Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фенотипические эффекты гетерозиготного носительства мутаций гена фенилаланингидроксилазы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сарычева, Елена Алексеевна, Москва

ПА

российская академия медицинских наук

медико-генетический научный центр

На правах рукописи удк 618.3+577.112.3

САРЫЧЕВА Елена Алексеевна

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ГЕТЕРОЗИГОТНОГО НОСИТЕЛЬСТВА МУТАЦИЙ ГЕНА ФЕН И Л АЛ АН И Н ГИ Д РО КС И Л АЗЫ

03. 00. 15.-ГЕНЕТИКА

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: член-корр. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В.П. Иванов; доктор биологических наук, профессор О .В. Евграфов

МОСКВА - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ,.,.,,.,.,,,........„,....„.,.,....,„..„„..,.,.,.,„„...,.,..,..,„„„„..„„...,..,.....5

ВВЕДЕНИЕ,,,,,,,.,..............................................................................................................Л

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1, Фенилаианин, его характеристика и метаболизм в организме,,,.,,,.,.,,.13

1ЛЛ, Общая характеристика аминокислоты феннлаланин.................Л3

1.1,2. Метаболизм фешшаланинав организме человека...........................18

1.2, Состояния обмена фенияаланина в организме беременных женщин

в норме и при иатологиях................................................................24

1.3, Фенилапаиннгидроксилаза - мажорный фермент фенилаяанингидрокси лазной системы,,= ,,.,26

1.4, Локусы и гены ФАГ-еистемы.........,,,,,,,.,.,,,,,,.,,,.,...,...,,,,.,,.,,...,.,........31

1,4Л. Ген ФАГ.................................................................................................31

1.4.2. Мутации в гене ФАГ..........................................................................33

1.4.3. Мутации в генах РЕЕ и ВНРК.............................................,.,,...,.,35

1.5, Фенилкетонурия, особенности ее клинического проявления и популя-

цнонная характеристика.....,,,,.,,.,,,..,,.,...,.........................................3?

1.6, Г етерозиготное носительсгво мутаций генов ФАГ-еистемы, медицинские и социальные аспекты.............................................................42

1,6,1 .Общая характеристика гетерозиготных носителей мутаций генов

ФАГ-сисгемы.................................................................................43

1,6,2. Гетерозиготное носительсгво мутаций генов ФАГ-систеиы беремен-ньшй женщинами,= 47 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2,1. Характеристика изучаемых выборок и программ исследования,,. .,,,52 ,2. Метод анкетирования.........................................................................56

2.3, Биохимические методы.....................................................................56

2.4, Молекузтарно-генегичесжиеметчшы,.,,,,..,,.,,,,,.,,60

2.5, Методы статистической обработки.......................................................66

-1

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 3, Биохимическое и молекуяярно- генетическое обследование в

семьях больных феншжегонурией............................................70

3.!. Результаты молекуяярно-генетического анализа семей больных

фенилкетонурией,,,, ,.,,....,..,..,.,,,,...,,......,,,,.,.,,..,.,............,........,,....,,71

3.2. Изучение количественного содержания фенилаланина в крови больных фенишеетонурией.....................................................................73

3.3. Изучение показателей ФЕН-ТИР обмена у родителей больных ФКУ (гетерозиготные носители).........,.,,.........,...........................................74

3.4. Сравнительное изучение содержания фенилаланина в цельной крови гетерозиготных носителей мутаций генов ФАГ-системы, определенное разными биохимическими методами..................................................77

3.5. Обсуждение,....,.........,....,.,,..,,..,.,..,. ....................................................77

Глава. 4. Пилотный скрининг беременных женщин на содержание фенила-

ланина..........................................................................................8!

4.1, Концентрация фенилаланина и возраст беременных женщин... ,,,,.,...,,8!

4.2, Вариабельность содержания фенилаланина в зависимости от времени с момента последнего приема пиши до забора крови.,..,........,,.,..,..,..81

4.3, Содержание фенилаланина и срок беременности............................. ....85

4.4, Многомерный анализ вариабельности содержания фенилаланина у беременных женщин...........................................................................89

4.5, Обсуждение,,,.,,,................................................................,..,.,,,.......,.,.,.94

Глава 5, Изучение количественного содержания показателей ФЕН-ТИР обмена у женщин иа различных сроках беременности и оценка их влияния на кощентрацию фенилаланина в крови новорожденных.,,.,,,.,.,,.,,,. .96

5.1, Вариабельность содержания фенилаланина у женщин на разных сроках беременности.,,,.,.,..,..,,,.,,,.........,,.,,,.................................... .,..96

5.2, Оценка вариабельность содержания тирозина и количественного соотношения содержания фенилаланина и тирозина у женщин на разных сроках беременности.....................................................................................101

5.3, Многомерный анализ вариабельности содержания показателей ФЕН-ТИР обмена и ряда фенотипических характеристик женщин во время беременности и оценка их взаимосвязи с концентрацией фенияаланина новорожденных...............................................................................................................................................105

5.4, Обсуждение.........................................................................................113

Глава 6, Мшгекуларно-генетический анализ малых мутаций 5, 7 и 12 эк-

зонов гена фенилаланннгндроксилазы у беременных женщин. Л15

6.1. Результаты детекции мажорной мутации R408W............................115

6.2. Результаты детекции генетических повреждений в 5 и 7 экзонах гена ФАГ........................................................................................................ Ш

6.3. Обсуждение...........................................................................................117

Глава 7. Изучение количественного содержания показателей ФЕН-ТИР

обмена у женщин гетерозиготных носителей мутаций гена фенияала-нингидроксилазы и оценка их взаимосвязи с концентрацией фенилаланина и росго-весовьшн показателями новорожденных.................. 120

7,¡.Оценка вариабельности количественных показателей ФЕН-ТИР обмена у женщин гетерозиготных носителей мутации R408W гена ФАГ на различных сроках беременности........................................................121

7.2. Оценка количественного содержания показателем ФЕН-ТИР обмена у беременных женщин носителей фрагментов ДНК с аномальной подвижностью, включающие 5 и 7 экзоны гена ФАГ.............................127

7.3. Многомерный сравнительно-статистический анализ показателей ФЕН-ТИР обмена у беременных женщин и оценка их влияния на фе-нотияичеекиепоказатели новорожденных.,....,...,............,,...,,,,..,,,,,,.,.,130

7.4. Обсуждение.,...,,,.......,.,...,.....,,................,,,.142

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.,,.,.,.......,,.,..,.,...,,.,..,,,.,....,..,...,,.,.....,„....„.,„.,...„.„...,,,.„„..,„„„.„„„„„145

ВЫВОДЫ..,..,,........................................ ...........................................................................156

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.,,,.,.-,,,,,,,,,,, „„„„,„„ ............................15?

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................„...,..........,.,.....,.„...158

ПРИЛОЖЕНИЕ,.,,,,.........................................................................................................„178

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ. СОКРАЩЕНИЙ

АА - акридам ид; Б А - ыегилбйсакрнламид; ГФА - гиперфенмлаланинемия; ДШР (DHPR) - дашщроптеридинредуктаза; ДГФР - дигидрофолатредуктаза; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ДОФА - 3, 4- дигидрофенилаланин; ЗПР - задержка психического развития; ЛДФ - линейно-дискриминантная функция; МПС - медико-генетическая консультация; НАД - никотинамвдаденяндинуклеотид; НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат; ОКБ » областная клиническая больница: ПААГ - полиакриламидный гель;

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов;

ПСА - персульфат аммония;

ПТС (РЕЕ) - 6-пирувилтетрагидроптерин синтеза,

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

1АЕ - трис-ацегатный злектрофорезный буфф;

TBE - трис-боратный электрофорезный буфер;

ТЕМЕД - Ы,Ы,Н/К,-теграметиш1!амидэт1шен;

ТИР - тирозин;

ТРИ - триптофан;

ФАГ (РАН) - фенияаланнн-4-гидрокеилаза;

ФЕН •• фенилаланин;

ФКУ - фенилкетоьг/рия;

ФМК - феннлмолочная кислота:

ФПК - фенилпировиноградная кислота; ФУК -■ феншгукеуеная кислота; ФЭА - фенилэтияамин;

ЭДТА •• этилендиамин- N'N'N'N - тетрауксуная кислота; ВНг - дигидробиоптерин; BI14 ■■ тетрагидробиоптерин; SDS - додецилсульфат натрия; SSCP - single -strand conformation polymorphysm

(одноцепочечный конфирмационный полиморфизм): т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов; п.н, - пара нуклеотидов;

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы.

В исследованиях последних лет отмечается тревожная тенденция роста количества детей с задержкой психического и физического развития. (Трифонова ВА., Степанова O.A., 1998).

По данным ООН на сегодняшний день в мире насчитывается 450 миллионов людей с нарушенным психическим и физическим развитием, что составляет 1/10 часть жителей нашей планеты. Данные Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) свидетельствуют, что число таких жителей в мире достигает 13 % , из них 3 % детей рождаются с недостатками интеллекта и 10 % детей - с другими психическими и физическими нарушениями (Карвялис В., 1998).

В связи с этим особенно остро встают вопросы раннего распознавания, квалифицированной диагностики и устранения причин развития де-

1 п г» и о»

фектов. Возникновение оольшеи части нарушении ооусловлено экзогенными и эндогенными факторами, оказывающими воздействие на плод во время беременности. Одним из таких факторов может рассматриваться повышенный уровень фенилаланина (ФЕН) в материнском организме.

В научной литературе накоплен большой фактический материал, свидетельствующий о патогенном влиянии гиперфенилаланинемии матери на развивающийся плод. Об этом свидетельствуют данные, полученные при изучении случаев материнской фенилкетонурии (ФКУ). До 1/3 детей матерей с ФКУ страдают олигофренией, сочетающейся с различными аномалиями и пороками развития, не связанными с нарушениями обмена. У них наблюдаются многочисленные дефекты: до 12% детей страдают врожденными пороками развития сердечно-сосудистой системы, до 40% - внутриутробной задержкой роста, до 73% - микроцефалией (Hanlev W.B. and et.al., 1987, Koch R. andet.al., 1986, Fisch R.O. andet.al., 1993).

Исследование уровня фенилаланина в крови у родителей больных ФКУ, которые являются облигатными гетерозиготными носителями, пока-

зало увеличение его количественного содержания, но невыходящее за пределы нормы по сравнению с аналогичными показателями у лиц в семейном анамнезе которых не выявлено случаев данного заболевания (Блюмина М.Г., 1973; Ситниченко Е.И., 1974, Юргелявичюс- В.В., 1987), Однако в условиях повышенных требований к обмену, одним из которых является беременность, у гетерозиготных носителей может происходить декомпенсация скрытого дефекта обмена, которая вызывает временное повышение концентрации ФЕН в крови, оказывающие неблагоприятное воздействие на развивающийся плод (Лебедев Б.В., 1970; Блюмина М.Г., 1973). Имеются, хотя и единичные, данные о поражении ЦНС и внутриутробного развития детей от матерей, гетерозиготных носителей ФКУ-мутаций (Кшег С., 1979). Это обстоятельство дает основание рассматривать каждую беременность таких женщин прежде всего как состояние риска.

Несмотря на довольно широкое изучение проблемы фенилкетону-рии, исследованию содержания основных показателей фенилаланин-тирозинового (ФЕН-ТИР) обмена у гегерозиготных носителей мутаций генов фенилаланингидроксилазной системы (ФАГ-системы) во время беременности не уделено должного внимания. Остаются открытыми вопросы о возможных путях выявления носительства ФКУ-мутаций у женщин во время беременности с использованием современных биохимических методов. Отсутствует исчерпывающая информация о взаимосвязи показателей количественного содержания ФЕН в крови женщин гетерозиготных носителей мутаций гена фенилаланингидроксилазы (ФАГ) во время беременности с его концентрацией и соматометрическими характеристиками новорожденных. Все выше изложенное и определило проведение настоящего исследования.

Цель исследования,

Установить количественное содержание фенилаланина в крови женщин на различных сроках беременности с использованием современ-

ных биохимических методов в рамках пилотной программы скрининга для определения возможных путей выявления гетерозиготного носительства мутаций гена фен и лалан и нгидрокси лазы этими методами и оценки влияния концентрации фенилаланина в крови беременных женщин на плод,

Основные задачи исследования.

1. Определить частоту встречаемости фенилкетонурии в Курской области по данным массового неонатального скрининга и установить вклад мажорной в европейских популяциях мутации Я408Л¥ гена фешгаа-ланингидроксилазы в развитии заболевания.

2. Изучить количественное содержание фенилаланина в крови родителей больных фенилкетонурией (гетерозиготные носители мутаций в генах фенилаланингидроксилазной системы).

3. Оценить вариабельность содержания фенилаланина и установить характер его варьирования в крови женщин на различных сроках беременности.

4. Проанализировать наличие мугаций в гене фенилаланингидро-ксилазы у женщин с повышенным содержанием фенилаланина в крови во время беременности и оценить их распространенность.

5.Исследовать взаимосвязи показателей количественного содержания фенилаланина в крови женщин гетерозиготных носителей мутаций гена фенилаланингидроксилазы во время беременности с его концентрацией и росто-весовыми характеристикам и у новорожденных.

Научная новизна работы.

Впервые в Курской области установлена частота распространения ФКУ и проведен молекулярно-генетический анализ локуса гена ФАГ с изучением распространения доминирующей в европейских популяциях мутации К.408\¥ гена ФАГ в пораженных ФКУ семьях.

Впервые проведено изучение вариабельности содержания фенила-ланина и характера его варьирования в крови женщин на различных сроках беременности в рамках пилотной программы скрининга с использованием современного биохимического метода - флюорометрии.

Получены количественные характеристик и основных показателей фенилаланин-тирозинового обмена в крови гетерозиготных носителей мутаций гена фенилаланингидроксилазы во время беременности.

Практическая значимость.

Проведенная работа по выявлению наиболее распространенной мутации гена фенилаланингидроксилазы в Курской области определила информативность отягощенных по ФКУ семей и может быть использована для молекулярно-генетического тестирования гетерозиготного носитель-ства у родителей и сибсов больных фенилкетонурией и пренатальной диагностики ФКУ в клинической практике методом прямой детекции мутации Я408\¥ гена ФАГ.

Полученные результаты по вариабельности концентрации фенила-ланина в крови женщин на различных сроках беременности могут быть использованы при проведении массового обследования беременных с целью определения количественного содержания фенилаланина в крови с использованием флюорометрического метода для формирования группы женщин по предполагаемому носительству ФКУ-мутаций с последующим проведением молекулярно-генетического тестирования гетерозиготного носитель-етва и пренатальной диагностики ФКУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Частота фенилкетонурии в Курской области по результатам массового неонатального скрининга составляет 1:5923, Доля мутации К408\¥ гена фенилаланингидроксилазы составляет 61,3%, что согласуется с данными у славян и представителей европейской части России.

2. Изучение содержания фенилапанина флюорометрическим методом у гетерозиготных носителей мутаций в генах фенилаланингидрокси-лазной системы показало его вариабельность в пределах от 0,7 до 2,0 мг%, при этом среднее значение концентрации фенилапанина составило 1,25 мг%,

3. Впервые в России выполнена пилотная программа скрининга беременных на содержание фенилапанина с использованием современных биохимических методов. Уровень фенилапанина в крови женщин варьирует в пределах от 0,1 до 3,7 мг% на различных сроках беременности и характеризуется снижением его содержания во втором триместре беременности по сравнению с первым и повышением в третьем триместре беременности.

4. У беременных женщин с содержанием фенилапанина в крови > 1,2 мг% во время беременности частота встречаемости мутаций 5, 7 и 12 экзонов гена фенилаланингидроксилазы в 12,6 раза превышала таковую среди беременных женщин с содержанием фенилапанина <1,1 мг%.

5. Различные типы мутаций гена фенилаланингидроксилазы у гетерозиготных носителей во время беременности имеют одинаковое феноти-пическое проявление на уровне показателей количественного содержания фенилапанина в крови.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертационной работы представлялись на I Всероссийской конференции "Медико-генетическое консультирование в профилактике инвалидизирующей наследственной патологии" (Москва, 1997), конференциях молодых ученых КГМУ (Курск, 1997, 1998. 1999). Всероссийской конференции "Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики наследственных заболеваний у детей'7 (Москва, ¡998), Республиканской конференции студентов и молодых ученых медицинских вузов

России (Самара, $999), межкафедральном заседании сотрудников КГПУ и КГМУ (Курск, 1999), межлабораторном семинаре в Институте клинической генетике МГНЦ РАМН (Москва, 1999). По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 5 глав результатов собственных исследований и обсуждений, заключение и выводы, практические рекомендации. Указатель литературы включает 204 источника, из них 6