Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фенотипическая и генотипическая характеристика метициллинрезистентных представителей вида Staphylococcus aureus

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фенотипическая и генотипическая характеристика метициллинрезистентных представителей вида Staphylococcus aureus"

Гостев Владимир Валерьевич

Фенотииическая и генотииическая характеристика метициллинрезистентных представителей вида Staphylococcus aureus

03.02.03 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Москва - 2013

005539447

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства»

Научный руководитель

доктор медицинских наук профессор Сидоренко Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

Дмитренко Ольга Александровна доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Митрохин Сергей Дмитриевич доктор медицинских наук профессор, руководитель отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН)

Защита состоится » ноября 2013 года в 11 час. на заседании диссертационного совета (Д 208.130.01) в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18

Автореферат разослан » октября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совет;

доктор медицинских наук профессор

Русакова Е. В.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Метициллинрезистентные представители вида Staphylococcus aureus (methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) были одновременно описаны Barber, M. и Jevons, М. в 1961 г, эти бактерии относятся к важнейшим возбудителям госпитальных, а в некоторых регионах и внебольничных инфекций. Так, в США от инфекций, вызываемых MRSA, ежегодно погибает около 20 ООО человек (Boucher, H.W., 2008). В Европе ежегодно регистрируется около 200 тысяч случаев MRSA инфекций, из которых 7% заканчиваются летальным исходом (ECDC report 2007). Этиотропная терапия MRSA инфекций связана со значительными сложностями, поскольку устойчивость к метициллину является маркером устойчивости к подавляющему большинству бета-лактамных антибиотиков. Кроме этого, для MRSA характерна высокая частота ассоциированной устойчивости к антибиотикам других групп. В течение долгого времени средством выбора для лечения MRSA инфекций был ванкомицин, однако, с середины 90-х годов прошлого века наблюдают рост устойчивости к этому антибиотику (Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus - VISA, hetero - VISA и Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus — VRSA). Проблему лечения MRSA инфекций не решают и появившиеся в последние годы новые антибиотики. К таким препаратам, как: линезолид, даптомицин, тигециклин и цефтаролин, уже зафиксировано появление резистентности. Очевидно, что для обоснования эффективной этиотропной терапии и профилактики MRSA инфекций необходимы данные о динамике распространения и механизмах ассоциированной устойчивости этих бактерий к широкому кругу антибиотиков различных групп.

Степень разработанности темы.

Анализ структуры популяции MRSA, циркулирующих на Земном Шаре, выявляет ее выраженную клональность, при этом, в различные периоды времени, в различных географических регионах обнаруживают доминирование различных генетических линий. Детали механизмов формирования таких

успешных генетических линий не установлены, однако ясно, что они основаны на эволюции основного (ядерного) генома бактерий и интенсивном обмене подвижными генетическими элементами. Важнейшим среди этих элементов является стафилококковая хромосомная тес - кассета (Staphylococcal Cassette Chromosome mec), в состав которой входит ген тесА, кодирующий измененный пенициллинсвязывающий белок (РВР2а), опосредующий устойчивость к бета-лактамам. В SCCmec также входят гены резистентности к другим антибиотикам.

На основании анализа «ядерного» генома методом мультилокусного сиквенс-типирования (multilocus sequence-typing - MLST) среди MRSA, циркулирующих на Земном Шаре, удается выделить 6 глобальных генетических линий (клональных комплексов Clonal complex, СС), среди которых описано 11 основных вариантов SCCmec и множество других подвижных генетических элементов (Holden, M., 2013; Chambers, H.F., 2010; Gomes, A.R., 2006).

До недавнего времени MRSA рассматривались как возбудители госпитальных инфекций (HA-MRSA, hospital-associated MRSA). Однако, с середины 90-х годов в ряде регионов (Северная Америка и Юго-Восточная Азия, Европа) отмечено появление и быстрое распространение новых генетических линий высоковирулентных MRSA, так называемых «внебольничных MRSA» (community-associated MRSA, CA-MRSA) (David, M.Z., 2010).

По мере возрастания количества известных детерминант вирулентности и антибиотикорезистентности, а также разнообразия их комбинаций, анализ популяционной структуры MRSA резко усложняется, что требует применения новых методических подходов, к которым, в первую очередь, следует отнести полногеномное секвенирование. Применение этого метода позволяет решать как локальные задачи по анализу вспышек госпитальных инфекций, так и выявлять глобальные эволюционные закономерности.

В последние годы предлагается объединять в одну группу, учитывая их общую функциональную направленность, факторы, защищающие бактерии от действия системы врожденного иммунитета хозяина. На сегодняшний день описано 38 таких факторов (McCarthy, A.J., 2013). В эту группу включают и факторы, входящие в состав комплекса IE С (Immune evasion cluster) кластер «ухода от иммунной защиты». В этот комплекс входят: стафилокиназа (sak), ингибитор системы комплемента (sen), ингибитор хемотаксиса лейкоцитов (chp), энтеротоксины А и Р (sea, sep). IEC классифицирован на A-G типы (van Wamel W.J., 2006).

В Российской Федерации проводились многоцентровые исследования, посвященные оценке чувствительности MRSA к ванкомицину и другим антибиотикам C.B. Сидоренко (1998), A.B. Дехнич (2002 и 2008). В работах Vorobieva, V. (2008), Afanasev, M.V. (2010), Yamamoto, T. (2012) показано, что на территории России распространены клоны ST8, ST239 (sequence type) и некоторые другие. Большой вклад в изучение молекулярной эпидемиологии MRSA в России внесли O.A. Дмитренко (2005 - 2006 и 2008), O.E. Хохлова (2011), Романов A.B. (2012), Гончаров А.Е. (2011-2012). Первое полногеномное секвенирование одного из эпидемических клонов MRSA было проведено исследователями из Владивостока совместно с японскими коллегами (Yamamoto, Т., 2012).

В то же время, в России такие вопросы, как распространение среди MRSA резистентности к новым антибиотикам, распространенность отдельных типов кассет SССтес, детерминант вирулентности, комплекса IEC, а также связь доминирующей в России генетической линии СС8 с глобально циркулирующими линиями, остаются неясными.

Цель исследования: Определить фенотипические и генотипические факторы метициллинрезистентных представителей вида Staphylococcus aureus, влияющие на эффективность антибактериальной терапии

Задачи исследования 1. Провести сравнительную оценку микробиологической активности

известных, новых и перспективных препаратов в отношении MRSA;

2. Охарактеризовать механизмы резистентности MRSA к аминогликозидам, тетрациклинам, макролидам/линкозамидам, фениколам;

3. Провести молекулярное типирование ядерного генома MRSA (по схеме MLST), регуляторных элементов (agr), а также подвижных генетических элементов (SCCmec и IEC), выявить доминирующие генетические линии;

4. Провести полногеномное секвенирование типичного представителя доминирующего клона и дать сравнительную оценку генома;

5. Выявить особенности ассоциированной антибиотикорезистентности в зависимости от генотипа MRSA;

6. Провести комплексный анализ фенотипических и генотипических свойств MRSA и определить антибиотики, наиболее перспективные для лечения стафилококковых инфекций.

Научная новизна. Впервые проведено полногеномное секвенирование доминирующего Российского клона ST8. Установлено, что изолят SA0077 имеет высокую гомологию с геномами 8 клонального комплекса, характеризуется наличием кассеты SCCmec IVc, тремя островками патогенности, двумя интактными профагами и тремя плазмидами. Были обнаружены и аннотированы все детерминанты резистентности и вирулентности.

Проведена оценка микробиологической активности ванкомицина у MRSA, циркулирующих в Российской Федерации. Выявлены изоляты со сниженной чувствительностью к гликопептидам. Проведена оценка активности новых препаратов в отношении MRSA: даптомицина, линезолида, тигециклина, цефтаролина.

Установлено, что в структуре популяции доминирующими клонами являются госпитальные HA-MRSA (hospital acquired MRSA), относящиеся к глобально распространенным линиям ST8 и ST239. Также, выявлен не описываемый ранее в России клон ST228. Кассеты SCCmec представлены у MRSA пятью типами (SCCmec I - SCCmec V) и 16 подтипами, но наиболее

часто встречающийся тип - SCCmec IVc. Установлено, что MRSA с разными SCCmec имеют различный уровень антибиотикорезистентности, а также отличаются по спектру ассоциированной устойчивости.

Подавляющее большинство изолятов (70%) имело D — тип строения комплекса «ухода от иммунной защиты» (IEC), включающий энтеротоксин А (sea), стафилокиназу (sak), ингибитор системы комплемента (sen).

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные о микробиологической оценке активности как известных, так и новых препаратов могут быть использованы для оптимизации эмпирической и целенаправленной антибиотикотерапии стафилококковых инфекций. Результаты генотипирования имеют эпидемиологическое значение и могут быть использованы для мониторинга распространения MRSA на территории России, а также для разработки мер по сдерживанию и своевременному выявлению новых эпидемических линий. Использованные в работе алгоритмы ПЦР типирования: определение SCCmec, детерминант резистентности и вирулентности, могут быть использованы в ПЦР - лабораториях для быстрой детекции антибиотикорезистентности и для мониторинга локальной эпидемиологии MRSA инфекций.

Методология и методы исследования. Работа выполнена на основе многоцентрового микробиологического исследования клинических изолятов MRSA. В основе фенотипического анализа было определение активности антибиотиков in vitro в отношении MRSA. Из генотипических методов использованы ПЦР-типирование, секвенирование и полногеномное секвенирование. Полученные данные обработаны методами описательной статистики.

Положения, выносимые на защиту 1. У 30% MRSA выявлен критический уровень чувствительности к ванкомицину(2 мкг/мл). Наибольшей активностью в отношении MRSA, циркулирующих на территории РФ, обладают антибиотики — линезолид,

тигециклин, даптомицин, цефтаролин, фузидиевая кислота, мупироцин и ко-тримоксазол.

2. В популяции MRSA, циркулирующих на территории РФ, выявлены три генетические линии (ST8, ST239 и ST228), что позволяет охарактеризовать указанную популяцию, как высоко клональную. Доминирующая на территории РФ генетическая линия MRSA (ST8) относится к 8-му клональному комплексу и имеет генотипические черты HA-MRSA.

3. Изоляты, относящиеся к ST228, ST239, и несущие кассеты SCCmec I-III типов, проявляют наибольший уровень ассоциированной устойчивости к антибиотикам различных групп. Выявлена гетерогенность ассоциированного резистома MRSA.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов определяется репрезентативным объемом выборки изолятов MRSA. Исследования антибиотикочувствительности проведены в соответствии с международными рекомендациями и с использованием контрольных штаммов. Выводы и рекомендации, сформулированные в работе, основаны на полученных результатах исследования.

Диссертационное исследование было поддержано грантом комитета по науке и высшей школы правительства Санкт-Петербурга в рамках выигранного конкурса на предоставление субсидии молодым ученым (Диплом серия ПСП №12453 от 20.09.2012).

Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях и научных форумах: 52 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (52nd ICAAC), Poster C2-1385, (США, 2012); Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «XV Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «XVI Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2013); XVII Всероссийская научно-практическая конференция "Интеграция в лабораторной медицине" (Москва, 2012);

Региональная Научно-практическая конференция "Актуальные вопросы клинической микробиологии" (Челябинск, 2012); Городской междисциплинарный семинар клинических фармакологов и микробиологов «Человек-микроб-антибиотик» ФГБУ «НИИДИ ФМБА России» (Санкт-Петербург, 2012); Ежегодный научно-практический семинар «Секвенирование нового поколения 454: от уникальных исследований к повседневной практике» (Москва, 2013); Итоговая XXXV научно-практическая конференция ФГБУ «НИИДИ ФМБА России» (Санкт-Петербург, 2013).

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась на Ученом совете ФГБУ «НИИДИ ФМБА России» (протокол № 7 от «24» сентября 2013 г.), председатель совета - академик РАМН, доктор медицинских наук профессор Лобзин Юрий Владимирович, секретарь — кандидат медицинских наук, доцент Волжанин Валерий Михайлович.

По результатам исследований опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов диссертационного исследования.

Личное участие автора в получении результатов. Все этапы экспериментальной части диссертационной работы, а также литературный обзор выполнены самостоятельно. Отдельные этапы работы были проведены в сотрудничестве с сотрудниками ФГБУ «НИИ ФХМ ФМБА России», Москва и «НИИ МБ им. В.А. Энгельгардта РАН» (ЦКП «Геном»), Москва.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, 4 глав, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы и приложений. Библиографический список литературы включает 242 источников литературы, в том числе 20 - отечественных и 222 иностранных. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 30 рисунками.

Основное содержание работы

Материалы и методы исследования. В исследование включены 350 изолятов MRS А, выделенных в 2011 — 2012 годах от больных с разными формами внутрибольничных и внебольничных инфекций, из стационаров в 8 регионах РФ. Идентификацию S.aureus проводили на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex LT («Bruker Daltonics», Германия). Фенотип MRSA определяли по уровню чувствительности к цефокситину, а также, по наличию гена тесА в ПЦР. Все изоляты депонировались в музей культур и хранились при -70°С.

Антибиотикочувствительность оценивали методом серийных микроразведений с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в бульоне САМН II Broth («Becton Dickinson», США) в соответствие с рекомендациями CLSI 2011- 2013. Были использованы следующие субстанции антибиотиков («Molekula», Англия): оксациллин (ОХА), цефокситин (FOX), гентамицин (GEN), эритромицин (ERY), клиндамицин (CLI), ципрофлоксацин (CIP), моксифлоксацин (MFX), тетрациклин (TCY), мупироцин (MUP), фузидиевая кислота (FUS), хлорамфеникол (CHL), ко-тримоксазол (SXT). Антибиотики других производителей: линезолид (LNZ) и тигециклин (TGC, «Pfizer», США), цефтаролин (СРТ, «AstraZeneca», Англия), арбекацин (ARB, «Meiji», Япония), ванкомицин (VAN) и даптомицин (DAP) («TREK Diagnostic Systems», США). Дополнительно, у 68 штаммов определяли МПК к ванкомицину с использованием E-тестов («Oxoid», Англия).

Для проведения типирования (SCCmec -, agr-, выявления детерминант резистентности и вирулентности) использовали ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Праймеры для типирования генов резистентности и вирулентности, а также для детекции шес-комплекса SCCmec разработаны в настоящем исследовании. Подбор праймеров и дизайн ПЦР проводили с помощью Oligo v.7.0. Праймеры синтезированы в ЗАО «Евроген» (Россия).

У изолятов, проявлявших фенотипическую устойчивость, методом ПЦР выявляли гены резистентности к соответствующим антибиотикам: устойчивость к аминогликозидам (aac(6')-aph(2"), aph(3')-HIa, aadD), макролидам/линкозамидам (ermABC, spc, InuA, те/А), тетрациклину (tetMK), мупироцину (тирA), ко - тримоксазолу (dfrK), фузидиевой кислоте {fusВ) и фениколам (cat, fax А).

Определение типа SCCmec осуществляли по рекомендациям IWG - SCC (International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements) с детекцией тес-комплекса, ccr - комплекса и J- регионов. Субтипирование SCCmec проводили по Kondo Y., et al. (2007), Milheirico C., et al. (2007).

Методом ПЦР проводили детекцию следующих детерминант вирулентности: генов комплекса IEC: sea, sep, sen, chp, sak, hlb (b-гемолизин); a также tsst (ген токсического шока), lukFS (токсин Пантона — Валентайна, PVL), seb (энтеротоксин В). Типирование проводили у 230 рандомизированно выбранных изолятов.

Для определения принадлежности S. aureus к разным agr - группам использовали метод Gilot P., et al. (2002).

MLST осуществляли по общепринятой схеме в соответствии с Enright, M.С., et al. (2000) и использованием базы данных http://saureus.mlst.net/. MLST проведено у 14 рандомизированно выбранных изолятов.

На основании всех данных молекулярного типирования был выбран один изолят MRSA, представитель доминирующего клона ST8, у которого было проведено секвенирование всего генома. Полногеномное секвенирование проводили на приборе «GS Junior» («454/Roche») с приготовлением библиотек случайных фрагментов ДНК (ShotGun) по стандартному протоколу Rapid Library.

Полученные в ходе исследования результаты были анализированы с помощью следующего программного обеспечения: Microsoft «Excel» 2007 WHOnet 5.6, Unipro Ugene, Mauve 2.3, Newbler, RAST (Aziz, R.K., 2008). При

сравнении результатов использовали двусторонний вариант точного критерия Фишера (Гланц, С. 1999).

Результаты исследования

Распределение изолятов по источнику выделения

S. aureus, выделенные из отделяемого ран при остеомиелитах составили 26%; из мокроты (пневмонии) - 14%; из отделяемого различных хирургических ран - 14%; из отделяемого ожоговых ран - 13%; из крови (сепсис) - 10%; из материала различных абсцессов и инфекций мягких тканей — 7%; из носоглотки у амбулаторно обследуемых пациентов - 6%; из прочих биологических материалов -10%.

Фенотипическая оценка микробиологической активности 18 антибиотиков. Все 350 изолятов, включенные в исследование, имели маркерный ген тесА. Результаты по определению МПК тестируемых препаратов в отношении MRS А, представлены в таблице 1. При оценке микробиологической активности антибиотиков были использованы такие критерии как: диапазон МПК, МПК50, МПК90, средняя геометрическая МПК (МПКсг), распределение МПК, количество (%) чувствительных, устойчивых, с промежуточной чувствительностью изолятов в соответствие с критериями С LSI и EUCAST.

Для оценки чувствительности к арбекацину использовали Японские критерии (Saito, А., 1995).

Несмотря на наличие гена тесА, 2% изолятов проявляли фенотипическую чувствительность (МПК<2 мкг/мл) к оксациллину. При использовании цефокситина все MRS А имели МПК >16 мкг/мл.

Полученные результаты подтверждают обоснованность использования цефокситина как маркерного антибиотика для выявления метициллинрезистентности.

Ванкомицин считается основным препаратом для терапии MRSA -инфекций.

Таблица 1. Фенотипическая оценка микробиологической активности 18 антибиотиков методом серийных

микроразведений

АБ Критерии CLSI 2013 Критерии EUCAST v.3.0 CLSI EUCAST мпк50 мпк90 МПКсг Диапазон МПК

мкг/мл мкг/мл %R %1 %s %R %s мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл

FOX S<4 R>8 R>4 100 - 0 100 0 256 256< 170 16-512

ОХА S<2 R>4 R>2 98,3 - 1,7 98,3 1,7 256 256< 147 0,25-512

CIP S<11=2 R>4 S<1 R>1 92,6 1,7 5,7 94,3 5,7 32 128 32 0,125 - 256

GEN S<4 1=8 R>16 S<1 R>1 88 0 12 88 12 128 128 62 0,125- 128

MFX S<0,5 1=1 R>2 S<0,5 R>1 54,6 30 15,4 84,6 15,4 2 4 1,312 0,06 - 64

CHL S<8 1=16 R>32 S<8 R>8 71,7 4,9 23,4 76,6 23,4 64 128 37 1-256

ERY S<0,5 1=1-4 R>8 S<1 R>2 59,7 5,4 34,9 64 36 128 128 8,217 0,06 - 128

TCY S<4 1=8 R>16 S<1 R>2 54,6 0,6 44,9 55,2 44,9 32 64 2,163 0,03 - 64

CLI S<0,5 1=1-2 R>4 S<0,25 R>0,5 52,6 0 47,4 52,6 47,4 64 64 1,734 0,03 - 64

ARBC - - 32,3 - 67,7 - - 2 16 2,033 0,125-128

SXT S<2/38 R>4/76 S<2/38 R>4/76 7,4 - 92,6 7,4 92,6 0,064 2 0,122 0,016- 16

MÜP R>256 S<1 R>256 - - - в 92,6 0,5 I 0,408 0,06- 16

CPT S<11=2 R>4 S<1 R>1 0,3 4,3 95,4 4,6 95,4 0,5 1 0,473 0,03 - 4

FUS - S<1 R>1 - - - 3 97 0,064 0,25 0,045 0,008 - 16

DAP S<1 S<1 R>1 - - 96,9A 3,1 96,9 1 1 0,765 0,03 - 2

VAN S<2 1=4-8 R>16 S<2 R>2 0 0,3 99,7 0,3 99,1 1 2 1,204 0,03 - 4

TGC - S<0,5 R>0,5 - - - 0 100 0,125 0,25 0,07 0,002 - 0,5

LNZ S<4 R>8 S<4 R>4 0 - 100 0 100 2 2 1,431 0,125-4

Примечаиия к таблице 1: Обозначения: АБ - антибиотики, R - устойчивый, I -промежуточная чувствительность, S - чувствительный. А - По критериям CLSI отсутствует граница резистентности, поэтому 3,1% изолятов рассматриваются как нечувствительные; В - использовали EUCAST epidemiological cut-off S<1 (7,4% изолятов имели МПК>1); С - для ARB использовали японские критерии: S<2.

Диапазон МПК ванкомицина у тестируемых MRSA составлял 0,03 - 4 мкг/мл, при этом только один изолят (0,3%) имел МПК = 4 мкг/мл (фенотип hVISA). Однако, 30% изолятов имели пограничное значение МПК - 2 мкг/мл. Из многочисленных исследований известно, что при МПК > 1 мкг/мл, возрастает вероятность неудачной терапии ванкомицином (Wi, Y.M., 2012, Howden, В.Р., 2010, Musta, A.C., 2009). В этой связи, эффективность ванкомицина ставится под сомнение.

Для детекции увеличения МПК дополнительно использовали Е-тесты с обычной бактериальной нагрузкой и высокой. Для 4 изолятов (6%) из 68 (или 1% от всей выборки), имеющих МПК=2 мкг/мл в серийных разведениях, были характерны высокие значения МПК (р<0,05) при использовании Е-тестов (МПК 3-4 мкг/мл), что можно расценивать как hVISA фенотипы. Следовательно, MRS А, имеющие МПК — 2 мкг/мл, стоит рассматривать как изоляты «группы риска».

Альтернативными ванкомицину антибиотиками являются линезолид, даптомицин, тигециклин и цефтаролин. Все эти антибиотики проявляли выраженную микробиологическую активность в отношении исследуемых MRSA. Снижение чувствительности выявлено только у 3% изолятов к даптомицину и у 5% изолятов к цефтаролину. Также, параллельный анализ чувствительности к ванкомицину и даптомицину показал, что 10 изолятов (3%) с «критическим» значением МПК ванкомицина (2мкг/мл) были не чувствительны к даптомицину, и соответственно, имели МПК=2 мкг/мл. Сохраняют высокую микробиологическую активность такие препараты

как: фузидиевая кислота, мупироцин и ко-тримоксазол, к которым было выявлено не более 7% устойчивых изолятов MRSA.

Для гентамицина, ципрофлоксацина и моксифлоксацина, отмечался крайне высокий уровень резистентности MRSA, соответственно выявлено 88%, 94%, 88% устойчивых изолятов. К аминогликозидному антибиотику арбекацину было выявлено 32% устойчивых изолятов MRSA. Также, высокий уровень резистентности MRSA выявлен к макролидам и линкозамидам: 13% проявляли индуцибельный тип устойчивости к клиндамицину, 53% - конститутивный тип. К тетрациклину, хлорамфениколу выявлено соответственно 55% и 77% устойчивых изолятов.

SCCmec — типирование. Все результаты типирования SCCmec у MRSA представлены в таблице 2. Всего было детектировано пять типов кассет (SCCmec I - V). Большинство изолятов (57%) имели SCCmec IVce - субтипы. SCCmec III тип выявлен у 34% MRSA. Изоляты, имеющие SCCmec III со специфической областью III. 1 и закодированными в J - регионах генами рекомбиназы С (ссгС), детерминанты устойчивости к кадмию (cad), транспозона Тп554, но не имеющих тегЛ (устойчивость к ртути), составили 25%. Изоляты, положительные по всем вышеуказанным локусам и дополнительно имеющие тегА, составили 4%. SCCmec IA были выявлены у 6% изолятов. MRSA, имеющие SCCmec V (1%) с характерными С2 тес-комплексом и С1 ссг — комплексом, были выделены из носоглоток носителей и, в одном случае, из раневого отделяемого больного с остеомиелитом.

Только у одного изолята был определен SCCmec II. Еще у одного изолята не удалось определить тип кассеты, он был положителен по участкам mecl, IS1272, а также имел две рекомбиназы ссгВЗ, ссгВ4.

MLST и agr типирование. Результаты молекулярного типирования представлены в таблице 2.

Все изоляты, для которых были определены аллельные профили, относились к СС8 (ST8, ST239) и СС5 (ST228, ST5).

Таблица 2. Результаты молекулярного типирования MRSA (SCCmec, MLST, agr)*

Тип SCCmec Мес Ссг Подтип SCCmec ccrC J - регионы п (%) MLST

(%) комплекс комплекс (%) pis IA Tn554 cad III. 1 merA

I В А1В1 ІА h/t + + + н/т н/т н/т 18(5) „ ST228 (п=2)

(6) (6) + + - н/т н/т н/т 2(1)

II** (0,3) А А2В2 н/т - - h/t + - - - 1 (0,3) II н/т

III. 1 (27) + н/т h/t + + + - 89 (25) I ST239 (п=2)

+ h/t h/t - + + - 2 (1) II н/т

+ h/t h/t + - + - 5(1,4) I н/т

III (34) А АЗВЗ III. 1 /mer (4) + h/t h/t + + + + 15 (4) I ST239 (п=1)

гал (2) - h/t h/t + + + - 6(2) I н/т

III (0,3) + h/t h/t + + - - 1 (0,3) I SLV ST239 (NEW), п=1

IVCE (57) h/t h/t h/t - н/т н/т н/т 198 (57) I ST8 (n=6)

IVA h/t h/t h/t + н/т н/т н/т 3(1) I н/т

IV В А2В2 (1) h/t h/t h/t - н/т н/т н/т 1 (0,3) I н/т

(59) IVH (1) h/t h/t h/t - н/т н/т н/т 2(1) I н/т

IVNT 0) h/t h/t h/t - н/т н/т н/т 2(1) I н/т

V (1) С2 СІ h/t h/t h/t h/t - н/т н/т н/т 4 (1) II ST5 (п=1)

NT (0,3) тесі IS 1272 ссгВЗ ссгВ4 - + - - + - - - 1 (0,3) I н/т

Примечания к таблице 2: * -типирование SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec), типирование MLST (multilocus sequence-typing), типирование групп agr (accession gene regulator). Обозначения - н/т - не типировали; NT -нетипируемые изоляты; в ячейках с данными MLST в скобках представлено количество анализированных изолятов.** - Изолят с SCCmec II был положительный по kdpB.

Изоляты, имеющие SCCmec IVce типа, относились к ST8. Все изоляты с SCCmec III принадлежали к ST239. Изолят, имеющий SCCmec III. 1, но без дополнительных рекомбиназы ссгС и тег А, имел уникальный аллельный профиль, который соответствует SLV (single locus variant) варианту ST239. Среди изолятов, имеющих SCCmec IA, был выявлен ST228 (Южно-Германский клон), который ранее не описывался в РФ. Изолят, имеющий SCCmec V, относился к ST5. Проведенное agr-типирование показало гомогенную структуру популяции MRSA. Подавляющее большинство изолятов относилось к agr I группы (93%). S.aureus, относящиеся к agr И, agr III, agr IV, составили, соответственно, 7%, 0,3%, 0,3%.

Определение детерминант вирулентности. Гены комплекса IEC были обнаружены у 99% стафилококков (табл. 3). Среди MRSA agr I преобладали IEC, относящиеся к D типу (sea, sak, sen) (65%). Изоляты, обладающие полным комплексом генов: F (sep, sak, sen, chp) и A (sea, sak, sen, chp) типы, составили соответственно 15% и 0,3%. Типы Е (sak, sen) и В (sen, chp, sak) были определены, соответственно, у 9% и 1% изолятов. Не классифицированные варианты IEC, положительные только по sak или по двум генам sak и sea, обнаружены у 3% MRSA. Среди MRSA, относящихся к II - IV группам agr, на долю которых приходится 6%, встречаются преимущественно также IEC с D типом (5,4%). Типы С, G не были выявлены.

Не было выявлено также seb -, lukFS - положительных изолятов. Ген токсического шока (tsst) детектирован у 7% MRSA, имеющих IEC Е - типа, и выделенных преимущественно из одного региона.

Таблица 3. Результаты типирования комплекса IEC

IEC

Тип agr - % Источник выделения

тип гены

D sen, sak, sea 65,4 Различный

F sen, chp, sak, 15 Ожоговые раны,

sep сепсис

Остеомиелиты,

E sak, sen 9 флегмоны, пневмонии,

сепсис, абсцессы

I - sak, sea 2,16 Различный

В sen, chp, sak 1,2 Различный

- sak 0,8 Различный

А sen, chp, sak, 0,4 Ожоговая рана

sea

нет He 1,3 Различный

обнаружены

II D sen, sak, sea 5 Различный

III E sak, sen 0,4 Рана, остеомиелит

IV D sen, sak, sea 0,4 Различный

Характеристика механизмов резистентности у MRSA с разными SCCmec типами. Устойчивость к аминогликозидам была обусловлена тремя генами: бифункциональным аминогликозид-модифицирующим белком (aac(6')-aph(2")), аминогликозид - фосфотрансферазой (ctph(3')-IIIa), аминогликозид - аденилаттрансферазой (aadD) и их комбинациями. Ген aac(6')-aph(2") выявлялся у 10% изолятов, имеющих SCCmec I, у 80% -имеющих SCCmec II-III и у 91% имеющих и SCCmec IV. Диапазон МПК гентамицина у этих изолятов составлял 4-128 мкг/мл и арбекацина 0,25 - 128 мкг/мл. Гены aph(3')-IIIa и aadD выявлялись у единичных изолятов. Комбинации генов aac(6')-aph(2")+aph(3')-llla детектировались у 68% изолятов с SCCmec I, у 6% с SCCmec II-III и у одного изолята с SCCmec IV. Комбинация генов aac(6')-aph(2")+aadD была выявлена у одного изолята с SCCmec I, 10% MRSA с SCCmec II - III, и у 2% с SCCmec IV.

Устойчивость MRSA к тетрациклинам была обусловлена генами tetK (активный эффлюкс) и tetM (защита рибосом), а также их комбинациями. Так, tetK преимущественно детектировался у изолятов с SCCmec IV (85%), ген tetM обнаруживался у изолятов с SCCmec II-III (92%), комбинация генов tetMK встречалась среди изолятов с SCCmec V.

У MRSA с SCCmec I (100%), SCCmec II - III (77%) были выявлены метилазы ermA совместно с генами устойчивости к спектиномицину (spc), обуславливающие устойчивость к макролидам и линкозамидам. Среди изолятов с SCCmec IV были выявлены метилазы егтС (91%). Также, комбинации генов ermA (+spc)+ermC детектировались среди изолятов с SCCmec II-III (23%) и изолятов с SCCmec IV (1%). Ген InuA (линкозамид нуклеотидил трансфераза) и метилаза егтВ были обнаружены у единичных изолятов (1%), система эффлюкса (те/А) не выявлена.

У MRSA, устойчивых к хлорамфениколу, был детектирован ген cat (хлорамфеникол ацетилтрансфераза).

Была выявлена тенденция к повышению МПК бета-лактамов у изолятов с SCCmec I-III, по сравнению с SCCmec IV-V. Так, изоляты имеющие SCCmec I-III, отличались высокими МПК, как оксациллина (128 - 512 мкг/мл), так и цефтаролина, более того, 14 (4%) изолятов имели МПК оксациллина более 512 мкг/мл и, соответственно, МПК цефтаролина 2-4 мкг/мл (устойчивые фенотипы). Напротив, изоляты с SCCmec IV-V имели широкий диапазон МПК оксациллина 1-512 мкг/мл, и только 2 (0,6%) изолята имели МПК цефтаролина 2 мкг/мл. Общая доля MRSA со сниженной чувствительностью к цефтаролину у изолятов с SCCmec I - III составила 4%, что выше (р<0,01), чем у изолятов с SCCmec IV (0,6%).

Среди MRSA с кассетами SCCmec I-III, была выявлена достоверно большая (р<0,05) частота устойчивости к арбекацину, моксифлоксацину, эритромицину, мупироцину и фузидиевой кислоте, чем среди изолятов с кассетами SCCmec IV. Доля стафилококков резистентных к гентамицину, клиндамицину, ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу и тетрациклину, также

была выше у изолятов с SCCmec I-III, однако, достоверных различий не выявлено.

Для оценки профилей резистентности были выбраны 11 препаратов: оксациллин, эритромицин, клиндамицин, ванкомицин, гентамицин, тетрациклин, ципрофлоксацин, моксифлоксацин, ко-тримоксазол, фузидиевая кислота, мупироцин. Всего бьшо получено 62 профиля резистентности, из них 26 приходилось на изоляты с SCCmec I-III, 36 - на изоляты с SCCmec IV-V, 9 профилей были характерны для всех MRSA. Так, среди профилей, встречающихся у изолятов с SCCmec I-III и SCCmec IV - V, превалируют: OXA-ERY-CLI-CIP-MFX-GEN (соответственно 14% и 19%), OXA-ERY-CLI-CIP-TCY-MFX-GEN (26% и 13%), OXA-CIP-TCY-MFX-GEN (3 и 8%), ОХА-ERY-CLI-CIP-MUP-TCY-MFX-GEN (6% и 1%). Таким образом, такие профили перекрывают 6 классов антибиотиков: бета-лактамы, макролиды/линкозамиды, фторхинолоны, аминогликозиды, тетрациклин.

Все MRSA с SCCmec I-III были устойчивы к 4 и более препаратам. Доля изолятов с устойчивостью к 8 и более препаратам составила 16% для S.aureus с SCCmec III.

Полногеномное секвенирование эпидемического клона (изолят SA0077). Размер собранной de novo хромосомы составил 2,8 млн. п.н., еще около 90 тыс. п.н. представлено внехромосомными элементами и не идентифицированными мобильными элементами. Выявлено 3 плазмиды размером 2,5тыс. п.н., Зтыс. п.н. и 20 тыс. п.н. В системе RAST бьшо аннотировано 2802 кодируемых последовательностей (генов). Секвенированный геном входит в один кластер с геномами линии CC8-ST8 (Ml, Newman, линия USA300, NCTC8325), с высокой степенью гомологии ядерной части генома. Так, сравнивая SNP (однонуклеотидные замены) с изолятами NCTC8325, Newman, COL, USA300FPR3757, USA300TCH1516, бьшо выявлено 0,03% нукпеотидных замен (863 - 1476 замен не хромосому). Высокая плотность мутаций выявляется в локусах островов патогенности и интеграции профагов (100 - 140 SNP/10 тыс. п.н.), области с плотностью <100

SNP/10 тыс.п.н. соответствуют различным мобильным генетическим элементам (рис.1). Изолят SA0077 имеет типичное строение SCCmec IVc типа, не имеет комплекса генов ACME (arginine catabolic mobile element). Островки патогенности идентифицированы как vSAa I типа, vSAp II типа, vSAy. В системе PHAST (PHAge Search Tool) выявлены интактные профаги: SMSAP5 -подобный (40 тыс. п.н.) и phiNM3 (50 тыс. п.н), который интегрирован в ген бета-гемолизина (hlb), и имеет локус IEC D типа. Две малые плазмиды относились к 13 и 10 группам репликации (rep) и имели, соответственно, гены устойчивости к хлорамфениколу (cat) и макролидам (егтС). Плазмида, имеющая размер 20 тыс. п.н., содержит два гена репликации rep20, repl4SU и имеет детерминанты устойчивости к пенициллину (blaRIZ), а также комплекс устойчивости к солям тяжелых металлов. Хромосомный резистом представлен следующими детерминантами - aac(6')-aph(2") (ген локализован в SCCmec); мутации в генах gyrA (S84L) и parC (S80F) (устойчивость к фторхинолонам); мутации регуляторов rpoB (Y946C), rpoC (H857R) (возможное снижение чувствительности к ванкомицину, даптомицину и рифампицину).

координаты хромосом

Рис. 1. Полногеномное распределение SNP изолята SA0077 по отношению к 5 геномам, относящимся к СС8 - ST8 (сверху вниз: NCTC8325. Newman, COL, USA300FPR3757, USA300TCH1516). Пики соответствуют высокой плотности SNP в конкретных координатах хромосом. Данные получены в программе SNPeff (делеции и инсерции не учитывались).

Выводы

1. Среди изученных изолятов MRS А выявлена высокая частота ассоциированной устойчивости к аминогликозидам, фторхинолонам, тетрациклину, хлорамфениколу. Устойчивость к мупироцину, ко-тримоксазолу, фузидиевой кислоте не превышала 7%. Критический уровень чувствительности к ванкомицину выявлен у 30% MRSA. Новые препараты: даптомицин, линезолид, тигециклин, цефтаролин — проявляли выраженную микробиологическую активность в отношении MRSA.

2. Устойчивость к аминогликозидам обусловлена генами аминогликозид модифицирующих белков и их комбинациями (aac(6')-aph(2")), aph(3 'J-IIIa, aadD)\ макролидам/линкозамидам — рибосомальными метилазами (ermA, ermC)', тетрациклину — защитой рибосом и системой эффлюкса (tetM, tetK); хлорамфениколу — модифицирующим белком (cat).

3. На территории Российской Федерации выявлена циркуляция трех генетических линий MRSA:

-ST8 - SCCmec IV - agr I (ermC, tetK, cat, aac(6)-aph(2 ")) -ST239 - SCCmec III - agr I (ermA, tetM, cat, aac(6 ')-aph(2 ")) -ST228 - SCCmec I - agr II (ermA, aac(6 )-aph(2 ") +aph(3 \)-JIIa)

4. Геном изолята доминирующего клона (ST8) имеет высокую степень гомологии с известными геномами HA-MRSA 8СС — ST8, основные различия затрагивают строение мобильных генетических элементов.

5. Установлено, что MRSA, имеющие SCCmec I-III, проявляют более выраженную резистентность по сравнению с изолятами SCCmec IV-V.

6. Препаратами выбора как для эмпирической, так и целенаправленной терапии MRSA инфекций, могут быть линезолид, даптомицин, тигециклин. Для профилактики и терапии не осложненных форм инфекций возможно применение мупироцина, фузидиевой кислоты и ко-тримоксазола.

Практические рекомендации

Весьма важным является корректная оценка чувствительности к ванкомицину с определением МПК. Для изолятов имеющих МПК=2мкг/мл, целесообразно замена ванкомицина на альтернативный препарат. На основании полученных данных об оценке микробиологической активности исследуемых антибиотиков и с учетом имеющихся показаний по их применению в клинической практике, можно сделать следующие выводы. Для терапии инфекций кожи и мягких тканей возможно использование комбинаций ко-тримоксазола, фузидиевой кислоты и топического препарата мупироцина, а также линезолида, цефтаролина. Для терапии бактериемий целесообразно использование даптомицина и линезолида; пневмоний и менингитов — линезолида; остеомиелитов и глубоких инфекций мягких тканей -даптомицина, линезолида, тигециклина.

Полногеномное секвенирование является самым информативным и точным методом молекулярного типирования, который может использоваться для выявления эпидемических клонов, анализа их происхождения и связи с другими генетическими линиями.

Перспективы дальнейшей разработки темы

MRSA с перекрестным снижением чувствительности к ванкомицину и даптомицину представляют собой как практический интерес, так и фундаментальный, поскольку механизмы, обуславливающие формирование таких фенотипов, затрагивают глобальные изменения в регуляторных системах бактериальной клетки. Проведенный анализ полногеномного секвенирования эпидемического клона является одним из элементов для дальнейшего изучения микроэволюции MRSA на территории России. Данные по молекулярной эпидемиологии должны быть дополнены результатами молекулярного типирования циркулирующих метициллинчувствительных S.aureus, для проведения более широкого филогенетического анализа с целью характеристики всей стафилококковой популяции на территории России.

Список основных работ по теме диссертации

1. Гостев В.В., Сидоренко С.В. SCCmec кассеты, эволюция и генетические линии метициллинрезистентных золотистых стафилококков /Антибиотики и химиотерапия, т.57, №9-10, 2012 с. 38-46

2. Гостев В.В., Попенко Л.Н., и др. Оценка чувствительности MRSA к оксациллину, цефокситину, ванкомицину и даптомицину / Антибиотики и химиотерапия, № 9-10 2013 с. 11-17.

3. Гостев В.В., Гончаров А.Е., и др. Распространение генов комплекса Immune evasion cluster и других факторов вирулентности у Staphylococcus aureus I КМАХ №.15(4), 2013 с. 280 - 285.

4. Гостев В.В., Ильина Е.Н., Сидоренко С.В. Молекулярная характеристика нескольких штаммов метициллинрезистентных золотистых стафилококков (MRSA) / Медицинский академический журнал (приложение: Материалы II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия»), Санкт-Петербург 2012

5. Гостев В.В., Сидоренко С.В. Тип стафилококковой хромосомной тес-кассеты (SCCmec) и уровень резистентности метициллинрезистентных Staphylococcus aureus к оксациллину / Проблемы медицинской микологии,т.14, №2, с.77-78 (Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии (XV Кашкинские чтения), Санкт-Петербург 2012

6. Гостев В.В. Обоснование рациональной антибиотикотерапии стафилококковых инфекций на основании анализа уровня резистентности метициллинрезистентных золотистых стафилококков (MRSA) / Сборник тезисов, С. 204-205, 2012 (XVII Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов) Санкт-Петербург, 2012

7. Гостев В.В., Сидоренко С.В. Снижение чувствительности метициллинрезистентных золотистых стафилококков (MRSA) к ванкомицину / Материалы V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, С. 107-108, Москва 2013

Подписано в печать 25.10.2013г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 3220.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_Iema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гостев, Владимир Валерьевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ДЕТСКИХ ИНФЕКЦИЙ ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА»

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТИЦИЛЛИНРЕЗИСТЕНТНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ВИДА

STAPHYLOCOCCUS A UREUS

03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Сидоренко Сергей Владимирович

Санкт-Петербург - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Общая характеристика работы................................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................11

1.1. Генетическое строение и классификация SCCтес....................................................................................11

1.2. Эволюция MRSA............................................................................................................................................................................14

1.3. Происхождение тесА и SCC - элементов............................................................................................................18

1.4. CA-MRSA................................................................................................................................................................................................19

1.5. Организация генома S.aureus................................................................................................................................................21

1.6. Глобально распространенные генетические линии MRSA..............................................................23

1.7. Проблема устойчивости стафилококков к гликопептидам............................................................25

1.7.1. VRSA......................................................................................................................................................................................................26

1.7.2. hetero - VISA, VISA..................................................................................................................................................................30

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................................34

2.1. Фенотипические методы исследования..................................................................................................................34

2.1.1. Выделение, идентификация и хранение изолятов..................................................................................34

2.1.2. Определение чувствительности к антибактериальным препаратам................................34

2.1.3. Определение МПК к ванкомицину с помощью Е-тестов..............................................................35

2.2. Генотипические методы........................................................................................................................................................36

2.2.1. Постановка ПЦР (выделение ДНК, амплификация, электрофорез)..................................36

2.2.2. SCCmec типирование..........................................................................................................................................................36

2.2.3. Типирование детерминант резистентности..................................................................................................39

2.2.4. Типирование детерминант вирулентности..................................................................................................40

2.2.5. Типирование agr......................................................................................................................................................................41

2.2.6. Мультилокусное сиквенс типирование..........................................................................................................42

2.2.7. Полногеномное секвенирование................................................................................................................................42

2.2.7.1. Выделение геномной ДНК........................................................................................................................................42

2.2.7.2. Подготовка ShotGun библиотек ДНК и проведение эмПЦР................................................42

2.2.7.3. Сборка генома........................................................................................................................................................................42

2.3. Обработка результатов исследования....................................................................................................................43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................................................................44

3.1. Распределение изолятов по источнику выделения....................................................................................44

3.2. Фенотипическая оценка микробиологической активности 18

антибиотиков................................................................................................................................................................................................44

3.2.1. Бета - лактамы и цефтаролин..........................................................................................................................................44

3.2.2. Ванкомицин и даптомицин............................................................................................................................................47

3.2.3. Макролиды, линкозамиды, фторхинолоны................................................................................................50

3.2.4. Аминогликозиды........................................................................................................................................................................52

3.2.5. Ко-тримоксазол, мупироцин, фузидиевая кислота..............................................................................54

3.2.6. Тигециклин, линезолид и препараты сравнения тетрациклин, хлорамфеникол..........................................................................................................................................................................................56

3.3. Генотипирование MRSA........................................................................................................................................................59

3.3.1. Результаты SCCmec - типирования......................................................................................................................59

3.3.2. Результаты MLST- и agr- типирования........................................................................................................61

3.3.3. Результаты типирования детерминант вирулентности..................................................................64

3.4. SCCmec типы и ассоциированная устойчивость к антибиотикам..........................................68

3.4.1. Характеристика механизмов резистентности у MRSA с разными SCCmec типами..................................................................................................................................................................................................................68

3.4.2. SCCmec и профили резистентности........................................................................................................................73

3.5. Результаты полногеномного секвенирования................................................................................................77

3.5.1. Описание изолята и результаты секвенирования..................................................................................77

3.5.2. Структурная организация генома, сравнение геномов....................................................................78

3.5.3. Анализ дополнительной части генома................................................................................................................83

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................87

4.1. Микробиологическая активность известных и новых

антибиотиков................................................................................................................................................................................................88

4.2. Генотипы MRSA..............................................................................................................................................................................94

Заключение......................................................................................................................................................................................................99

Выводы................................................................................................................................................................................................................101

Практические рекомендации......................................................................................................................................................102

Список сокращений..............................................................................................................................................................................103

Благодарности............................................................................................................................................................................................105

Список литературы................................................................................................................................................................................106

Приложение 1..............................................................................................................................................................................................125

Приложение 2..............................................................................................................................................................................................129

Общая характеристика работы Актуальность исследования

Staphylococcus aureus относят к условным патогенам, инфекции кожи и мягких тканей -наиболее частые нозологические формы, вызываемые S. aureus, однако бактерии могут вызывать инфекционные процессы практически любой локализации [1]. После внедрения в медицинскую практику пенициллина в 1940 годах летальность от стафилококковых инфекций стала снижаться в разы, даже несмотря на уже описываемые в то время, пенициллинустойчивые изоляты S. aureus. Ситуация кардинальным образом меняется в 1961 году, когда в Англии, впервые были описаны метициллинрезистентные стафилококки (methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) [2-3]. Важнейшей особенностью таких стафилококков является устойчивость ко всем бета-лактамным антибиотикам, что определяет особенности тактики антибактериальной терапии. Позже, с 1980 годов появляются госпитальные клоны MRS А с ассоциированной устойчивостью почти ко всем препаратам, используемых в медицинской практике в то время [4]. Особенностью MRS А является наличие уникального мобильного генетического элемента - стафилококковой хромосомной тес - кассеты (Staphylococcal Cassette Chromosome mec, SCC тес), в состав которой входит ген тес А, кодирующий измененный пенициллинсвязывающий белок (РВР2а), опосредующий устойчивость к бета-лактамам [5]. В структуру SCCтес способны интегрироваться различные детерминанты устойчивости к другим антибиотикам, что объясняет феномен ассоциированной устойчивости MRSA. Сформировавшиеся таким образом госпитальные штаммы образуют особый кластер MRSA: HA-MRSA (Hospital associated MRSA) [4]. HA-MRSA пандемично распространены по всему миру, но можно выделить наиболее «успешный» эпидемический клон - ST239, который циркулирует и в нашей стране [6-8]. Но, к сожалению, в России отсутствуют систематизированные данные о циркуляции MRSA, их детальной молекулярной эпидемиологии, данные о происхождении эпидемических клонов и динамика их антибиотикорезистентности.

На сегодняшний день MRSA остаются одними из актуальных возбудителей госпитальных инфекций, терапия которых является серьезной проблемой. Так, например, в США от инфекций, вызываемых MRSA, ежегодно погибает около 20 ООО человек [9]. В Европе регистрируется около 200 тысяч случаев MRSA инфекций из которых 7% заканчиваются летальным исходом [10]. Основу лечения MRSA инфекций составляет ванкомицин, однако, появление изолятов со сниженной чувствительностью к этому антибиотику (Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus - VISA) [11] ставит под сомнение его эффективность.

Снижение чувствительности VISA связано с утолщением клеточной стенки бактерий, обусловленной накоплением мутаций в генах, участвующих в биосинтезе пептидогликана. Описаны также изоляты гетерогенные по уровню чувствительности к ванкомицину (heteroVISA, hVISA), снижение чувствительности проявляют только 1-2% отдельных микробных клеток в колонии. Выявление подобных изолятов представляет собой методически сложную задачу [12]. Частота распространения таких изолятов в России не изучена. Возрастание этиологической значимости инфекций, вызванных грамположительными бактериями, а также недостатки ванкомицина стимулировали разработку и внедрение в медицинскую практику во второй половине XX века новых препаратов соответствующей направленности [13]. К таким препаратам относится даптомицин, разработанный еще в 1980 годах, но одобренный FDA (Food and drug administration, США) для использования только в 2003 году. Предметом интенсивного изучения является вопрос о возможности развития перекрестной резистентности между ванкомицином и даптомицином [14]. К ряду новых препаратов, обладающих анти-MRSA активностью, также относятся линезолид, тигециклин, цефтаролин. Однако, уже описаны механизмы резистентности к этим антибиотикам у MRSA, хотя интенсивного распространения таких устойчивых штаммов пока не наблюдается [15]. Чувствительность циркулирующих MRSA в России к таким препаратам как даптомицин, тигециклин, цефтаролин, линезолид не изучена.

Крайне неблагоприятной тенденций последних лет является появление новых генетических линий высоковирулентных MRSA, так называемых «внебольничных MRSA» (community-associated MRSA, CA-MRSA) [16]. CA-MRSA имеют ряд особенностей: это быстрое распространение за счет упрощенного строения кассет SCCтес IV типа, наличие токсина Пантона - Валентайна (PVL), и наряду с этим, отсутствие ассоциированной устойчивости к антибиотикам. На сегодняшний день, CA-MRSA распространены во многих странах мира, так например, в США циркулирует клон US A300, в странах Европы клональный комплекс 80 [17-18]. Неблагоприятными регионами можно считать страны Азии, где частота выявления CA-MRSA достигает 30-40% [19]. Данные о распространении CA-MRSA в России немногочисленны, но первые сообщения были сделаны с Дальнего Востока [20]. По сравнению с другими представителями рода Staphylococcus, золотистый стафилококк обладает существенно более широким набором различных факторов вирулентности [1, 21]. Так, на сегодняшний день у S. aureus описано 16 различных адгезинов, 8 экзоэнзимов, 4 гемолизина, 20 энтеротоксинов, а также эксфолиативные токсины, экзотоксины, лейкоцидины. В последние годы предлагается объединять в одну группу, учитывая их общую функциональную направленность, факторы, защищающие бактерии от действия системы врожденного

иммунитета хозяина, на сегодняшний день описано 38 таких факторов [22]. В эту группу включают и факторы, входящие в состав недавно охарактеризованного комплекса IEC (Immune evasion cluster) [23]. Дискуссионным вопросом остается биологическое взаимодействие факторов вирулентности и антибиотикорезистентности в популяции S.aureus.

Изучение биологических свойств MRSA в России на сегодняшний день стоит остро, в силу недостаточности эпидемиологических данных о распространении таких стафилококков, и отсутствия оценки фармакоэкономической целесообразности использования как традиционных, так и «новых» антибиотиков. Выявление частоты распространения среди MRSA устойчивости к антибактериальным препаратам различных групп, а также оценка их микробиологической активности, позволит обосновать рациональную эмпирическую и целенаправленную терапию стафилококковых инфекций.

Цель исследования

Определить фенотипические и генотипические факторы метициллинрезистентных представителей вида Staphylococcus aureus, влияющие на эффективность антибактериальной терапии

Задачи исследования

1. Провести сравнительную оценку микробиологической активности известных, новых и перспективных препаратов в отношении MRSA;

2. Охарактеризовать механизмы резистентности MRSA к аминогликозидам, тетрациклинам, макролидам/линкозамидам, фениколам;

3. Провести молекулярное типирование ядерного генома MRSA (по схеме MLST), регупяторных элементов (agr), а также подвижных генетических элементов (SCCтес и IEC), выявить доминирующие генетические линии;

4. Провести полногеномное секвенирование типичного представителя доминирующего клона и дать сравнительную оценку генома;

5. Выявить особенности ассоциированной антибиотикорезистентности в зависимости от генотипа MRSA;

6. Провести комплексный анализ фенотипических и генотипических свойств MRSA и определить антибиотики, наиболее перспективные для лечения стафилококковых инфекций.

Научная новизна

Впервые проведено полногеномное секвенирование доминирующего Российского клона ST8. Установлено, что изолят SA0077 имеет высокую гомологию с геномами 8 клонального комплекса, характеризуется наличием кассеты SCCтес IVc, тремя островками патогенности,

двумя интактными профагами и тремя плазмидами. Были обнаружены и аннотированы все детерминанты резистентности и вирулентности.

Проведена микробиологическая оценка эффективности ванкомицина в отношении MRSA, циркулирующих в Российской Федерации. Установлено, что 30% изолятов имеют критический уровень чувствительности (2 мкг/мл). Выявлены фенотипы hVISA, которые составили 1%. Впервые проведено исследование по изучению активности новых препаратов: даптомицина, линезолида, тигециклина, цефтаролина, которые показали высокую эффективность в отношении MRSA.

Установлено, что в структуре популяции доминирующими клонами являются госпитальные HA-MRSA (hospital acquired MRSA), относящиеся к глобально распространенным линиям ST8 и ST239. Также, выявлен не описываемый ранее в России клон ST228. Кассеты SCCтес представлены у MRSA пятью типами (SCCтес I - SCСтес V) и 16 подтипами, но наиболее часто встречающийся тип - SССтес IVc. Установлено, что MRSA с разными SCCтес имеют различный уровень антибиотикорезистентности, а также отличаются по спектру ассоциированной устойчивости.

Подавляющее большинство изолятов (70%) имело D - тип строения комплекса «ухода от иммунной защиты» (IEC), включающий энтеротоксин A (sea), стафилокиназу (sak), ингибитор системы комплемента (sen).

Практическая значимость работы

Полученные данные о микробиологической оценке эффективности как известных, так и новых препаратов могут быть использованы для оптимизации эмпирической и целенаправленной антибиотикотерапии стафилококковых инфекций. Результаты генотипирования имеют эпидемиологическое значение и могут быть использованы для мониторинга распространения MRSA на территории России, а также для разработки мер по сдерживанию и своевременному выявлению новых эпидемических линий. Использованные в работе алгоритмы ПЦР типирования: определение SCCтес, детерминант резистентности и вирулентности могут быть использованы в ПЦР - лабораториях для быстрой детекции антибиотикорезистентности и для мониторинга локальной эпидемиологии MRSA инфекций.

Перспективы дальнейшего изучения

Выявленные в исследовании hVISA изоляты требуют детального изучения механизмов, обуславливающих снижение чувствительности к ванкомицину. MRSA с перекрестным

снижением чувствительности к ванкомицину и даптомицину представляют собой, как практический интерес, так и фундам�