Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фенотипическая изменчивость в популяции клеток Escherichia coli, содержащих циклические дигенные системы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Фенотипическая изменчивость в популяции клеток Escherichia coli, содержащих циклические дигенные системы"

На правах рукописи

Ступак Игорь Валериевич

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ В ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИХ ЦИКЛИЧЕСКИЕ ДИГЕННЫЕ СИСТЕМЫ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА - 2006

Работа выполнена в лаборатории математической и молекулярной генетики Института биологии Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Чураев Рустэм Нурович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович кандидат биологических наук Блинов Александр Геннадьевич

Ведущая организация: Казанский государственный университет

Защита состоится 5 июля 2006 г., в 16 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Адрес: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан 3 июня 2006 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного

совета, к.б.н.

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изменчивость является одной из фундаментальных характеристик живых систем. В последнее время, кроме наследственной и ненаследственной (модификационной) изменчивости стали выделять эпигенетическую изменчивость, объединяющую явления, основанные на различных механизмах и не укладывающиеся в традиционные представления. Возобновился интерес к, казалось бы, давно забытой проблеме наследования приобретённых признаков (Jablonka, Lamb, 1989; Landman, 1991; Голубовский, 2001); обсуждаются и необычные филогенетические феномены, такие как стресс-индуцируемая эволюция (Маркель, 2000). Более того, формируется новая ветвь генетики — эпигенетика, изучающая наследственные изменения генной экспрессии, которые происходят без изменения нуклеотидной последовательности ДНК (Riggs, Porter, 1996; Wolffe, Matzke, 1999).

Одним из механизмов эпигенетической изменчивости является наследование признаков, основанное на регуляторных взаимодействиях в циклических генных сетях. Гипотеза о существовании эпигенов— особых наследственных единиц, имеющих не менее двух режимов функционирования подчинённых им генов, способных сохранять каждый из режимов в последовательном ряду поколений, была выдвинута в 1975 году (Чураев, 1975). Существование эпигенов как наследственных единиц следующего уровня сложности, чем гены, было доказано в рамках теоретической математической модели системы управления онтогенезом общего вида (Tchuraev, 2000). Так же было показано наличие бис-табильных генетических модулей, имеющих свойства эпигенов (Tchuraev, 2005) в генных сетях, управляющих ранним развитием Drosophila.

Одним из классов эпигенов являются циклические системы генов. Экспериментальное изучение функционирования искусственных циклических диген-ных систем с отрицательными обратными связями (ЦЦС<_>) в клетке, позволяет расширить представление об особенностях эпигенетической изменчивости и оценить влияние внешних и внутренних факторов на устойчивость наследования альтернативных фенотипических состояний.

3

Цель работы - изучение функционирования ЦДСН в клетках Escherichia coli, по фенотипическим изменениям в бактериальных популяциях, подвергшихся действию различных индуцирующих факторов.

Задачи исследования:

1. Конструирование ЦЦС(~', содержащей ген lacl под контролем промотора PL и ген с1$57 термочувствительного репрессора бактериофага X под контролем промотора Р|ас.

2. Экспериментальное тестирование ожидаемых функциональных свойств полученной рекомбинантной плазмиды.

3. Сравнение свойств ЦДС("\ отличающихся особенностями регуляторных районов или областями репликации плазмид-носителей.

4. Исследование функционирования ЦДС^ в составе трёхгенной системы.

5. Исследование устойчивости режимов работы ЦДСН к стрессовым воздействиям среды.

Научная новизна исследования. Впервые: сконструирована особая наследственная единица (эпиген), которая может кодировать, хранить и передавать в ряду клеточных поколений изменения функционального состояния, вызванные внешними специфическими сигналами, без изменения ДНК-последовательностей входящих в систему генов; исследовано наследование и переключение фенотипов бактериальных клеток, содержащих ЦЦС*-*, в процессе роста колонии на индикаторной среде в постоянных условиях; показана зависимость функционирования ЦЦС^ от области репликации плазмиды носителя; экспериментально смоделировано изменение динамики функционирования генных сетей, при дупликации структурной части одного из генов ЦДС<_); показано влияние стрессовых факторов на функциональные свойства ЦДС<_).

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследования способствуют пониманию возможной роли ЦДС(_) в эпигенетической изменчивости, как структуры, реагирующей на внешние временные сигнальные воздействия переключением регуляторных режимов функционирования генов.

Также полученные результаты имеют значение для развития представления о взаимодействии бистабильных модулей клеточной памяти с регуляторными системами клетки. ЦДС<_) могут быть использованы для управляемого биосинтеза и контроля клеточного роста в биотехнологии. Принимая во внимание, что такие генетические системы по существу представляют ячейку памяти, способную «запоминать» двоичные сигналы, в дальнейшем возможно использование ЦДС'*' для создания искусственной генной памяти систем управления онтогенезом клетки, а также в генной терапии — для адресного воздействия и включения компенсаторных генов в нужный момент при лечении наследственных заболеваний.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II (Санкт-Петербург, 2000) и III (Москва, 2004) съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 9 и 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объём диссертации. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 204 источника (47 работ отечественных и 157 работ зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 4 схемами, 7 диаграммами и 23 фотографиями.

Благодарности. Считаю своей приятной обязанностью выразить признательность моему научному руководителю д.б.н. проф Чураеву Р. Н.( сотрудникам института биологии м.н.с. Ступак Е. Э., к.б.н. Галимзянову А. В., к.б.н. Гапимзяновой Н. Ф., к.б.н. Миграновой И. Г., сотрудникам института Органической химии к.х.н. Астахову С. С., к.х.н. Алябьеву А. С.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Экспериментальную работу проводили на клетках E.coli штамма JC158 Ilfr Р01, thil, serA6, lac!22, relAl (Murphy, Pembroke, 1995), содержащих циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦЦСН), локализованную на плазмидах pCEPI (Tchuraev et al., 2000), pCIA2 или pCIK3 (предоставлены J.J. Collins, Boston University, USA). Для конструирования плазмиды pCEPI были использованы плазмиды pLACcI, pLACI, сконструированные на основе pUCBM 21 («Boehringer Manheim», Германия), pET-15b («Novagene», США), pCP2 (Камалетдинова и др., 1990).

Методы исследования. Клетки культивировали в средах LB и М9 (Миллер, 1976), с добавлением необходимых для поддержания плазмид антибиотиков, при 30°С или 42°С. Логарифмическую фазу роста поддерживали периодическими разведениями свежей средой, оптическая плотность культуры составляла 0.020.3 ед. при длине волны 600 нм. Для индукции экспрессии с Р|ас-промотора использовали изопропилтио-/3-0-галактозид (ИОТТ) в концентрации 1 мМ. Бактериальные клетки, синтезирующие /3-галактозидазу, выявляли на чашках Петри со средой LB, содержащей 40 мкг/мл хромогенного субстрата 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-/3-0-галактопиранозид (X-Gal). Флуоресценцию белка GFP (green fluorescent protein) измеряли на флуориметре MPF-4 фирмы Hitachi на длине волны 508 нм при длине волны возбуждающего света 430 нм.

Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Харди, 1990). Трансформацию проводили по оригинальной методике основанной на прописях предложенных в работах (Ханаан, 1988) и (Perbal, 1988). Гидролиз эндонуклеа-зами рестрикции и лигирование ДНК проводили согласно прописям фирмы-изготовителя ферментов. Одноцепочечные концевые участки фрагментов ДНК для получения тупых концов отщепляли нуклеазой S1 (Головин, 1990). Электрофорез фрагментов плазмидной ДНК проводили в 1% агарозном геле, содержащем 0,01% бромистый этидий (Маниатис и др., 1984). Извлечение ДНК из агарозных гелей проводили стандартным методом (Маниатис и др., 1984).

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили в программе Microsoft Office Excel. На диаграммах представлены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех повторностей). Принадлежность данных, полученных в экспериментах серии, к одной генеральной совокупности проверяли по критерию $.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование плазмидных циклических дигенных сетей с отрицательными обратными связями

Для экспериментального исследования циклических дигенных сетей с отрицательными обратными связями (ЦЦС( )) была сконструирована векторная конструкция pCEPI (ori ColEl, Ар1), содержащая ген lacl Е. coli под контролем промотора PL фага X и ген cISS7 термочувствительного репрессора бактериофага X (дальнейшее обозначение cl) под контролем промотора Piac (рис. 1).

иптг

Рис. 1. Схема генной сети, состоящей из циклической дигенной системы с отрицательными обратными связями на плазмиде рСЕР1 и маркерного гена 1асХ на хромосоме. Термочувствительный репрессор С1 подавляет транскрипцию 1ас1 гена с Рь промотора и инактивируется температурным воздействием. Ьас-репрессор подавляет транскрипцию с! гена с Р|К промотора и транскрипцию маркерного гена и инактивируется ИПТГ

Тестирование функциональной активности плазмиды pCEPI было проведено в клетках штамма JC158 Kcoli: на индикаторной среде отбирали колонии трансформантов, устойчивых к ампициллину и имеющих фенотипы: Lac" при 42°С, Lac+ при 30°С, Lac* при 42°С с ИПТГ.

Согласно моделям циклической дигенной системы (Чураев, 1975) можно, применительно ЦДС( ), локализованной на плазмиде pCEPI, ожидать существование двух устойчивых эпигенотипов lacfcl1 и lacfcf, которые проявляются на чашках с X-Gal по экспрессии маркерного гена lacZ, как альтернативные фенотипы: Lac+ (синяя окраска колоний) и Lac" (белая окраска колоний). Заметим, что эпигенотипом называется перечень генов с указанием их функционального состояния (Чураев, 1975). В данном случае: 1 - ген дерепрессирован, 0 - операторный участок гена связан с репрессором. Эпигенотипы lacfcl1 и lacfcf должны устойчиво наследоваться в ходе последовательных делений бактериальных клеток. Переключение одного эпигенотипа в другой осуществляется внешними метаболическими и температурными сигналами. Кроме того, возможны два нестабильных эпигенотипа lacfcf и lacllcll, которые в зависимости от условий переходят либо в эпигенотип lacfcf, либо lacfcf.

Для проверки наследования и переключения ожидаемых эпигенотипов нами был поставлен следующий эксперимент. Плазм иду pCEPI трансформировали в клетки штамма JC158. Далее культуру JC158(pCEPI) выращивали в 3 мл LB-среды при 30°С, рассеивали до единичных колоний на чашки Петри с LB-агаром и инкубировали 24 часа при 30°С. Образовавшиеся колонии переносили на чашки с ИПТГ и инкубировали при 30°С. В результате выросли синие колонии, имеющие эпигенотип lacfclДалее колонии с каждой чашки Петри были пересеяны бактериальной петлей на свежие чашки согласно схеме, представленной на рис 2.

Наследование и переключение эпигенотипов lacfcf и lacfcf в эксперименте соответствовало теоретически предсказанным результатам. Появление синих колоний на чашке 3 (ИПТГ, 42°С) объясняется тем, что ИПТГ, инактивируя Lac-репрессор, снимает репрессию с генов lacZ и с/, а повышенная температура приводит к разрушению димеров нарабатывающегося белка CI, что соответствует не-

стабильному эпигенотипу /ас/'с/. Таким образом, экспериментально показано, что ЦДСН, локализованная на плазмиде рСЕР1, является элементарным эпигеном, т. е. может кодировать, хранить и передавать клеточному потомству вызванные внешними специфическими сигналами изменения функционального состояния без изменения ДНК-последовательностей, входящих в систему генов.

Рис. 2. Схема тестирования наследуемости функциональных состояний пересевом колоний клеток штамма JC158(pCEPI) на чашках с X-Gal.

Колонии росли 24 часа при температурных условиях, указанных на схеме.

Стрелками указана последовательность пересева.

Обозначения:-----переключение,-наследование

Изучение функциональной активности циклических дигенных систем рассевом до единичных колоний

Для экспериментов по исследованию динамики наследования и переключения эпигенотипов использовалась методика рассева культуры до единичных колоний, с последующим анализом фенотипов образующихся колоний. В данной работе были использованы культуры JC158 (pCIK3), JC158 (рС1А2) и JC158(pCEPI). Плазмиды pCIK3 (ori р15А, Km") и pCIA2 (ori ColEl, Арг) содержат генетический переключатель (toggle switch) из плазмиды рТАК (Gardner et al., 2000), представляющий собой ЦДС(_) (рис. 3).

9

иптг

42°С

Рис. 3. Схема ЦЦС'"* на плазмидах рС1КЗ и рС1А2.

Отличия от ЦЦС(_) на плазмиде pCEPI заключаются в следующем: природный промотор PL модифицирован; промотор Pjac заменен более сильным синтетическим промотором Рй-С; за геном с/ расположен ген gfpmut3, считывающийся с того же промотора PtrC. Работа блоков ЦЦСН на плазмидах рС1КЗ и рС1А2 сбалансирована лучше, чем на pCEPI и, благодаря отсутствию в промоторе Р„с области связывания комплекса БАК-цАМФ (белок-активатор катаболитных оперонов - циклический аденозинмонофосфат), не зависит от уровня и доступности источника углерода в среде.

В процессе изучения наследования и переключения эпигенотипов, были проведены эксперименты, в которых культура, инокулированная единичной колонией, 14 ч росла в условиях, необходимых для перевода клеточной ЦДС(_) в соответствующий эпигенотип: lac fe Iх - с ИПТГ, ¡acfcf - при 42°С, lacllcll — при 42°С с ИПТГ. Затем бактериальные клетки жидкой культуры отмывали от остатков среды и переносили в свежую среду, изменяя условия культивирования. На чашки Петри клетки высевали из культуры с первоначальными условиями роста (чашка 0 ч) и далее каждые 2 часа роста в измененных условиях (чашки 2 ч, 4 ч, 6 ч). На чашках с X-Gal колонии росли при 30°С на протяжении 24 ч.

Тестирование способности клеток штамма JC158 (рС1КЗ) поддерживать каждый из двух альтернативных фенотипов показало, что клетки поддержива-

ют каждый из эпигенотипов по крайней мере в течение 8 часов роста в жидкой среде (13 поколений) + 24 часа роста на чашке. На всех чашках в 99,5-100% клетки давали начало колониям с ожидаемым фенотипом: синие из культуры /ас/с/, белые из культуры /ас/'с/0.

Для исследования переключения эпигенотипа 1асРс1[ в эпигенотип /ас/'с/, клетки культивировали 14 ч при 30°С в присутствии ИПТГ, а затем пересевали в среду без ИПТГ и инкубировали при 42°С. Результаты посевов на чашки Петри представлены на рис. 4. Секторными названы колонии, состоящие из белых и синих секторов (® ®

и

Рис. 4. Соотношение фенотипов колоний клеток JC158 (рС1КЗ) на чашке при переключении lacf с/ ¡acfcf.

Клетки были посеяны на чашки после указанного периода роста при 42°С без ИПТГ в жидкой среде, ■i - синие колонии, иа - секторные колонии, сп - белые колонии

Для исследования переключения эпигенотипа lacúcf в эпигенотип lacfcl1 клетки культивировали 14 ч при 42°С без ИПТГ, а затем пересевали в среду с ИПТГ и инкубировали при 30°С. Полученные результаты представлены на рис. 5.

11

4 6 Время ч.

Рис. 5. Соотношение фенотипов колоний клеток ГС 158 (рС1КЗ) на чашке при переключении /ас/'сТ0 -» lacfcI>.

Клетки были посеяны на чашки после указанного периода роста при 30°С с ИПТГ в жидкой среде, м - синие, еа - секторные, □ - белые колонии

Эксперименты по изучению динамики наследования и переключения эпи-генотипов клетками штаммов КЛ58 (рС1А2) и ,1С158(рСЕР1) проводились так же, как для .ГС158 (рС1КЗ). Было показано, что эпигенотип 1ас1лсР наследуют 100% клеток. Экспериментальные результаты по наследованию эпигенотипа \acfct, представлены в табл. 1.

Таблица 1

СООТНОШЕНИЕ ФЕНОТИПОВ КОЛОНИЙ ГС158(рС1А2) И ГС158(рСЕР1) В ПРОЦЕССЕ НАСЛЕДОВАНИЯ ЭПИГЕНОТИПА /ас/с/

Фенотип колонии Число колоний, %

.1С 158 (рС1А2) ЛС158(рСЕР1)

0ч 2ч 4ч 6ч 0ч 2ч 4ч 6ч

О 0 1±0,5 14±4 39±10 7±4 68±10 90±5 95±2

© 9±4 13±5 64±11 56±13 42±13 27±9 6±4 5±2

ф 72±11 80±13 22±6 5±2 50±16 3±1 4±2 0

® 18±5 5±3 0 0 0 2±1 0 0

• 1±0.5 1±0.5 0 0 1±0.5 0 0 0

— белые колонии, ® — синие колонии, ® Ф ® — секторные колонии.

12

При переключении эпигенотипа 1асРс1х в 1ас1хсР клетки штаммов ГС158(рС1А2) и .УС158(рСЕР1) в 99% образуют белые колонии через два часа экспоненциального роста при 42°С вне зависимости от эпигенотипа колонии, используемой для инокуляции ночной культуры. Результаты переключения 1С158 (рС1А2) и ,ГС158(рСЕР1) из /ас/'сУ0 в 1асРс1\ представлены в табл. 2. Эксперимент был продлен до 8 часов инкубирования в измененных условиях, так как до этого момента наблюдаемая картина постоянно изменялась.

Таблица 2

СООТНОШЕНИЕ ФЕНОТИПОВ КОЛОНИЙ В ПРОЦЕССЕ ПЕРЕКЛЮЧЕНИЯ ЭПИГЕНОТИПА /ас/1 с/0 В ЭПИГЕНОТИП 1асМ

Фенотип колонии Число колоний,%

«Л58 (рС1А2) ЛС158(рСЕР1)

0ч 2ч 4ч бч 8ч Оч 2ч 4ч бч 8ч

О 100 100 0 4±2 28±12 100 100 0 9±4 20±7

® 0 0 2±1 5±2 42±7 0 0 7±2 38±11 80±7

ф 0 0 2±1 80±5 30±8 0 0 83±10 53±12 0

ф 0 0 90±5 6±3 0 0 0 5±2 0 0

• 0 0 6±2 5±2 0 0 0 5±2 0 0

О — белые колонии, ® — синие колонии, ©Ф Ф — секторные колонии.

Наличие синих колоний на чашках говорит о том, что как минимум на протяжении роста колонии клетки .ГС158 (рС1А2) и .1С158(рСЕР1) способны наследовать эпигенотип 1асРсТестирование способности наследовать эпиге-нотип /яс/°с/' клетками образующихся при этом синих колоний даёт крайне неоднозначные результаты: поддерживать данный эпигенотип способны от О до 90% клеток колонии.

Несмотря на то, что плазмиды рС1А2 и рС1КЗ содержат одинаковую ЦДС'-1, динамика наследования и переключения эпигенотипов у культур .1С158 (рС1А2) и ЛС158(рС1КЗ) различна. Культура 1С158(рС1КЗ) полностью переключается и стабильно наследует оба эпигенотипа, а культура .ГС158 (рС1А2) имеет дина-

13

мику наследования и переключения эпигенотипов сходную с JC158 (pCEPI), когда более устойчив эпигенотип lacllcf. Устойчиво переключается из lacfcf в lacfcl1 только часть клеток, причём при ограниченном времени воздействия ИПТГ. Максимум переключившихся клеток наблюдается при 4-6 часах воздействия ИПТГ. Длительное культивирование колоний на чашке с ИПТГ, также не приводит к устойчивому наследованию эпигенотипа lacfclПри длительном воздействии ИПТГ (как в жидкой среде, так и на чашке) культура имеет эпигенотип lacfcl\ но, как видно из табл. 1 по изменению фенотипа колоний, наследуется ограниченное число поколений.

Плазмиды (рС1А2) и (pCEPI) содержат одинаковую область начала репликации - ColEl (50-70 копий на клетку), тогда как область начала репликации плазмиды рС1КЗ - р15А (20-30 копий на клетку) (Lutz, Bujard, 1997). Можно предположить, из-за высокой копийности плазмиды (и, соответственно, гена lac/) для переключения культур JC158 (рС1А2) и JC158(pCEPI) недостаточно 1 мМ ИПТГ. Однако, увеличив концентрацию ИПТГ до 2 мМ, обнаружили, что при этом увеличивается скорость переключения, но не стабильность наследования.

Проведенные эксперименты показывают, что для стабильного наследования эпигенотипов недостаточно ввести в клетку ЦЦСН (даже с хорошо сбалансированными параметрами), необходимо подобрать ее копийность, а, возможно, и локализацию.

Моделирование дупликаций, изменяющих функциональную активность ЦДС<-> При создании генных систем, имитирующих дупликации одного из генов входящих в ЦДС(), к плазмиде pCIK3 (Кшг, ori р15А), находящейся в штамме E.coli JC158, были котрансформированы плазмиды pLACcI (Арг, ori ColEl) или pLACI (Арг, ori ColEl), которые несут генные блоки Р1асс/ и Piaclacl, соответственно. По сути, в этом эксперименте имитировалась широко распространённая в бактериальном мире система горизонтального переноса, при этом ген Р1асс/, можно рассматривать как ортолог гена Р,гес/, а ген

Р\ijacl как ортолог гена Р\}ас1. С биплазмидными штаммами был проведён эксперимент по изучению наследования и динамики переключения эпигено-типов, описанный в предыдущем разделе.

В штамме 1С158(рС1КЗ/рЬАСс1) образуется трёхгенная сеть, состоящая из циклической дигенной системы и гена Р|асс/. В результате введения дополнительного блока Р1аСс/, произошло увеличение дозы гена, что привело к изменению не только особенностей наследования и переключения, но и к изменению фенотипа колоний соответствующих эпигенотипу /асУ'с/. Эпигенотип /асУ°с/' наследуется стабильно, эпигенотип /ас/'сТ0 в условиях эксперимента стабильно наследуют 10±5% клеток культуры, подвергавшейся воздействию температуры 42°С в течение 14 ч. Из эпигенотипа /ас/'сУ0 в /яс/с/1 клетки полностью переключаются за 2 часа. Динамика переключения из эпигенотипа /ас/с/1 в /ас/'сУ0 представлена на рис. 6.

0 2 4 6 Время, ч

Рис. 6. Соотношение фенотипов колоний штамма .1С 158 (рС1КЗ/рЬАСс1) на чашке при переключении 1ас1°с/' - /йс/'сЛ Клетки были посеяны на чашки после указанного по оси абсцисс периода роста в жидкой среде при 42°С без ИПТГ. ■■ — синие колонии, га — секторные колонии, □ - белые колонии

Трёхгенная система в штамме ДС158(рС1КЗ/рЬАС1) состоит из ЦЦС(_) и искусственного генного блока Р^/ас/, который является авторегулируемым (Rosenfeld, 2002), в связи с чем, при избытке Ьас-репрессора в клетке можно ожидать снижение уровня экспрессии данного гена, а при низком уровне Ьас-репрессора в клетке - повышение экспрессии. Высев культуры бактериальных клеток на чашки Петри показал, что уровень синтеза ¿З-галактозидазы в клетках ,ГС158(рС1КЗ/рЬАС1) с эпигенотипом 1асРс1х значительно ниже, чем в клетках ДС158(рС1КЗ/рЬАСс1) и 1С158(рС1КЗ). Характер наследования и переключения, в общем, соответствует 1С158(рС1КЗ), но полностью из одного эпигеноти-па в другой культура не переключается - приблизительно 10±5% клеток образуют колонии, соответствующие противоположному эпигенотипу или секторные (рис. 7, 8). Можно предположить, что стабилизирующее влияние генного блока Р^/ас/ на уровень Ьас-репрессора в клетке приводит, в части клеток, к увеличению частоты переключения эпигенотипов без индукции и, соответственно, фенотипическому разнообразию.

* _ т _

>| 100 Р^^Ч РН

~ I ш

Ш

& 40

IН ИМИ I

<->0 2 4 6 Время, ч

Рис. 7. Соотношение фенотипов колоний штамма 1С 158 (рС1КЗ/рЬАС1) на чашках при переключении 1асМ - /ос/'сА Клетки были посеяны на чашки после указанного по оси абсцисс периода роста в жидкой среде при 42°С без ИПТГ. ■■ — синие колонии, ш - секторные колонии, сп — белые колонии.

Рис. 8. Соотношение фенотипов колоний штамма 1С 158 (рС1КЗ/рЬАС1) на чашках при переключении /ас/'с/0-» /ас/°с/'. Клетки были посеяны на чашки после указанного по оси абсцисс периода роста в жидкой среде при 30°С с ИПТГ. м - синие колонии, га - секторные колонии, сп - белые колонии

Таким образом, проведённые эксперименты показали возможность изменения динамики функционирования генных сетей по механизму дупликации одного из компонентов сети. Продемонстрирована принципиальная возможность существования системных мутаций в генных сетях с отрицательными обратными связями, которые приводят к устойчивым фенотипическим изменениям. Показано, что для бактерий «закрепление» в результате добавления генного блока Р|асС/, или "ослабление" при добавлении Р|ас/ас/ режимов функционирования ЦДС^ в клетках ,1С158(рС1КЗ) может иметь адаптивное значение в изменяющихся условиях окружающей среды.

Влияние аминокислотного голодания на работу ЦЦС'"' В природных условиях бактериальным клеткам необходимо уметь приспосабливаться к неблагоприятным изменениям окружающей среды. Адаптация достигается скоординированным изменением уровня экспрессии генов, как

в отдельных генных сетях, отвечающих за определённую функцию, так и всего набора генов клетки. Первичной реакцией бактериальных клеток на воздействие стрессовых факторов окружающей среды является остановка клеточного роста. Прекращение деления позволяет клеткам перестроить работу на генетическом, биохимическом и физиологическом уровнях. Нами была изучена функциональная активность ЦЦС("' в экспоненциально растущей культуре бактериальных клеток, поэтому целесообразно исследовать особенности функционирования ЦДС'"' в условиях стазиса. Для дальнейшего исследования влияния стрессовых условий (голодания) на работу ЦДСН были проведены эксперименты с использованием штаммов 1С158 (рС1КЗ) и ЛС158(рС1КЗ/рЬАС1).

В процессе эксперимента ночная культура инокулировалась клетками белой колонии и росла при 42°С. Далее клетки из ночной культуры были посеяны в колбы со средой М9 с глюкозой, но без казаминовых кислот. В данном питательном субстрате штамм 1С158, как ауксотрофный мутант по синтезу серина (хегЛб), не способен поддерживать рост. Оптическая плотность разведённой в колбах культуры при длине волны бООнм (Цюо) составила 0,1. Через 3, б и 9 суток из колб производили отбор проб для посева на чашки Петри с ЬВ-агаром, которые инкубировали при 30°С. Одновременно забирали образцы для определения оптической плотности культуры и флуориметрического определения содержания белка ОРР, ген которого считывает-ся с того же промотора что и ген с/. Полученные данные представлены на рис. 9.

За время проведения эксперимента оптическая плотность культур снизилась в 2 раза, что может указывать на активацию программ апоптоза, когда часть клеток бактериальной популяции подвергается автолизу, позволяя выжить остальным клеткам в условиях недостатка питательных веществ. В тоже время, несмотря на уменьшение числа жизнеспособных клеток, относительное содержание ОРР (ед. флуоресценции/ Б6оо пробы) выросло в 5 раз. Причем, как видно из рис. 9 динамика накопления ОБР в клетках штаммов 1С158 (рС1КЗ) и ГС158(рС1КЗ/рЬАС1) совпадает. Можно предположить, что увеличение содержания ОРР в клетках является результатом активации большего числа генных блоков Р(кс/, чем это было до голодания. Эти данные совпадают с резуль-

татами рассева голодающих клеток на чашки Петри с богатой средой, где клетки культуры .ГС158 (рС1КЗ) в 70±10% случаев меняют эпигенотип /ос/1 с/0 на/ас/с/1. Клетки голодающей культуры .1С158 (рС1КЗ/рЬАС1) образуют синие колонии различных оттенков.

Рис. 9. Изменение оптической плотности (D000) и количества белка GFP в процессе аминокислотного голодания культур JC158(pCIK3) и JC158(pCIK3/pLACI).

D6(x) и количество белка GFP указаны по оси ординат в относительных единицах, за единицу приняты: D«»-начальная D6oo, GFP - количество белка (показания флуориметраЛ360о пробы) на 9-е сутки.

Обозначения: ... D6ooштамма JC158(pCIK3),_D600штаммаЗС158(pClK.3/pLACl),

_____содержание GFP в культуре JC158(pCIK3),

___содержание GFP в культуре JC158(pCIK3/pLACI).

Таким образом, работа ЦЦС^, как регуляторной системы управляющей клеткой, не является жёстко детерминированной. Это связанно со сложностью организации живых систем. Такая интегрированность регуляторных механизмов позволяет клеткам поливариантно реагировать на множественные внешние стимулы, что в свою очередь увеличивает шансы бактерии на выживание в изменяющихся условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На современном этапе развития молекулярной генетики одной из важнейших проблем является расширение представлений о наследственности и изменчивости. В данной работе экспериментально смоделирован один из возможных механизмов эпигенетического наследования признаков. Используя генно-инженерные методы, мы получили векторную конструкцию pCEPI, несущую циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦДС(_>). Проверка ожидаемых функциональных свойств полученной рекомбинантной плазмиды, показала возможность наследования двух альтернативных эпигеноти-пов lactcf и lacfcf, а также переключение из одного состояния в другое внешними температурными и метаболическими воздействиями.

Исследование свойств ЦДС( ), содержащих природные (pCEPI) и синтетические (рС1КЗ, рС1А2) регуляторные элементы, показало зависимость стабильности наследования эпигенотипов от плазмиды носителя. Было выявлено, что даже для сбалансированных по параметрам ЦДС(_) при повышении их копийно-сти с 20-30 копий на клетку (ori р15А) до 50-70 копий на клетку (ori ColEl) более устойчив эпигенотип laclxcf, альтернативный эпигенотип lacfcf наследуется ограниченное число поколений.

Исследование функционирования ЦЦС<_) в составе трехгенной сети, где третий компонент системы представляет собой дупликацию структурной части одного из генов ЦЦС("\ показывает возможный механизм обратимого изменения в функционировании управляющих генных сетей бактериальной клетки, без изменения структуры ЦДСЧ Учитывая распространённость горизонтального переноса генов у бактерий, такой механизм может рассматриваться как один из путей повышения фенотипического разнообразия в популяции. В плане исследования искусственных генных систем, подобный модульный подход позволяет конструировать и изучать генные системы произвольного уровня сложности.

Было обнаружено, что в условиях голодания может происходить спонтанное переключение эпигенотипов, что, вероятно, связано с изменением функ-

циональных параметров ЦДС<_) при включении генетических систем ответа на стресс и экспрессии генов, характерных для стационарной фазы, а также со снижением общего уровня синтеза белка в стационарной фазе.

ВЫВОДЫ

1.Сконструирована рекомбинантная плазмида pCEPl, содержащая циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦДС1"'). Экспериментально показано, что эта система является эпигеном.

2.Выявлена зависимость устойчивого наследования и переключения эпигенотипов клетками Escherichia coli от области репликации плазм иды носителя 1ДДС(_).

3.Экспериментально смоделированы дупликации структурной части генов, входящих в ЦДС9 и изучено изменение динамики функционирования НДС'"' в составе образующейся трёхгенной сети.

4.Обнаружено влияние стрессовых условий культивирования клеток Escherichia coli на функционирование искусственной циклической дигенной сети.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Тропынина Т. С., Голубев О. В., Ступак И. В., Чураев Р. Н. // Материалы II съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - СПб., 2000. -Т. 2.-С. 91-92.

2.Tchuraev R. N., Stupak I. V., Tropynina Т. S., Stupak E. E. Epigenes: design and construction of new hereditary units // FEBS Letters. - 2000. - V. 486. - P. 200202.

3. Чураев Р. H., Ступак И. В., ТропынинаТ. С., Ступак Е. Э. Сконструирован двухкомпонентный эпиген с наперед заданными свойствами // ДАН. - 2001. -Т. 378,№6.-С. 837-840.

4.Ступак И. В., Ступак Е. Э., Чураев Р. Н. Анализ функциональных состояний векторной эпигенной конструкции. // Материалы 3-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва, 2004. - С. 411.

5.Ступак И. В., Сгупак Е. Э. Стационарность и нестационарность режимов функционирования плазмидных эпигенетических конструкций в популяции клеток E.coli // Материалы 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. Биология — наука XXI века. - Пущино, 2005. - С. 55.

6. Ступак И. В., Ступак Е. Э., Чураев Р. Н. Экспериментальное моделирование мутаций, изменяющих функциональную активность искусственной генной сети в клетках E.coli // Материалы международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск, 2005. - Т. 1.- С. 115.

7. Чураев Р. Н., Ступак Е. Э., Ступак И. В., Галимзянов А. В. Новое свойство эпигенов: метастабильные эпигенотипы // ДАН. - 2006. - Т. 406, № 4. - С. 570-573.

8. Ступак И. В., Ступак Е. Э. Сравнительное изучение функциональной активности циклических дигенных систем в клетках E.coli Н Материалы 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. Биология — наука XXI века. - Пущино, 2006. - С. 53.

СТУПАК Игорь Валериевич

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ В ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИХ ЦИКЛИЧЕСКИЕ ДИГЕННЫЕ СИСТЕМЫ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Издательская лицензия № 06788 от 01. И .2001 г. ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450077, РБ, г. Уфа, Ул. Ленина,3, -гел.(3472) 72-73-50.

Подписано к печати 30.05.2006 г. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 287.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ступак, Игорь Валериевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Теоретико-экспериментальные аспекты изучения эпигенных систем.

1.2. Генные сети.

1.2.1. Конструирование искусственных генных сетей.

1.2.2. Организация генной регуляторной сети Е. соИ.

1.2.3. Функционально-генетическая изменчивость генных сетей.

1.3. Физиолого-генетические механизмы адаптивной изменчивости

1.3.1. Системы ответа бактериальных клеток на стресс.

1.3.2. Системы программируемой клеточной смерти у прокариот.

1.3.3. Система коллективного выживания у бактерий.

1.4. Молекулярные механизмы адаптивного мутагенеза прокариот.

1.4.1. Точковые мутации, как результат адаптивной изменчивости.

1.4.2. Адаптивные изменения в структурно-функциональной организации хромосом.

1.4.3. Закрепление результатов адаптивного мутагенеза в эволюции.

1.4.4. Адаптивные механизмы преодоления межвидовых генетических барьеров.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Среда и условия роста.

2.3. Выявление клеток, синтезирующих Р-галактозидазу.

2.4. Определение относительной концентрации белка ОБР в клетках.

2.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.6. Трансформация клеток Е.соИ.

2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.8. Лигирование фрагментов ДНК.

2.9. Расщепление одноцепочечных участков ДНК нуклеазой 81.

2.8. Электрофорез в агарозном геле.

2.9. Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы.

2.10. Статистический анализ.

2.11. Штаммы E.coli и плазмиды.

2.12. Ферменты.

2.13. Реактивы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И PIX ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Конструирование плазмидных циклических дигенных сетей с отрицательными обратными связями.

3.2. Изучение функциональной активности циклических дигенных систем путем рассева до единичных колоний.

3.3. Экспериментальное моделирование дупликаций, изменяющих функциональную активность циклической дигенной системы.

3.4. Влияние аминокислотного голодания на работу циклической дигенной системы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипическая изменчивость в популяции клеток Escherichia coli, содержащих циклические дигенные системы"

Актуальность проблемы

Изменчивость является одной из фундаментальных характеристик живых систем. В последнее время, кроме наследственной и ненаследственной (модификационной) изменчивости стали выделять эпигенетическую изменчивость, объединяющую явления, основанные на различных механизмах и не укладывающиеся в традиционные представления. Возобновился интерес к, казалось бы, давно забытой проблеме наследования приобретённых признаков (Jablonka, Lamb, 1989; Landman, 1991; Голубовский, 2000; 2001); обсуждаются и необычные филогенетические феномены, такие как стресс-индуцируемая эволюция (Маркель, 2000). Более того, формируется новая ветвь генетики -эпигенетика, изучающая наследственные изменения генной экспрессии, которые происходят без изменения нуклеотидной последовательности ДНК (Riggs, Porter, 1996; Wolffe, Matzke, 1999).

Одним из механизмов эпигенетической изменчивости является наследование признаков, основанное на регуляторных взаимодействиях в циклических генных сетях. Гипотеза о существовании эпигенов - особых наследственных единиц, имеющих не менее двух режимов функционирования подчинённых им генов, способных сохранять каждый из режимов в последовательном ряду поколений, была выдвинута в 1975 году (Чураев, 1975). Существование эпигенов как наследственных единиц следующего уровня сложности, чем гены, было доказано в рамках теоретической математической модели системы управления онтогенезом общего вида (Tchuraev, 2000). Так же было показано наличие бистабильных генетических модулей, имеющих свойства эпигенов (Tchuraev, 2006) в генных сетях, управляющих ранним развитием Drosophila.

Одним из классов эпигенов являются циклические системы генов. Экспериментальное изучение функционирования искусственных циклических дигенных систем с отрицательными обратными связями (ЦДС^) в клетке, позволяет расширить представление об особенностях эпигенетической изменчивости и оценить влияние внешних и внутренних факторов на устойчивость наследования альтернативных фенотипических состояний.

Цель и задачи исследования

Цель работы - изучение функционирования ЦДС^ в клетках Escherichia coli, по фенотипическим изменениям в бактериальных популяциях, подвергшихся действию различных индуцирующих факторов. Конкретные задачи работы включали:

1. Конструирование ЦДСН, содержащей ген lacl под контролем промотора Pl и ген cl857 термочувствительного репрессора бактериофага X под контролем промотора Piac.

2. Экспериментальное тестирование ожидаемых функциональных свойств полученной рекомбинантной плазмиды.

3. Сравнение свойств ЦДСН, отличающихся особенностями регуляторных районов или областями репликации плазмид- носителей.

4. Исследование функционирования ЦДС^ в составе трёхгенной системы.

5. Исследование устойчивости режимов работы ЦДСН к стрессовым воздействиям среды.

Научная новизна исследования

Впервые сконструирована особая наследственная единица (эпиген), которая может кодировать, хранить и передавать в ряду клеточных поколений изменения функционального состояния, вызванные внешними специфическими сигналами, без изменения ДНК-последовательностей, входящих в систему генов. Исследовано наследование и переключение фенотипов бактериальных клеток, содержащих ЦДСЯ, в процессе роста колонии на индикаторной среде в постоянных условиях.

Впервые показана зависимость функционирования ЦДС(-) от области репликации плазмиды носителя.

Экспериментально смоделировано изменение динамики функционирования генных сетей, при дупликации структурной части одного из генов ЦДС^.

Впервые показано влияние стрессовых факторов на функциональные свойства 1ДДС().

Научно-практическая значимость работы

Результаты исследования способствуют пониманию возможной роли ЦДС^ в эпигенетической изменчивости, как структуры, реагирующей на внешние временные сигнальные воздействия переключением регуляторных режимов функционирования генов. В связи с этим, большое значение приобретает изучение взаимодействия бистабильных модулей клеточной памяти с регуляторными системами клетки. Также ЦДС(-) могут быть использованы для управляемого биосинтеза и контроля клеточного роста в биотехнологии. Принимая во внимание, что такие генетические системы по существу представляют ячейку памяти, способную "запоминать" двоичные сигналы, в дальнейшем возможно использование ЦДС^ для создания искусственной генной памяти систем управления онтогенезом клетки, а также в генной терапии - для адресного воздействия и включения компенсаторных генов в нужный момент при лечении наследственных заболеваний.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены на II (Санкт-Петербург, 2000) и III (Москва, 2004) съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 9 и 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005), международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объём диссертации

Работа изложена на 109 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 204 источников (47 работ отечественных и 157 работ зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 4 схемами, 7 диаграммами и 23 фотографиями.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ступак, Игорь Валериевич

ВЫВОДЫ

Сконструирована рекомбинантная плазмида pCEPI, содержащая циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦДС^). Экспериментально показано, что эта система является эпигеном.

Выявлена зависимость устойчивого наследования и переключения эпигенотипов клетками Escherichia coli от области репликации плазмиды носителя ЦДСЧ

Экспериментально смоделированы дупликации структурной части генов, входящих в ЦДС(") и изучено изменение динамики функционирования ЦДС^ в составе образующейся трёхгенной сети. Обнаружено влияние стрессовых условий культивирования клеток Escherichia coli на функционирование искусственной циклической дигенной сети.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На современном этапе развития молекулярной генетики одной из важнейших проблем является расширение представлений о наследственности и изменчивости. В данной работе экспериментально смоделирован один из возможных механизмов эпигенетического наследования признаков. Используя генно-инженерные методы, мы получили векторную конструкцию pCEPI, несущую циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦДСН). Проверка ожидаемых функциональных свойств полученной рекомбинантной плазмиды, показала возможность наследования двух альтернативных эпигенотипов lacfcP lacfcf , а также переключение из одного состояния в другое внешними температурными и метаболическими воздействиями.

Исследование свойств ЦДСН, содержащих природные (pCEPI) и синтетические (рСЖЗ, рС1А2) регуляторные элементы, показало зависимость стабильности наследования эпигенотипов от плазмиды носителя. Было выявлено, что даже для сбалансированных по параметрам ЦДС() при повышении их копийности с 20-30 копий на клетку (orí р15А) до 50-70 копий на клетку (orí ColEl) более устойчив эпигенотип lacl альтернативный эпигенотип lacfcf наследуется ограниченное число поколений.

Исследование функционирования ЦДС^ в составе трехгенной сети, где третий компонент системы представляет собой дупликацию структурной части одного из генов ЦДС("\ показывает возможный механизм обратимого изменения в функционировании управляющих генных сетей бактериальной клетки, без изменения структуры ЦЦСЧ Учитывая распространённость горизонтального переноса генов у бактерий, такой механизм может рассматриваться как один из путей повышения фенотипического разнообразия в популяции. В плане исследования искусственных генных систем, подобный модульный подход позволяет конструировать и изучать генные системы произвольного уровня сложности.

Было обнаружено, что в условиях голодания может происходить спонтанное переключение эпигенотипов, что, вероятно, связано с изменением функциональных параметров ЦЦСН при включении генетических систем ответа на стресс и экспрессии генов, характерных для стационарной фазы, а также со снижением общего уровня синтеза белка в стационарной фазе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ступак, Игорь Валериевич, Уфа

1. Abouheif Е., Wray G.A. Evolution of the gene network underlying wing polyphenism in ants // Science. 2002. - V. 297, № 5579. - P. 249-252.

2. Aizenman E., Engelberg-Kulka H., Glaser G. An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by 3',5'- bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996.-V.93.-P. 6059-6063.

3. Aleshkin G.I., Kadzhaev K.V., Markov A.P. High and bow UV-dose responses in SOS-induction of the precise excision of transposons Tnl, Tn5 and TnlO in Escherichia coli II Mutat. Res. 1998. - V. 401. - P. 179-191.

4. Aim R.A., Ling L.S., Moir D.T. et al. Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori // Nature.- 1999.-V. 397.-P. 176-180.

5. Angeli D., Ferrell J. E., Sontag Jr. D., Sontag E. D. Detection of multistability, bifurcations, and hysteresis in a large class of biological positivefeedback systems // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101, № 7. - P. 1822-1827.

6. Atkinson M. R., Savageau M. A., Myers J. Т., Ninfa A. J. Development of genetic circuitry exhibiting toggle switch or oscillatory behavior in Escherichia coli II Cell. 2003. - V.l 13. - P. 597-607.

7. Azam A.T., Iwata A., Nishimura A. et al. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid // J. Bacteriol. 1999. -V. 181.-P. 6361-6370.

8. Babu M.M., Teichmann S.A. Evolution of transcription factors and the gene regulatory network in Escherichia coli II Nucleic Acids Research. 2003. - V. 31, № 4. - P. 1234-1244.

9. Barcus V., Murray N. Bartlers to recombination: restriction // Population Genetics of Bacteria / Eds Baumberg S., Yong J., Wellington E., Saunders J. -Cambridge: University Press, 1995.-P. 31-58.

10. Barth M., Marschal C., Muffler A. et al. Role for histone-like protein H-NS growth-phase-dependet and osmotic regulation of as-dependent genes in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 3455-3464.

11. Basu S., Gerchman Y., Collins C. H. et al. A synthetic multicellular system for programmed pattern formation // Nature. 2005. - V. 434. - P. 1130-1134.

12. Bauer C.E., Elsen S., Bird T.H. Mechanisms for redox control of gene expression // Annu. Rev. Microbiol. 1999. - V. 53. - P. 495-523.

13. Becker G., Hengge-Aronis R. What makes an Escherichia coli promoter os dependet? Role of the -13/-14 nucleotide promoter positions and region 2.5 of E. coli Hi. Mol. Biol.-2001.-V. 39.-P. 1153-1165.

14. Becskei A., Serrano L. Engineering stability in gene networks by autoregulation // Nature. 2000. - V. 405. - P. 590-593.

15. Becskei A., Seraphin B., Serrano L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. // EMBO J. 2001. - V. 20, № 10. - P. 2528-2535.

16. Biehs B., Sturtevant M.A., Bier E. Boundaries in the Drosophila wing imaginal disc organize vein-specific genetic programs // Development 1998. -V. 125, №21.-P. 4245-4257.

17. Bird A. DNA methilation patterns and epigenetic memory // Genes Dev. -2002.-V. 16.-P. 6-21.

18. Blake W. J., Kaern M., Cantor C. R., Collins J. J. Noise in eukaryotic gene expression //Nature. 2003. - V. 422. - P. 633-637.

19. Blattner F.R. et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 // Science. -1997. V. 277. - P. 1453-1462.

20. Bordes P., Conter A., Morales V. et al. DNA supercoiling contributes to disconnect cts accumulation from os- dependent transcription in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 2003. - V. 48. - P. 561-571.

21. Brenner S. A night at the operon // Nature. -1997. V. 386. - P. 235.

22. Buck M., Gallegos M. A., Studholme D. J. et al. The bacterial enhancer-dependent a54 (aN) transcription factor // J. Bacteriol. 2000. - V. 182, №. 15. -P. 4129-4134.

23. Bull H.J., McKenzie G.J., Hastings P.J., Rosenberg S.M. Evidence that stationary-phase hypermutation in the Esherichia coli chromosome is promoted by recombination // Genetics. 2000. - V. 154. - P. 1427-1437.

24. Cairns J., Overbough J., Miller S. The origin of mutants // Nature. 1988. -V. 335. - P. 142-145.

25. Carrasco C.D., Buettner J.A., Golden J.W Programmed DNA rearrangement of a cyanobacterial hupL gene in heterocysts. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995. -V. 92, № 3. P. 791-795.

26. Cavalli G., Paro R. Chromo-domain proteins: linking chromatin structure to epigenetic regulation // Curr. Opin. Cell Biol. 1998.- V. 10.- P. 354-360.

27. Cavalli G., Paro R. Epigenetic inheritance of active chromatin after removal of the main transactivator // Science. -1999. V. 286. - P. 955-958.

28. Charlebois R.L., St. Jean A. Supercoiling and map stability in the bacterial chromosome //J. Mol. Evol. 1995. -V. 41, №1. - P. 15-23.

29. Chilley P.M., Wilkins B.M. Distribution of the ardA family antirestriction genes on conjugative plasmids // Microbiology. 1995. - V. 141. - P. 21572164.

30. Chong S., Whitelaw E. Epigenetic germline inheritance // Current Opinion in Genetics & Development. 2004. - V. 14. - 692-696.

31. Chow K.C. Hsp70 (DnaK) an evolution facilitator? // Trends Genetics. -2000.-V. 16.-P. 484-485.

32. Colland F., Barth M., Hengge-Aronis R., et al. a factor selectivity of Escherichia coli RNA polymerase: role for CRP, IHF and Lrp transcription factor // EMBO J. 2000. - V. 19. - P. 3028-3037.

33. Cramer W.A., Lindeberg M., Taylor R. The best offense is a good defense // Nature Struct. Biol. 1999. - V. 6. - P. 295-297.

34. Dalgaard J.Z., Klar A J. Orientation of DNA replication establishes mating-type switching pattern in S. pombe II Nature. 1999. - V. 400. - P. 181-184.

35. Dimpfl J., Echols H. Duplication mutation as an SOS response in Escherichia coli: enhanced duplication formation by a constitutively activated RecA // Genetics. 1989. - V. 123. - P. 255-260.

36. Dri A.-M., Morerau P.L. Control of the LexA regulon by pH: evidence for a reversible inactivation of the LexA repressor during the growth cycle of Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1994. - V. 12. - P. 621—629.

37. Dukan S., Nystrum T. Oxidative Stress Defense and Deterioration of Growth-arrested Escherichia coli Cells // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274, № 37.-P. 26027-26032.

38. Edwards R., Helm A., Maloy S. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction // BioTechniaues. 1999. - V. 26. -P. 892-900.

39. Eichenbaum Z., Livneh Z. UV light induces IS 10 transposition in Escherichia coli II Genetics. 1998. - V. 149. - P. 1173-1181.

40. Elowitz M.B., Leibler S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators // Nature. 2000. - V. 403. - P. 335-338.

41. Elowitz M. B., Levine A. J., Siggia E. D., Swain P. S. Stochastic gene expression in a single cell // Science . 2002. - V. 297. - P. 1183-1186.

42. Errington J. Determination of cell fate in Bacillus subtilis // Trends Genet. — 1996.-V. 12.-P. 31-34.

43. Farmer W. R., Liao J. C. Improving lycopene production in Escherichia coli by engineering metabolic control // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. - P. 533537.

44. Felsenfeld G, McGhee J. Methylation and gene control // Nature. 1982. -V. 296.-P. 602-603.

45. Force A., Lynch M., Pickett F.B. et al. Preservation of duplicate genes by complementary, degenerative mutations // Genetics. 1999. - V. 151. - P. 1531-1545.

46. Foster P.L. Adaptive mutation: implication for evolution // BioEssays.2000. V. 22, №. 12. -P. 1067-1074.

47. Franch T., Gerdes K. Programmed cell death in bacteria: translational repression by mRNA end-pairing // Mol. Microbiol. 1996. - V.21. - P. 10491050.

48. Francis N.J., Kingston R.E. Mechanisms of transcriptional memory // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2001. -V. 2. P. 409-421.

49. Garcia-Bellido A., de Celis J.F. Developmental genetics of the venation pattern of Drosophila // Annu. Rev. Genet. 1992. - V. 26. - P. 277-304.

50. Gardner T.S., Cantor C.R., Collins J.J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli II Nature. 2000. - V. 403. - P. 339 - 342.

51. Golden J.W., Mulligan M.E., Haselkorn R. Different recombination site specificity of two developmentally regulated genome rearrangements // Nature. 1987. - V. 327. - P. 526-529.

52. Goldman E., Jakubovski H. Uncharged RNA, protein synthesis and the bacterial strigent response // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 2035-2040.

53. Harris R.S., Feng C., Ross K.J et al. Mismatch repair is diminished during stationary-phase mutation // Mutat. Res. 1999. - V. 437. - P.51-60.

54. Harshey R.M. Bees aren't the only ones: swarming in Gram-negative bacteria // Mol. Microbiol. 1994. - V.16, №. 3. - P.389-394.

55. Hartwell L. H., Hopfield J. J., Leibler S., Murray, A. W. From molecular to modular cell biology // Nature. 1999. - V.402. - P. 47-51.

56. Hasty J., McMillen D., Isaacs F., Collins J.J. Computational studies of gene regulatory networks in numero molecular biology // Nature reviews genetics.2001. №2. - P.268 - 279.

57. Hastings P.J., Bull H.J., Klump J.R., Rosenberg S.M. Adaptive amplification: an inducible chromosomal in- stability mechanism // Cell. -2000. -V. 103.-P. 723-731.

58. Hengge-Aronis R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the as (RpoS) subunit of RNA polymerase // Microbiol. Mol. Biol. Revs. 2002. - V.66. - P.373-395.

59. Hiom K., Thomas S.M., Sedgwick S.G. Different mechanisms for SOS induced alleviation of DNA restriction in Escherichia coli II Biochimie. -1991. -V. 73.-P. 399-405.

60. Hiom K.J., Sedgwick S.G. Alleviation of EcoK DNA restriction in Escherichia coli and involvement of umuDC activity // Mol. Gen. Genet. -1992.-V. 231.-P. 265-275.

61. Hochman A. Programmed cell death in prokaryotes // Crit. Rev. Microbiol. 1997. -V. 23.-P. 207-214.

62. Holliday R. The inheritance of epigenetic defects // Science. 1987. - V. 238.-P. 163-170.

63. Holmes S.G., Braunstein M., Broad J. Transcriptionalsilencing of the yeast mating-type genes // Epigeneticmechanism of gene regulation / Eds Russo V.E.A., Martienssen R.A., Riggs A.G. N. Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press., 1996.-P. 467-487.

64. Isaacs F. J., Hasty J., Cantor C.R. Collins, J.J. Prediction and measurement of an autoregulatory genetic module // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100, № 13.-P. 7714-7719.

65. Ishihama A. Adaptation of gene expression in stationary phase bacteria // Curr. Opin. Genet. Develop. 1997. - V. 7. - P. 582-588.

66. Jablonka E., Lachmann M., Lamb M.J. Evidence, Mechanisms and Models forthe Inheritance of Acquired Characters // Journal of Theoretical Biology -1992. -V. 158.-P. 245-268.

67. Jablonka E., Lamb M.J. The inheritance of acquired epigenetic variations // J. Theor. Biol. 1989. - V. 139. - P. 69-83.

68. Jacob F., Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins // J. Mol. Biol. -1961. V. 3. - P. 318-356.

69. Jacobs Ch., Shapiro L. Microbial asymmetric cell division: localization of cell fate determinants // Current Opinion in Genetics & Development. -1998. -V.8. -P. 386-391.

70. Kaneko T., Sato S., Korani H. et al. // DNA Res. 1996. - V. 3. - P. 109136.

71. Kelleher J., Raleigh E. Response to UV damage by four Escherichia coli K-. 12 restriction systems // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 5888-5896.

72. Kobayashi H., Kaern M., Araki M. et al. Programmable cells: Interfacing natural and engineered gene networks // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2004. -V. 101.-P. 8414-8419.

73. Kolsto A.B. Dynamic bacterial genome organization // Mol. Microbiol. -1997.-V. 24.-P. 241-248.

74. Kolter R., Siegle D., Torno A. The Stationary phase of bacterial life cycle // Ann. Rev. Microbiol. 1993. - V. 47. - P. 855-874.

75. Kuzminov A. Collapse and repair of replication forks in Escherichia coli H J. Mol. Microbiol. 1995. -V. 16. - P. 373-384.

76. Kuzminov A., Stahl F.W. Double stranded repair via the RecBC pathway in Escherichia coli primes DNA replication // Genes Dev. 1999. - V. 13. - P. 345-356.

77. Lammers P.J., Golden J.W., Haselkorn R. Identification and sequence of a gene required for a developmentally regulated DNA excision in anabaena // Cell. 1986. - V. 44. - P. 905-911.

78. Landman O.E. The inheritance of acquired characteristics // Ann. Rev. Genet. 1991. - V. 25. - P. 1-20.

79. Lee T. I., Rinaldi N. J., Robert F et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae II Science. -2002. V. 298. - P. 799-804.

80. Lemon B., Tjian R. Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control // Genes and Development. 2000. - V. 14, № 20. - P. 2551-2569.

81. Levy D.D., Cebula T.A. Fidelity of replicatiove DNA in mutS and repair prificient E. coli // Mutat. Res. 2001. - V. 474. - P. 1-14.

82. Li E. Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development // Nature Reviews Genetics 2002. - V. 3, № 9. - P. 662-673.

83. Lieber M.M. Environmentally responsive mutator systems: toward a unifying perspective // Rev. Biol. 1998. -V. 91. - P. 425-457.

84. Loewen P.C., Hu B., Strutinsky J., Sparling R. Regulation in the rpoS regulon of Escherichia coli II Can. J. Microbiol. -1998. V. 44. - P. 707-717.

85. Lohuizen M. The trithorax-group and Polycomb-group chromatin modifiers: implications for disease // Current Opinion in Genetics & Development. 1999. -V. 9, №3.-P. 355-361.

86. Lundhlad V., Kleckner N. Mismatch repair mutations of Escherichia coli K12 enhance transposon excision // Genetics. 1985. - V. 109. - P. 3-19.

87. Lutkenhaus J. The regulation of bacterial cell division: a time and place for it // Current Opinion in Microbiology. 1998. - V. 1. - P. 210-215.

88. Lutz R., Bujard H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/Oand AraC/Il-I2 regulatory elements I I Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25, № 6. - P. 1203-1210.

89. Madeo F., Frehlich E., Ligr M. et al. Oxygen stress: a regulator of apoptosis in yeast //J. Cell Biol. 1999. - V. 145. - P. 757-767.

90. Maeda H., Jishage M., Nomura T. et al. Two extracytoplasmic function sigma subunits, cE and aFecI, of Escherichia coli: promoter selectivity and intracellular levels // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 1181 -1184.

91. Marmorstein R. Protein modules that manipulate histone tails for chromatin regulation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001 - V. 2. - P. 422-432.

92. Matic I., Taddei F., Radman M. Genetic barriers among bacteria // Trends Microbiol. 1996. - V. 4. - P. 69-72.

93. Matic I., Taddei F., Radman M. No genetic barriers between Salmonella enterica serovar typhimurium and Escherichia coli in SOS-induced mismatch repair-deficient cells // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 5922-5924.

94. Matin A. Role of alternate sigma factors in starvation protein synthesis -novel mechanisms of catabolite repression // Res. Microbiol. -1996. — V. 147, №6-7.-P. 494-505.

95. Maynard Smith J. The Problems of Biology. Oxford University Press, Oxford, U.K, 1989.

96. McAdams H. H., Arkin A. Stochastic mechanisms in gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 814-819.

97. McKenzie G.J., Harris R.S., Lee P.L., Rosenberg S.M. 7 he SOS response regulates adaptive mutation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 6646-6651.

98. McKenzie G.J., Lee P.L., Lombardo M.J. et al. SOS mutator DNA polymerase IV functions in adaptive mutation and not adaptive amplification // Molec. Cell. -2001. -V. 7. P. 571-579.

99. Meyer A., Schartl M. Gene and genome duplications invertebrates: the one-to-four (to-eight in fish) rule and the evolution of novel gene functions // Curr. Opin. Cell. Biol. 1999.-V. 11.-P. 699-704.

100. Missiakas D., Raina S. The extracytoplasmic function sigma factors: role and regulation // Mol. Microbiol. 1998. - V. 28, № 6. - P. 1059-1066.

101. Motamedi M.R., Szigety S.K., Rosenberg S.M. Doublestrand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo // Genes Dev. 1999. - V. 13. - P. 2889-2903.

102. Murphy D.B., Pembroke J.T. Transfer of the IncJ plasmid R391 to recombination deficient Escherichia coli K12: evidence that R391 behaves as a conjugal transposon // FEMS Microbiology Letters. 1995. - V. 134. - P. 153158.

103. Murray K. D., Bremer H. Control of spoT-dependent ppGpp synthesis and degradation in Escherchia coli II J. Vol. Biol.-1996. -V. 295. P. 41-57.

104. Nijkamp H.J.J., Szybalski W., Calef E. Antirepressor controls the transcription of the repressor operon of lambda phage // Informative Molecules in Biological Systems / Nord-Holland Publ. Co. Amsterdam, 1971. - 241 p.

105. Nystrom T., Neidhardt F.C. Expression and role of the universal stress protein, UspA, of Escherichia coli during growth arrest // Mol. Microbiol. -1994.-V. 11.-P. 537-544.

106. Nystrom T. To be or not to be: the ultimate decision of the growth-arrested bacterial cell // FEMS Microbiol. Rev. 1998. - V.21. - P.283-290.

107. Ochman H., Lawrence J.G., Groisman E.A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation // Nature. 2000. - V. 405. - P. 299-304.

108. Ogata Y., Miki T., Sekimizu K. A Role of heat shock proteins for homologous recombination in Escherichia coli II Biochem. Biophys. Res. Communs. 1993. - V. 197. - P.34-39.

109. Pedraza J. M., Oudenaarden A. Noise propagation in gene networks // Science. 2005. - V. 307. - P. 1965-1969.

110. Perbal B.V. A practical guide to molecular cloning. NY.: A Wiley -Interscience publication, 1988. - 811 p.

111. Petit M.A., Dimpfl J., Radman M., Echols H. Control of large chromosomal duplications in Escherichia coli by the mismatch repair system // Genetics. -1991.-V. 129.-P. 327-332.

112. Poux S., Horard B., Sigrist C.J., Pirrotta V. The Drosophila trithorax protein is a coactivator required to prevent re-establishment of polycomb silencing // Development. 2002. - V. 129. - P. 2483-2493.

113. Powell S.C., Wartell R.M. Different characteristics distinguish early versus late arising adaptive mutations in Escherichia coli FC40 // Mutat. Res. 2001. -V. 473.-P. 2 19-228.

114. Priault M., Camougrand N., Chaudhuri B., Schaeffer J., Manon S. // FEBS Lett. 1999. - V. 456. - P. 232-238.

115. Radman M., Taddei F., Matic I. Evolution-driving genes // Res. Microbiol. -2000. V. 151.-P. 91-95.

116. Ramaswamy K.S., Carrasco C.D., Fatma T., Golden J.W. Cell-type specificity of the Anabaena fdxN-element rearrangement requires xisH and xisl II Mol. Microbiol. 1997. -V. 23. - P. 1241-1249.

117. Ratner V.A., Tchuraev R.N. Simplest genetic systems controlling ontogenesis: organization principles and models of their function // Progress in Theor. Biol. New York: Acad. Press, 1978. - V. 5. - P. 81-127.

118. Riggs A.D., Porter T.N. Overview of Epigenetic Mechanisms // Epigenetic mechanism of gene regulation / Ed. V.W.A. Russo, R.A. Martienssen, A.G. Riggs. -N. Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press., 1996. P. 489-505.

119. Riley M., Kraweic S. // Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology. 2nd ed. / Neidhardt F.C., Ed. Waschington. D. C.: ASM Press.-1996.

120. Romero D., Palacios R. Gene amplification and genomic plasticity in prokaryotes // Ann. Rev. Genet. 1997. - V. 31. - P.91 -111.

121. Rosenberg S. Mutation for survival // Cuff. Opin. Genet. Dev. 1997. - V. 7.-P. 829-834.

122. Rosenberg S.M. Evolving Responsively: Adaptive Mutaion // Nature Rev. Genetics. 2001. - V. 2. - P. 504-515.

123. Rosenfeld N, Elowitz M.B., Alon U.J. Negative autoregulation speeds the response times of transcription networks // J. Mol. Biol. 2002. - V. 323. - P. 785-793.

124. Rosenfeld N., Young J. W., Alon U., Swain P. S., Elowitz M. B. Gene regulation at the single-cell level // Science. 2005. - V. 307. - P. 1962-1965.

125. Sato T., Kobayashi Y. The ars Operon in the skin Element of Bacillus subtilis Confers Resistance to Arsenate and Arsenite // J. Bacteriol. 1998. - V. 180, №7.-P. 1655-1661.

126. Seyfradeh M., Keener J., Nomura M. j^or-dependent accumulation of guanosine tetraphosphate in response to fatty acid starvation in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1993. - V. 90. - P. 1004-1008.

127. Shapiro J.A. Differential action and differential expression of DNA polymerase I during Escherichia coli colony development // J. Bacteriol. -1992. V. 174, №. 22. - P. 7262-7272.

128. Shapiro J.A. Pattern and control in bacterial colonies // Sci. Progr. 1994. -V.76. -P.399-424.

129. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays. -1995.-V. 17,№7.-P. 597-607.

130. Shen-Orr S. S., Milo R., Mangan S., Alon, U. Network motifs in the transcriptional regulation network of Escherichia coli II Nat. Genet. — 2002. -V. 31.-P.64-68.

131. Smith B.T., Walker G.C. Mutagenesis and more: umuDC and the Escherichia coli SOS response // Genetics. 1998. - V. 148. - P. 1590-1610.

132. Stark G.R., Wahl G.M. Gene amplification // Annu. Rev. Biochem. 1984. -V. 37.-P. 217-224.

133. Steidler L., Neirynck S., Huyghebaert N. et al. Biological containment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinal delivery of human interleukin 10 // Nat. Biotechnol. 2003. - V. 21. - P. 785-789.

134. Stepanenko I.L., Grigor'ev S.A. Organization of the gene network of apoptosis // Proc. Ill Intern. Conf. on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS'2002). Novosibirsk: ICG. 2002. - V. 2. - P. 89-91.

135. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. Two-component signal transduction // Annu. Rev. Biochem. 2000. - V. 69. - P. 183-215

136. Storz G., Imlay J.A. Oxidative stress // Current Opinion in Microbiology. -1999. V.2. - P. 188-194.

137. Studholme D.J., Buck M. The biology of enhancer-dependent transcriptional regulation in bacteria: insights from genome sequences // FEMS Microbiol. Lett.-2000.-V. 186.-P. 1-9.

138. Taddei F., Halliday J.A., Matic I., Radman M. Genetic analysis of mutagenesis in aging Escherichia coli colonies // Mol. Gen. Genet. 1997. - V. 256.-P. 277-281.

139. Takemaru K., Mizuno M., Sato T. et al. Complete nucleotide sequence of a skin element excised by DNA rearrangement during sporulation in Bacillus subtilis // Microbiology. 1995. - V. 141. - P. 323-327.

140. Tchuraev R.N. The epigene hypothesis // Biopol. & Cell. 1997. - V. 12. P. 75-81.

141. Tchuraev R.N. On storing, coding, passing and processing the hereditary information in living system // Computational Technologies. 2000. - V. 5, № 2. - P. 100-111.

142. Tchuraev R.N., Stupak I.V., Tropynina T.S., Stupak E.E. Epigenes: design and construction of new hereditary units // FEBS Lett. 2000. - V. 486. - P. 200-202.

143. Theissen G., Saedler H. Floral quartets // Nature. 2001. - V. 409, № 6819. -P. 469-471.

144. Thieffry D., Huerta A.M., Perez-Rueda E. et al. From specific gene regulation to genomic networks: a global analysis of transcriptional regulation in Escherichia coli II Bioessays. 1998. - V. 20, № 5. - P. 433-440.

145. Velkov V.V. How environmental factors regulate mutagenesis and gene transfer in microorganisms // J. Biosci. 1999. - V. 24, № 4. - P. 529-559.

146. Votyakova T.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B. Influence of viable cells on the resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in extendedstationary phase. The population effect // Appl. Environ. Microbiol. 1994. -V.60. - P.3284-3291.

147. Vulic M., Dionisio F., Taddei F., Radman M. Molecular keys to speciation: DNA polymorphism and the control of genetic exchange in enterobacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V 94. - P. 8763-9787.

148. Wagner J, Nohmi T. Escherichia coli DNA polymerase IV mutator activity: genetic requirements and mutational specificity // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. -P. 4587-4595.

149. Weber W., Fussenegger M. Artificial mammalian gene regulation networks-novel approaches for gene therapy and bioengineering // J. Biotechnol. 2002. -V. 98,№2-3.-P. 161-187.

150. Wolf D.M., Eeckman F.H. On the relationship between genomic regulatory element organization and gene regulatory dynamics. // J. Theor. Biol. 1998. -V. 195.-P.167- 186.

151. Wolffe A.P., Matzke M.A. Epigenetics: regulation through repression // Science. 1999. - V. 286. - P. 481-486.

152. Wright M.E., Han D.K., Carter L., Fields S., Schwartz S.M., and Hockenbery D.M. // FEBS Lett. 1999. - V. 446. - P. 9-14.

153. Yarmolinsky M.B. Programmed cell death in bacterial populations // Science. 1995. - V. 267. - P.836-837.

154. Акайзин E.O., Воскун C.E., Панова JI.A., Смирнов С.Г. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза // Микробиология. 1990. - Т.59. - С.283-288.

155. Будрене Е.О. Образование пространственно упорядоченных структур в колониях подвижных бактерий на агаре // Докл. АН СССР. 1985. -Т.283, № 2. - С.470-473.

156. Бельков В.В. Амплификация генов в прокариотических и эукариотических геномах // Генетика. 1982. - Т. 18. - С. 529-543.

157. Вельков В.В. Новые представления о молекулярных механизмах эволюции: стресс повышает генетическое разнообразие // Молекуляр. биол. 2002. - Т. 36, № 2. - С. 277-285.

158. Глазер В.М. Конверсия гена // СОЖ. 2000. - № 1. - С. 23-31.

159. Головин С.Я. Коннекторный способ клонирования кДНК // Методы молекулярной генетики и генной инженерии / Отв. ред. Р.И. Салганик. -Новосибирск: Наука, 1990. С. 44-56.

160. Голубовский М.Д. Концепция эпигена 20 лет спустя // Биополимеры и клетка. 1996. - Т. 12, № 6. - С. 5-24.

161. Голубовский М.Д. Век генетики: эволюция идей и понятий. СПб.: Борей Арт, 2000. - с. 262.

162. Голубовский М.Д. Неканонические наследственные изменения // Природа. 2001. - № 8-9. - С. 3.

163. Дельвер Е.П., Агафонова О.В., Туликова Е.Е и др. Система регуляции экспрессии генов антирестикции ardA и ardB, кодируемых трансмиссивной плазмидой IncN pKMlOl // Молекуляр. биология. 1998. -Т. 32, №2.-Р. 242-248.

164. Жимулёв И. Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Изд. Новосиб. ун-та, 2002. - 458 с.

165. Завильгельский Г.Б. Антирестрикция // Молекуляр. биология. 2000. -Т. 32.-С. 854-862.

166. Камалетдинова М.А., Сагитов Ш.З., Набиуллина P.P., Ривкин М.И., Чураев Р.Н. Плазмидный вектор с каскадной регуляцией экспрессии генов // Доклады Академии наук. 1990. - Т. 313, № 4. - С. 980-982.

167. Кель О.В., Кель-А.Э. Межгенные взаимоотношения в регуляции клеточного цикла: ключевая роль транскрипционных факторов семейства E2F// Молекулярная биология.-1997.-Т. 31, № 4.-С. 656-670.

168. Колчанов H.A., Ананько Е.А., Колпаков Ф.А. и др. Генные сети // Мол. биология. 2000. - Т. 34, № 4. - С. 533-544.

169. Колчанов H.A., Суслов В.В., Гунбин К.В. Моделирование биологической эволюции: регуляторные генетические системы и кодирование сложности биологической организации // Вестник ВОГиС. -2004. Т.8, № 2. - С. 86-99.

170. Лихошвай В.А., Матушкин Ю.Г., Фадеев С.И. О связи графа генной сети с качественными режимами ее функционирования // Молекуляр. биология. 2001. - Т. 35, № 6. - С. 1080-1087.

171. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-479с.

172. Маркель A.JI. Стресс и эволюция: концепция Д.К.Беляева и ее развитие // Современные концепции эволюционной генетики. Сборник научных трудов / Отв. ред. В.К. Шумный, A.JI. Маркель. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2000.-С. 103-114.

173. Мартынкина Л.П., Милько Е.С. Ультраструктурные особенности диссоциантов Rhadococcus rubropertinctus и Streptococcus lactis II Микробиология. 1991. - T.60, № 2. - C.334-338.

174. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. -436 с.

175. Могильная О.А, Милько Е.С., Медведева С.Е. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение колонии и клеток диссоциантов родококка // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. - Т. 30, № 6. - С. 877-882.

176. Моно Ж., Жакоб Ф. Общие выводы: телеономические механизмы в процессах клеточного обмена, роста и дифференцировки // Регуляторные механизмы клеток. М.: Мир, 1964. - 477с.

177. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова Е. А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. - Т.69, № 3. - С.З 09-327.

178. Патрушев JI.И. Экспрессия генов. М.: Наука. - 2000. - 526 с.

179. Прозоров A.A. Строение генома бактерий: единство или многообразие? II Генетика. -1995. Т. 31, № 6. - С. 741-752.

180. Прозоров A.A. Горизонтальный перенос генов у бактерий: лабораторное моделирование, природные популяции, данные геномики // Микробиология. 1999. - V. 68, № 5. - С. 632-646.

181. Пташне М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг X. -М.: Мир, 1989.-160 с.

182. Ратнер В.А. Молекулярно-генетические системы управления. -Новосибирск: Наука, 1975.-286 с.

183. Ратнер В.А. Что содержит геном Escherichia coli II Вестник ВОГиС. -2002.-№18.-С. 86-99.

184. Ратнер В.А., Чураев Р.Н. Существует ли двухоперонная система управления (триггер)? Некоторые факты и эвристическое значение триггера // Генетика. 1971. - Т. 7, № 9. - С. 175-179.

185. Самуилов В.Д., Олескин A.B., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия. 2000. - Т. 65, № 8. - С. 1029-1046.

186. Ханаан Дж. Методы трансформации Е. coli II Клонирование ДНК. Методы. / Ред. Д. Гловер. М.: Мир, 1988. - С. 140-173.

187. Харди К.Дж. Выделение бактериальных плазмид // Плазмиды. Методы /Ред. К.Дж. Харди.-М.: Мир, 1990.-С. 11-18.

188. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М.: Наука, 1985. - 472 с.

189. Хмель И.А. Регуляция экспрессии бактериальных генов в отсутствие активного роста клеток // Генетика. 2005. - Т. 41, № 9. - С. 1183-1202.

190. Чураев Р.Н. Гипотеза об эпигене // Исследования по математической генетике / Ред. В.А. Ратнер. Новосибирск: ИЦиГ СО АН СССР, 1975. -С. 77-94.

191. Чураев Р.Н. Прикладные аспекты концепции эпигенов // Журн. общ. биологии. 1982. - Т. 43, № 1. - С. 79-87.

192. Чураев Р.Н. Моделирование молекулярно-генетических систем управления: Дис. . д-ра биол. наук. Уфа, 1987. 414 с.

193. Чураев Р.Н. Метод обобщенных пороговых моделей для анализа динамики эукариотических молекулярно-генетических систем управления // Препринт. Уфа: УНЦ РАН, 1993. - 32 с.

194. Чураев Р.Н. Кибернетический подход как ключ к пониманию жизненных процессов // Труды конференции, посвященной 90-летию со дня рождения A.A. Ляпунова. Новосибирск, 2001. - С. 741-757.

195. Чураев Р.Н. Контуры неканонической теории наследственности: от генов к эпигенам // Журн. общ. биологии. 2005. - Т.66, № 2.- С. 99-122.

196. Чураев Р.Н., Ратнер В.А. Моделирование молекулярно-генетических систем управления на языке теории автоматов. Сообщение I. Опероны и оперонные системы // Исследования по теоретической генетике. Новосибирск: ИЦиГ СО АН СССР. 1972. - С. 210-227.

197. Чураев Р.Н., Ратнер В.А. О моделировании молекулярно-генетических систем управления на языке теории автоматов // Генетика. 1973. - Т. 9, №2.-С. 173-175.

198. Чураев Р.Н., Ступак И.В., Тропынина Т.С., Ступак Е.Э. Сконструирован двухкомпонентный эпиген с наперед заданными свойствами // Доклады Академии наук. 2001. - Т. 378, № 6. - С. 837-840.

199. Чураев Р.Н., Ступак И.В., Ступак Е.Э., Галимзянов A.B. Новое свойство эпигенов: метастабильные эпигенотипы // Доклады Академии наук 2006. - Т. 406, № 4. - С. 570-573.

200. Шапиро Дж.А. Бактерии как многоклеточные организмы // В мире науки. 1988. - № 8. - С.46-54.