Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Естественные микробные ассоциации почвы и их взаимодействие с лигнинными веществами сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Естественные микробные ассоциации почвы и их взаимодействие с лигнинными веществами сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности"

На правах рукописи

Зырянова Нелли Васильевна

Естественные микробные ассоциации почвы и их взаимодействие с лигнинными веществами сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности

Специальность 03.00.16 - Экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2003

Работа выполнена на кафедре физико-химической биологии Иркутского государственного университета

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Саловарова Валентина Петровна

доктор биологических наук, профессор Дрюккер Валентин Валерианович

Доктор биологических наук Цыренов Владимир Жигжитович

Ведущая организация:

Экологический факультет Российского Университета Дружбы народов

Защита состоится «8» октября 2003 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 Иркутского государственного университета по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Биолого-почвенный факультет

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского государственного университета

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Купчинская Е.С.

-А

¿Я

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Прогрессирующее снижение качества вод в результате сброса промышленных отходов в естественные водоемы является одной из важнейших экологических проблем современности. Основную роль в загрязнении водоемов Прибайкалья играют предприятия целлюлозно-бумажной промышленности (ЦБП) и лесопереработки. Большие объемы сточных вод, образующиеся в результате их деятельности и сбрасываемые в водоемы, несмотря на применяемые методы переработки, содержат значительные количества токсических веществ и оказывают неблагоприятное действие на гидробионтов. Многотоннажные твердые отходы ЦБП - опилки, лигнин, кора и пр. - скапливающиеся в отвалах, занимают большие территории и также являются антропогенным поллютантом.

В естественных условиях трансформация лигноцеллюлозных субстратов осуществляется сообществами микроорганизмов. Деятельность микробных сообществ - особенно почвенных, - является одной из наименее изученных областей экологии, что связано с многочисленностью и разнообразием микроорганизмов естественных ассоциаций, а также с неоднородностью местообитаний. Исследовательская работа в области синэкологии позволит понять закономерности функционирования экосистем и оценить влияние различных факторов загрязнения, а также возможности компенсации и адаптации экосистем к каждому конкретному поллютанту.

Сообщества почвенных микроорганизмов длительное время считались более устойчивыми к антропогенным факторам, чем сообщества животных и растений (Одум, 1986). Однако в последнее десятилетие часто высказывалось прямо противоположное мнение - о пригодности почвенных микроорганизмов для мониторинга состояния почвы, подверженной антропогенному загрязнению (Гузев, Левин, 2001; Наплекова, 2002). Результаты взаимодействия поллютантов с микробным сообществом могут быть неоднозначными и даже неожиданными (Емцев, 2001). Имеющаяся в литературе информация не дает возможности составить достаточно цельное представление об изменениях, происходящих в микробной системе почвы под влиянием загрязнения. В ряде случаев один и тот же агент может ингибировать, стимулировать и не оказывать никакого воздействия на микробиоту почвы (Гузев, Левин, 2001).

Изучение микробных сообществ, обитающих в условиях высокой антропогенной нагрузки, в частности, в условиях загрязнения сточными водами целлюлозно-бумажных предприятий, является актуальной задачей, поскольку позволяет оценить реакцию микробного сообщества на определенный длительно действующий фактор загрязнения, например, сточные воды. Микроорганизмы такого местообитания могут обладать полезными адаптациями и ферментными системами, позволяющими им избегать токсического действия стоков ЦБП и осуществлять деструкцию органических веществ сточных вод. Подобные свойства можно успешно применять и для промышленной переработки дов.

Целью исследования являлось изучение структуры и функциональной активности микробных сообществ, обитающих в условиях загрязнения сточными водами целлюлозно-бумажных предприятий В задачи исследования входило:

- анализ структуры микробного сообщества почвы, длительно существовавшего в условиях загрязнения сточными водами ЦБП в сравнении с таковым из нативной почвы;

- определение степени токсичности сточных вод для почвенного микробного сообщества;

- выявление культур исследуемого сообщества, эффективно воздействующих на органические компоненты сточных вод;

- оценка возможности применения таких микроорганизмов для утилизации промышленных отходов целлюлозно-бумажных предприятий;

- исследование взаимоотношений отдельных компонентов почвенного микробного сообщества для выявления закономерностей его жизнедеятельности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Структура микробного сообщества почвы изменяется под влиянием сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности.

2. Дрожжи, входящие в состав исследуемого микробного сообщества, оказывают максимальное воздействие на лигнинные вещества стоков ЦБП.

3. Токсичность сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности в отношении почвенных микробных сообществ сравнительно невелика.

4. Бактериальная микрофлора подавляет синтез целлюло- и лигнолитических ферментов микромицетов.

Научная новизна. Проведен сравнительный анализ микробных сообществ из загрязненных и естественных местообитаний Прибайкальского региона и определен уровень антропогенного стресса, оказываемого сточными водами ЦБП. Выявлены изменения структуры микробных сообществ, возникающие в ответ на новые условия культивирования и различные органические субстраты. Впервые с использованием методов ИК- и ЯМР-спектроскопии исследованы качественные и количественные изменения, происходящие в растворимых лигнинных веществах под влиянием микробных ассоциаций и доминирующих в них штаммов. Установлена роль отдельных культур микробного сообщества при утилизации ими лигнина.

Практическая значимость работы. Результаты исследования могут быть использованы как исходные для сравнительного анализа почвенных микробных сообществ из местообитаний с различной антропогенной нагрузкой. Полученные данные о преобладающей роли культуры дрожжей в утилизации растворимых лигнинных веществ выявляют новое перспективное направление для

скриннинга микроорганизмов-деструкторов лигнинсодержащих

отходов. Результаты изучения микробных сообществ будут полезны исследователям, занимающимся вопросами ассоциативного симбиоза и очисткой сточных вод.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на международной конференции «Человек. Земля. Вселенная» (Иркутск, 1997), Всероссийской конференции «Проблемы природопользования и ресурсосбережения Прибайкалья» (Иркутск, 1998), Всероссийской конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002), Всероссийской конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2002), Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, главы о полученных результатах, выводов, списка использованной литературы и 13 приложений. Список литературы включает 140 источников, из них 94 работы зарубежных авторов. Диссертация содержит 27 таблиц и иллюстрирована 26 рисунками.

Автор приносит искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н., профессору Саловаровой В.П. за постоянное внимание и помощь в организации исследований.

Автор благодарит к.б.н. Андрееву И.С. и д.б.н. Огаркова Б.Н. за оказанную помощь в определении таксономической принадлежности изученных микроорганизмов, к.х.н. Анненкова В.В., к.х.н. Рохина A.B., д.х.н. Каницкую J1.B. - за сотрудничество при исследовании субстратов методами ИК- и ЯМР-спектроскопии, а также сотрудников кафедры физико-химической биологии за оказанную поддержку при обсуждении результатов работы.

Содержание работы

Объекты и методы исследований

Объектами исследования являлись микробные сообщества почвы, подвергшиеся длительному воздействию сточных вод Байкальского (СБ) и Южно-Сахалинского целлюлозно-бумажных предприятий (СЮ), контрольное микробное сообщество, выделенное из почвы, не подвергавшейся воздействию стоков (СБ-K), и отдельные штаммы, выделенные их этих микробных ассоциаций. Чистые культуры бактерий и дрожжей получали на среде LA, микромицетов - на среде сусло-агар. Структурные изменения микробных сообществ и и способность штаммов к синтезу ферментов лигниназного и целлюлазного комплексов оценивали при культивировании микроорганизмов на жидкой среде с глюкозой и

минеральными солями (Barrath et al., 1965), и при добавлении различных лигноцеллюлозных субстратов: гидролизного лигнина (J1C-2), древесины ивы, предобработанной паровым взрывом (JIC-1), ячменной лузги.

Морфологические свойства клеток исследовали с использованием светового микроскопа Jenamet (Германия) и атомно-силового микроскопа Solver P47BIO NT-MDT (Russia).

Концентрации редуцирующих веществ в растворах определяли методом Шомоди-Нельсона, суммарное содержание фенольных соединений -колориметрическим методом с использованием реактива Фолина-Дениса (Запрометов, 1974). Количество белка определяли гравиметрическим способом с предварительным осаждением этанолом.

Спектры ИК лигнинсодержащих соединений регистрировали на спектрофотометре Bruker IFR-25 (Германия). Спектроскопию ЯМР 'Н и 13С осуществляли на спектрометре VXR-500S фирмы "Vanan" (Швейцария). Спектры УФ растворимой фракции лигнинных веществ получали на спектрофотометре СФ-26 (Россия).

Суммарную целлюлолитическую активность определяли по модифицированному методу Mandéis (Mandéis, Veber, 1969) с использованием в качестве субстрата фильтровальной бумаги Whatman 1.

Активность Mn-пероксидазы определяли по начальной скорости окисления NADH до NAD (Волчатова, 1994; Camarero et al., 2000). Качественное определение лигнолитической активности микросообществ и штаммов проводили по методу Бавендамма (Билай, Билай, 1982), количественное определение активности фенолоксидазы было основано на регистрации начальной скорости убыли пирокатехина при 280 нм.

Достоверность результатов оценивали общепринятыми методами биологической статистики (Плохинский, 1970; Рокицкий, 1973) с использованием программы Microsoft Excel 2000.

Результаты и их обсуждение

1.Изменение структуры микробных сообществ при их культивировании на средах с различными субстратами

Микроорганизмы исследуемых микробных сообществ очень разнообразны: из образцов почв были выделены микромицеты, относящиеся к родам Pénicillium, Aspergillus, Verticillium, Fusarium, дрожжевые штаммы родов Rhodotorula, Cryptococcus, Sporobolomyces, a также многочисленные бактериальные штаммы, преимущественно рода Bacillus. В составе микромицетов микробного сообщества СБ, подвергшегося длительному действию сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината, и контрольного микробного сообщества СБ-K, не подвергшегося воздействию стоков, значительных отличий не наблюдалось. В исследуемых почвенных сообществах бактерии представлены аэробными мезофильными формами со сходными физиологическими свойствами. Исследование ферментативной активности этих бактериальных штаммов показало, что способность к

утилизации органических субстратов у штаммов микробного сообщества СБ снижена по сравнению с таковой штаммов микробного сообщества СБ-К.

При высеве данных микробных сообществ на жидкие среды со сточными водами было выявлено, что видовое разнообразие сообществ в этих условиях резко снижалось, из микромицетов преобладали грибы рода Тпскос/егта. Доминирующие в количественном отношении штаммы бактерий демонстрировали способность к утилизации разнообразных органических субстратов, однако активность целлюлазы и оксидазы у них отсутствовала. Накопление биомассы и потребление глюкозы микробными сообществами при росте на среде со сточными водами существенно превышали аналогичные показатели при росте на среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что сточные воды Байкальского целлюлозно-бумажного комбината не подавляют жизнедеятельности микробных сообществ. Последние интенсивно растут и активно утилизуют доступные источники углерода. Вместе с тем, имеются некоторые признаки стрессового состояния, о котором можно судить по изменению структуры микробного сообщества и утрате ряда ферментативных активностей.

При выращивании микросообщества СБ на среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода наблюдалось развитие смешанного сообщества, состоящего из дрожжей, мицелиальных грибов рода ТпсИоЛегта и бактерий. При культивировании байкальского микробного сообщества СБ ь сахалинского микробного сообщества СЮ на жидкой среде с лузгой наблюдали преобладание бактериальной флоры, и отсутствие дрожжей и мицелия грибов. Активность целлюлазы и фенолоксидазы при культивировании микробных сообществ на данных средах отсутствовала, однако при высеве на среду с ячменной лузгой микромицета Тпскойегта 1ощ1ЬгасШаШт, выделенного из микробного сообщества СБ, наблюдалось его активный рост и небольшая АФБ-активность, достигающая 5 ед/мг белка.

Таким образом, состав и свойства исследуемых микробных сообществ существенно меняются в зависимости от типа субстрата. Результаты исследования также свидетельствуют, что преимущественное развитие бактериальной компоненты в условиях избытка углеводов тормозит рост дрожжей и микромицетов.

2. Рост микробных сообществ на средах с лигнинами

Лигнинные вещества являются основным компонентом сточных вод ЦБП и технических лигнинов и способны оказывать токсическое действие на живые организмы. Исследование воздействия, оказываемого почвенными микробными сообществами на разные виды лигнинсодержащих субстратов, представляет интерес в плане использования микроорганизмов для быстрой и полной утилизации отходов ЦБП. Изучение влияния лигнина на почвенную микробиоту позволит оценить его потенциальную опасность для различных экосистем, а также способно пролить свет на жизнедеятельность сложного

биологического объекта - ассоциации микроорганизмов - в условиях антропогенного загрязнения.

Для выявления влияния, оказываемого почвенным микробным сообществом на лигнинные компоненты сточных вод, были проведены исследования по культивированию байкальских и южносахалинского микробных сообществ на жидкой среде с различными видами лигнина: гидролизным (ЛС-2) и лигнином древесины ивы после ее обработки паровым взрывом (ЛС-1). Полученные результаты обнаружили снижение видового разнообразия микробов до нескольких видов, увеличение доли дрожжей и мицелиальных грибов в микробном сообществе. Из грибов в подавляющем большинстве случаев развивались представители рода ТпсИойегта: Т. longibrachiaíum, Т. катагит, Т. viride, Т. коЫпфи

Микроскопические наблюдения за микробным сообществом СБ выявили активный рост мицелиальных клеток на твердых частицах - нерастворимой фракции - ЛС-1 и ЛС-2. Однако результаты ИК-спектроскопии свидетельствуют об отсутствии заметных изменений в их составе до и после культивирования (рис.1).

Рис. 1. ИК-спектр нерастворимой фракции ЛС-1 до (1) и после (2) воздействия микробного сообщества СБ

При исследовании растворимой фракции ЛС-1 с помощью УФ-спектроскопии было выявлено снижение концентрации оптически плотных веществ культуральной жидкости по мере развития микробного сообществ (рис.2). Было установлено, что за 14 суток роста микросообщество СБ утилизует 35,1% ± 1,1% растворимой фракции ЛС-1. Изменения в

химическом составе последнего, происходящие под действием сообщества СБ, были охарактеризованы с помощью метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Анализ спектра ЯМР 13С исходной растворимой фракции JIC-1 показал, что в ней содержатся лигнин, "нелигнинные" компоненты, в том числе, возможно, соединения типа CH3-O-CH2-COOR (R=H, Alk), являющиеся продуктами деструкции углеводов или гемицеллюлоз. О последнем свидетельствует завышенное количество атомов углерода фрагментов СНОалк, СН2Оалк- Кроме того, исходный образец содержит довольно высокое количество сложноэфирных групп (табл.1).

■СБ-К -СБ ■СЮ исходный

-Т-Г' 1111

V Т? 0> Т? 'У V длина волны, нм

Рис.2. УФ-спектры растворимой фракции взорванного лигнина после воздействия различных почвенных микробных сообществ.

В образце растворимой фракции ЛС-1 после воздействия микробного сообщества СБ наблюдалось увеличение количества сложноэфирных групп в 1,3 раза за счет окисления аномерных атомов углерода углеводов до СООН-групп с последующим образованием сложноэфирных связей с фрагментами макромолекулы лигнина. Содержание углеводов в субстрате при воздействии сообщества микроорганизмов снижается в 5,8 раза. Сумма недеструктированных и окисленных углеводов в образце после воздействия микробного сообщества СБ (в % масс.) практически равна исходной концентрации углеводов в контрольном образце (табл.1). После роста в течение 14 суток микробной ассоциации в образце растворимой фракции ЛС-1 практически не осталось продуктов деструкции углеводов, которые

образуются в результате взрывного автогидролиза древесины ивы: суммарное количество фрагментов СНОалк- и СНгОа.™ составляет всего 1.55 в расчете на ароматическое кольцо. Это в 3,1 раза меньше, чем в контрольном образце.

Известно, что степень токсичности лигнинных веществ пропорциональна их количеству в среде культивирования. Изучаемые микробные сообщества росли и эффективно утилизовали растворимый лигнин при его содержании в среде 51 мг/л.

Таблица 1

Содержание функциональных групп и углеводов в растворимом лигнинсодержащем субстрате до и после воздействия микробного _сообщества СБ_

Функциональные группы, углеводы Содержание, мае. %

Исходный образец растворимой фракции ЛС-1 Образец растворимой фракции ЛС-1 после роста СБ

С=Ю + С(0)Н 0,1 1,1

С(0)0Н 0,5 0,02

С(0)0- 3,3 10,1

СН30 4,7 8,6

ОН^ен 1,3 1,6

Углеводы 9,9 1,7

Углеводы деструктированные ("нелигнинные" компоненты) 5,6 Не определяются

В результате экспериментов было установлено, что концентрации растворимого лигнина 93 и 128 мг/л практически не оказывали влияния на состав почвенного сообщества и не снижали уровень накопления биомассы развившихся микроорганизмов. При концентрации лигнина 163 мг/л становилось заметным снижение накопления биомассы культуры (табл.2).

В процессе культивирования микробных сообществ на жидких средах с лигнинами наблюдалась незначительная целлюлазная активность. Максимальные значения АФБ-активности были отмечены на 7-е сутки роста СБ на среде с ЛС-1, тогда как при культивировании его на среде с ЛС-2 пик активности наблюдали в более поздние сроки — на 14-е сутки. Независимо от вида сообщества, к 30-м суткам роста микроорганизмов целлюлазная активность исчезала.

Таблица 2

Влияние концентрации растворимых веществ ЛС-1 на степень утилизации и накопление биомассы микроорганизмов

Исходная Конечная Убыль

концентрация концентрация растворимых Накопленная

растворимых растворимых лигнинных биомасса, г/л

веществ ЛС-1, веществ ЛС-1, веществ, %

мг/л мг/л

51,0±0,3 33,1±0,2 35,1±1,1 1,8±0,3

93,1 ±0,9 56,6±1,0 39,2±2,3 2,8±0,2

128,3±0,7 73,2±1,1 41,0±4,2 2,9±0,1

163,2±0,9 88,4±0,8 45,8±1,2 3,0±0,1

Мп-пероксидазная и полифенолоксидазная активности при росте почвенных микробных сообществ на средах с лигнинами не регистрировались.

Полученные данные свидетельствуют, что естественная способность микромицетов к синтезу ферментов, разлагающих лигноцеллюлозы, в составе микробного сообщества каким-то образом подавляется. Для выяснения причин этого явления, а также для изучения взаимоотношений членов микробной ассоциации в ходе их воздействия на растворимые лигнинные вещества, были исследованы основные компоненты микробного сообщества СБ.

3. Воздействие отдельных компонентов микробного сообщества СБ на лигнинсодержащие субстраты

Соотношение штаммов микроорганизмов значительно различалось в исходном почвенном сообществе и после культивирования его на жидкой среде с лигнинсодержащим субстратом. Исходное сообщество содержало 2% от общего количества колоний дрожжей рода Rhodotorula, 70% колониеобразующих единиц были представлены штаммом 17С (грамотрицательные палочковидные неспороносные бактерии, в настоящее время не определенные до вида), 6% бактерий - штамм 1С (грамотрицательные палочковидные неспороносные бактерии), Micrococcus luteus - 4%, спор грибов - не более 1%. Численность других бактериальных штаммов составила 17%. В ходе культивирования наблюдали значительное накопление мицелия грибов, преимущественно вида Trichoderma longibrachiatum и в небольших количествах - вида Fusarium moniliformae. Изменения, произошедшие в процентном соотношении культур после роста микросообщества представлены на рисунке 3.

В составе почвенных сообществ по биомассе и метаболической активности доминируют грибы и бактерии, поэтому представляется возможным получить базовую картину взаимосвязей в микробного сообществе на основе изучения этих организмов. Для выявления

межмикробных взаимодействий в сообществе СБ были выделены три количественно доминирующих на среде с ЛС-1 штамма микроорганизмов: микромицет ТпсИос1егта 1оп&ЬгасЫаШт, дрожжи рода ЯИос^о(от1а, бактериальный штамм 17С. При изучении степени утилизации фенольных веществ ЛС-1 данными штаммами было установлено, что наиболее активен в этом отношении гриб микробного сообщества СБ Тг1сИос1егта longiЪrachiatum. При сравнении его активности в деградации фенолов с таковой дрожжей КИос1оюги1а яр. и целого микросообщества СБ, было отмечено, что активность сообщества ниже таковой грибного штамма, но выше активности дрожжей. Так как аддитивности действия грибов и дрожжей при изучении активности микросообщества не наблюдалось, это может свидетельствовать о подавлении исходно высокой активности грибов в составе сообщества, что может быть обусловлено присутствием бактерий.

80

1 2 3 4 5 6

Рис.3. Соотношение микроорганизмов СБ до и после культивирования на среде с ЛС-1:1- Ююс1о^ги1а зр., 2- бактерия 17С, 3 - бактерия 1 С, 4 -Мгсгососсш ¡Шеш, 5 - микромицеты, 6 - прочие.

Уровень деструкции лигнинных веществ доминирующими штаммами СБ по результатам УФ-спектроскопии можно оценить по рис.4.

Из него видно, что культивирование бактериального штамма практически не изменяет УФ-спектра культуральной жидкости. Влияние дрожжей и гриба на растворимую фракцию ЛС-1 гораздо более выражено и сопоставимо с таковым целого микробного сообщества. Для характеристики химических процессов, протекающих в растворимой фракции ЛС-1 под действием микроорганизмов, был применен метод инфракрасной спектроскопии. Анализ ИК-спектров показал, что в образцах, полученных после воздействия микробного сообщества СБ и дрожжей КНосЬюпЛа л/7., возрастает количество метоксильных группировок, тогда как воздействие

Рис.4. УФ-спектры лигнинных веществ культуральной жидкости после культивирования членов микробного сообщества на среде с ЛС-1.

микромицета Trichoderma 1ощ&гасЫатт на лигнинсодержащий препарат, напротив, приводит к снижению их числа (рис. 5). Под влиянием микробного сообщества увеличивается количество сирингильных единиц и снижается количество гваяцильных В образцах, полученных в результате воздействия дрожжей ЯНос1о1оги1а зр. и грибного штамма Т.1оп^1ЬгасЫаШт уменьшается относительное содержание карбоксильных (и/или сложноэфирных) групп, о чем свидетельствует снижение интенсивности полос при 1220 см"1 и 1270 см-1.

Следует отметить, что ИК-спектр растворимой фракции ЛС-1 после культивирования микробного сообщества более сходен с таковым после роста ШосЬгопйа яр., чем с образцом после культивирования Тпскос1егта 1оп&ЬгасМаШт. Так как подобное общее сходство действия целого микробного сообщества и дрожжей на растворимый лигнин наблюдается и при сравнении УФ-спектров, можно считать доказанным факт преобладающего действия дрожжей на лигнинные вещества в составе микробного сообщества.

Результаты анализа удельной целлюлолитической активности штаммов доминирующих видов микробного сообщества СБ свидетельствуют, что бактериальный и дрожжевой штамм на среде с ЛС-1 не обладают способностью к разложению целлюлозы, а штамм ТЛоп&ЪгасЫашт демонстрирует невысокую фоновую активность целлюлазы. Также в культуральной жидкости грибного штамма по результатам качественных тестов была выявлена полифенолоксидазная активность, отсутствующая у дрожжевого и бактериального штаммов.

Рис. 5. ИК-спектры растворимой фракции ЛС-1 после культивирования СБ и его компонентов

Взаимное влияние различных компонентов микробных сообществ при деградации ими растворимых лигнинных веществ показано на рис.6, где приведены УФ-спектры растворимой фракции взорванного лигнина в культуральной жидкости при совместном культивировании доминирующих компонентов СБ.

При анализе приведенных УФ-спектров выявлено, что дрожжевой и бактериальный штамм при совместном культивировании с ТЛоп&ЬгасЫаШт в значительной мере снижают скорость утилизации микромицетом лигнинных веществ. Особенно это относится к бактериям. Профиль УФ-спектра лигнинных веществ при совместном росте пары (Т.1о^&гасЫаШт+бактерия) на первой неделе культивирования в значительной степени изменен по сравнению с таковым к концу второй недели, когда он становится похож на УФ-спектр после воздействия ипаммма микромицета. Дрожжи ШюйогогиЫ зр. при совместном культивировании с ТАощЛгасЫаит незначительно снижают скорость утилизации лигнинных веществ грибным штаммом, и практически не изменяют вид УФ-спектра культуральной жидкости. Относительно культивирования пары (ЮюсЬгоги1а эр. + бактериальный штамм 17С) на среде с ЛС-1 следует отметить, что при анализе УФ-спектра лигнинных веществ культуральной жидкости наблюдается функциональное (вид УФ-спектра) и количественное (темп утилизации растворенных лигнинных веществ) преобладание дрожжевого штамма.

jf # # # tf длина волны, ни

j» # # £ длина волны, нм

В

2,5

- исходным -7 суток -14 суток

^ 4> 4> 4> ^

длина волны, нм

Рис.6. УФ-спектры растворимой фракции лигнина в процессе совместного культивирования Rhodotorula sp.+ Т. longibrachiatum (А); Т. longibrachiatum + шт.17С (В); Rhodotorula sp. + шт. 17С (С).

При совместном культивировании компонентов на 14-е сутки культивирования максимальная целлюлазная активность отмечается у пары {T.longibrachiatum+Rhodotorula sp.), а минимальной - сочетание (бактерия ПС+T.longibrachiatum), пара (Rhodotorula i^.+бактерия 17С) обладает активностью, лишь незначительно превышающей таковую пары (бактерия 17С+Т. longibrachiatum). Активность Mn-пероксидазы в условиях совместного культивирования не наблюдалась.

Заключение

Антропогенное давление на природные микробные сообщества обычно приводит к изменениям в их составе и снижению видового разнообразия, особенно при высоких уровнях загрязнения (Виноградова, 2002, Pankhurst, 2001, Макарова, 2002). В наших исследованиях не было выявлено существенного снижения видового разнообразия микробного сообщества

СБ, подвергшегося длительному воздействию сточных вод ЦБП по сравнению с контрольным сообществом СБ-К, однако в СБ наблюдалось перераспределение доминантных штаммов микроорганизмов - смена доминирующих видов и увеличение их числа. Также наблюдалась утрата штаммами СБ ряда ферментативных активностей, что, наряду с перестройкой структуры микробного сообщества, позволяет нам определить уровень антропогенной нагрузки как средний (вторая адаптивная зона по Гузеву и Левину - зона стресса микробной системы почвы) (Гузев, Левин, 2001).

Эксперименты по раздельному культивированию на средах с лигнином доминирующих членов микробного сообщества СБ (бактериальный штамм 17С, дрожжевой штамм Шо(Ыоги1а зр., микромицет Тпс1юс1егта 1оп&ЪгасЫашт) позволили нам выявить роль отдельных компонентов микробного сообщества в утилизации лигнинных веществ. Показано, что бактериальный штамм 17С не снижает концентрации последних в культуральной жидкости и не изменяет вид УФ-спектра КЖ. При культивировании на среде с взорванным лигнином наблюдалась остановка развития бактерий уже на пятые-шестые сутки, задолго до исчерпания Сахаров в среде. Причиной этого явления может быть как негативное влияние на штамм лигнинных веществ, так и накопление в культуральной среде отходов жизнедеятельности. К последним могут относиться фенольные соединения, карбоновые кислоты, метиловый спирт - токсические вещества, образующиеся в водоемах в процессе разложения лигнина бактериями (Криульков и др., 1974; Калинкина, 1993). На наличие таких веществ косвенно указывает наблюдаемое понижение рН до 3,6-3,8. Сопоставление УФ-спектров КЖ при культивировании членов микробного сообщества по отдельности и попарно, а также данных по рН КЖ, наводит на мысль о том, что бактериальный штамм в первые дни культивирования подавляет как рост гриба, так и его активность в отношении растворимых лигнинных веществ. Негативное влияние бактерий на ТпсИос1егта \ongibrachiatum устранялось лишь на второй неделе культивирования, о чем свидетельствует как изменение УФ-спектра КЖ, приближающегося к таковому, характерному для микромицета, так и уменьшение кислотности среды. Отрицательное воздействие бактерий на развитие микромипетов выявляется и при культивировании на богатой сахарами среде с ячменной лузгой. В этих благоприятных условиях бактерии бурно размножаются с активным выделением С02, а рост мицелия, равно как и дрожжей, не наблюдается вовсе. Между тем, и ТЛоп&ЪгаеЫаЫт, и ЯИос1о1огы1а яр. хорошо растут на данной среде в виде монокультур, и подавление их жизнедеятельности наблюдается только в составе микробного сообщества. Дрожжевой штамм практически не подвержен негативному влиянию бактерий при их росте на среде с лигнином, но, в свою очередь, немного снижает интенсивность воздействия T.longibrachiatum на лигнинные вещества, хотя и в меньшей степени, чем бактерии. Общее сходство действия целого микробного сообщества и дрожжевого штамма Юю<1о1оги1а лр. на растворимую фракцию лигнина выявляется на УФ- и ИК-спектрах, так что мы можем говорить о

преобладающем действии дрожжей на лигнинныевещества в составе микробного сообщества. Угнетение роста и жизнедеятельности микросообщества по такому показателю, как накопление биомассы, наблюдалось только при концентрациях растворимых лигнинных веществ свыше 0,13 мг/мл культуральной жидкости. Эта концентрация описывается в литературе как среднесмертельная для дафний (Новикова и др., 1989). При этом убыль (%) лигнинных веществ в КЖ возрастала даже при культивировании микробного сообщества на среде с высокими концентрациями лигнина. Вероятной причиной такого явления может быть уменьшение количества бактерий в данных условиях. Как указывалось выше, бактериальные штаммы были способны ингибировать рост и активность Trichoderma longibrachiatum, и, в случае подавления деятельности прокариотных микроорганизмов при высоких концентрациях лигнина, микромицет функционировал более активно и выделял ферменты в более ранние сроки, что и позволило получить наблюдаемую картину.

Выводы

1. Установлено, что под влиянием сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности в почвенном микробном сообществе изменяется состав доминирующих видов - увеличивается количество штаммов рода Bacillus - без существенного снижения видового разнообразия, что позволяет оценить уровень антропогенной нагрузки как средний.

2. Выявлено, что бактериальная микрофлора почвы более подвержена негативному воздействию сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности, чем грибная компонента почвенной микробиоты.

3. Методами ИК и ЯМР 'Н и |3С спектроскопии исследованы растворимые лигнинные вещества, трансформированные микробным сообществом. При этом в их составе в 1,3 раза увеличивалось количество сложноэфирных групп, содержание углеводов уменьшается в 5,8 раз, суммарное количество фрагментов СНО^ и СНгО^,, уменьшается в 3,1 раза. Установлено, что основные химические изменения в составе субстрата обусловлены действием дрожжевых штаммов.

4. Изучено взаимное влияние основных компонентов почвенного микробного сообщества при их росте на лигнинсодержащем субстрате. Выявлено негативное воздействие, оказываемое бактериальным штаммом на ферментативную активность микромицетов.

• 5. Применение исследованных микробных сообществ микроорганизмов для утилизации промышленных отходов в их естественном составе является малоперспективным из-за отсутствия в среде культивирования активных форм ферментов. Более пригодными для этой цели представляются ассоциации микроорганизмов на основе штаммов дрожжей и микромицетов.

Список опубликованных по теме работ

1. Саловарова В.П., Степанова Л.М., Трифонова Т.М., Зырянова Н.В. Использование биотехнологических методов для утилизации лигноцеллюлозных отходов // Тез.докл. международной конф «Человек. Среда. Вселенная», Иркутск, 1997, с. 131.

2. Зырянова Н.В., Саловарова В.П., Макаренко С.П. Получение фузантов дереворазрушающих грибов с новыми свойствами // Тез. докл. конф. «Современные проблемы экологии, природопользования и ресурсосбережения Прибайкалья», Иркутск, 1998, с. 197.

3. Зырянова Н.В., Саловарова В.П., Макаренко С.П. Некоторые особенности влияния стероидного сапонина дигитонина на липиды мембран при получении фузантов ТпсНос1егта \iride и СогЫш риЬевсет II Журнал , «Известия РАН», (сер. Биология), 1998, N 5, с.628-631.

4. Зырянова Н.В., Саловарова В.П., Колодкин А.Н., Валеева Д.С. Изменение структуры микробного сообщества почвы при разных условиях существования // Мат. конф. «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», Иркутск, 2002, с.141-143.

5. Зырянова Н.В., Саловарова В.П. Внутренние взаимосвязи почвенного микросообщества // Тез. докл. конф. «Биология - наука XXI века», Пущино, 2002.

6. Зырянова Н.В., Саловарова В.П. Влияние сточных вод на микробное сообщество почвы // Тез. докл. конф. «Современные проблемы водной токсикологии», Борок, 2002, с. 85.

7. Валеева Д.С., Саловарова В.П., Зырянова Н.В. Изучение термофильных продуцентов целлюлаз из микробных ассоциаций // Мат. конф. «Биоповреждения» Пенза, 2002, с.201-202

Отпечатано в Глазковской типографии, г. Иркутск, ул. Гоголя, 53. Подписано в печать 3.09.2003 г. Формат 60x84'/,6. Гарнитура Типе8Не\¥11отап. Усл. печ. л. 1,05. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Заказ № 3852. Тираж 100 экз.

Р13 6 3 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зырянова, Нелли Васильевна

Введение.

ГЛАВА 1. Микробные сообщества: структура, функционирование и взаимодействие с антропогенными поллютантами.

1.1.Функционирование почвенных микробных сообществ.

1.1.1. Свойства и состав естественных микробных сообществ.

1.1.2. Анализ современных методов изучения почвенных микробных сообществ.

1.1.3. Реакция почвенных микробных сообществ на антропогенное загрязнение.

1.2.Лигнинсодержащие отходы целлюлозно-бумажной промышленности как антропогенный поллютант.

1.2.1. Химический состав сточных вод ЦБП.

1.2.2. Технические лигнины - отходы ЦБП.

1.2.3. Влияние сточных вод ЦБП на живые организмы.

1.3.Ферменты, участвующие в деградации лигноцеллюлозных субстратов.

1.3.1. Ферменты, разрушающие целлюлозу.

1.3.2. Ферменты, разрушающие лигнин.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Условия выделения микробных сообществ почвы.

2.3. Питательные среды для выделения микроорганизмов и поддержания их в активном состоянии.

2.4. Изучение морфофизиологических свойств штаммов.

2.5. Качественные методы определения активности ферментов бактериальных штаммов.

2.6. Условия и способы культивирования почвенных микробных сообществ.

2.7. Определение концентрации редуцирующих веществ.

2.8. Определение концентрации белка.

2.9. Методы исследования химического состава лигнинсо держащих субстратов до и после воздействия на них микробных сообществ и отдельных штаммов.

2.9.1. Определение содержания фенолов.

2.9.2. Спектральные методы анализа.

2.9.2.1. УФ-спектроскопия.

2.9.2.2. ИК-спектроскопия.

2.9.2.3. Спектроскопия ЯМР.

2.10. Методы определения активностей ферментов, участвующих в разложении лигноцеллюлозных субстратов.

2.10.1 Определение активности целлюлазы.

2.10.2. Определение активности лигнолитических ферментов.

2.11. Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3. Микробные сообщества почв, загрязненных сточными водами целлюлозно-бумажной промышленности: структура, свойства и взаимодействие с лигнинными веществами.

3.1. Байкальские почвенные микробные сообщества.

3.2. Влияние сточных вод БЦБК на рост и свойства микробных сообществ.

3.3. Развитие микробных сообществ на средах с ячменной лузгой и глюкозой.

3.4. Рост микробных сообществ на средах с лигнинами.

3.4.1. Изменение структуры микробных сообществ.

3.4.2. Воздействие микробных сообществ на лигнин.

3.4.2.1. Химический состав лигнинсодержащих субстратов.

3.4.2.2. Утилизация растворимой и нерастворимой фракций лигнина микросообществами.

3.4.2.3. Количественная спектроскопия ЯМР растворимой фракции взорванного лигнина.

3.4.2.4. Исследование воздействия концентрации лигнина на микробное сообщество СБ.

3.4.2.5. Развитие байкальских почвенных микросообществ на среде с лигнином, обработанным электрическим разрядом.

3.4.2.6. Внеклеточные ферменты микробных сообществ при росте на средах с лигнинами.

3.5. Воздействие отдельных компонентов микросообщества СБ на лигнинсодержащие субстраты.

3.5.1. Изменения видового и количественного состава микробного сообщества.

3.5.2. Воздействие компонентов микробного сообщества на фенольные вещества культуральной жидкости.

3.5.3. Воздействие отдельных компонентов микробного сообщества на растворимые лигнинные вещества.

3.5.4. Активность ферментов компонентов микробного сообщества СБ при культивировании на среде с ЛС-1.

3.5.5. Влияние компонентов микросообщества на уровень кислотности среды.

3.6. Взаимодействие компонентов СБ при культивировании на среде с ЛС-1.

3.7. Обсуждение результатов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Естественные микробные ассоциации почвы и их взаимодействие с лигнинными веществами сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности"

Актуальность темы. Прогрессирующее снижение качества вод в результате сброса промышленных отходов в естественные водоемы является одной из важнейших экологических проблем современности. Основную роль в загрязнении водоемов Прибайкалья играют предприятия целлюлозно-бумажной промышленности и лесопереработки. Большие объемы сточных вод, образующиеся в результате их деятельности и сбрасываемые в водоемы, несмотря на применяемые методы переработки, содержат значительные количества токсических веществ и оказывают неблагоприятное действие на гидробионтов. Многотоннажные твердые отходы ЦБП - опилки, лигнин, кора и пр. — скапливающиеся в отвалах, занимают большие территории и также являются антропогенным поллютантом.

В естественных условиях трансформация лигноцеллюлозных субстратов осуществляется сообществами микроорганизмов. Деятельность микробных сообществ — особенно почвенных, - является одной из наименее изученных областей экологии, что связано с многочисленностью и разнообразием микроорганизмов естественных ассоциаций, а также с неоднородностью местообитаний. Исследовательская работа в области синэкологии позволит понять закономерности функционирования экосистем и оценить влияние различных факторов загрязнения, а также возможности компенсации и адаптации экосистем к каждому конкретному поллютанту.

Сообщества почвенных микроорганизмов длительное время считались более устойчивыми к антропогенным факторам, чем сообщества животных и растений (Одум, 1986). Однако в последнее десятилетие часто высказывалось прямо противоположное мнение — о пригодности почвенных микроорганизмов для мониторинга состояния почвы, подверженной антропогенному загрязнению (Гузев, Левин, 2001; Наплекова, 2002).

Результаты взаимодействия поллютантов с микробным сообществом могут быть неоднозначными и даже неожиданными (Емцев, 2001). Имеющаяся в литературе информация не дает возможности составить достаточно цельное представление об изменениях, происходящих в микробной системе почвы под влиянием загрязнения. В ряде случаев один и тот же агент может ингибировать, стимулировать и не оказывать никакого воздействия на микробиоту почвы (Гузев, Левин, 2001).

Изучение микробных сообществ, обитающих в условиях высокой антропогенной нагрузки, в частности, в условиях загрязнения сточными водами целлюлозно-бумажных предприятий, является актуальной задачей, поскольку позволяет оценить реакцию микробного сообщества на определенный длительно действующий фактор загрязнения, например, сточные воды. Микроорганизмы такого местообитания могут обладать полезными адаптациями и ферментными системами, позволяющими им избегать токсического действия стоков ЦБП и осуществлять деструкцию органических веществ сточных вод. Подобные свойства можно успешно применять и для промышленной переработки лигноцеллюлозных отходов.

Целью исследования являлось изучение структуры и функциональной активности микробных сообществ, обитающих в условиях загрязнения сточными водами целлюлозно-бумажных предприятий В задачи исследования входило:

- анализ структуры микробного сообщества почвы, длительно существовавшего в условиях загрязнения сточными водами ЦБП в сравнении с таковым из нативной почвы;

- определение степени токсичности сточных вод для почвенного микробного сообщества;

- выявление культур исследуемого сообщества, эффективно воздействующих на органические компоненты сточных вод;

- оценка возможности применения таких микроорганизмов для утилизации промышленных отходов целлюлозно-бумажных предприятий;

- исследование взаимоотношений отдельных компонентов почвенного микробного сообщества для выявления закономерностей его жизнедеятельности.

Научная новизна. Проведен сравнительный анализ микробных сообществ из загрязненных и естественных местообитаний Прибайкальского региона и определен уровень антропогенного стресса, оказываемого сточными водами ЦБП. Выявлены изменения структуры микробных сообществ, возникающие в ответ на новые условия культивирования и различные органические субстраты. Впервые с использованием методов ИК- и ЯМР-спектроскопии исследованы качественные и количественные изменения, происходящие в растворимых лигнинных веществах под влиянием микробных ассоциаций и доминирующих в них штаммов. Установлена роль отдельных культур микробного сообщества при утилизации ими лигнина.

Практическая значимость работы. Результаты исследования могут быть использованы как исходные для сравнительного анализа почвенных микробных сообществ из местообитаний с различной антропогенной нагрузкой. Полученные данные о преобладающей роли культуры дрожжей в утилизации растворимых лигнинных веществ выявляют новое перспективное направление для скриннинга микроорганизмов-деструкторов лигнинсодержащих отходов.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на международной конференции «Человек. Земля. Вселенная» (Иркутск, 1997), Всероссийской конференции «Проблемы природопользования и ресурсосбережения

Прибайкалья» (Иркутск, 1998), Всероссийской конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе» (Иркутск, 2002), Всероссийской конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2002), Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем работы

Работа изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы об объектах и методах исследования, главы о полученных результатах и их обсуждении, выводов, списка использованной литературы и 13 приложений. Список литературы включает 140 источников, из них 94 работы зарубежных авторов. Диссертация содержит 27 таблиц и иллюстрирована 26 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Зырянова, Нелли Васильевна

выводы

1. Установлено, что под влиянием сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности в почвенном микробном сообществе изменяется состав доминирующих видов — увеличивается количество штаммов рода Bacillus — без существенного снижения видового разнообразия, что позволяет оценить уровень антропогенной нагрузки как средний.

2. Выявлено, что бактериальная микрофлора более подвержена негативному воздействию сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности, чем грибная компонента почвенной микробиоты.

3. Методами ИК и ЯМР 'Н и 13С спектроскопии исследованы растворимые лигнинные вещества, трансформированные микробным сообществом. При этом в их составе в 1,3 раза увеливалось количество сложноэфирных групп, содержание углеводов уменьшается в 5,8 раз, суммарное количество фрагментов СНОалк и CH20^K уменьшается в 3,1 раза. Установлено, что основные химические изменения в составе субстрата обусловлены действием дрожжевых штаммов.

4. Изучено взаимное влияние основных компонентов почвенного микробного сообщества при их росте на лигнинсодержащем субстрате. Выявлено негативное воздействие, оказываемое бактериальным штаммом на ферментативную активность микромицетов.

5. Применение исследованных микробных сообществ микроорганизмов для утилизации промышленных отходов в их естественном составе является малоперспективным из-за отсутствия в среде культивирования активных форм ферментов. Более пригодными для этой цели представляются ассоциации микроорганизмов на основе штаммов дрожжей и микромицетов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зырянова, Нелли Васильевна, Иркутск

1. Антоненко A.M. Микробиологический и биохимический анализ природной среды юго-восточного побережья озера Байкал // Тез. докл. конф. «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», Иркутск, 2002, с.82-83.

2. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей //М.: Пищевая промышленность, 1979, 240 с.

3. Бейм A.M. Актуальная проблема экологической токсикологии и химии // Тез. докл. конф. «Проблемы экологической химии и токсикологии в охране природы», Байкальск, 1990, с.86-87.

4. Бейм A.M., Зубкович В.В. К оценке степени токсичности для водных организмов некоторых органических компонентов стоков сульфатцеллюлозного производства // В кн.: Проблемы водной токсикологии, Петрозаводск, 1978, с. 40-51.

5. Бейм Ф.М., Кородева JT.A. Токсикометрическая характеристика лигнина // В кн.: Состояние и перспективы развития технологии и оборудования ЦБП, JI.:JITA, 1982, с.99.

6. Билай В.И., Билай Т.И. Методы экспериментальной микологии: справочник // Киев: Наукова думка, 1982, 530 с.

7. Благодатская Е.В., Богомолова И.Н., Благодатский С.А. Изменение экологической стратегии микробного сообщества почвы, инициированное внесением глюкозы // Почвоведение, 2001, № 5, с.600-608.

8. Бельков B.B. Новые представления о молекулярных механизмах эволюции: стресс повышает генетическое разнообразие // Молекулярная биология, 2002, т.36, N 2, с.277-285.

9. Ю.Виноградова Т.П. Исследования О.М. Кожовой микробного звена водных экосистем Сибири // Тез. докл. конф. « Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», Иркутск, 2002, с.88-90.

10. П.Волчатова И.В. Физиолого-биохимические механизмы микробиологической деструкции лигнина // Дисс. на соискание уч.ст. канд. биол. наук, Иркутск, 1994.

11. Головченко A.B., Добровольская Т.Г., Максимова И.А., Терехова В.А., Звягинцева Д.Г., Трофимов С .Я. Структура и функции микробных сообществ почв Южной тайги // Микробиология, 2000, т.69, № 4, с. 453-464.

12. Н.Грицай М.В., Ахмина Е.И. Исследование структурно-механических свойств гидролизного лигнина // Сб. тр. ВНИИГидролиз, 1971, вып.23, с. 187-196.

13. Громов А.Е. Изменение гидрохимических и токсикологических параметров сточной воды отбельного цеха БЦБК после ее электрохимической обработки // Тез. докл. конф. «Проблемы экологической химии и токсикологии в охране природы», Байкальск, 1990, с. 28-29.

14. Грушников О.Т., Елкин О.В. Достижения и проблемы химии лигнина // М.: Наука, 1973,296 с.

15. Гузев B.C., Левин C.B. Техногенные изменения сообщества почвенных микроорганизмов// Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии», Москва, 2001, с.178-219.

16. Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П. Аккумуляция меди и никеля почвенными грибами // Микробиология, 1991, т.60, вып.5, с.801-807.

17. Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П. Влияние выбросов предприятия цветной металлургии на почву в условиях модельного опыта // Почвоведение, 2000, N 5, с. 630-638.

18. Емцев В.Т. Почвенные микробы и деградация ксенобиотиков // Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии», Москва, 2001, с.77-78.

19. Емцев В.Т., Мишустин Е.М. Микробиология. М.: Колос,1993, 383 с.22.3апрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений // М.:

20. Высшая школа, 1974, 214 с.

21. Иванова Т.И., Артамонова С.Ю., Охлопкова A.B. Сообщества почвенных микрооганизмов района золотодобычи в Южной Якутии// Наука и образование, 2001, N 1, с. 13-16.

22. Имранова E.JI. Сукцессии микроорганизмов при деструкции древесных остатков //Дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук, Иркутск, 1998.

23. Калабин Г. А., Каницкая JI. В., Кушнарев Д. Ф. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки // Москва: Химия, 2000,408 с.

24. Калинкина Н.М. Эколого-токсикологическая оценка опасности сульфатного лигнина для гидробионтов // Автореф. дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук , Санкт-Петербург, 1993.

25. Криульков ВЛ., Каплин В.Т., Ганин Г.И. Механизм превращения лигнина и его производных в природной воде // Химия и использование лигнина, Рига, 1974, с.397-408.

26. Кураков A.B. Роль микроскопических грибов в трансформации азота в почве // Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии», Москва, 2001, с. 133-162.

27. Лапыгина Е.В., Лысак Л.В. Изменение структуры бактериального комплекса почвы под влиянием насыщенных растворов минеральных солей // Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии», Москва, 2001, с.273-278.

28. Леванова В.П. Технология, свойства и применение энтеросорбентов на основе гидролизного лигнина // Дисс. на соискание ученой степени доктора технических наук, Санкт-Петербург, 1995, с.ЗЗ.

29. Левин C.B., Гузев B.C., Асеева И.В., Бабьева И.П. Тяжелые металлы как фактор антропогенного воздействия на почвенную микробиоту // в кн. Микроорганизмы и охрана почв / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1989, с. 5-46.

30. Любешкина Е.Г. Лигнины как компонент полимерных композиционных материалов // Успехи химии, 1983, т.52, N 7, с.1196-1224.

31. Марфенина O.E. Нарушение эколого-географической зональности комплексов микроскопических грибов в почвах при антропогенных воздействиях // Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии», Москва, 2001, с.79-93.

32. Методы общей бактериологии (п/р Ф. Герхарда) // М.: Мир, 1984, Т.З, 350 с.

33. Наплекова H.H. Микробная индикация состояния почв // Тез. докл. конф. «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», Иркутск, 2002, с.160-161.

34. Никитин В.М., Оболенская A.B., Щеголев В.П. Химия древесины // М.: Лесная промышленность, 1978, 386 с.

35. Новикова Л.Н., Рудых А.Р., Стом Д.И., Чупка Э.И Трансформация и токсичность лигнинных веществ сточных вод сульфатцеллюлозных производств//Изд-во Иркутского Университета, 19946, 173 с.

36. Павленко В.Ф. Влияние минеральных удобрений и гербицидов на функционирование микробных сообществ в почвах плодовых насаждений / Структура и функции микробных сообществ почв с различной антропогенной нагрузкой //Киев, 1982, с. 180-184.

37. Плохинский H.A. Биометрия //М.: Изд-во Московского Университета, 1970, 367 с.

38. Полянская Л.М., Полянский М.Р., Гейдебрехт В.В. Современные представления о функционировании микробных сообществ в почвах //

39. Тез.докл. конф. «Перспективы развития почвенной микробиологии», Москва, 2001, с.171-177.

40. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы // Успехи биологической химии, 2000, т.40, с.205-266.

41. Раппопорт A.B., Мясоедов A.C., Лысак Л.В. Биологическая активность некоторых урбаноземов и культуроземов на территории Москвы // Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии», Москва, 2001, с.279-282.

42. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйшая школа, 1973,319 с.

43. Саловарова В.П., Козлов Ю.П. Эколого-биотехнологические основы биоконверсии растительных субстратов // М.: Изд-во Университета дружбы народов, 2001,331 с.

44. Селибер Г. Л. Большой практикум по микробиологии // Москва: Высшая школа, 1962, 500 с.

45. Синева Л.Н. Метод биологического контроля при изучении персистентности сточной воды Байкальского ЦБК // Тез. докл. конф. «Проблемы экологической химии и токсикологии в охране природы», Байкальск, 1990, с. 27-28.

46. Сухановский С.И., Ахмина Е.И., Лисина З.К Фракционный состав гидролизного лигнина и методы его определения // Сб. тр. ВНИИГидролиз, 1968, вып. 17, с.210-215.

47. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии. М.: Мир, 1980, 572 с.

48. Чернов И.Ю. География почвенных микроорганизмов: итоги и перспективы // Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии», Москва, 2001, с.34-46.

49. Чудаков М.И. Промышленное использование лигнина // М.: Лесная промышленность, 1972, 200 с.

50. Чудаков М.И. Гидролизный лигнин // Сб. тр. ВНИИГидролиз, 1978, вып.20, с. 151-180.

51. Asada Y., Watanabe A., Irie Т., Nakayama t., Kuwahara M. Structure of genomic and complementary DNAs coding for Pleurotus ostreatus manganese (II) peroxidase // Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1251, p.205-209.

52. Baath E., Diaz-Ravina M., Frostegard A., Campbell C.D. Effect of Metal-Rich Sludge Amendments on the Soil Microbial Community // Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol.64, N 1, p.238-245.

53. Barr D.P., Shah M.M., Grover M.A., Aust S.D. Production of hydroxyl radical by lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium II Arch. Biochem. Biophys., 1992, vol.298, p. 480-485.

54. Barrath R.W., Ogata W.N., Jonson G.B. Wild type and mutant stocks of Aspergillus nidulans II Genetics, 1965, vol.52, p.233-234.

55. Bourbonnais R., Paice M.G., Reid I.D., Lanthier P., Yaguchi M. Lignin Oxidation by Laccase Isozymes from Trametes versicolor and role of the mediator ABTC in Kraft Lignin Depolymerization // Appl. Environ. Microbiol., 1995, vol.61, N 5, p.1876-1880.

56. Broughton L.C., Gross K.L. Patterns of diversity in plant and soil microbial communities along a productivity gradient in a Michigan old-field // Oecologia, 2000, vol. 125, Issue 3, p. 420-427.

57. Buchan A., Collier L.S., Neidle E.L., Moran M.A. Key Aromatic-Ring-Cleaving Enzyme, Protocatechuate 3,4-Dioxygenase, in the Ecologically Important Marine Roseobacter Lineage // Appl. Environ.Microbiol., 2000, vol.66, N 11, p.4662-4672.

58. Buckley D.H., Schmidt T.M. Structure of microbial Communities in soil and the lasting impact of cultivation // Microb. Ecol., 2001,42, vol.1, p. 11-21.

59. Chen C., Chang H. Biosynthesis and biodégradation of wood components // Ed. Higuchi T. Orlando: Academic Press Inc., 1985, 535 p.

60. Collins P.C., MJ.Cotterman, J.A. Field, A.D.Dobson. Oxidation of Antracene and Benzo(a)pyrene by Laccases from Trametes versicolorII Appl. Environ. Microbiol., 1996, vol.62, N 12, p.4563-4567.

61. Collins P.J., O'Brien M.M., Dobson A.D.W. Cloning and Characterization of a cDNA Encoding a Novel Extracellular Peroxidase from Trametes versicolor II Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol.65, N 3, p. 1343-1347.

62. Dagley S. Microbial metabolism of xenobiotic compounds. In: Comprehensive Biothecnology. M. Moo-Young (ed.); 1985, vol.1; Pergamon Press, Oxford, UK. p. 483-505.

63. Daniel G., Vole J., Kubatova E. Pyranose Oxidase, a major source of H202 during wood degradation by Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, and Oundemansiella mucida // Appl. Environ. Microbiol., 1994, vol.60, N 7, p.2524-2532.

64. Dey S., Maiti T.K., Bhattachacharyya B.C. Lignin peroxidase production by a brown-rot fungus Polyporous ostriformes II J. Ferment. Bioeng., 1991, vol.72, p.402-404.

65. Diaz-Ravina M., Baath E., Frostegard A. Multiple Heavy Metal Tolerance of Soil Bacterial Communities and Its Measurement by a Thymidine Incorporation Technique // Appl. Environ. Microbiol., 1994, vol.60, N 7, p.2238-2247.

66. D'Souza T.M., Merritt C.S., Reddy C.A. // Lignin-Modifying Enzymes of the White Rot Basidiomycete Ganoderma lucidum // Appl. Environ. Microbiol., 1999, Vol. 65, No. 12, p. 5307-5313.

67. Dunbar J., Takala S., Barns S.M., Davis J.A., Kuske C.R. Levels of Bacterial Community Diversity in Four Arid Soils Compared by Cultivation and 16S rRNA Gene Cloning // Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol.65, N 4, p. 1662-1669.

68. Edwards S.L., Raag R., Wariishi H., Gold M.H., Poulos T.L. Crystal Structure of Lignin Peroxidase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, p.750-754.

69. Eggert C., Temp U., Eriksson K.I. The Ligninolytic System of the White-Rot Fuhgus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and Characterization of the Laccase // Appl. Environ. Microbiol., 1996, vol.62, N 4, p.l 151-1158.

70. Eggert C., Temp U., Eriksson K.L. Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Picnoporus cinnabarinus II FEBS Letters, 1997, vol.407, p.89-92.

71. Greene E.A., Kay J.G., Jaber K., Stehnmeier L.G., Voordouw G. Composition of Soil Microbial Communities Enriched on a Mixture of Aromatic Hydrocarbons // Appl.Environ. Microbiol., 2000, vol.66, N 12, p. 5282-5289.

72. Guillen F., Munoz K., Gomez-Toribio V., Martinez A.T., Martinez M.J. Oxygen activation during Oxidation of Methoxyhydroquinones by Laccase from Pleurotus eringii II Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol.66, N 1, p.170-175.

73. Gonsalves A.R., Costa S.M., Esposito E. Evaluation of Panus tigrinus strains in the delignification of sugarcane bagasse prior to krafi pulping // 24th Simposium on Biothechnology for Fuel and Chemicals, 2002, Gatlinburg, USA.

74. Haack S.K., Garcho H., Klug M.J., Forney L.J. Analysis of factors affecting the Accuracy, reproducibility and interpretation of microbial community carbon source utilization patterns // Appl. Environ. Microbiol., 1995, vol.61, No.4, p. 1458-1468.

75. Hammer E., Krowas D.,Schafer A.,Specht M., Francke W., Schauer F. Isolation and Characterization of Dibenzofuran-Degrading Yeast: Identification of Oxidation and Ring Cleavage Products // Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol.64, N 6, p.2215-2219.

76. Hanson J.R., Macalady J.R., Harris D., Scow K.V. Linking toluene Degradation with Specific Microbial Population in Soil // Appl. Environ. Microbial., 1999, vol.65, N 12, p.5403-5408.

77. Heinzkill M., Bech L., Halkier T., Schneider I., Anke T. Characterization of Laccases and Peroxidases from Wood-Rotting Fungi // Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol.64, N 5, p.1601-1606.

78. Helm R.F., Zheintian L., Ranatunga T., Jervis J., Elder T. Towards understanding monomeric ellagitannin biosyntesis // In: Plant Polyphenols 2: Chemistry and Biology (G. Gross, Hemingway R.W. and Yoshida T., Eds)1999, p.83-89.

79. Homolka L., Nerud F.,Kofronova O., Novotna E., Machurova V. Degradation of wood by the basidiomycete Coriolopsis occidentalis II Folia Microbiologica, 1994, vol.39, N 1, p.37-43.

80. Johannes C., Majcherczyk F. Natural Mediators in the Oxidation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Laccase Mediator Systems // Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol.66, N 2, p.524-528.

81. Jordan M., Sanchez M.A., Padilla L., Cespedes R., Osses M., Gonzalez B. Kraft Mill Residues Effects on Monterey Pine Growth and Soil Microbial Community // Journal of Environmental Quality, 2002, vol.31, p. 10041009.

82. Kanaly R.A., Harayama S. Biodégradation of High-Molecular-Weight Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Bacteria // Journal of Bacteriology,2000, vol.182, N 8, p.2059-2067.

83. Kawai S., Shoji S., Nabeta K., Okygama H., Higuchi T. Degradation of non-phenolic p-O-4 lignin substructure model compounds by lignin peroxidase of Coriolus versicolor H Mokuzai Gakkaishi, 1990, vol.36, p.126-132.

84. Konopka A., Zakharova T., BischofF M., Oliver L., Nakatsu C., Turco R.F. Microbial Biomass and Activity in Lead-Contaminated Soil // Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol.65, N 5, p.2256-2259.

85. Kuan I., Johnson K.A., Tien M. Kinetic Analysis of Manganese Peroxidase // The Journal of Biological Chemistry, 1993, vol.268, N 27, p.20064-20070.

86. Kurek B., Kersten P.J. Physiological regulation of glyoxal oxidase from Phanerochaete chrysosporium by peroxydase systems // Enzyme and Microbial Technology, 1995, vol.17, p. 751-756.

87. Langworthy D.E., Stapleton R.D., Sayler G.S., Findlay R.R Genotypic and Phenotypic Responses of a Riverine Microbial Community to Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Contamination // Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol.64, N 9, p.3422-3428.

88. Leontievsky A, Myasoedova N.M., Baskunov B.P., Pozdnyakova N.N., Vares T., Kalkkinen N., Hattakka A.I., Golovleva L.A. Reaction of blue and yellow fungal laccases with lignin model compounds // Biochemistry, 1999, vol. 64, N 10, p. 32-36.

89. Li K., Xu F., Eriksson K.L. Comparison of Fungal Laccases and Redox Mediators in Oxidation of a Nonphenolic Lignin Compounds // Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol.65, N 6, p.2654-2660.

90. Likon M., Perdih A. Fractionation of Spruce Trichloroacetic Lignin // Acta Chim. Slov., 1999, V. 46, N 1, p.87-97.

91. Lin C.L., Rohatgi N.K., De More W.B. Ultraviolet absorption Cross Section of Hydrogen Peroxide // Geophys. Res. Lett., 1978, vol. 5, p.l 13115.

92. Lobos S., Larrain J., Salas L., Cullen D., Vicuna R. Isoenzymes of manganese-dependent peroxidase and laccase produced by the lignin-degrading basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora II Microbiology, 1994, vol.140, p.2691-2698

93. Locher H.H. Bacterial degradation of p-toluene sulfonate and related sulfonic acids: characterization of degradative pathways and enzymes. 1991, Ph.D.Thesis N 9434; Swiss Federal Institute of Technology, Zurich, Switzerland.

94. Mandels M., Weber J. The production of cellulases // Adv. Chem. Series, 1969, vol. 95, p.391-414.

95. Martinez A.T. Molecular biology and structure-function of lignin-degrading heme-peroxidases // Enzyme and Microbial Technology, 2002, v.30, p.425-444.

96. Mester T., Field J.A. Characterization of a Novel Manganese Peroxidase-Lignin Peroxidase Hybrid Isozyme Produced by Bjerkandera Species Strain BOS55 in Absence of Manganese // The Journal of Biological Chemistry, 1998, vol.273, N 25, p.15412-15417.

97. Noble P.A., Almeida J.S., Lovell C.R. Application of Neural Computing Methods for Interpreting Phospholipid Fatty Acid Profiles of Natural Microbial Communities // Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol.66, N 2, p.694-699.

98. Novotna E. Extracellular lignin-modifying enzymes produced by Pleurotus ostreatus II In: Abstracts of 7th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology, 1994, Prague, p. 419.

99. Ohtonen R., Fritze H., Pennanen T., Jumpponen A., Trappe A. Ecosystem properties and microbial community changes in primary succession on a glacier forefront // Oecologia, 1999, Vol.119, Issue 2, p.239-246.

100. Ollikka P., Harjunpaa T., Palmu K., Mantsala P., Suominen I. Oxidation of Crocein Orange C by lignin peroxidase isoenzymes. Kinetics and effect of H202 // Appl. Biochem. Biotechnol, 1998, vol.75, N 2-3, p.307-321.

101. Pennanen T., Fritze H., Valhala P.,Kiikkila O., Neuvonen S., Baath E. Sructure of a Microbial Community in Soil after Prolonged Addition of Low Levels of Simulated Acid Rain // Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol.64, N6, p.2173-2180.

102. Perez J., Jeffries T.W. Roles of manganese and organic acid chelators in regulating lignin degradation and biosynthesis of peroxidases by Phanerochaete chrysosporium II Appl. Environ. Microbiol., 1992, vol.58, N 8, p.2402-2409.

103. Piontek K., Smith A.T., Blodig W. Lignin peroxidase structure and function // Biochemical Society Transaction, 2001, vol.29, p.l 11-116.

104. Reddy C.A., D'Souza T.M. Physiology and Molecular Biology of the Lignin Peroxidases of Phanerochaete chrysosporium II FEMS Microbiology Reviews, 1994, vol.13, p.137-152.

105. Ritchie N.J., Schutter M.E., Dick R.P., Myrold D.D. Use of Length Heterogeneity PCR and Fatty Acid Methyl Ester Profiles To Characterize Microbial Communities in Soil // Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol.66, N4, p. 1668-1675.

106. Ruiz-Dienaz F.J., Camarero S., Perez-Boada M., Martinez M.J., Martinez A.T. A new versatile peroxidase from Pleurotus II Biochemical Society Transaction, 2001, vol.29, p.l 16.

107. Ruiz-Duenas F.J., Martinez M.J., Martinez A.T. Molecular characterization of a novel peroxidase isolated from the ligninolytic fungus Pleurotus eringii II Mol. Microbiol., 1999, vol.31, p.223-235.

108. Sayadi S., Ellouz R. Roles of Lignin Peroxidase and Manganese Peroxidase from Phanerochaete chrysosporium in the Decolorization of Olive Mill Wastewaters // Appl. Environ. Microbiol., 1995, vol.61, N 3, p. 1098-2003.

109. Schlosser D., Hofer C. Laccase-Catalyzed Oxidation of Mn2+ in the presence of Natural Mn3+ Chelators as a Novel Source of Extracellular H2O2 Production and Its Impact on Manganese Peroxidase // Appl. Environ. Microbiol., 2002, vol.68, N 7, p.3514-3521.

110. Schultz A., Jonas U., Hammer E.,Schauer F. Dehalohenation of Chlorinated Hydroxybiphenyls by Fungal Laccase // Appl. Environ. Microbiol., 2001, vol.67, N 9, p.4377-4381.

111. Wariishi H., Dunford H.B., MacDonald I.D., Gold M.H. Manganese peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Transient state kinetics and reaction mechanism // J. Biol. Chem., 1989, vol.264, p.3335-3340.

112. Wariishi H., Valli R., GoldM.H Manganese (II) Oxidation by Manganese Peroxidase from the Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium II J. Biol. Chem., 1992, vol.267, N 33, p.23688-23695.

113. Yao H., He Z., Wilson M.J., Campbell C.D. Microbial Biomass and Community Structure in a Sequence of Soils with Increasing Fertility and Changing Land Use // Microbial Ecology, 2000, vol.40, p.223-237.

114. Yee D.C., Wood T.K. 2,4-Dichlorophenol Degradation using Streptomyces viridosporus T7A Lignin Peroxidase // Biotechnol. Prog., 1997, vol.13, p.53-59.8 10 мкмF