Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физические механизмы взаимодействия красителейфеназинового ряда с нуклеиновыми кислотами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физические механизмы взаимодействия красителейфеназинового ряда с нуклеиновыми кислотами"

.чГ^ ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ^ іи. В.Н. КАРАЗША

ЩЕРБАКОВА Аитоніна Сергіївна

УДК 577.113.7

ФІЗИЧНІ МЕХАНІЗМИ ВЗАЄМОДІЇ БАРВНИКІВ ФЕНАЗИНОВОГО РЯДУ З НУКЛЕЇНОВИМИ КИСЛОТАМИ

03.00.02-біофізнка

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеїш кандидата фшікл-иатематіїчшіх паук

Харків-2000

Робота виконана у Фізико-технічному інституті низьких температур ім. Б.І. Веркіна НАН України

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор,

Благой Юрій Павлович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Веркіна НАН України, завідувач відділу молекулярної біофізики

Офіційні опоненти:

- доктор фізико-матемагичних наук, старший науковий співробітник

Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усікова НАН України, провідний науковий співробітник (м. Харків);

- доктор фізико-математичних наук, професор

Веселков Олексій Никонович, Севастопольський державний технічний університет, завідувач кафедри фізики (м. Севастополь).

Привідна установа: Інститут теоретичної фізики НАН України, м. Київ

Захист відбудеться «£%» С? 'Г 2000 р. о годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківскому національному університеті ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою:

61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий «» (У(р 2000 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальпість теми. В останній час все більшого значення набувають роботи щодо створення терапевтичних препаратів ген-спрямованої дії на основі антисенсових та антигенних олігонуклеотидів. Такі сполуки, що є комплементарними до визначеної ділянки нуклеїнової кислоти-мішені (м-РНК- або ДНК-мішені), утворюють' із нею дуплексні або триплексні комплекси, блокуючи тим самим експресію генів. Ефективність антисенсової гібридизації багато в чому визначається стабільністю комплексу між олігонуклеотидом та ділянкою нуклеїнової кислоти. Використання похідних олігонуклеотидів з приєднаними по фосфатних групах гєтероароматичними поліциюіічними системами є одним із варіантів стабілізації комплементарного комплексу. В якості таких поліциклічних систем використовують барвшіки-інтеркалятори акридинового та феназинового ряду. Звичайно приєднання барвників здійснюється через поліметшіеновий лінкер. Однак, при цьому стабілізуюча дія барвника залежить як від природи хромофору, так і від довжини .лінкеру, крім того подібна модифікація не забезпечує однозначності місця розташування молекули інтеркалятора в дуплексі або триплексі, що обмежує використання барвників яж репортерпих груп для мічення олігонуклеотидів. У зв'язку з цим пошук нових ефективних способів модифікації антисенсових та антигенних олігонуклеотидів до цього часу залишається дуже актуальним.

В Інституті молекулярної біології і генетики НАН України були синтезовані нові похідні феназинового барвника, що належать до глікозидів та четвертинних солей і містять різні гідрофобні ірупи. Також було розроблено новий, хімічно більш простий ніж лінкерний, спосіб ковалентного приєднання глікозидного похідного феназину до олігонуклеотидів. У даному випадку молекула барвника вбудовується в послідовність ланцюга олігонуклеотиду як звичайний нуклеозид, отже очікується цілком визначене розташування хромофору в комплексах, і такий барвник може служити надійним флюоресцентним зондом гібридизації. Приєднання до олігонуклеотидів подібних нейтральних гідрофобних молекул дозволяє також вирішувати проблеми доставки олігонуклеотидів у клітини, адже незаряджені ліпофільні групи полегшують проникнення олігонуклеотидіїих кон’югатів через мембрани клітини завдяки пасивній дифузії. Крім того, ковалентно приєднана молекула барвника підвищує нуклеазну резистентність антисенсових олігонуклеотидів в умовах in vivo.

Використання нових похідних феназину як модифікаторів антисенсових та антигенних олігонуклеотидів неможливе без детального вивчення фізичних механізмів взаємодії цих барвників з нуклеїновими кислотами, визначення констант асоціації та встановлення внесків електростатичних та гідрофобних факторів у процес комплексоутворення.

При цьому основною проблемою залишається адекватний термодинамічний опис процесу комплексоутворення, що ускладнюється наявністю більш ніж одного типу зв'язування в системі ліганд-полінуклеотидна матриця. •

Щодо проблеми підвищення ефективності стабілізації дуплексних та триплексних формувань нуклеїнових кислот шляхом ковалентного приєднання барвщіків-інтеркаляторів до олігонуклеотидного ланцюга, до останнього часу недостатньо уваги приділялось питанням концептуального характеру. Так, практично не розглядались термодинамічні аспекти стабілізації молекулярної гібридизації через відсутність теоретичних моделей, які дозволяли б описувати переходи спіраяь-клубок у випадку, коли , комплексоутворення здійснюється олігонуклеотидом, модифікованим барвником. У зв’язку з цим особливої актуальності набуває розвиток існуючих математичних моделей для адекватного термодинамічного аналізу процесу комплексоутворення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконувалась у відділі молекулярної біофізики ФТІНТ НАН України у відповідності з планом науково-дослідних робіт за темою «Досліджеїшя структурних та фізико-хімічних властивостей комплексів їіуклеїновнх кислої' з біологічно активними речовинами» (номер держреєстрації 0195Ш09876). Частина роботи виконана в рамках проектів СЇШБ Ш1-435 та ІНТАБ 973 і 158.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було встановлення фізичних механізмів зв'язування ковкх похідних феназину із ДИК і визначення ефектів стабілізації дуплексних та триплексних формувань олігонуклеотидів при їх модифікації глікозидом феназину. Для досягнення цієї мети було поставлено та вирішено такі задачі:

1. Дослідити спектрально-флюоресцентні властивості нових похідних

- феназину та їх комплексів з ДНК. . .

2. Одержати ізотерми зв'язування похідних феназину з ДНК при низьких та фізіологічних значеннях іонної сили розчину.

3. Провести теоретичний опис експериментальних ізотерм зв'язування за допомогою модельних рівнянь. Шляхом аналізу ізотерм зв'язування встановити механізми і термодинамічні параметри взаємодії, оцінити внесок електростатичних та гідрофобних сил у процес зв'язування феназинових похідних з ДНК. .

4. Методом термічної денатурації з використанням абсорбційної і ' флюоресцентної спектроскопії отримати криві плавлення дуплексних та

' триплексних комплексів оліготимідилату, модифікованого глікозидом феназину, що утворюються з о%о(сіА)і5, ро1у(гА) та ро1у(сіА)роІу(с1Т).

5. Шляхом порівняння температур плавлення комплексів, що утворюються модифікованим та немодифіхованим декатимідилатом, встановити

з

ефективність нового способу модифікації для стабілізації дуплексних та триплексних комплексів нуклеїнових кислот.

. Провести термодинамічний аналіз переходів спіраль-клубок у дуплексних і триплексних комплексах немодифікованого та модифікованого олІготимідилату з оліго- і поліаденілатом, оцінити вплив ковалентно приєднаного' барвника на термодинамічні характеристики комплексоутворення.

Наукова новпзпа одержаних результатів.

. Проведено детальне дослідження фізичних механізмів взаємодії з ДНК нових похідних феназину, що належать до глікозид,ів і четвертинних солей. Визначено внески електростатичних та гідрофобних факторів у процес комплексоутворення.

!. Вперше при аналізі даних про комплексоутворення було проведено урахування кулонівського відштовхування між зарядженими приєднаними молекулами хромофору, що призводить до додаткового ефекту антикооперативносгі зв'язування.

5. Встановлено, що ковалентне приєднання до декатамідилату глікозида феназину стабілізує ж дуплексні, так і триплекси і формування олігонуклеотиду.

1. Запропоновано модифікацію рівнянь моделі «застібка-блискавка» для аналізу переходів спіраль-клубок у дуплексних та триплексних формуваннях олігонуклеотндів, модифікованих барвником.

5. На основі термодинамічних розрахунків показано, що спосіб приєднання глікозидного похідного барвника до олігонуклеотиду, подібний до вбудовування у нуклсотиднии ланцюг зви чанного нуклеозиду, забезпечує більш енергетично вигідне зміцнення як дуплексів, так і триплексів, ніж приєднання через лінкєр.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі експериментальні дані дозволяють рекомендувати новий перспективний спосіб олігонуклеотидної модифікації глікозидним похідним феназину для стабілізації антисенсової та антигенної'Гібридизації при створенні ліків ген-спрямованої дії.

Отримані теоретичні результати розширюють існуючі уявлення про процеси взаємодії барвників із нуклеїновими кислотами, а також про дуплексні та триплексні формування олігонуклеотндів, модифікованих ковалентно приєднаними барвниками.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1,3,6,9] - одержання й обробка результатів, проведення теоретичних розрахунків; . .

у роботах [2,4,5,7,8,10,11,12] - проведення експерименту, обробка й

обговорення отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались і обговорювались на: World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering (Nice, France, 1997); Vth International Conference on Methods & Applications of Fluorescence Spectroscopy (Berlin, Germany, 1997);

II з'їзд Українського біофізичного товариства (Харків, 1998); Jablonski Centennial Conference on Luminescence and Photophysics (Torun, Poland, 1998); Conference on Physics of Biological systems (Poushcha-Vodytsa (Kyiv), Ukraine, 1998); VIth International Conference on Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy (Paris, France, 1999); 8th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Enschede, The Netherlands, 1999); Summer School on Nucleic Acids Chemistry: Oligonucleotides and Analogues -Synthesis, Structure and Properties (Kollekolle, Denmark, 1999).

. Публікації. Основні результати роботи опубліковані в 12 наукових працях, у тому числі в 4 статтях у наукових журналах і в 8 тезах доповідей національних і міжнародних конференцій і з'їздів.

Струкггура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, п'ятьох розділів та висновків. Повний обсяг дисертації складає 119 сторінок. Робота містить 26 рисунків і 5 таблиць (на окремих сторінках немає). Список використаних джерел (149 найменувань) займає 18 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальпість обраної теми, сформульовано мету досліджень та задачі, що необхідно вирішити для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертаційної роботи.

.;. У.розділі 1 проведено аналіз літературних даних, що відображають сучасні уявлення про взаємодію барвників з нуклеїновими кислотами. Надано характеристику двом основним типам взаємодії, а саме -інтеркаляції хромофору між площинами основ, та зовнішньому приєднанню барвника до фосфатних.груп нуклеїнових кислот, визначено внески електростатичних та гідрофобних факторів, а також іонного складу розчину у сильний та слабкий типи зв’язування. Розглянуто існуючі методики аналізу комплексоутворення за допомогою моделі «виключеного сусіди» з використанням рівнянь Мак Гі та ван Хіппела, що враховують кооперативність процесу зв’язування, а також модифікацію цих рівнянь з урахуванням поліелектролітних ефектів. Показано, що жодна з моделей не дозволяє адекватно описати процес комплексоутворення у разі, коли зв’язування відбувається двома типами, тому що вони не враховують усіх

факторів, що впливають на взасмодіто барвника з нуклеїновими кислотами. ■

У розділі 2 розглядається стан проблеми використання антисенсових і антигенних олігонуклеотидів як лікарських препаратів ген-спрямованої дії та посилення ефективності молекулярної гібридизації шляхом ковалентного приєднання до олігонуклеотидів барвників-інтеркаляторів. Зроблено висновок про необхідність пошуку нових ефективних стабілізаторів антисенсової гібридизації. Далі обговорюються загальні принципи утворення дуплексних та триплексних структур олігонуклеотидів та факторів, що впливають на їх термічну стійкість та зумовлюють стехіометрію комплексу. Також розглядаються методи дослідження дуплексів та триплексів. У розділі звертається увага на існуючі моделі, що дозволяють розрахувати термодинамічні параметри переходів спіраль-клубок, а саме моделі «двох станів» та «застібка-блискавка». Показано, що модель «двох станів» дає лише усереднені термодинамічні параметри комплексоутворення, а модель «застібка-блискавка» надає можливість урахувати імовірність утворення частково упорядкованих структур, але її ніколи не використовували для термодинамічного опису дуплексів, які формують олії оиуклеотвди, модифіковані иарвником, та триплексів.

У розділі 3 обгрунтовано вибір об’єктів та методів дослідження. Об’єктом дослідження були: нові похідні феназину, що належать до глікозидів та четвертинних солей (Рис.1) (синтезовані в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України), 3'-модифікований декатимідилат (Рис.2), декатимідилат, пентадекааденілат (синтезовані в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України), поліаденілат, поліаденілат*політимідилат (від «Sigma», ФРН), високополімерна еритроцитариа ДНК (від «Reanal», Угорщина). Всі спектральні експерименти проводили в №і-какодилатному буфері (10 мМ, 0.5 мМ EDTA, pH 7) на деіонізованій дистильованій воді. Для підвищення іонної сили у буфер додавали NaCl. Концентрації оліго-, полінуклеотидів та ДНК визначали спектрофотометрично.

Спектри поглинання та абсорбційні криві плавлення визначали на спектрофотометрі SPECORD UV VIS (ФРН), а флюоресцентні - на лабораторному спектрофлюориметрі з електронною системою рахування фотонів. Ці прилади були приєднані,до персонального комп’ютера для накопичення і обробки даних. Експерименти з термічної денатурації проводили в спеціальній кварцевій кюветі (об’єм 60 мкл, довжина оптичного шляху 0.2 см). Кювету поміщали в мідний утримувач, температуру якого змінювали за допомогою елементу Пелтье, керованого

комп’ютером. Виміри поглинання та інтенсивності флюоресцеш; здійснювали при швидкості нагрівання 0.5 °С/хв.

П2

ио он

(І) Я=Н, N]^-D-pi6oфypaaoзвд імідязо[43-й}феназі

РЬЗ

(II) К=5ЧйТй<іТ о — р________ » З’-модвфікованай

; декатимідилнт

феназину (І) і модифікованого декатимідилату (II).

їм

И*

Рис.і Похідні феназину

У розділі 4 наведено результати досліджень взаємодії нових похідних феназину (Рис.1) з ДНК методом поляризованої флюоресценції та абсорбційної спектроскопії. Визначено спектрально-флюоресцентпі властивості вільних барвників та їх комплексів з ДНК (Табл. 1).

При зв'язуванні феназинів із ДНК їх спектри поглинання виявляють гіпохромізм і зсуваються в довгохвильовий бік, а спектри флюоресцеції - у короткохвильовий (Таблиця 1), що е типовим для інтеркаляції барвників.

0

’О 5 10 15 20 25

Р/Л

Рпс.З Зміна інтенсивності, І/Іо, і поляризації флюоресценції, р, похідних феназину при титруванні ДНК (довжина хвилі збуджуючого випромінювання для нейтральних феназинів дорівнює 450, для катіонних - 530 нм; Іо -інтенсивність флюоресценції вільного барвника): Phi (□), Ph2 (х), Ph3 (о), Ph4 (+), Ph5 (*), Ph6 (A). Загальна концентрація барвника була 20 цМ, іонна сила розчину -

0.002 М NaCI.

Для нейтральних і катіонних похідних феназину спостерігається істотне розходження у ступенях поляризації флюорес-ценцїі (Таблиця 1). Менший ступінь поляризації для нейтральних феназинів

пояснюється істотно більш триваліш часом життя їх збудженого стану, ніж дая катіонних форм.

Початкові ділянки кривих флюоресцентного титрування похідних феназину ДНК у вигляді залежностей відносної

інтенсивності, І/Іо (Іо -інтенсивність випромінювання вільного барвника), і поляризації флуоресценції, р, від

співвідношення молярних

концентрацій ДНК/барішик, P/D, подані на Рис.З для розчинів із низькою іонною силою.

З ростом РID флюоресценція гаситься, а поляризація збільшується, що свідчить про збільшення частки зв'язаного барвника. При P/D -» =о інтенсивність і поляризація флюоресценції кожної досліджуваної системи досягають своїх межових значень, що характеризують випромінювання барвників у комплексах із ДНК.

Параметри флюоресценції для всіх комплексів були визначені шляхом графічної екстраполяції залежностей І/Іо і р від D/Р до D/P = 0.

Таблиця 1.

Оптичні властивості похідних феназину та їх комплексів з ДНК

Система Поглинання Флюорєсценція

Ямаї, НМ Ем«, М-1 CVT* Я„ах, НМ ІЛо Р

Phi 384 22400 543 1 0.004

Phi-ДНК 389 14300 539 0.08 0.035

Ph2 387 23300 546 1 0.003

Ph2 - ДНК 391 16310 542 0.08 -

Ph3 517 15200 617 1 0.095

РЬЗ-ДНК 531 10868 613 0.12 0.44

Ph4 545 16200 630 1 0.09

Ph4 - ДНК 550 15066 626 0.12 0.42

Ph5 520 15009 . 615 1 0.08

Ph5 - ДНК 533 12307 611 0.15 -

Ph6 520 12600 615 1 0.08

РЬш - ДНК 533 9400 ■ 611 0.14 0.42

•Параметри найіитенсивніших довгохвшіьвих смуг поглинання

Використовуючи дані флтооресценшого титрування і параметри флюоресцепції комплексів (Таблиця 1) були розраховані частки барвника у зв'язаному стані, fь, за відомого формулою

/* =

0)

де Іо - та інтенсивність флюоресценцїї вільного барвника, а и? та п -анізотропії флюоресценцїї вільного барвника та у комплексі із ДНК, відповідно. ■

Дані про зв'язування представлені на Рис. 4а і 46 в координатах Скетчарда для всіх досліджуваних систем при [Na+]=0.002 М. Нейтральні феназини Phi і Ph2 слабо зв'язуються з ДНК, внаслідок чого були отримані лише малі значення ступеня заповнення місць зв'язування, г (кількість молекул зв'язаного барвника, що приходиться на одну пару основ ДНК). Прямолінійність ізотерм зв'язування для цих барвників свідчить про наявність одного типу взаємодії, у даному випадку - інтеркаляції. Форма кривих Скетчарда для катіонних похідних Ph3-Ph6, безсумнівно, виявляє два: типи зв’язування, а саме інтеркаЛяцію і зовнішню електростатичну взаємодію з фосфатними групами. Остання має кооперативний характер (опуклість ізотерм) внаслідок стекінгу хромофорів адсорбованого барвника, і через сильні гідрофобні ефекти виявляється навіть в умовах конкуренції за місця зовнішнього зв'язування з іонами Na+ при фізіологічних значеннях іонної сили.' Серед катіонних похідних особливе місце займає Ph5, його слабке зв'язування з ДНК пояснюється цвітеріонною формою молекули барвника. Значення констант зв'язування феназинів були визначені по точках перетинання експериментальних кривих Скетчарда з віссю r/Со і наведені в Таблиці 2.

При аналізі даних про комшіексоутворення зручно скористатися існуючими модельними рівняннями зв'язування, що враховують внутрішнє і зовнішнє приєднання молекул барвника до ДНК, наприклад, відомими рівняннями МакГі і ван Хіппела. На жаль, у цих рівняннях не враховувалося кулонівське відштовхуваним між зарядженими приєднаними молекулами барвника, що може призвести до додаткового ефекту антикооперативності зв'язування. У зв'язку з цим рівняння дають невірну форму ізотерм, особливо в частині зовнішнього приєднання. Простим і точним у цьому випадку може бути урахування енергії кулонівського відштовхування катіонів в рамках моделі «двох станів» - зв'язаних і вільних іонів. У найпростішому наближенні даної моделі можна припустити, що енергія відштовхування зв'язаних із ДНК катіонів пропорційна ступеню заповнення місць зв'язування на полімері, г = \7 N (V - кількість зв'язаних іонів, N - кількість місць зв'язування).

Ав І ЯТ = аг (2)

де а - емпіричний коефіцієнт, близький до 6 для одновалентних іонів і до

12 для двовалентних іонів. Варто зауважити при цьому, що характер кулонівського відштовхування принципово відрізняється своєю

Діи»ьМ\іДі».'.ім іііД і ІДрОфОчЗПОі СТСКіКГ-БЗаСМОДІі, І ТО лі у сНсрГіЯ

відштовхування не може бути урахована параметром кооперативності, , що залежить від вільної енергії стекінгу молекул барвника у стопці. З огляду на це, можна модифікувати рівняння МакГі і ван Хіппела при наявності двох типів зв'язування введенням додаткових множників типу

ехр|- а(г, + г,)|, для констант зв'язування К} (іптеркаляція) і

Кг (зовнішнє приєднання). Модифіковані таким чином рівняння мають вид

/С„ =К{ -ехр {-«,(>-, +гг)}-(і-л,г1)’' -(і-«/і +'і)(і Л,);

-2 / С0 = Кг -ехр{- а2(г, +гг)) - (і - п2г2)-

Де Я=(4кгг-(і-л2гг) + (і-(и2 +іЬ)2) ;

(2и’-і)(і -я,г,) + /у- II 1 1 + І

2(1 - п2г2) _

(3)

н» - параметр кооперативності, С0- концентрація вільного барвника, К, і кг

- константи зв'язування при г ->0, а, і аг - емпіричні коефіцієнти, що враховують кулонівське відштовхування хромофорів, Щ І П2 розмір місць зв'язування для процесів інтеркаляції і кооперативного зв'язування, відповідно. Ця система нелінійних рівнянь із двома невідомими гх і г2 вирішувалася методом Ньютона з лінійною екстраполяцією початкових значень коренів по двох попередніх. При цьому концентрація вільних

молекул С0 варіювалася в межах від 10-9 до ЇСИ М, а параметри К,, К,, а1,а1 , я,, пг і вибиралися, виходячи з літературних даних про їх значення для подібних молекул і відповідності результатів розрахунку експериментальним ізотермам. Як видно з Рис. 4, результати розрахунків (суцільні лінії) адекватно' описують 'експериментальні дані (точки). У Таблиці 2. подано використані при розрахунках значення параметрів, що дають максимальну згоду з експериментом.

• iogoo

9000 !" 8000 7000 6000 г/С0 5000 4000 3000 2000 1ПОЛ

о

. 800000

700000 гЛ б

- а 600000 і

эиООш %

-х— гУС0 400000 300000 . 200000 100000 ДдЧ У\ лЧ !/ ,

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10

СУ 0,4 0,6 0,8 1,0

г

Рис. 4 а і б Ізотерми зв’язування похідних феназину і ДНК при ,[Na+]=0.002 М, pH 7. Нейтральні феназини Phi (□), Ph2 (х); катіонні барвники Ph3 (о), Ph4 (+), Ph5 (*), Ph6 (Д).Теоретична крива Скетчарда -суцільна лінія, внесок зовнішнього зв'язування в криву Скетчарда -пунктирна лінія).

Таблиця 2.

Система [Na+], М К/, м-' К.2, М < м № пі П2 W

Phi - ДНК 0.002 б.8‘10з - - - - -

Ph2 - ДНК 0.002 1.8*103 _ . - - - ~ _

Ph3 - ДНК 0.002 6.6*105 103 3 5 2 1 1.1*103

РМ-ДНК 0.002 5.8*105 Юз- 5 5 4 1 3.0*103

Ph5 - ДНК 0.002 4.7*10’ 18 5 5 3 1 4.0*103

Ph6 - ДНК 0.002 7.0* 105 103 5 5 3 1 5.0*103

Phi-ДНК 0.1 1.4*103 - - - - - _

Ph2 - ДНК 0.1 0.5*103 - - - - - -

РЬЗ-ДНК 0.1 9.4*103 - - - - - _

Ph4 - ДНК 0.1 2.0*103 20 . 5 5 4 1 3.0*103

Ph5 - ДНК 0.1 0.8*103 11 5 5 3 1 4.0*103

РЬб-ДНК 0.1 7.0*103 20 5 5 3 1 5.0*10з

У розділі 5 наведені результати дослідження дуплексних та риплексних формувань оліготимідіїлату, модифікованого глікозидом феназину, які були одержані методом термічної денатурації з іикористанням абсорбційної та флтооресцентної спектроскопії. Було зиявлено стабілізуючий ефект модифікації олігонуклеотаду на його іуплекси з (сіА)і5 та роІу(гА), що полягає у підвищенні температури тлавлення комплексів на 10-12 °С. Результати досліджень у вигляді іереходів спіраль-клубок представлені на Рис.5, Рис.6, Рис. 7.

Темгералура^С)

Рис.5 Температурна залежність частки розплетених АТ-пар у комплексах (сіА)і5-(с1Т)іо (о, д) і СаА)і5(сіТ)іоРЬ (• ,-) при [іМа+]=0.1 М (а) та 1 М (б). Плавлення здійснювалося при 7=260 нм. Точки -експериментальні дані, суцільні криві -розрахунок за моделлю «застібка-блискавка».

Рис.6 Переходи спіраль-клубок у дуплексах, утворених (<іТ)іо (а) або (сІТ)іоРІі (о, +) з роІу(гА) при

[>Іа+]=0.1 М (а) та 1 М (б); дані (+) отримані за флюоресценпіими, а (Д, о) -за абсорбційними кривими плавлення при х=260 нм. Точки - експериментальні дані, суцільні криві - розрахунок за моделлю «двох станів».

Для оцінки термодинамічних характеристик комплсксоутворенш використовували просту модель «двох станів» (Табл.З). Слід відзначити, що, хоча цю модель звичайно використовують при подібних розрахунках, вона с напівемпіричною і дає лише усереднені термодинамічні параметри, не враховуючи фізичних механізмів комшіексоутворення. В нашому випадку термодинамічний аналіз переходів спіраль-клубок для комплексів декатимідилату з пентадекааденілатом ускладнюється імовірністю ефектів «прослизання» та утворення частково розплетених дуплексних та триплексних структур. Врахування цих ефектів здійснювалось за допомогою моделі «застібка-блискавка» (Табл.4). Розраховані за цією моделлю величини ентропії та ентальпії узгоджуються з калориметричними даними, отриманими іншими авторами.

Таблиця 3.

Термодинамічні характеристики переходів спіраль-клубок, розраховані за моделлю «двох станів»__________________________________________________________

Система Тип комплексу, [Ка+], т*ю., -ДН, -А Б, -Д Сітщ

співвідношення м °С ккал/моль кал/моль ккал1 моль

олігонуклеотидів ниток ниток-К. ниток

(<ІА)і5.(СІТЬ дуплекси, 1:1 0.1 19.7 49 142 7.4

1.0 34.8 60 147 7.85

ТріІПІЇСКиіґї, і и. і - - - -

1.0 '« 14 21 - -

дуплекси, 1:1 0.1 29 56 (60 7.7

1.0 44 65 180 8.0

триплекси, 1:2 0.1 « 12 20 - -

1.0 ' «33 26 - -

дурлсхси 1*1 0.1 С / О -

1.0 36.9 84 246 -

ро1у(гЛ)(с1Т)юРіі 0.1 38.8 г [ і оо і 257 -

1.0 ' 49.0 96 273 -

а Тш- температура, при якій 0= 1/2.

При термодинамічних розрахунках для комплексів, утворених олігонуклеотидами з ковалентно приєднаним барвником, модель була модифікована таким чином. Ковалентне приєднання барвника до одного з кінців олігонуклеотиду підвищує константу переходу дуплекс-розплетений стан, К ’і-2, що може бути враховано введенням константи стабільності, ад, для барвника

= ехр[(- АІІп + ТЛБп) / ЙТ] = 4*ехр{-о(7’-273)} (4)

де АНрь і АБи, - зміни ентальпії й ентропії при інтеркаляції барвника між основами протилежного ланцюга, що дає додаткові зв'язки олігонуклеотидів, .^-значення тпри 0 °С, а=АНрь/КТоТт, Го=273 К.

КІ2 = PY,{sfh{^i -n) + {Nl -и+ l)(tf2 -И + l)}s" (5)

паї

e p- параметр асоціації; л-констаита приєднання нової пари до

порядкованої ділянки дуплексу: In s = (л£, I r) - (ая, / Rt) де AHS і

lSs - зміни ентальпії та ентропії в цьому процесі, тобто різниця величин для порядкованого і розплетеного стапій; Nj і N2 - кількість мономерів у анщогах. У цій формулі передбачається, що існують: 1) дуплекси зі в’язаним барвником і 2) дуплекси, у яких барвник не інтеркалюс.

0 10 20 ЗО 40 50 60

Температура (°С)

Рис.7 Температурна залежність частки хугстинівських пар у розплетених комплексах (с1А)і5-2(<ГГ)т (о, д) і

С<ІА)і5-2(<ІТ)іоРЬ (• ) при [Ка+]=0.1 М

(а) та 1 М (б). Плавлення проводилося при Х=284 нм. Точки - експериментальні дані, суцільний криві - розрахунок за моделлю «застібка-блискавка».

Рис. 8 Абсорбційні криві плавлення при 266 нм для систем: ро1у(йА)-ро1у(<1Т) (+), (с!Т)[с*роІу((ЗА)-рс!у(с1Т) (Д) і

(сІТ)юРіі*роІу((іА)роІу(с1Т) (о) при

Р4а+]=1 М. Концентрації полімеру (у парах основ) і олігомерів (у залишках тиміау) однакові (200 цМ).

Встановлено, що ковалентне приєднання глікозида феназину д< оліготимідилату стабілізує трштаексні формувань останнього з ((1А)і5 при цьому температури плавлення триплексів підвищується на ~20 °С (Рис.7). При розрахунку термодинамічних параметрів для триплексни; комплексів з використанням моделі «застібки-блискавки» (Табл.4 припускали, що третя нитка приєднується до вже сформованого дуплексу Для олігонухлеотидів без барвника такий підхід дозволяє використовувати для розрахунків константи рівноваги приєднання мономера третього ланцюга до дуплексу, Кг-з, формулу, аналогічну (5), але при №=№, том> що довжини дуплексу і триплексу однакові.

Таблиця 4.

Термодинамічні характеристики переходів шіраль-клубок, розраховані за моделлю «застібка-блискавка»_____________________________________________________

Система Тип комплексу, співвідношенім олігонуклеогидів Р*а1, М Тт. °С -ЛН5, ккал/моль пар оси. -да, кал/моль пар осн. К У < а,

((іАЬЧгіТЬ дуплекси, 1:1 0.1 19,7 5.8 17.04 10-7

1.0 34.8 Г 6,1 17.09 10-7

триплекси, 1:2 0.1 - 3.5 11.38 ю-5

1.0 »14 3.85 11.38 10-5

дуплекен, 0.1 25 С>.о і 7.04 і0-г зии 0.05

1.0 44 6.1 17.09 10-7 300 0.05

триплекси, 1:2 0.1 я12 3.5 11.38 10-5 2000 0.05

1.0 «33 3.85 11.38 10-5 2000 0.05

Також було встановлено, що ковалентно приєднаний до оліготимідилату глікозид феназину стабілізує його тришісксні формування з двонитковою полімерною послідовністю роІу(&А.)-ро1у(сіТ). На Рисунку В приведені криві плавлення комплексів, що утворені модифікованим та немодифікованим декатимідилатами з ро1у((1А)-ро1у(с1Т), біфазність яких свідчить про наявність двох переходів в системах, з яких низькотемпературні переходи г характеризують відділення олігонуклеотидного ланцюга від двониткового полінуклеотиду, а високотемпературні належать роіу(бА) ро!у(сіТ). З цього рисунку видно, що приєднаний феназин зсуває низькотемпературний перехід у бік вищих температур приблизно на 15 °С.

висновки

1. Методом поляризованої флюоресценції показано, що взаємодія шістьох нових похідних феназину з ДНК здійснюється шляхом штеркаляци.

2. Форма ізотерм зв'язуваній свідчить про те, що для катіонних похідних

феназину крім інтеркапяції здійснюється зовнішнє приєднання молекул барвника до фосфатних груп ДНК. ■ -

3. Показано, що зовнішнє зв’язування має кооперативний характер, який через сильні гідрофобні ефекти виявляється навіть в умовах конкуренції з

іонами Ка+ за місця зовнішнього приєднання при фізіологічних значеннях іонної сили.

4. Запропоновано модифікацію рівнянь МакГі і ван Хіппела з метою врахування кулонівського відштовхування між приєднаними хромофорами, яка дозволяє адекватно описати експериментальні ізотерми зв'язувати. Отримані кількісні характеристики зв'язування похідних феназину з ДНК.

5. Методом термічної денатурації виявлено, що ковалентно приєднаний імідазофеназин стабілізує як дуплексні, так і триплексні формування олігонуклеотидів.

6. Встановлено, що приєднання до олігонуклеотиду барвника у вигляді нуклеозидного похідного забезпечує не менший ефект стабілізації дуплексних формувань, ніж приєднання на лііпсері. Однак, перевага нового способу модифікації олігонуклеотидів полягає у тому, що він зумовлює стерично однозначне положення хромофору в дуплексі, отже, барвник служить надійною флюоресцентного міткою гібридизації. З погляду термодинаміки, при однозначному розташуванні хромофора в комплексі немає програшу в ентропії, який може давати довгий лінкер.

7. Виявлено, що ковалентне приєднання до олігонуклеотиду імідазофеназину призводить до більшого ефекту стабілізації триплексних формувань, ніж модифікація звичайними трициклічними барвниками. Наявність четвертого плоского кільця в молекулі імідазофеназину забезпечує більше перекриття площини хромофору з площинами основ двониткової мішені.

8. Показано, що звичайна модель «двох станів» дозволяє оцінювати лише

уССрСДКСЙі ТСрМОДИНа\1їЧН1 ХараКТсрЙСТйКИ ПсрслОДШ СПІрйЛЬ-КЛуООК (ентропію, ентальпію та вільну енергію) і не враховує ефекту «розплетення кінців». З метою врахування імовірність утворення частково зв'язаних структур було застосовано модель «застібка-блискавка». Запропоновано модифікацію цієї моделі, яка дозволяє описати переходи спіраль-клубок як у дуплексах, так і в триплексах, утворених олігонуклеотидами, модифікованими барвником.

9. Пропонується використання 1\ІЬр-0-рібофураігозид імідазо(4,5-(і)-феназину як ефективного стабілізатора молекулярної гібридизації при розробці лікарських препаратів ген-спрямованої дії.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Благой Ю.П., Зозуля В.Н., Волошин И.М., Макитрук В.Л., Шаламай А.С., Щербакова А.С. Исследование взаимодействия производных феназина с ДНК методом поляризованной флуоресценции // Биополимеры иклетка.-1997.-т.13.- №1.-с.22-29.

2. Зозуля В.М., Благой Ю.П., Дубей 1.Я., Федоряк О.Д., Щербакова А.С., Федоряк Д.М. Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів

оліготимідшіату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину / Биополимеры и кяетка.-1998.-т. 14.-№1 .-с.1-8.

3. Благой Ю.П., Зозуля В.Н., Щербакова А.С. Термодинамика переходої

спираль-клубок в дуплексных' и триплексных комплекса) олигоаденилата с олиготимидилатом. Влияние ковалентне присоединенного красителя // Віся. Харк. ун-ту №410, Біофізичний ВІШИК.-1998.-ВИП.1.-С.21-32. .

4. Zozulya V.N., Shcherbakova A.S., Blagoi Yu.P. Effect of Mg2+ on double and triple helix formations between poly(dA) and poly(dT) // Вісн. Харк. унту №466, Біофізичний вісник.-1999.-вип.5(3).-с.7-10.

5. Shcherbakova A., Zozulya V., Dubey I., Lober G., Fedoryak D. Fluorescence study of molecular hybridization of oligonucleotides modified with nucleoside phenazine derivative // J. Int. Federation for Med. & Biomed. Eng.-1997,-V.35, Suppl. Part I.-P. 122.

6. Shcherbakova A., Zozulya V., Blagoi Yu., Lober G., Winter S. Fluorescence properties of phenazine derivatives in complexes with DNA И Vth Int. Conf. Methods & Applicat. Fiuor.Spectr. - Berlin - Germany, 1997. - Book of abstracts. - P. 168.

7. Zozulya V., Blagoi Yu., Lober G., Shcherbakova A. Fluorescence investigation on double and triple helix formation by oligothymidylate- linked to nucleoside phenazine //Vth Int. Conf. Methods & Applicat. Fluor. Spectr. -Berlin - Germany. - 1997. - Book of abstracts. - P. 212-213.

8. Щерабокова A.C., Зозуля B.M., Благой Ю.П., Волошин I.M. Спектроскопічне дослідження ■ зв’язування шістьох похідних феназинового барвнику з ДНК // Тези доп. II з’їзду Укр. Біофіз. тов. 29 червня -3 липня і 998, Jvlisiicov. - v.. ой.

9. Zozulya V., Shcherbakova A. Calculation helix-to-coil transitions of duplexes formed by phenazine-conjugated oligonucleotide, using fluorescence melting data // Book of Abstract. The Jablonski Cent. Conf. Lumin. and Photophys. -Torun-Poland, 1998 - P. 305-306.

Ю. Zozulya V.N., Blagoi Yu.P., Dubey I.Y., Fedoryak O.D., Shcherbakova A.S., Fedoryak D.M. Investigation on molecular hybridization of oligonucleotides modified with a phena-zine derivative by spectroscopic techniques II Book of abstr. Conf. Physics of Biol. Systems.- Poushcha-Vodytsa (Kyiv, Ukraine), 1998. - P. 51.

И. Zozulya V., Blagoi Yu., Dubey I., Shcherbakova A., Sorokin V. Fluorescence investiga-tion of Na+ and Mg++ effects on double and triple helix formations by phenazine-decathymidylate conjugate // Book of abstr. 6th International Conference on Methods and Applications of fluorescence spectroscopy. Paris-France, 12-15 September 1999. - P23.

12. Shcherbakova A., Zozulya V., Blagoi Yu. Effect of Na+ and Mg2+ on double-helix-to-coil transition of poly(dA)*poly(dT) // Spectrosc. Biol. Moleculcs: New Directions. Ed. J. Greve, G.J. Puppels and C. Otto. Kluwer Academic Publishers. Dordreght - Boston - London. - 1999. - P. 261-262.

АНОТАЦІЯ

Щербакова А.С. Фізичні механізми взаємодії барвників феназинового ряду з нуклеїновими кислотами. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-іатематичних наук за спеціальністю 03.00.02-біофізика.-Харківський іаціональний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2000.

Вивчено взаємодію з ДНК шістьох нових похідних феназину, які іалежать до глікозидів та четвертинних солей, методами поляризованої [злюоресценції та абсорбційної спектроскопії. Показано, що основним ■ипом зв'язування феназинів з нейтральною формою хромофора є нтеркаляція. Для катіонних барвників, крім інтеркаляційиого механізму, стотний внесок у комплексоутворення робить кооперативна :лектростатична взаємодія з фосфатними групами. При аналізі процесу ів'язування використовували рівняння МакГІ та пан Хіппела, модифіковані ! метою врахування енергії кулонівського відштовхування між щеорбованими молекулами барвника. Подібна модифікація дозволяє з сорошою точністю описати експериментальні ізотерми зв'язування.

Методом термічної денатурацп з використанням абсорбційної і флюоресцентно-! спектроскопії показано, що ковалентне приєднання до зліг отим іДИЛаї 3' глшозидз. феназину сіректшшо стабілізує молекулярну ібридизацію, підвищуючи температуру плавлення дуплексних комплексів сіТ)[о з (dA)l5 та роІу(гА) на 10~! 2 °С і триплексних структур з зо1у((1А)-ро1у(сГТ) та (іА)і5 на 15-20 °С. Проведено термодинамічний аналіз тереходів спіраль-клубок для комплексів (<1А)і5 з (сІТ)ю та (сГГ)юРЬ за допомогою моделей «двох станів» та «застібки-блискавкн». Модифікація моделі «засгібка-блискавка» вперше дозволила провести розрахунки термодинамічних параметрів з урахуванням імовірності формування частково розплетених дуплексних ‘ та триплексних структур, що утворюються олігонуклеотидом, модифікованим барвником.

КЛЮЧОВІ СЛОВА: феназин, іитеркаляція, дуплекси, триплекси, модифіковані олігонуклеотиди, термічна денатурація, флюоресценція, перехід спіраль-клубок.

АННОТАЦИЯ

Щербакова А.С. Физические механизмы взаимодействия красителей феназинового ряда с нуклеиновыми кислотами, -Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата физикоматематических наук по специальности 03.00.02-биофизика.-Харьковский национальный университет им. Каразина, Харьков, 2000.

Методами поляризованной флюоресценции и абсорбционной спектроскопии изучено взаимодействие с ДНК шести производных феназина, относящихся к пшкозидам и четвертичным солям. Исследованы

спектрально-флуоресцентные свойства свободных красителей и их комплексов с ДНК. Показано, что основным типом связывания феназинов с нейтральной формой хромофора является интеркаляция молекул красителя между плоскостями оснований двойной спирали ДНК. Для катионных красителей помимо. интеркаляционного механизма существенный вклад в комплексообразование вносит кооперативное электростатическое взаимодействие с фосфатными группами, проявляющееся за счет сильных гидрофобных эффектов как при низкой ([Ка+]=0.002 М), так и при умеренной ([Ыа+]=0.1 М) ионных силах раствора. При анализе процесса связывания использовали уравнения МакГи VI ван Хиппсла. модифицированные для учета энергии кулоновского отталкивания между адсорбированными молекулами красителя. Подобная модификация позволяет с хорошей точностью описать экспериментальные изотермы связывания.

Методом термической денатурации с использованием абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии исследовано влияние ковалентного присоединения гликозида феназина на формирование комплементарных комплексов (сЗТ)т'— дуплекса с (с!А)15 и триплексов с (аА)15-(йТ)щ и ро1у(<ЗА)-ро!у(<1Т) — в-буферных растворах с нейтральным pH при двух значениях ионной силы раствора: рЧа+1= 0.1 и 1 М. Показано, что гликозид феназина стабилизирует образующиеся дуплексные и триплексные комплексы за счет шперкаляции хромофора красителя в последовательность ёА и с1А-(1Т. Температура плавления комплексов возрастала на 10-12 °С для дуплексных и на 15-20 °С для триплексных структур. Стабилизирующее действие нейтрального имидазофеназина на дуплексные формирования оказалось сравнимым по величине с тем, которое оказывают катионные • интеркалирующие красители, присоединяемые к олигонуклеотидам через полиметиленовый линкер, а стабилизация триплексов четырехциклическим хромофором оказалась выше, чем обычно используемыми трехциклическими красителями. Проведен термодинамический анализ переходов спираль-клубок комплексов олигонуклеотидов (<дА)15 с (<1Т)ю, а также с олиготимидилатом, модифицированным феназином, (ёТ)юРЬ, при молярном соотношениях нитей аденин:тимин -1:1 и 3:2 и значениях ионной силы раствора рЯа+]=0.1 и 1 М. С помощью модели «двух состояний» и модели «застежка-молния» рассчитаны термодинамические параметры переходов АН, ДБ и АС. Обнаружено отклонение экспериментальных зависимостей от модели «двух состояний» для дуплексов, образованных олигонуклеотидом с ковалентно присоединенным феназинрм. Этот эффект интерпретируется как результат влияния примесного триплексного состояния. С помощью

>асчетов но модели «застежка-молния» установлено, что концевые группы ;омплсксов находятся в частично разупорядоченном состоянии, степень оторого возрастает с повышением температуры. Предложена юдификация этой модели для описания процесса комплексообразования, >существляемого олигонуклеотидом с присоединенным лигандом. Токазано, что укрепление дуплексных и триплексных комплексов за счет :овалентного присоединения красителя к олигонуклеотиду может быть 'чтено путем умножения константы связывания комплекса на константу грисоединения красителя к комплиментарной структуре.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: феназин, шггеркаляция, дуплексы,

риплексы, модифицированные олигонуклеотиды, термическая денатурация, флуоресценция, переход спираль-клубок.

SUMMARY

Shcherbakova A.S. Physical mechanisms of interaction of phenazine dyes vith nucleic acids.-Manuscript.

Thesis for candidate’s degree by speciality 03.00.02-Biophysics.-V.N. iarazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2000.

The interaction of six phenazine derivatives belonging to glycosides and quaternary salts with DNA was studied by fluorescence polarized and ibsorption methods. It was shown that the main type of binding of phenazines with a neutral chromophore is the dye intercalation between base pairs of the DNA double helix. For cationic dyes besides the intercalation the cooperative “lectrostatic interaction with phosphate groups makes the essential contribution :o the complex formation. The equations of McGhee and von Hippel, which ,vere modified to take into account coulombic repulsion between charged molecules bound to DNA, were used for the binding process analysis. Such modification makes it possible to describe experimental binding isotherms.

By thermal denaturation methods using absorption and fluorescence spectroscopy it was shown, that covalent attachment of the glycoside phenazine to the oligothymidylate stabilizes effectively a molecular hybridization, increasing the melting temperature for the duplexes of (dT)io with (dA)is or poly(rA) by 10-12 °C and triplexes with poly(dA)-po!y(dT) or (dA)is by 15-20 ЭС. The helix-to-coil transition for complexes of (dA)is with (dT)m and/or (dT)ioPh have been thermodynamically analyzed using «all-ог-попе» and «staggering zipper» models. Modification of the «staggering zipper» model permits firstly to fit the helix-to-coil transition for complexes formed by dye-modified oligonucleotide, taking into account that terminal group of the complexes are in a partially disordered state the degree of which increases with temperature. '

KEY WORDS: Phenazine, intercalation, duplexes, triplexes, modified oligonucleotides, melting, fluorescence, helix-to-coil transition.