Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эстеразы Aspergillus carbonarius и Aspergillus varians

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эстеразы Aspergillus carbonarius и Aspergillus varians"

АКАДЕМИЯ НШ БЕЛАРУСИ

институт ткровтош

На правах рукописи УДК 677:151 +■ 577.162.311

ЗЛХАРЕНКО Ирина Школаевна

ЗСИЗРАСи А^ся<311л.из слппон/ляиз и аерее<згьип> у/ыакз Спэцкальноиь - 03.00.07 - микробиология

лзгоРЕоирдт

диссартащ'л щ соисшшо учешЯ степени кандздага Одахогу-гасгак наук.,

!.!;гяск -. Г953

Работа выполнена в лаборатории ферментов Института шкрооаслолга (Ль Беларуси

Дэучныо ругсоаэдатели: ,- академик АН Беларуси,

профессор А.Г.Лобадок;

' кааддаг биологических наук, водудкй научный сотрудник " Р.В.НюсаЯлова

Официальна оппонента: . члон-гарросиондоиг АН Беларуси, ■'профессор В.И.?еаюишкэв;

^доктор бкологпчосгаас наук В„Р,Ба"5Ецкая •'.--

Ведущая оргашзадая: 11аучно|Есодвловатольскиа и

т»роектво - конструкхораяй меДЕКо-Оаологичосккй гас- , ' титут ' .' ,

Запита . состоится л5*»' ¿¿ш/ип^и 1993 г. в У-3 часов но заседании Спецаелазмро&агоого совете ( К Q06.09.0i } но приеуадвшю. учоаоЗ степени кшаждата сиологичесяк паук в Инапкуто «.троби^гшЖ Беларуси: 220000, г.Минск, Ячадэмгородок, ул. Еадлнская, 2. ■

С дассери-дай ькшо ознавошться в бкблиотзке Ико?.иту-.а микробиологии АН Беларуси.' \

Автореферат разослан. '25я1953 года.

Ученый секретарь . . Специализированного совета, , . ■ ' . ,

Кандидат биологических наук У-'лс: Н, В.Образцова

общая характеристика работу

Актуальность проблема. Эстеразц - это фор,глот класса гидролаз,

квталкЕкрущиэ гидролиз слокноэфяршх связей, реакции этерификации и пэра этерификации. Наибольший интерес представляют эстеразы, расцэп-лявциб ьфяри карбонових кислот, среда которцх различают споцифпвс-кие (зкшиэстеразк и ацетштишнэстеразц), гядролизуюцив хсшшовыэ и неспецифэтэскиэ (карбоксилэстеразн, ацетшэсгарзг.ч, врилэс-теразн),для которых природные субстрата не найдены. Наиболее изучена Ефярояатпческие фермент« животного ггрслс-садешя, в меньшей степей: - рас питательного. Большинство работ посвящено исследования специфических эстэраз. .

«Хорментнке препарата афнролттского действия все более широко используются для деградации мщ «родных субстратов я средах отходов, в технологических процессах щщовоЯ и химической прошзленкос-тя, для лечебных и диагаосгнческих целей. Однако, промышленное полу-чо:ш9 еивотных эстэраз ограштвггтся сирьевой б^зой ( эритроциту человека, сыворотка крови лошади, печень теленка, электрические органы морских яивотшх и т.п.) и высокой себестоимостью.

На началкшх этапах исследования эстераз, продуцируемых микроорганизмами, их образование рассматривалось, главам образом, как 'дополнительные тансоноотчэсккй признак. Расширение исследований мик-робних встераз обусловлено лорспвкткваш практического использования эфяролатичесипс. ферментов и необходимость» поиска солее акоаомячных источников их получения. ЭстеразыЧпкрооргашзмов малоизучены, поэтому иссладовашш процессов их биосинтеза, ©шко-хшических. свойств и чдаз&алогкоддаэй роли в клеточном -метаболшэ предотавляе--ся актуалышм и дарспактавшм направлением ъ кикросиздогаи, связаи-с репехтем-Тэлрэпяэсия.!! практтгаеаспс задач. '

Цель и задачи иссдадовашя. Цоль 'ностояйай работа - поиск висо-

■коакташнх продуцентов- эфирогатачаспп 'фэргзглов" среда шщ&ли'алыых грибов, исследование закономерностей биосинтеза остераз а их фияико-яжачвсиях свойств.

Исходя из цр.ш исследования били таставвеш едедувдш задачи:

- изучение образования езспИяЯяч^скюс в сшщфиескнх эстераз грпбасг различит; родов к отбор '^«мглахтазад продуцзцтоз;

- исслодоЕшпга влияния источников пжшия и условий культивирования ПЗ ИеКОШЯШз ЕЕеКВОТОЧКД ОСТбрЗЗ Л.саг-ЪсгшМиа И А.гаг1(лпо;

- изучение закояслэртоогоА бпоспитеза грибгшз внеклеточных ас-

тераз и механизмов его регуляции;

- исследование свойств неспецифичэской и специфической зстзраз

A. oarbonariua;

- исследование свойств неспехйЕической эстеразы a. variana.

Научная новизна. Впервые показало, что способность продуцировать э$иролитнческие ферменты широко распространена срэда квделизль-1шх грибов различных родов. Образование эстераз является характерной особенностью грибов рода Аарогвтпо. Специфические йстеразы грибного происхождения обнаружены впервые.

У кицелиальши грибов A. carbonarios И A. vari ела УСТЗПОБЛЭНО разобщение во времени максимальных скоростей роста и синтеза эстераз. Показано, что ефиролитические ферменты продуцируются грибами в постокспонеьциально.": фазе развития, Уомант достижения иаксималшой скорости образовашш нзспецифшоской эстеразы А.оагЪопаг1ш1 значительно опережает таковой для специфзчоской, . ' •

Установлен шшдаровашый характер образования неспецифической ' естеразк a. rnri№s. Показано. репрессирующее действие глюкозы на синтез фермента, проявляамоэ йа уроЕаэ транскрипции. Внесение экзогенного ц-3* ,5'- А!.® дерепроссирует синтез асторази.

Ка основе субитратио-кнгибвтсрвдго анализа установлено, что А.оягьопаПиа продуцирует ацетилэстеразу (КФ 3.I.I.6.), наиболее эф$ективио гидрольукаую sfcrpj уксусной кислоты и ае чувствительную к органофосфатам и карбачатам, а.тают ацотшшнэстеразу ( КФ 3.1 Л.7> с шзкой чувствительностью к холинзстеразнйм ингибиторам.. Носпеифтсляя эстераза A.variaas гаассафящрованз кт карбокашс-тераза (КФ 3.1 ЛЛ.), коталЕзнруюаая пцфолаа ароматически!. э4мров короткоцепочечию, зкирпых кислот и высокочувствительная к действии ор.'Яша, ГД-42, фосфакола, хлорофоса. . ,, .

В оглтао от шюгзишх в литературе оффолатичесша фэрмзнтов,' эстеразы A.o.v$-fconarius проявляет максимальную каталитическую актив-кость в зода рН 10,0 - 11,0, -что свидетельствует об их уникальности.'

Установлено иалетюа ;дю~9Ствотых молекулярных форм наспеидфи-ческшс эстераз л.олтымЕтХия в A.yerUms, сдактр которых зазискт от способа культивирования продуцентов.

Практическое значаще работы. Вперьне отобраш продуцента неспецифических н специфических естераз - AspereUiui oarbouarius ,? i, A.nleor, A.nlgei 1T4, A.nleor 175, rttSetrium Beialteotum, ííortieralla вр. 415b.

Огселектировшш и охарактеризованы высокоактивные штаммы - а.

oarbónarlus Б11М-30 И A.voricci3 БИМ-10.

. Оптимизированы условия и разработан состав штатальшх сред для глубинного И твердофазного КуЛЬТИВИрОВаНИЯ A. curbonarius II A.vari-ana. ПОЛУЧЭЗШ эсторззшэ препарата ГО ОХ Л ПСХ A.carbonsrius, оодер-жгацио ацетилэегеразу и оцетилхолинэстераЕу. препараты ПЮХ и ИОХ A.vro-iens содерхнцие карбоксилэстеразу. .

Показана возможность использования нвст.у.флческнх эстераз A.carbonai-iug К A.vaz-lmis ДЛЯ Д0ГраД8ЦИИ арОМаТИЧвСКИХ ЭфирОВ КороТ-коцйпочечшх ¡киршх кислот. Карбсксилэотвразн мокет применяться для тдиксщга мшфоксличэстг фосфорорганлческих соединений, ацетклхолин-йстераза - для определения содеркагая ацетилхолина в биологических кидаостях.

Публикация материалов. Но твнв диссертационной работа опубликована I статья, 3 приняты к печати.

Структура и объем т»аботы. Диссертационная работа состоит из

вводопия, эбсора литературу, энамримопгалыгей части, ЕкпачаздоЯ 5 глав, ос1'огз!н:к результатов и синодов, списка литературы. Работа изложена w 134 етрашщаг машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 21 таблицей. Список литературы ссдертаг 172 наиманования, в 7оч число 100 - на иностранном языке.

ЭХ(ЯШРК.1Еа?АЛЬКАЯ МАСТЬ Объекта.я иэтода исследования

Скринингу продуцентов эфпролитпчесхих ферментов осуществляли среде МИЦеЛИО-КЬЯШС грябоэ родов Aorenoniun, AJ, ternaria, Aspftrgillus,

Mae ver la, Ch-aotoKiurr,, üithonicph tora, Füsarí'rn, 03 locladium. liortie-• relln, i-yrotheai'um, Оозрога, РаесИсттогаез. Penialllium, Pliorna, Khl-zopiís. " Ccopularicpaia; Stechybotjys, rri.chxjoladiuni. Trtchoderma, получении из различных музэеп и вндплеашх та нриродшх ИСТОЧНИКОВ. ЙДЗНТПфПКаЦИМ грибов проводил!! ПО опрвдэжтелш G liman (1945), СТвдопличко (1977).

При перзичном отбора продуцентов специфических. эстяраз культури , сцравдшали на эгарэ '".апока .(Метода иссшрим. микология, 1973) с 0,Б& кукурузного экстракта ti 0,5 % холкасодераадаго источзглса углэрода. .Шш-пейпяй отбор культур гговодзия при таердсфззпом культивировании п течение 120 ч при 28° ила 32° па сроде. содврзасой (% по весу): шэ>щчпые отруби (ПО) - 4В,5; дистиллированную Н20 - 46,5; сасг2 -т, г, последувдей водной'акстраогаей. В экстрактах определяли зфиро-

логическую зкппнасть.

Основными объектами исследований. являлись итселектированные в Институте микробиологии AHS штамма л. corbonajri.ua ЕИЫ-30 и д. vari-юа БШ-ХО.

Кулътавировсние продуцентов проводили твердофазным п глубинным способами. При глубинном культивировании в качеств g основной исполь-оовали среду Чашка (рк В,5) с 3% ПО или. их -:п/н водны;,! екстрак-том. Культавировшше осущоствляж на кечаисе (180 об/шн) в колбах Эрленшйера объемом 250 мл с ЬО мл срода при 28 или. 32° в течете 96 ч. Биомассу отделяли фильтрованием, промывали..дистиллированной водой, васушивали до 'постоянного, веса-lipa 105° «'учитывал:: васовш методом. В культуральиой .жидкости.определяла астераэну» активность.

удольиую скорость роста грабов (t>) к удельную скорость синтеза ферментов (*) вычисляли' по.фряулам: чщ ах dt~,«~,ii «*.<ш' dt"1«"'. где х - биомасса ( шУш .)» <iz- прирост биомассы ( [.т/м ), &в- прирост активности (ед/ад) ад црокэЕУТон врзгаш at (тыиг.ютз).

Эфиролитвчэску» астегность шспсщгХичэсгак астераз. определяли спехтр«фотс><етрцчос{9Ш -'мбтодрм .'(00-46) -по скорости 'гидролиза субстрата при длш> полны, соотштетйувдой максимуму поглощения продукта его расцепления. Для. отого .начисляли сродкй прирост■ оптической рлотяостя за I ьшпри слоншшои СаДс) . sr С5ор«нтатшюм (дДЬ) пиролизе субстрата.. В ¡сачсстсо" субстратов .ксшльзовзли ароматические афирц карсЗоношх кислот.-различней кодокулярпой. структуры, растворок-шо в ацетоне. литивксса рассчаписш!по £ордуло: SA = ¿Дс) К^О"1, где К' - кос@зщй61|т, ' учптиваидаз оггпкоскув плотность раствора, сэдеряаадго- .продд» шдрлпра субстрата в 'коццэглрацш! I Ш/ ил; 0 - рабочая ЕрЕ^нтрац:ш:фор!г?итного раствора.

Активность стпфчаских остераз .определял! спадотно, используя в качества субстратов холшюе^о Цара кзрбеновзд. кислот. За еди-нйцу остеразной активности прянаиадп колгчеотво. фораента, руюздв гидролиз ! кхМ субстрата.,га I iaá прз ' температуре 25° к plí

а.О. V":

Чувствительность scTopas js дзасташ'фзсфероргаяпческкх и карбонами ингибиторов (Ю-1- ÏO"". Ы) оценивали по величине1 i50- концентрации ингибитора, вызивызаой ЕШ-ноэ, стгвзшю активности Сэрчента.

•Влияние температуры па катшшычакаю свойства фе^кэнтов исследовали в диапазоне 20- 60°. Тормостабалыюсть эстораз оценивала по остаточной активности после шдерайвания m раствора в течение 10. 20, 30 и 60 шШ при соответствукцей 'тегяюраэд».

. Влияние концентрации водорадщх конов па фзркзптативнуо. актив-

ность проверяли в диапазона рН 7,0 - 12,0, создаваемого с помощью 0,04 М универсального буфера (Лурье,1967). О р!Г.-стабилыгости эстераз судили по остаточной активности после выдерживания ферментного раствора в течение 1ч при соответствующем рН.

Ксшпество белка в пробах определяя! по методу хотоу еь а1. (1951). Ступенчатый электрофорез в 7,5 X пожакршшмдном геле проводили в вертикальных пластиках по методу Орнстейнз и Дзвиса (Остер,ган, 1931).

Окраииваниэ гел&й после, электрофореза с целью выявления зон кесгоцифгеосгасс зстераз проводит при 37° в течение I ч в реакционной смеси, г.одорзааэй: «-нафтоловый эфир - 2 1жМ; прочный синий гр-солъ - 50 от; 0,05 и фосфатный буфор, рН 7,0- 100 мл. Активные зоил о;фыатааятсь в черпий цвет.

Снраяивэяпе голой с целъв' выявления зон специфических эстераз ' проводили при 37° в тачэииг. I ч в О,Г 'Л фосфатном буфере ( рН 7,0 ), содержащем 0,5 мл 0,1 М лй.тапиокпслого На, I ил 0,03 М сернокислой меди, I мл 0,005 !.! калия келезослнародистого, 2 мкМ тиохолпювого эфзра в общем объеме 10 мл. Активные зош проявлялись как полоса молочного цвета. '■ - .•■..'

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССУЭДОБШЯ И Ж ОБСУВДЕШЕ . Отбор продуцентов афиролдтячэскд фэшэптов и их характеристика

Прсвэдзшмй'С1ф«ш1пг показал (р'до.1), что из £50 кселедозаппых зтемтюз (дцэуЬшыых грэбов 375 ве образуют свспзцвфаческве остера-зн, 73 продуцирую? слёдозие калкзсгаа, у. Е0£ активность составляет о ,05 - 0,9 ед/мл ж только'.6% являвтсгг ектевншз продуцентами. Наиболее льяерасным представляется род

Установлено, что чащзлиалкшэ -'грабы 'розличтас' родов обладает способность*) ассимилировать холтсодэрхдав пстбчгопа углерода, но только 14 итшаш продуцпртот отецифгсескзв. эстэрззы при твердофазном кулыдвировашш на среде с НО. -

Выявлена . ■оцсокоакшет/е продуценты га специфических я специфа-ЛЭСКИХ эстераз - Л.согЬопйГ^из ?.1 . А.а 1езг*. А.Шеэг Г'Д, А.пЛеег 1Т5, А.-чагЮ-па 232. Тизы1иа еапМмздм, КогЪ1«га11а зр. 415Ъ.

Прп проведении окрянига продуцентов учитывалась чувствительность сштезцруаьшх граяла эст&раз к фосфорорганлческнм соединениям. Установлено, что яеспецифаческая эстерзза А.тог1апо 232 ингиби-руется ГЛ-42 (2Х10-4 М) к арминсы (БхГО-6 Ы).

Рис Л. Диаграмма распределения исследованных мицелиальных грибов ио способпоста продуцировать яэспецйфические эстеразы: I-ЗЛ отсутствует; 2- ЭА шяее 0,05 ед/мл; З-'ЗД от 0,05 до 0,9 од/мл; 4- ЭА 1,0 ед/мл и выве.

: - э ~

Для дальнейших исследогеннй отобраш два мшелиальннх гриба: д. оагъопаг!шч г 1 - наиболее активный продуцент шспецифической и спо-цафаческоЯ астераз; А.маПвпв гзг - шсокоактивтай продуцент нзспо-да$пес1Юй еотерази, проявляющей пошвеннув чувствительаоо'.ь; к ФОС.

Путем направленного отбора спснтащгди мутантов на селективных

СЕЮДЗХ ИЗ КОЛЛеКЦИОНЕиХ культур А.саги?паг1иэ ВКМ Р-21 И А.таг1шгЗ 323 (Укр'ШИПЛ) получены ноше ЩтаИМа л.оагЬипёг^иа ЕШ-30 и А.таг!-та БКМ-10, осповлым стллчлтолышм свойством которых является более высокий ( в 1,4 а 2,0 раза ) уровень синтеза эффодитаческих ферментов.

Биосинтез внеклеточных эстераз грибатги '

Авретт;111из оагЬопаг1из Я АзрагдЩид уаг!апз

Апалияируя способность ¿.«игЪогадчиз проецировать внеклетотнуа пестааифэтескуп зстерэзу ггрз ассютляции углеродсодерзаглх соадино-пий, из 26-ти испытанных источников углерода «озао выделить ПО, акс-тркст ПО « тм'Л 80. Синтез специфической встерази л.сагъопапиз наблюдается только на средах с ПО, экс грантам ПО пАИМ.

, Максимальное накоплений неспеда1яческоа эстерози А.уаг1апз в культуральной еидкости' набладоэтсл па средах с ПО,, экстрактом ПО и шаюм ,40. ■■

Внеклеточные зстерази исследуема грибов синтезируются на сре-'дах со все® исттантгмд. источниками азота.. Ояткмадышш источни-кгда азотного' питвиш для -чгкоплэнкя несдацзфгшских вкэозстераз

-Д.а№Ьспаг1г^> П А.гагАепз ЯВЛЯЮТСЯ "СОЛИ . ЙШСНКЯ, ОСОбеШЮ Ш4С1. В

то ер время г>амвна в среде шивргугьного источника азота органическим выаиввву'шившй- оангоэа. г 3-5 раз. Дязлогкчшз рваулмам получеш для стл^офоВ-эстерет '^.ввгъсавв^ио;'; •

Синтез ¡^щкх/пттащ фзргАмтоз в знаадтольноЗ сгзпзтг зависит от способа кудьтавяропаяия продуцента.: В условиях твердофазного ш-рвдвения, у л.еагъоиаглиэ НЕиошсшю шэдфкоскоа эсторази в 40 рад, шсавцкфявсазЛ' яоир.^-'а','», |Мйа,'-.'в-'у '¿¿»»«а» 'в 25 раз

та срагаэш® с глубгавтау.;Тат1:;образой,- ^'.пакодаюния зстераз :; гфовявзтш' втааал ■ твзрдофззнрё: .едлвясроааш! звя'штодьао''э®&з -/¡¡геиЕпео глу(багаого.; ■'■'■■[■'г" '"■• ,',;•.

' ;.гго?аш!»яо, что спя ¿адыюэ; зкаадгаэ! шидаюгй. рН для сшгсзза гегбрзз А'.ошАопагХив''•{ I.' \еЯ-1агЫ -ССВД2й2Яа* 4;Ь -7,0 И 5,5, /сЫя-!.ГйТС'/вз'ПНО. Сеная т<хтя'^щтрлоря. способность' а. СйгЪ<таг1из гдазуеется при фдоийфааснаи.¿да 32°, л,;*ёг1щш V ера 28°. .

По литературным данным неяоногешше, поверхностно-активные вещества могут стимулировать синтез , внеклеточных ферментов благодаря наличии в их молекулах. эфирных функциональных групп или влиянию на проницаемость клеточной мембраны..Установлено, что образование эстераз A.oarbonarius и a.varions такие возрастает при введении. ПАВ я среду для. твердофазного и глубинного культивирования. Так, твин 4P увеличивает выход неспецифаческой эстеразы л..variais при глубинном культивировании на 75S, при твердофазном - - на 250 %. Б отношении A.oarbonariun наиболее эффективно использованле тритона Х-100. V

Ка оптю.изировшшоа среде рост а . оагъспаг1из начинается на 8-ом ч культивирования. ij^ составляет 0,24 ч-1 и достигается, н 16-ти ч (рис.2,А; З.А). Следовые количества внеклеточных ьфиролитических ферментов можно обнаружить на 12-ом часу роста гриба, однако макси- ' глальное количество шсЦэцуфичбской встеразы р мл. культуральноЯ жвд-кости отаючается черэз .8б .ч, спбЦ1:фачоскоа - через 112 .ч ферментации. Максимальная скорость синтеза Ееспэцрфаческоа зстеразы наблюдается на 24-ом ч, -отэдафпоскоа-- ш 44-оф

В отличие от. а.>>rboTiariu9 y . A..yariœio Оиокасса начинает интенсивно 1шкшишат}>сл несколько позхо (16 ч ), в неспещфиеская эсхе-раза появляется а кудьтуральшй яадасооимолько на 28-ом ч фор-энта-щш С ри^.2,В; ); Q.2Z ч"1 6тыэчае1'ся к' 24 ч культивирования и

опережает коизнт достИЕ8шгя максимальной скорости синтеза эстеразы более чем на сутки;(piic,3,B)V" : ; \.•• ,'.*. : *. •.* ' Тагам образом, времени.максимальной ско-

рости роста' нррдуцватоо н; кахсдааль1Ш ' скоростей : синтеза ефиролити- : чоских фермоатов , ' образование;котррах цриходится на аостзкспонеици-альнуя фазу : •'.'•••'.*:''..'.' .

В качестве. «ода '-и дяя. цс^эдовашг рагуляторпых механизмов образования грибных эфирметэдз«^ ьшцелиалькый гриб A.varions - ПрбдуЦбНТ 'В0СДОШ№ФСКр& '¿ОГвраЗН. V- - -

При изучении характера сюразоваш эстерагн ' в .оштах с отмытым мицелием. установлено, что аз воех всштзншяс Соединений с эфирной связью только /»-нафадл8Ц0гат обладвэт ьырахешшм индуцкруюоЕм действием. Оптимальная ковдеатрацая .индуктора составляет 2х10-3М. йндуци-рувдий эффект 0-нафтилацвт:атв подтвераайтря'й растущей культуре. .

Сйнтез веспецлфичбсксй гстеразн А.уаПапз подаериен репрессии глюкозой, причем степень репрессии зависит Ьт.кочцентрацга репрес-сора. Глюкоза н^ оказывает влияния на каталитическую активность фермента." : '.' "•'■./.

С целью выяснения уровня проявления репрессии сравнивали дейгт-

-ЗА АХЭА ЗА

Рас.2. Двв&тка роста Â.oaï-bor^rious (i) « а.^влшш (Б) к синтеза внеклеточных естераз: I - рЯ; 2 - биомасса, urAui; 3 - нэспешфгазская зстораза ( ЗА, ед/мл ); 4 - спацвфпескгя эстараза ( АХЭА, зд/ыл ).

0,3 ■

0.2

0,1

8

I

:Й I

0' 16 32 43 64 час

О 16 32 48 64 час

Рис.3. Кинетика роста А.евгЪог1&г1.из (А) и А.^аг-злуьа (Б) и синтеза внеклеточных &стераз: I - удельная скорость роста (к), час-1; 2 - удельная, скорость синтеза Еэспецифическоя зстеразы (*•[), ед .мг~^час~^; 3 -удельная скоромь синтеза специфической эстерэзи (¿2), ед.мг'Час-1.'

-га-

ки глюкозы т ингибиторов белкового синтеза (акткясмицина Д и 8-оксишюлина) на образование эстеразы отмытым мицелием в условиях индукции. Установлено ( рис.4 ), что репрессирующий эффект ?пкжозы сходен с действием актиномищша Д. Это позволяет полагать, ''70 ка-тзболктная репрессия реализуется на уровне транскрипции. Внесение экзогенного ц-З'.б'-АЮ дерэпрэссирует синтез нзспецифической эсте-рпзи а.«плела (рИО.5).

Свс.йстза эстераз АЕрагя111иэ сагЬог»\г1ив

Спкртосаадэшда препараты 11101 и ГЮХ А.сагъопаг1ия получены, соответственно, после твердофазного и гдуйашого культивирования продуцента и содержат шспецифическую к специфическую эстеразы. Для успешного применения препаратов необходимо исследовать их свойства, . вашэйкими из которых являются субстратная и кнгибиторная специфичность.

Скорость ферментативного гидролиза субстратов препаратом ПЮХ а. сагьогапиа значительно сшгается ло мере удлинения цепи их кислотной составляющей { хьбл.1 ). Эта наглядно продемонстрировано в ряду пара-нитрофекиових и кчдофегаловых эфаров карбоновых кислот для нвепэщтфической и холиаогагс- эфиров для специфической ■ эстеразк препарата. Катагатичэская активность коснтаифачвскоЯ зстеразн па отнешешю к эфира*, имйшм развэядаЕия в кислотаой или стартовой части молекулы ( п-шггрофешлтридатлацетгт и п-китро-м-карОоксифо--гомацэтат ), угашается в 17 раз по сравнению со скоростью гидролиза нерьзве'голенного п-нктрофешлсцэ'$8та. Зфяри с положительно заряженной группой гидролизу»тса в 4 разе быстрее аналогов, не содержащих: . таковой. Лучшим из проверенных субстратов для несдацифической эстераз« препарата ЩСХ д.гагъогшгюэ являются 2-матил-4-азо( 2'- м-мвтпл-теазолилперхлорат )- ацетсибанзол, 2 -мет:и-4-азо( 2'-тиазо-лш1)-аттсксибеньол к ЙВА, для стоцафкеской эстерэзи - АТХИ. Субстратная спощфгптость эстбраз препарата ГЮХ д.оагьопагюз аналогична. . ,

йкгибитерный анализ астзраз, содержащихся в препаратах П10Х и ГЮХ, показал, что кеспйщфкеская эстераза а. оагьопаг±иа не чувствительна к действию органтфосфатои и карбачатов,' а специфическая естераза. е отлитое о? югвотных и растительных ферментов, пщролиау-

ща/. хслиноЕие яфиры, характеризуется слабой чувствительностью к ГД-42 (150= 1 а' о"3), аршту (1^*5*1 о"г >. проэерину (1й0=5п о"1).

Показано, что достаточно васоюга концентрации ацэтнлтиохолша

Рис,4. Влияние глюкозы и ингибиторов белкового синтеза на синтез ^гпрцгЛической встеразц А.таг1апэ: I- ^-нафталацетат; 2-Р 1')&г1у:ацетат I глшоза; 3- ^-нафтилэцетат + актиюмищш Д; 4- (1-нефп"лацетат + 8-оксихинолин; Б- ^-нафтилацетат + глюкоза ;!:<тдаомицин Д.

ЭА,ед/мл

Рас.5. Деропрессвл сшгеза пвспецкфгаеской эстарази Á.variana ц-3',5'- /MS: I - р-нофтилацотат; 2 - ^-кафтилацетат + глчкоза; 3 - .^-пафгшэдотат + глшоза + ц -3" ,6'- А!.№.

- Таблица I.

Дейптви.6 эстерао A.carbouaxlv.J И А.Verlans на афиры карбоновых кислот

ФорЧУЛЯ

Кйшгевдвшга субстрата

ЭА, ед/г

Л.. carbonariaa J к. vaj-i'iп

НО.

СИ.

— /.О !JO„-// n>-0-C'

- ' !г/

' си. -

■CCY)H __ _ ,0

V-.' \-• .CH

CH-

| -4

ck,,

/0

lc3K7

о !

CH3 CH„

CH„

п-нитро^вниладатат 270

_ п-нич'рофегошфопионат. .. '84

* .... -

' п-гоягрсгёеиилбутират . 30

п-нитрофеязигер'Ллвтал-. 1в а.чатгт •

п-нжтрэ-м-карбокскфо - 16 нилацэтат •

индофзшиацетат . - 600 вдофэгалбутират . О,

2-мвтил-4-азо( 2*-теа- 746 зсаш;-ацасокоисензол :

2-М0ТиЛ"4-аза(2'-к-мэ- 2950 . тил-тмазолшшерыорат) -ацетоясабемзаа

4)c-a-CHecHg-H ^сн3 х" ацэтилтиохолишс.дид 540

Л * / _

учс-к-сн^сн, и <н„ вг ыр01ш((н1ътт0х0пж-

* й • ЙрОМВД

ir5o

60

-20 10

20

300

90

280

ингибируют каталитическую активность сиещтфачбской ы.тврази д.саг&о-паг1из. Максимальна? активность отмечается при концентрации субстрата 25 х 1СГ3 М.

Получяннне результаты дают, основание полагать, что резистентная к ингибиторам вдсшиифиеская астераза л. оЕп-ьопаг1ив, наиболее легко гидролтаупцая ьфирн уксусной'кислоты, относится к эцетилэстсрз- -зам. Обнаруженная наки специфическая ост&раза А.сагЬоппПиз, вероятно, является эцагютолинэстеразой, отличающейся шзкой чувстЕитоль-рость-о к холинэстеразшм ингибиторам.

Установлено, что эфиролигические фермента препарата ПЮХ к аце-плхолинэстэрчза Г10Х л. сагьопаг!ия максимально активны при температуре 30-40°, температурный оптимум ацетилэстеразу ГЮХ на ш-пп.

рН-оптимум деРсшш зстерзз препарата ШОХ и ацетилэстэразн 'ГОХ составляет 10,0-11,0. Максимальное проявление- каталитической ¡ктивнооти ацетадхолитстеразы ГЮХ наблюдается при рН 8,5.

Для ацетапзстераз обоих препаратов характерна устойчивость к .-егазратуре 46°, сохранение более 75% активности после 60->дшутного фогревания при и 1056 - при; 60°. Ацетилхолиьэсторазк обоих пре-гэратов также не теряют активность при 45°. Однако, в отличие от чцетшшшэстерази ПЮХ, ипахтввирувг ,ейся при тешературе 60° через ;0 №Ш, фермент ГЮХ характеризуется более высокой термоетабпль--юстыо и сохраняет после часот-ого прогревания о:<оло 30£ активности.

Каталитическая активность ацеталэстерзза и ацеталхолигэстеразн 1репарата П1СХ сохраняется практически без' потерь в зоне рН 6,0-8,0 л 6,0-9,0, соответственно. Существенна!« отличием эфяролитических ¡узрментов препарата ГЮХ язлпотсл. повигзшая кислотоустойчивость: ацетилзстераза практически из теряет активности при рН 5,0- в,О, чцетилхолкнэ.-.тергза - при рН 4,0- 6,0. В дгаактсе роста гриба про-лстодит снижение р![ от 5,5 до 2,4, а затем повышение до 7,0, таким образом, аптя зстераз осуществляется в ■ кислой зоне р!Г, чем, воз-моию, и объясняется их.клслотоустойчмвость..

Таким образом, у.-тгновлены некоторые различия в свойстеш ферментных препаратов, шл.'/ченных при различных способах- культивирова- ■ шш гриба. . ' . .

Различия в составе комплексов эфиролитаческих ферментов ь зависимости от способа культивирования.продуцента установлены с использованием электрофореза в . Полиакриламидном геле. . Препарат ГЮХ л.оагъолаг1ггя представлен 7-ю! множественными пекулярными формами неспсчнфичеоккх.' эстчргз,'обозначенными Е.- - Е^ в порядке уменьшения

злектрофорвтичаской подвижности. Активность их наметоо снижается по нерв увеличения длины углеводородной цопи кислотной составляющей используемого в качестве субстрата а-нафтаяоюто эфира. Препарат ГЛОХ характеризуется 6-ю множественными молекулярными фирмами кеспе-цифических эстераз (Е-- Бе), также иаяболзе эффективно пщролизувди-вд я-нафтилацетат. Преимущественный гидролиз эфира уксусной кислоты рсеми множественными молекулярными форыамя неспецгаргческой &стеразы л.оагьопапмв позволяет классифицировать ферменты как ацетилэстера-пн (КФ 3.1.1,6.).

Сравнительный анализ еимограг.а кеспецкфичоских эсгераз двух препаратов а оахЬопммив (табл.2> выягил несомненное сходство в характере расположения эстеразшх полос: фракши Е^, Ед, Е4, Е6 препарата ЩОХ соответствуют фракциям Е3, Е^, Еб, Е^ препарата ГЮХ. Вместе с тон, в препарате твердофазной культуры оСнарукана остераза о ^=0,08, а эстеразы с и продуцируются_

только глубинной культурой. ' £

Я- . ТАБЛИЦА 2.

' Значения , шожзствэикых. молекулярных форм нэстцсфгческих эстераз препаратов ПОХ и П10Х а. сагьопаПиз

Наименование фракции . препарата ГЮХ ■

£2 %

■ Значений

о.уо

О.БГ^

0,42

0,29

0,23

0,17

0,05

Наикенование фргчции препарата ШС;

■*2-

V А

Значишь н.

0,58 0.42 '•'0,30

0,18 0,08 0.05

Данные электрофореза свидетельствуют о том, что спектр продуцируемых А.овхьопат1л»в мнокбствэншх молекулярных фор« внеклеточных неспецифических эстераз зависит от способа культивирования гриба. .

Установлено, что препарат ПЮХ содержит одну специфическую эс-торазу Вт (п^-О.бв), активно гидролизуидую вцетилтиохолин, в меньшей степени - пропионилтиохолин и не расщешшадую бутирилтиохолин. Ка основания субстратной специфичности фрмоат классифицирован как

ацатилхолияэстераза (КФ 3.1.1.7.). Ацэтатхяшэсгерзза со входными свойствам! и значением п{=0,84 обнаружена в препарате ИОХ.

Свойства астераз Лзр«гя111иа varl&na '

Исследование субстратной спеш-фичкости препарата П1ПХ -А'.тапавз показало (Табл.1.), что-.э^фолитпческая'активзосгь неспэцкфаческой естераза сшивается по мере удлинения углеводородной цепи кислотной составляюизй субстрата.' Фермент в дахьшей степени способен гядрсла-.зевать субстрата о разветвлениями е спиртовой и-кислотаой.части молекулы. Большое влияние из каталитическуи активность астеразы иказа-веет наличие в молекуле субстрата катшвной. группы: 2~метп)1-4-азо (2'~ н- штил-тиазол1лперморат)-ацетокск5ензол расцепляется в 3 раза быстрее, чам 2-1!9Тпл-4-азо(2'-тиазол1Я)-ацетоксибензол. Оптимальными субстратам! для несгоцайпескоя остсразы П10Х A.variana являются Ш и 2-метил-4-азо(2'*н-к50,п1лтиазолилпархлорат) -ацотокси-бензол. Аналогична субстратная специфичность*эстеразы препарата ГЮХ. ■

Ингибпторшй анализ показал /табл.4.}, что чувствительность фермента к производным фосфоповой кислоты (армии) вайе, чем к производным фосфорной (фосфакол)..Прокзвсднн9 тиофосфорной кислоты (мета-фос, карбофос) татаз практически не обладают шгибирутим фермент действием. Глолоаый эфар фосфоновой кислоты (ГД-42) в меньшей степени подавляет эстарззнув активность, чэм.кислородный (армии). Из исследованных оргзнофосфатов наиболышй шЕгаСирущий э$фект наблюдается при обработке эстеразы НЮХ Aspergillus variana армином в концентрации 5х10-6М.' v..

Установлено аналогичное действие форфороргашгееских ингибиторов на клталит1пескум, /активность., эстераз A-voarW^ius; независимо от способа культивирования; гриба.; Как показали исследования, прозерин не является; ингибитором эстераз ПЮХ й Г10Х A.tariehs. ; . ■

Основываясь as экспериментальных данных по субстратной и инги-Зиторной с!№i.лфгляостя,; ЭфИроЛИТИЧвСКЯ8 " ферменты . aivarlana могут. 5кть отнесены к кпрбсксилэстераза» (КФ 3.1.1.1.).

; .Температурный ептимум действия.карбокснлэстервзы ШОХ составляет 35°, • оптимальная теитература для проявленля каталитичоской актив-ости карбоксилэотеразы ГГСХ несколько, выше йДй0. Карбоксидзстераса бокс препаратов практически. не ешкаот- каталгтичесую ' активность осле GO-минутЕого' прогрэвак.;:я при.'' I Однако, при" Ь5° фермент ПЮХ

* sa -

сохраняет 75Я. активности, а ПСК только ББЖ. При 60° оба фермента •кнактивирувтсл через 40-50 мин. ' ,

Ыехсимальная ахтивность карбоксилэствразн ШОХ A.varians наблюдайте« при рй ; Э.О, карбоноилзстеразы ИСК - при pH 9;5. Ферменты прэшзрзгов, шл/чашшх как при твердофазном, так и .'при глубинном , Способах культивирования продуцента, стабильны в пределах pH 8,0-но грк pH 6.0 и 10,0 терявт y¡a 'около 402 активности.

V Основываясь на вниекглоквнйом, кошо заключить, что свойство &ффолигичоскик фэркадтов л-variant зависят от способа культивироза-

ТАЕЛШ 3.

Г

^^TfBBTc.ibвасть н§<жац2©неско2 воторазы ШОХ д. varions .

.v-'. í V-;'ч>'••.',соедашшм ..

. Тоюамьное! '; наим&ноаание (600

Щжазатель чувствительности i6q,!<!

• №3o/ 4cH(Girj-aci3 -сн3о/ No-cîi«ccig

wx/0 ♦>»

си/ ^iciipi.-s:

if

• ш,о' s-u-н:

4 ÇtiOC^iJg.

: aptara . . фос^жзА

■■\¿fiaptфос.'

• i ■ \ '" ï

^ ДШЮфОС' . . ГД-43

'.-даувфсо'л-

б К 10"

б к 10'

г4

>-4

5 x 10'

I * Ю-3

2 X 10

Í-4

,-г-

. 6 г. то:

кия продуцента, как это отмечалось ранее для эсторез А.сагьса*пиг.

Установлено различие эстеразншс комплексов А^пиапз, продуцируемых при разлгаш. способах культивирования грйба. 11а зимогрэммэ препарата ИОХ обларукено 5 шокествэнннх молекулярных форм нсопеци-Фачесюи астврзз, обозначешшх - % в порядке уменьшения электро-'форе"пиеской подшшюсти. .Молекулярные Форш отличаются, по активности в отноиешта а-нафталовых эфяров й наиболее эффективно гидрел^ауют а-нафталацотат. Препарат ПТ0Х илвпми представлен 4-мя множзствеи-. иа»и молекулярным формами неспедафгазских эстэрзз. Активность ферментов твкго укеньпается при переходе от эфира уксуспой к офиран пропионовой и масляной кислот. ■

Эстеразкно фргшцш В-, Ед, Ед {ор,житного препарата, подученного прп глубинном выращивают А.тог1впа, идентичны фракциям Ер Бд, Е4 препарата твердофазной культура (габл.4). Препарата близки по характеру распределения эстеразшх полос п отличаются только одной эстеразоп с п^О.ЕО, продуцируемой глубгашой культурой.

..•'■• ; . ■ ТАБЛИЦА 4.

Значения ¡люгтаствегдшх молекулярных форм не оно цифтсз сксс эстероз препаратов Г10Х и П10Х а. -7аг1впп

Наименование фракции ■ препарата ПОХ Вначозиз "г . Наименован®) фракции препарата ПЮХ Значение .

Е1 ■ 0.85 % 0,86

% 0,81 % • 0,81

" % ' ■ ' 0,63 . ' % 0,63

•V 0,50

0,27 V 0,27

Сракциенированта феркентннх бйжов в полиакрмамидном геле показало, что, несмотря ня сходную субстратную специфичность нэспоця-фаческих астераз, эстеразнай комплекс А.уаг1апз соверкенпо отличен ОТ эстэразного КОШШКСа А.сагЪоп4г1иа. ■ ' .

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ « ВЫВОДЫ

I. Установлено, что способность продуцировать внеклеточные эфи-р;ш1тические фэрменты пшрок. 'распространена среда кицелиальных. гри-

'Job различных родов. Образование эстераз является характерной особенностью гркбоз рода АзрвгеШиз. Впервые'отобраны грибные продуценты несгоцифлческих • и специфических астераз - Aspergillus сагъо-

nsriue 21, A.nlper. A .nicer 174. A.ridgar 175, Fusarium semltootum, Kortlarelib' nj). A15t> . ,.

Б результата скрининга выявлен мицелиальный гриб л.variant гзг. ггродударущий ие стгэцифиче скую эотеразу, высокочувствительную к действия СОС. '•/' •■ ..•.'.•'.-'•''

Отселзктирована коше' внсокоактквше штамш Aspergillus сагьо-мапиз БИМ-30 и A.variann, БШ-Ю, охарактеризованы их культурэльно-морфологические и физ'лолого-блохзазносшгв свойства. .

2. Деталью всоодозсш условия образования зстерзз грибами A.farfccaar'ive- -я A.rari^ns. '■Показало*'.' .Что максимальное .накопление эстераз- у ' обоих продуцентов происходит ..при ~ их; культивировашш на •орадэх.с тзничшшй огрубяш или их/экстрактом. .Опталальным"источником азотного ..питания'является !Ш4с... Усаансвлепо кржудаство твор-дофаааох-о способа .культивирования перед глубинным.

" Спшуляторамя. образования вшслеточных .грибных эстераз-служат нвионогвяше ПЛБ: а. сед-ЪопаЛиз -наиболее - эффективен, тритон X-

100, ДЛп Алг»г-1.шяз - ТБЩ1.40..

Оптишзкроьанн гятагелышз. орзды для глубинного, и твердофазного выр&дизэяда тще^иалыах грибовпродуцентов вно. гаточяых эстераз, ■Жидкая среде содертат {% по весу;: ПО- '3,0 (или эк( ракт-Е0~9Э,28);. iraaci - 0,32; KCl - 0,05;-ке^рОд - 0,10; мазо4 - 0.0& и, ПАВ - 0,2 (трЯТОН Х-100 для A. carbotoariua ■ И ТЕШ! 40 для A.yeriftna). p!t ö,5. Среда дчл твердофазного-культивирования содержит (% по cow): ПО -46,4; HgC - 48,4; "cscig - .7,0; JMS - 0,2. Для образования внеклеточных üOTepifö' A.oarbonorlus И A.yariana ОПТИИаЛЬЕа те!/л?ратура 32° Ц 28°, роответсгвенно. ' -

■ 3. При глубинном культивировании на епшлизировашшх средах выявлено разобщение - во врештш максимальных скоростей роста грибов л сил теза яптераз. Мошат достшичая иаксдарльнай скорости образования неспбцйфйчос;- .й зстеразы и.oarboaarioa спорегаьт таковой для спецг-фйческой на 20 часов. ¡Образование шеклеточпых эстераз шоладьотсч а пос.тэксяоненциальяоа фазе развятля культур.

4. Установлен шдуцироп&зшй характер образования ко специфической эстеезы a.v.irimjs. Образований кндуцирсванной эстерэзы подвегао-но р«прдссии гл лозой. Кш-аболитная репрессия реализуется ьа .уровне транскрйпцда. !■ ■ -ечие вкз'Л'эшюго ii-3 *5' д^роя^ссирует синтез исюрэзи А.von, - . •

5. Получеш эст«рэзше препарата ШОХ и ГЮХ л.о^ъоплг.гиз Показано, что оба препарата A.oarbomriun содержат нвспещфгческую и специфическую эстерагы. Лучшим субстратами дпл ивиюцифпвской эо-твразн ппллптал эфирц уксусной кислота, особенно 2-негил-4-азо( 2'-н-мвткл-тйьзоладперхлсрат) -ьцетоксибензол, 2-мэтал—!-эзо< 2'-тиазо-ллл) -ьцетоксибаязол и ЙА. Неспоцй^кческлч эстораза не чувствительна к .сойстьию ор'.'ансх&сфатов и пчрбамэтов: л класлчфкщ!рована как ацетилэсторэза (КФ З.ТЛ'.б.К Специфическая эстораза наиболее эффективно расщепляет ЛИИ,' характеризуется нтекой чувствительностью к холииэстерязнвм янгабитор&м и шюссифицкрованэ как'оц&тилхолкнзсте-раза '.КФ 3.1.7.V). Ацегнлхолинрсторзза грмСпэго проясхозаения описана шерпце.

S. Получеш иртеерг.та ГЛОХ и ГЮХ 4. varies. Установлено, что нвспенифлчэская згг.раза, содержащаяся в препаратах, эффективно гад-ротазуьт ароматические' эфири .короткокепочвчшх rrjpixx кислот. Опти-налышм;* .убетрзтямя являются 1ЭА и 2-иетал-4-азо( й'-и-метил тназо--лилвдрхлоратЬацетоксибецзол. Формант в большой степени шгибируется лроютюдякш фогфоновсЯ кислоты,, чек фосфорной, кислородными эфира).« фосфопоЕэй кислота, чем тиолошми. Показана высокая чувствительность эстеразн к армтау .'SxIO-6!.!), ГД-42 <2x10"%), фосфэколу и хлорофосу (5хЮ~'5М>. 11е< пецифаческая всторага д. von™™ классифицирована как карбоксилэстерясл (К® 3.1.1.1.).

7. Изучено .слияние температуря и кислотности па каталитическую активность и стабильность эстераз препаратов ПЛОХ и Г.ГОХ обоих продуцентов. Показана относительная тормостзбйльность эстераз .», .сагЬо-

narlus И A;vi«riar»3. УОТЙЯОВЛОЫ'./, Ч1'0 ЭСТЗряЗП A.carbonorlus ПРОЯВЛЯЕТ гахсаглльнуй каталишаскуя активпооть в зоне рП 10,0-11,0, что являотся утиалыЕлл. для ферментов' етого класса. Er.spsue показано, что свойства эфкролитичвегеи препаратов зависят от способа культиви-роганяя продуцентов. ' ■.'"'..

8. Доказана нгогсксмпопенгное'гь остеразпого комплекса л.сга-ьо-niriuo, Екпичащего щулилэстерйзу ц адотилкшшэсторазу. Установлв-яо наличие многостеегаш молекулярных Фора посшвдфнвсктх эстераз

Л. sarbonariuj И A.varluia, ШЭКТр КОТОрЫХ заШСЯТ ОТ СИОССба К'УЛЬТИ-вироваиия продуцентов.

9. Показана возмокиость использования адопиэствразы А.оагъопа-riuo и карбоксиластеразы ¿.Wtena -да «ФЕектйвнога разрушения про-«¡атнческих / ефпров короткоценочечннх .тарных кислот. К&рбохсилэстера-гя, благодаря своей чувствительности к оргадафосфатам,, может гриме-1яться для 'индикации микроколичеств фосфорорганичэс.ких соединений.

ч" > гь -

Лцепшоллнэстеразу л, салопапиз кюто использовать для гидролаза аце'пшолша и определения его кодачаства в биологических вдцкостях, а также а качестве уникального объекта для изучения грибных ацетил-холинэстераз, „КьрЗокскластераза A.v&rJans представляет интерес как i/o до ль .для исследования структура активной поверхности и механизма катализа ефиров кзрбошвых кислот.

СПИСОК РАБОТ ПО НАГЕРШШ ДЙССЕРТАШ ■ •

I. Лобааок А.Г., Михайлова Р.В., Звхарешю H.H. Образование sotepas гркбти родов Aspai-sinus п Fanioiiiiura // Прикладная био-tiw. я индюфго«.» 1993,- T.Z9, шаЛ.- С.УОг-'/ог.

Z. Нлхайлоио ?.В., Захареико U.K., Лобанок А.Г. Влияние компонентов гаяйталыгай срады а условий культивирования на образование Ш£*К.'МГ;;ЧШХ ьсторао Л.-раг;)Ииз oarbonai>ius П Aspergillus variens // биош*. к иикробпол. (в печати).

0. Ы/хаЯдада Р.В., Лобянох АЛ1., Захаренко H.H., Стацевич В.Я. CifcActW SCSf-рйЗ ¿врмвШд» oarbcnai-iub /I ПрШНВДВаЯ бйОХШ. И кккро бгол. (в сеч эк»). -

4. Еахаречко , Михайлова "Р.В., Лобааок .V.r., Стоцэвкч Е.Я. Свойстве кьрбоасилэстэразы Aeversriiiue v«riene // Г..:йкяадаш бяомм. к мгегрооу.ол. (в печати).