busscher H.J., Plasma treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions, Biomaterials, 2004, Vol. 25, pp. 1735-1747.

141. Van Wachem P.B., van Luyn M.J.A., Ponte da Costa M.L., Myoblast seeding in a collagen matrix evaluated in vitro, J. Biomed. Mater. Res., 1996, Vol. 30, pp. 353-360.

142. Viola J., Lai В., Grad O., Abt. report on The Emergence of Tissue Engineering as a Research Field, 4.0 Development of the Field: 1987-2002, October 14, 2003, http://www.nsf.gov/pubs/2004/nsro450/start.htm.

143. Volova Т., Shishatskaya E., Sevastianov V., Efremov S., Mogilnaya O., Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV fibers, Biochem. Eng. J., 2003, № 3736, pp. 1-9.

144. Wang L., Khor Eu., Wee A., Lim L.Y., Chitosan-alginate PEC membrane as a wound dressing: assessment of incisional wound healing, J Biomed Mater Res, 2002, Vol. 63(5), pp. 610-618.

145. Werkmeister J.A., Edwards G.A., et al. Evaluation of a collagen-based biosynthetic material for the repair of abdominal wall defects. J. Biomed. Mater. Res., Vol. 39, 1998, pp. 429-436.

146. Winn S.R., Tresco P.A., Zielinski В., Greene L.A., Jaeger C.B., Aebischer P., Behavioral recovery following intrastriatal implantation of microincapsulated PC 12 cells, Exp. Neurol., 1991, 113, pp. 322-329.

147. Woerly S., Pinet E., De Robertis L., et al., Heterogeneous PHPMA hydro-gels for tissue repair and axonal regeneration in the injured spinal cord, J.Biomater. Sci. Polymer Edn, 1998, Vol. 9, pp. 681-711.

148. Woerly S., Petrov P., et al., Neural tissue formation within porous hydro-gels implanted in brain and spinal cord lesions: Ultrastructural, immunohisto-chemical, and diffusion studies. Tissue Engineering, 1999, Vol. 5, pp. 467488.

149. Woerly S., Doan V. D., Evans-Martin F., Paramore C.G., Peduzzi J.D., Spinal cord reconstruction using NeuroGel™ implants and functional recovery after chronic injury, J. Of Neurosciensce Res., 2001, Vol. 66, pp. 11871197.

150. Wojciak-Stothard В., Curtis A., Monaghan W., Macdonald K., Wilkinson C., Guidance and activation of murine macrophages by nanometric scale topography, Cell Res., 1996, Vol. 223, pp. 426-435.

151. Yanagi K., Miyoshi H., Ohshima N., Improvement of metabolic performance of hepatocytes cultured in vitro in a packed-bed reactor for use as a bio-artificial liver, ASAIO J., 1998, Vol. 44, M436-440.

152. Yu G.-E:, Marchessault R.H., Characterization of low molecular weight poly((3-hydroxybutyrate)s from alkaline and acid hydrolysis, 2000, Vol. 41, pp. 1087-1098.

153. Zhang S., Holmes T.C., DiPersio C.M., Hynes R.O., Su X., Rich A., Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment, Biomaterials, 1995, Vol. 16, pp. 1385-1393.

154. Zhang M, Methot D, Poppa V et al. Cardiomyocyte Grafting for Cardiac

155. Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies. J Mol Cell Cardiol, 2001; Vol. 33: pp. 907-921.

Информация о работе

Егорова, Валентина Александровна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Физико-химические и биологические свойства матрикса на основе бактериального полимера для биоискусственных органов и тканей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Физико-химические и биологические свойства матрикса на основе бактериального полимера для биоискусственных органов и тканей - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы