Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом и эффективность его применения для повышения спермопродукции и качества спермы у производителей сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом и эффективность его применения для повышения спермопродукции и качества спермы у производителей сельскохозяйственных животных"

На правах рукописи

Юдин Владимир Сергеевич

Фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом и эффективность его применения для повышения спермопродукции и качества спермы у производителей сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

06.02.03-ветеринарная фармакология с токсикологией

1 9 АЙГ

Воронеж-2015

005561537

Работа выполнена в ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» (г. Воронеж)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Советкин Станислав Васильевич

доктор биологических наук, профессор

Юсупов Самат Равхатович -

кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры акушерства и патологии мелких животных им. А.П. Студенцова Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Сайтов Вадим Расимович -

доктор биологических наук, заведующий сектором электронной микроскопии Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности

Ведущая организация:

Московская государственная академия ветеринарной медицины и

биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита состоится « 6 » октября 2015 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок - 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Электронный вариант автореферата и текста объявления о защите размещен на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru. текст диссертации, автореферата, отзыв научного руководителя - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» wwvv.vnivi.rf

Автореферат разослан « 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ^

кандидат ветеринарных наук Степанов

1 Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования. Решение проблемы продовольственной безопасности и обеспечения населения России продукцией животноводства во многом определяется показателями репродуктивной способности сельскохозяйственных животных. В последние годы в животноводческих хозяйствах РФ получают менее 75 телят на 100 коров. Снижение показателей репродукции сельскохозяйственных животных является общемировой тенденцией и характерно для стран с развитым животноводством.

Эффективность репродукции животных во многом зависит от биологического и санитарного качества спермы производителей. Специалисты отмечают устойчивую тенденцию к снижению биологического качества спермы у производителей сельскохозяйственных животных. Одной из возможных причин этого является повышение неблагоприятной экологической нагрузки на организм животных и, как следствие, нарушение физиологических, биохимических процессов, регулирующих процесс сперматогенеза.

Достаточно много внимания специалисты уделяют изучению роли соматотрогаюго гормона (СТГ) в регуляции процессов роста и повышения мясной и молочной продуктивности животных. Результаты экспериментальных исследований, проведенных в последние годы, показали, что помимо вышеуказанных регуляторных механизмов, СТГ также влияет на регуляцию репродуктивных процессов животных и на развитие эмбрионов млекопитающих. Тем не менее, детальные механизмы влияния СТГ на вышеуказанные процессы еще недостаточно изучены. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о перспективности разработки лекарственных соединений, повышающих репродуктивный потенциал сельскохозяйственных животных, и оказывающих регуляторное воздействие на содержание в организме гормона роста.

Степень разработанности темы. Теоретической предпосылкой для разработки и изучения фармако-токсикологических свойств ветеринарного препарата на основе соматостатинсодержащего белка является регулирующее влияние соматостатина на содержание СТГ в организме животных, который, как показали исследования последних лет, играет важную роль в сперматогенезе у производителей сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме и исследование его фармакологической активности при применении у хряков и быков-производителей.

Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:

-изучить фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме и определить иммуногенную активность соматостатин-содержащего белка;

-установить оптимальную дозу и схему применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на хряках-производителях;

-изучить фармакологическое действие препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на спермопродукцию и биологическое качество спермы у хряков и быков-производителей;

-изучить фармакологическое действие препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на содержание тестостерона и эстрадиола в крови у быков-производителей молочной и мясной пород и установить взаимосвязь этих показателей с уровнем спермопродукции и биологическим качеством спермы животных;

-определить эффективность применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на оплодотворяющую способность спермы, полученной от быков-производителей, у которых первоначальный брак спермы по биологическим показателям превышал 40%.

Научная новизна. Изучены фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме и экспериментально доказана безопасность его применения в практике ветеринарии и животноводства.

Экспериментально доказана более высокая иммуногенность соматостатинсодержащего белка препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме. Впервые доказано регулирующее влияние применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на содержание тестостерона и эстрадиола у быков-производителей. Впервые обоснована перспективность применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для повышения спермопродукции и биологического качества спермы у быков и хряков-производителей. Экспериментально подтверждена высокая оплодотворяющая

способность спермы, полученной от хряков и быков-производителей, которым применяли препарат Сат-Сом в новой лекарственной форме.

Научная новизна исследований подтверждена Патентом РФ № 2493873 «Инъекционный препарат для повышения спермопродукции у производителей сельскохозяйственных животных и петухов и способ его применения (приоритет изобретения от 07.06.2012г.).

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате выполнения научных исследований определены фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме. Установлена высокая оплодотворяющая способность спермы хряков и быков-производителей, полученной после введения животным препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме. Экспериментально доказано регулирующее влияние применения препарата Сат-Сом на содержание тестостерона и эстрадиола в крови у быков-производителей молочной и мясной пород и взаимосвязь этих показателей с уровнем спермопродукции и биологическим качеством спермы.

Методология и методы исследований. Предметом исследований явилось изучение фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме и его эффективности для повышения сперматогенеза, качества спермы хряков и быков-производителей. Исследования по изучению фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме проводили в соответствии с положениями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» с использованием следующих методов:

токсикологические: определение острой токсичности препарата при внутрижелудочном и подкожном введении, субхронической токсичности, накожной токсичности, раздражающих, эмбриотоксических и тератогенных свойств;

иммуно-биохимические и гистологические: изучение иммуногенной активности соматостатинсодержащего белка, гематологических и биохимических показателей крови, проведение гистологического анализа органов и тканей;

клинические: изучение переносимости препарата, наблюдение за физиологическим состоянием лабораторных и сельскохозяйственных животных, изучение показателей

сперматогенеза и качества спермы хряков и быков-производителей;

статистические: статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему ^критерию Стьюдента. Различия определяли при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполняли с помощью программы «8ик1еп1-200».

Апробация и реализация результатов исследований. Основные научные положения, выводы и рекомендации диссертации доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных», посвященной 85-летию со дня рождения профессора Г.А. Черемисинова и 50-летию создания Воронежской школы ветеринарных акушеров (18-19 октября 2012г., г. Воронеж), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного акушерства и репродукции животных», посвященной 75-летию со дня рождения и 50-летию научно-практической деятельности доктора ветеринарных наук, профессора Г. Ф. Медведева (10-12 октября 2013 г., Горки, Республика Беларусь). Практические предложения, изложенные в материалах диссертации, включены в инструкцию по применению препарата Сат-Сом для повышения продуктивности и качества спермы быков и хряков-производителей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, из которых 3- в научных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: -фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме;

-результаты изучения фармакологического действия препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на спермопродукцию и биологическое качество спермы у хряков и быков-производителей;

-влияние применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на содержание тестостерона и эстрадиола у быков-производителей молочной и мясной пород и взаимосвязь этих показателей с уровнем спермопродукции и биологическим качеством спермы;

-результаты искусственного осеменения коров и телок спермой быков-производителей после применения им препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного набора, включая введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, список использованной литературы, приложения. Работа содержит 25 таблиц. Список использованной литературы включает 211 источников, в том числе 74 зарубежных.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2011 по 2014 годы в отделе фармакологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» (г. Воронеж).

Изучение иммуногенной активности диспергированного соматостатинсодержащего белка проводили по следующей схеме. Масляные эмульсии соматостатинсодержащих белков (диспергированного и не диспергированного) вводили двум группам кроликов по три животных в каждой группе подкожно в область спины в 2-3 точки трехкратно с интервалом 4 недели между инъекциями. Контрольной группе кроликов вводили по той же схеме и в тех же объемах физиологический раствор. Концентрация белков составляла 100 мкг/мл эмульсии, объем вводимых препаратов-3 мл. Вторую и третью инъекции проводили возрастающими в 1,5 раза дозами препаратов (концентрация белков составила 150 мкг/мл эмульсии). Определение титров специфических антисоматостатиновых антител проводили методом нИФА. В качестве антигенов использовали соматостатинсодержащий белок и химически синтезированный соматостатин («Sigma», США).

Острую токсичность препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при внутрижелудочном введении изучали с определением значений максимально возможной вводимой дозы. Исследование проводили на 50 крысах обоего пола массой тела 200210 г. Масляную эмульсию препарата Сат-Сом животным вводили перорально без разведения однократно с помощью желудочного зонда в дозах 0,5; 1; 2; 3 и 4 мл на голову, что соответствует 2320 мг/кг, 4640 мг/кг, 9280 мг/кг, 13920 мг/кг и 18560 мг/кг. Доза 18560 мг/кг (4 мл) является максимально возможной для перорального введения крысе.

Данную дозу вводили в два приема равными порциями с интервалом не более 15 минут. В течение 14 суток проводили наблюдение за общим состоянием животных и за проявлением у животных симптомов интоксикации.

Исследование острой токсичности препарата Сат-Сом при подкожном введении проводили на двух группах крыс (по 10 животных в каждой) обоего пола массой тела 200-220 г. Препарат Сат-Сом животным вводили без разведения в виде нативной эмульсии однократно в дозах 4,0 и 5,0 мл на голову, что соответствует 18560 мг/кг и 23200 мг/кг (максимально возможные значения при подкожном введении). В течение 14 суток проводили наблюдение за общим состоянием животных и за проявлением симптомов интоксикации.

Субхроническую токсичность препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме определяли на 40 крысах обоего пола с исходной массой тела 190-200 г. Масляную эмульсию препарата вводили крысам подкожно ежедневно в течение 14 суток в дозах: 1/10, 1/20 и 1/50 от максимально возможной дозы, т.е. 1856 мг/кг, 928 мг/кг и 371 мг/кг живой массы тела. В течение всего периода применения препарата Сат-Сом наблюдали за физиологическим состоянием животных, приемом корма и воды. В конце опыта через сутки после последнего введения препарата животных убивали декапитацией и отбирали пробы крови (с и без антикоагулянта) для определения гематологических и биохимических показателей. Также были проведены макроскопическое исследование органов и гистологическое исследование печени, селезенки, сердечной мышцы, легких, почек, желудка, образцы которых отбирали в определенных участках исследуемых органов у всех крыс каждой группы.

Определение показателей накожной токсичности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме проводили при нанесении масляной эмульсии на неповрежденную кожу белых крыс-самцов массой тела 180-200 г. Всего в опыте были использованы 18 крыс, по 6 голов в каждой группе. За сутки до нанесения препарата выстригали шерстный покров площадью 3x3 см в области спины животных. Препарат наносили на кожу без разведения в виде нативной эмульсии в объеме 1,0 и 1,5 мл на 200 г массы тела животного, что соответствует 2320 и 3480 мг/кг. Максимально возможную дозу-3480 мг/кг наносили в два приема, равными порциями препарата с интервалом между нанесениями не более 15 минут. Животным контрольной группы

наносили на поверхность кожи дистиллированную воду методом аппликаций в сравнимых объемах. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток.

Оценку раздражающего действия препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на кожу проводили нанесением масляной эмульсии препарата в дозах 2320 и 3480 мг/кг. Первичную реакцию кожи оценивали сразу после нанесения эмульсии и через 1; 2; 24; 48 и 72 часа. Изучали общее состояние кожи животных, обращая особое внимание на признаки покраснения, отечности, появление трещин, изъязвлений, кровоизлияний.

Исследовали возможное раздражающее действие препарата Сат-Сом на слизистые глаз у кроликов породы шиншилла. Для этого 5 кроликам массой 2,5-2,7 кг в левый глаз под конъюнктиву вносили 1 каплю масляной эмульсии препарата, в правый глаз - каплю дистиллированной воды, и он служил в качестве контроля. Реакцию слизистых глаз оценивали сразу после закапывания препарата и дистиллированной воды, далее через 15 минут, 1; 24; 48 и 72 часа. В течение первых и последующих 7 суток проводили наблюдение за состоянием слизистой глаз у кроликов. Оценку раздражающего действия препарата выражали в баллах по шкале в соответствии с методическими указаниями.

Исследования эмбриотоксических и тератогенных свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме проводили на 120 беспородных самках белых крыс массой 220-240 г. За первый день беременности принимали день обнаружения спермиев во влагалище самок после подсадки самцов. В каждой опытной и контрольной группе было по 15 животных. Всего было сформировано 8 групп (6 опытных и 2 контрольных группы). Животным контрольных групп препарат Сат-Сом не применяли. Препарат применяли в двух дозах: терапевтической - 0,05 мг белка Сат-Сом на кг живой массы тела или 0, 0125 мг белка на крысу (1,2,3 опытные группы животных) и в дозе, превышающей терапевтическую в три раза, -0,15 мг белка на кг живой массы тела или 0, 0375 мг белка на крысу (4,5,6 опытные группы животных). Препарат в указанных дозах вводили ежедневно: крысам первой и четвертой групп- с 1 по 6-й день беременности, животным второй и пятой групп — с 7 по 13-й день беременности, крысам третьей и шестой групп - с 14 по 19-й день беременности. Беременных самок крыс опытных и контрольных групп убивали на 20-й день

беременности путем декапитации. После убоя и вскрытия тела у самок крыс извлекали матку и яичники. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке - количество мест имплантации, число живых и мертвых эмбрионов, резорбированных плодов. Плоды просматривали под бинокулярной лупой для обнаружения внешних аномалий, определяли пол, взвешивали и измеряли краниокаудальный размер, массу и диаметр плаценты. По соотношению числа желтых тел, мест имплантации и живых плодов вычисляли показатели общей, предимплантационной и постимплантационной гибели зародышей. После взвешивания плоды в помете от каждой самки делили на две равные части для исследования на наличие аномалий внутренних органов по методу Вильсона и костной системы по методу Даусона.

Изучение переносимости препарата Сат-Сом проводили на 9 бычках голштинской породы живой массой 100-110 кг в ОАО «Агрокомбинат Юбилейный» (Республика Беларусь, Витебская область). Животные были разделены на три группы. Одной группе животных (3 головы) препарат Сат-Сом в новой лекарственной форме в дозе, превышающей терапевтическую в три раза, вводили подкожно в область лопатки в объеме 6 мл (концентрация белка Сат-Сом составила 2,5 мг/мл), другой группе животных (3 головы) препарат Сат-Сом в дозе, превышающей терапевтические значения в пять раз, вводили подкожно в область лопатки в объеме 10 мл. Наблюдение за физиологическим состоянием животных проводили в течение 15 суток. Контрольной группе животных препарат не вводили.

Определение оптимальной дозы препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме проводили в условиях промышленного свиноводческого комплекса (ОАО «Агрокомбинат Юбилейный», Республика Беларусь, Витебская область). Хрякам-производителям крупной белой породы и породы дюрок был введен препарат Сат-Сом двукратно с интервалом 14 суток между инъекциями из расчета 25 мкг, 50 мкг, 100 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела. Препарат вводили животным подкожно в область лопатки в объеме 2,0 мл масляной суспензии. У хряков-производителей до и после применения препарата осуществляли взятие спермы согласно действующим инструкциям и определяли объём эякулята, концентрацию сперматозоидов в эякуляте и количество спермодоз.

Фармакологическую активность препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для повышения сперматогенеза и качества

спермы изучали на хряках и быках-производителях при применении препарата в дозе 5 мг белка на 100 кг живой массы тела дважды с межинъекционным интервалом в 14 суток. Качество свежеполученной спермы хряков проверяли в соответствии с требованиями ГОСТ Р 54638-2011 «Сперма хряков свежеполученная разбавленная. Технические условия», а свежеполученную и замороженно-оттаяную сперму быков-производителей оценивали в соответствии с «Инструкцией по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных». Оплодотворяющую способность замороженно-оттаяной спермы быков-производителей после применения препарата Сат-Сом проверяли путем искусственного осеменения и последующего ректального исследования коров и телок в животноводческих хозяйствах Московской области.

2.2 Изучение иммуногенной активности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме

В процессе исследований усовершенствован режим сублимационного высушивания соматостатинсодержащего белка -подобрана оптимальная толщина слоя замороженного раствора белка в поддоне. Этот параметр обеспечивался при розливе по 400-500см3 суспензии соматостатинсодержащего белка в поддон при толщине слоя препарата 0,5-1,0 см и замораживании при температуре минус 40°С в течение не менее суток.

После окончания процесса сублимации субстанцию рекомбинантного белка диспергировали в роторной мельнице (модель «Retsch Zm200», производство «Retsch GmbX», ФРГ). Средний размер частиц субстанции соматостатинсодержащего белка после диспергирования составляет от 10 мкм до 1 мкм. По завершении процесса диспергирования полученную белковую субстанцию контролировали на наличие соматостатинсодержащего белка методом электрофореза в полиакриламидном геле. Результаты анализа свидетельствовали о наличии доминирующей белковой полосы молекулярного веса 28 кДа, соответствующей показателям стандарта соматостатинсодержащего белка.

Определение титров специфических антисоматостатиновых антител проводили методом нИФА. Результаты определения титров

специфических антисоматостатиновых антител в кроличьих сыворотках представлены на рис 1.

30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

К 1 2

Рис. 1. Титры антисоматостатиновых антител:

1-результаты определения титров специфических антисоматостатиновых антител при иммунизации кроликов препаратом Сат-Сом с не диспергированным соматостатинсодержащим белком;

2- результаты определения титров специфических антисоматостатиновых антител при иммунизации кроликов новой лекарственной формой препарата Сат-Сом с диспергированным соматостатинсодержащим белком.

Как видно из представленных на рис. 1 результатов, титр антисоматостатиновых антител в сыворотке крови, полученной от животных, иммунизированных препаратом Сат-Сом, содержащим диспергированный соматостатин-содержащий белок, составлял 26000. В тоже время, титр антисоматостатиновых антител в сыворотке крови, полученной от животных, иммунизированных препаратом Сат-Сом, содержащим не диспергированный соматостатин-содержащий белок, составлял 18000. По данным литературы, наиболее высокой иммуногенностью обладают препараты с размерами частиц антигенов, составляющих 1-5мкм и которые наиболее доступны для иммунокомпетентных клеток. Именно подобные параметры были

I Титры специфических антител к препарату Сат-Сом

5 Титры Анти-Сом антител

достигнуты за счёт диспергирования соматостатинсодержащего белка. Подтверждение специфической активности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме позволило продолжить дальнейшие исследования.

2.3 Фармако-токсикологические исследования препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме

Исследование острой токсичности препарата Сат-Сом при внутрижелудочном введении проводили по методике, представленной в разделе 2.1.

Внутрижелудочное введение препарата Сат-Сом в дозах от 2320 до 18560 мг/кг не вызывало гибели животных, симптомов интоксикации не регистрировали за весь период наблюдений (14 суток). Животные опытных групп адекватно реагировали на внешние раздражители, имели чистый и опрятный внешний вид, прием корма и воды был без особенностей. Непосредственно после введения масляной эмульсии препарата в дозе 18560 мг/кг у крыс отмечали временное угнетение общего состояния, дефекацию и мочеиспускание, что связано с большим количеством вводимого вещества. Эти признаки проходили через 1,5-2 часа после введения препарата. Вводимая доза 18560 мг/кт препарата Сат-Сом является максимально возможной для внутрижелудочного введения крысам. Результаты исследований позволяют отнести препарат Сат-Сом в новой лекарственной форме к 4 классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76.

Острую токсичность препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при подкожном введении определяли также по методике, описанной в разделе 2.1.

В первые сутки после введения указанных доз препарата Сат-Сом у животных отмечали общее угнетение, выражающееся в снижении двигательной активности, полностью проходящей на вторые сутки после инъекции препарата. Гибели животных не регистрировали за весь период наблюдения (14 суток). Животные опытных групп адекватно реагировали на внешние раздражители, имели чистый и опрятный внешний вид, прием корма и воды был без особенностей. Доза 23200 мг/кг является максимально возможной для подкожного введения.

Токсичность препарата Сат-Сом при накожном применении проводили путем нанесения масляной эмульсии на кожу крыс в дозах

2320 и 3480 мг/кг (в объемах 1,0 мл и 1,5 мл). У животных не отмечали видимых признаков интоксикации и нарушений физиологических функций. Гибели лабораторных животных в опытных группах не регистрировали в течение всего периода наблюдений. Для аппликации на кожу крыс доза препарата 3480 мг/кг была максимально возможной. Животные опытных групп адекватно реагировали на внешние раздражители, имели чистый и опрятный внешний вид, прием корма и воды находился в рамках физиологических норм. Гибели лабораторных животных в опытных группах не отмечено в течение всего периода наблюдений.

Изучение раздражающего действия препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на кожу и слизистые глаз показало, что при нанесении испытуемого препарата на кожу и в конъюнктивальный мешок глазного яблока у лабораторных животных отсутствовали какие-либо характерные признаки раздражения кожных покровов в виде очагов отечности, изъязвлений, покраснений и слизистой оболочки глаз в течение всего срока наблюдения.

Исследование субхронической токсичности препарата Сат-Сом проводили по методике, описанной в разделе 2.1. При ежедневном введении препарата во всех испытуемых дозах видимых отклонений в физиологическом состоянии животных опытных групп от крыс в контрольной группе, а также гибели животных в опытных группах не регистрировали. Анализ результатов применения препарата Сат-Сом в тестируемых дозах на лабораторных животных позволяет сделать вывод о том, что введение препарата статистически не отразилось на показателях массы тела животных в течение срока наблюдения. Макроскопические исследование внутренних органов крыс опытных и контрольной групп показало отсутствие патологических изменений в жизненно важных органах животных. Гистологические исследования тканей печени, селезенки, сердца, легких, почек, желудка лабораторных животных опытных и контрольной групп показали отсутствие патоморфологических изменений в структуре тканей органов, характерных при проявлении токсического действия препарата.

Длительное введение крысам препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме не выявило отклонений в гематологических показателях крови крыс. Содержание в крови гемоглобина у животных опытных групп находилось в пределах 150,50±2,20г/л-147,50±4,51г/л,

концентрация эритроцитов-12,11±0,90'109/л, лейкоцитов-

12,44±1,16'109/л, показатели лейкограммы были в пределах физиологической нормы для данного вида животных. Не установлено каких-либо изменений при анализе биохимических показателей состава крови животных: содержание общего белка (71,11±1,34г/л-69,50±2,96г/л), глюкозы (5,54±0,25ммоль/л-5,19±0,28ммоль/л), активность ферментов печеночной ткани не отличалось у животных контрольной и опытных групп.

Анализ результатов исследований эмбриотоксических и тератогенных свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме свидетельствует об отсутствии эмбриотропной активности у исследуемого препарата при применении в терапевтической дозе и в дозе, превышающей терапевтическую в три раза: предимплантационная гибель эмбрионов составила 4,75±0,64%-4,61±0,65% в опытных и 4,64±0,58% в контрольной группах; постимплантационная гибель эмбрионов была равной 4,53±0,51%-4,51±0,52% в опытных и 4,54±0,53% в контрольной группах; общая эмбриональная гибель составила соответственно 8,93±1,54%-8,86±1,64% и 8,85±1,72%. Не выявлено случаев уродств и изменений внутренних органов при исследовании плодов. Результаты, полученные при визуальном осмотре и измерении плодов животных опытных и контрольной групп, подтвердили отсутствие отрицательного воздействия препарата Сат-Сом на развитие плода. Масса плодов животных составила 2,57±0,10-2,96±0,10г в опытных и 2,95±0,11г в контрольной группах; масса плаценты- 0,55±0,06-0,58±0,06г и 0,58±0,05г, соответственно; размер эмбрионов 3,08±0,09-3,17±0,11 мм и 3,19±0,10 мм; количество эмбрионов 10,30±0,50-10,30±0,51 и 10,30±0,52 соответственно в опытных и контрольной группах.

При измерении размеров костной ткани плодов животных опытной и контрольной групп установлено, что длина трубчатых костей была практически одинаковой. Не обнаружено случаев уродств и изменений внутренних органов при исследовании плодов. Анализируя результаты проведенных исследований, можно заключить, что при введении препарата Сат-Сом самкам крыс в терапевтической дозе на всех стадиях эмбриогенеза, включая критические периоды, показатели развития эмбрионов животных опытных групп не отличались от показателей развития эмбрионов у животных

контрольной группы. Следовательно, препарат Сат-Сом, применяемый в терапевтической дозе беременным крысам, не обладает тератогенной активностью и эмбриотоксическим действием.

Анализ результатов эксперимента по изучению переносимости препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на бычках при подкожном введении животным препарата в дозе, превышающей терапевтическую в 3 и 5 раз, показал отсутствие отрицательных реакций в поведении животных. Поедаемость кормов, динамика моторики желудочно-кишечного тракта бычков, состояние кожных покровов, в том числе и в месте введения препарата, находились на уровне показателей у бычков контрольной группы. На основании проведенных исследований можно сделать заключение о хорошей переносимости животными препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме.

2.4 Определение оптимальной дозы применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме

Важным этапом при выполнении экспериментальных исследований являлось определение оптимальной дозы препарата Сат-Сом для повышения спермопродукции у производителей сельскохозяйственных животных. Дозы препарата (по действующему веществу-соматостатинсодержащему белку) были следующие: 25 мкг/кг, 50 мкг/кг, 100 мкг/кг живой массы тела.

В результате анализа качества спермопродукции и количества полученных спермодоз было сделано заключение, что оптимальной дозой препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме является доза 50 мкг белка Сат-Сом на килограмм живой массы тела.

2.5 Исследование эффективности применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для повышения сперматогенеза у хряков-производителей

Изучение фармакологических свойств препарата Сат-Сом показало положительное влияние препарата на функциональное состояние организма животных. После подкожного введения препарата Сат-Сом в дозе 50 мкг/кг живой массы тела в крови хряков-производителей достоверно увеличилось содержание гемоглобина после первой инъекции на 16,9%, а после второй инъекции - на 28,5%. Через 14 дней после первого введения препарата Сат-Сом было

отмечено повышение лизоцимной активности сыворотки крови на 37,2%, бактерицидной активности на 14,7%.

В эякулятах животных опытной группы через 60 дней после применения препарата Сат-Сом установлено повышение абсолютной выживаемости сперматозоидов на 10,3%. При осеменении свиноматок спермой, полученной от производителей, которым применяли препарат Сат-Сом, отмечено повышение ее оплодотворяющей способности по результатам фактических опоросов на 7,5% по сравнению с оплодотворяющей способностью спермы, полученной от тех же хряков, до обработки животных препаратом Сат-Сом. Анализ результатов исследований позволяет констатировать, что применение препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на хряках-производителях оказывает положительное влияние на сперматогенез и биологическое качество получаемой от них спермы. Результаты исследований представлены в таблице 1.

2.6 Исследование эффективности применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для повышения сперматогенеза у быков-производителей

Специалисты организаций по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных ежегодно выбраковывают около 20% племенных быков, у которых брак спермы по биологическим показателям превышает 30%. Поэтому повышение биологического качества получаемой спермы является практически важной задачей.

Таблица 1

Влияние препарата Сат-Сом на показатели спермопродукции хряков(п=5)

Показатели Исходное значение Через 30 суток после 2-го введения препарата Через 45 суток после 2-го введения препарата

Внешний вид эякулята, консистенция, цвет Молочно-белый, однородная жидкость, без посторонних примесей Молочно-белый, однородная жидкость, без посторонних примесей Молочно-белый, однородная жидкость, без посторонних примесей

Объем эякулята, мл 176,67± 8,88 208,67± 7,47** 223,22± 8,88***

Подвижность сперматозоидов, балл 8,37± 0,09 8,67± 0,11* 8,83± 0,11**

Концентрация сперматозоидов, млн/мл 307,60± 13,50 309,83± 14,59 301,63± 15,90

Количество полученных спермодоз 14,23± 0,87 17,12± 0,91* 17,81± 0,82**

Абсолютная выживаемость сперматозоидов при 16-18°С, усл.ед. 1148±56,2 не исследовали 1266± 62,5

Коли-индекс 20,1±11,3 13,9±8,2 15,8±9,1

* различия достоверны (Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001) - по отношению к исходному значению

В ходе выполнения диссертационной работы проведены исследования по изучению влияния применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на уровни тестостерона и эстрадиола в крови быков-производителей молочных и мясных пород во взаимосвязи с биологическим качеством получаемой от них спермы, пригодной для искусственного осеменения коров и телок. После второй инъекции препарата Сат-Сом у быков голштинской породы содержание тестостерона в крови по сравнению с исходным уровнем (61,2±6,9 нмоль/л) повысилось на 44,3% (86,3±7,1 нмоль/л) к 90 суткам после применения препарата. Содержание эстрадиола в крови у этих же быков находилось практически на одном уровне. С повышением уровня тестостерона в крови животных отмечается и повышение объема эякулятов на 11,6 % к 90 дню по сравнению с исходным уровнем. Показатели брака замороженно-оттаянной спермы снизились до 27,6 % (исходный уровень брака составлял 43,9 %).

В контрольной группе животных голштинской породы содержание тестостерона и эстрадиола за анализируемый период времени находились практически на одном уровне: тестостерон -80,9±6,2нмоль/л - 83,4±6,7 нмоль/л, эстрадиол - 0,469±0,015нмоль/л -

0,491±0,019нмоль/л. Показатель брака замороженно-отгаянной спермы быков не превышал 19,3 %.

Достаточно низкие исходные значения концентрации тестостерона в крови быков-производителей опытной группы (61,2±6,9 нмоль/л) по сравнению с аналогичными показателями быков контрольной группы (80,9±6,2 нмоль/л), по видимому, свидетельствуют о нарушении нейроэндокринной регуляции репродуктивной способности быков.

Одним из основных показателей качества спермы быков-производителей является ее оплодотворяющая способность. В 2013 году на базе ОАО «Московское» было обработано препаратом Сат-Сом 7 быков голштинской породы, у которых брак спермы по биологическим показателям составлял в среднем 55 % и она не применялась в племенных хозяйствах.

В 2013 году в СПК «Зубцовский» Сергиево-Посадского района Московской области замороженно-оттаянной спермой быка Монарх (исходный брак спермы по биологическим показателям составил 48%) осеменено 67 коров и 36 телок, стельность от 1-го осеменения составила соответственно 53,7 % и 77,7 %. В ЗАО «Барыбино» Домодедовского района и ЗАО «Зеленоградское» Пушкинского района Московской области замороженно-оттаянной спермой быка Соляниум (исходный брак спермы по биологическим показателям составил 58%) осеменено соответственно 29 телок и 19 коров, стельными после 1-го осеменения стали 21 телка (72,4 %) и 12 коров (63,1%). Приведенные результаты исследований свидетельствуют об эффективности применения препарата Сат-Сом для повышения сперматогенеза, качества спермы быков-производителей по биологическим показателям и рентабельности работы организаций по искусственному осеменению животных.

Результаты проведенных исследований показали положительное влияние препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на эндокринную систему хряков и быков-производителей. Применение препарата достоверно увеличивает содержание в крови тестостерона, что сопровождается повышением сперматогенеза у производителей и улучшением биологического качества спермы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты анализа экспериментальных исследований, полученных в ходе выполнения настоящей работы, позволяют рекомендовать применение новой лекарственной формы препарата Сат-Сом для повышения спермопродукции и качества спермы у хряков и быков-производителей. Таким образом, на основании результатов проведенных исследований, можно сделать следующие выводы:

1. Экспериментально установлены показатели острой токсичности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при пероральном и подкожном введении белым крысам: препарат нетоксичен в дозах 18560 мг/кг живой массы тела при пероральном и 23200 мг/кг живой массы тела при подкожном введении, что позволяет отнести препарат к 4 классу опасности (малотоксичен по ГОСТ 12.1.007-76).

2. При изучении субхронической токсичности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на белых крысах при подкожном введении в дозе 1856 мг/кг живой массы тела в течение 14 дней не выявлено отклонений в гематологических и биохимических показателях крови животных от физиологической нормы, не установлено патоморфологических изменений в органах и тканях животных. Препарат Сат-Сом в новой лекарственной форме не обладает тератогенными, эмбриотоксическими и аллергизирующими свойствами.

3. Экспериментально определена иммуногенная активность диспергиро-ванного соматостатинсодержащего белка. Установлено повышение титра антисоматостатиновых антител в крови у лабораторных животных, иммунизированных препаратом Сат-Сом в новой лекарственной форме по сравнению с титром антител в крови у лабораторных животных, иммунизированных препаратом Сат-Сом, содержащим не диспергированный соматостатинсодержащий белок.

4. Экспериментальные исследования препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме показали его хорошую переносимость на быках в дозах, превышающих терапевтические значения в 3 и 5 раз.

5. На хряках-производителях пород крупная белая и дюрок установлена оптимальная доза и схема применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для повышения сперматогенеза и биологического качества спермы производителей животных. Для стимуляции сперматогенеза у хряков-производителей рекомендовано

применять препарат Сат-Сом подкожно в дозе 5 мг белка Сат-Сом на 100 кг массы тела животного дважды с интервалом между инъекциями 14 суток. Введение препарата обеспечивает повышение объема эякулята у хряков-производителей на 26,3%, абсолютной выживаемости сперматозоидов - на 10,2%, количества спермодоз, пригодных для искусственного осеменения свиноматок, на 25,2%. Повышение биологического качества спермы подтверждено результатами искусственного осеменения свиноматок.

6. Установлено влияние препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на содержание тестостерона и эстрадиола в крови у быков-производителей. Введение препарата Сат-Сом быкам-производителям в дозе 5 мг белка Сат-Сом на 100 кг живой массы тела с интервалом 14 суток между инъекциями сопровождается повышением уровня содержания тестостерона в крови к 90 суткам после второй инъекции у быков голштинской породы на 41,0%, а у быков абердино-ангусской породы- на 17,8% по сравнению с исходным уровнем стероидных гормонов при одновременном повышении количества получаемых спермодоз соответственно на 31,2% и 25,5% и снижении брака спермы по биологическим показателям на 16,3% и 21,9% соответственно.

7. Экспериментально выявлены различия в содержании тестостерона и эстрадиола в сыворотке крови быков-производителей молочной и мясной пород, у которых брак спермы по биологическим показателям составил соответственно в среднем 49,3% и 53,1%. Содержание тестостерона у быков голштинской и абердино-ангусской пород находится на уровне 61,2±6,9 нмоль/л и 83,7±6,3 нмоль/л соответственно (Р<0,05), а содержание эстрадиола- 0,43 8± 0,019 нмоль/л и 0,569±0,047 нмоль/л (Р<0,05).

8. Установлена высокая оплодотворяющая способность замороженно-оттаяной спермы быков голштинской породы, обработанных новой лекарственной формой препарата Сат-Сом. После первого искусственного осеменения 86 коров и 65 телок стельность была установлена у 55,8% коров и 75,4% телок.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практической ветеринарной медицины предложена новая лекарственная форма препарата Сат-Сом на основе более иммуногенного соматостатинсодержащего белка, которая

обеспечивает повышение сперматогенеза и биологического качества спермы у хряков и быков-производителей. Препарат Сат-Сом для стимуляции сперматогенеза у хряков и быков-производителей в соответствии с инструкцией рекомендовано применять подкожно в дозе 5 мг белка Сат-Сом на 100 кг массы тела животного дважды с интервалом между инъекциями 14 суток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Юдин, B.C. Влияние биологически активного препарата Сат-Сом на спермопродукцию сельскохозяйственных животных и птиц / B.C. Юдин, B.C. Зернов, Г.В. Ескин, C.B. Советкин, С.М. Юдин //Зоотехния-2013.-№1,- С.29-31;*

2. Юдин, B.C. Эффективность применения ветеринарного препарата Сат-Сом хрякам-производителям / B.C. Юдин, A.B. Филатов, К.А. Селезнева // Зоотехния. - 2013. - №6. - С.30-32;*

3. Панин, А.Н. Эффективность применения некоторых биологически активных соединений в свиноводстве / А.Н. Панин, C.B. Советкин, B.C. Юдин // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук - 2013. - №4. - С.45-47*;

4. Юдин, B.C. Влияние биологически активного препарата САТ-СОМ на спермопродукцию сельскохозяйственных животных и птицы / B.C. Юдин, B.C. Зернов, Г.В. Ескин, C.B. Советкин, С.М. Юдин // Матер. Международной научно-практической, конференции «Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных», Воронеж, 2012. - С.533-538;

5. Юдин, В.С Влияние биологически активного препарата Сат-Сом на гормональный профиль быков-производителей / B.C. Юдин, Г.В. Ескин, C.B. Советкин, С.М. Юдин // Матер. Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного акушерства и репродукции животных», Горки, Беларусь, 2013 - С.3-5.

*- публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК России