Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Эпизоотологический мониторинг и совершенствование противосибиреязвенных мероприятий в Республике Чад

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Эпизоотологический мониторинг и совершенствование противосибиреязвенных мероприятий в Республике Чад"

На правах рукописи

ШЕРИФ Л АМАДИН АМИН

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РЕСПУБЛИКЕ ЧАД

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

14 МАР 2013

Уфа-2013

005050599

005050599

Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии при ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана».

Научный руководитель

Галиуллин Альберт Камилович -

доктор ветеринарных наук, профессор.

Официальные оппоненты:

Андреева Альфия Васильевна —

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»;

Садьгков Нариман Султанович -

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности».

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Защита диссертации состоится 15 марта 2013 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.03 при ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ по адресу: 450001, Россия, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34 (325/2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ, с авторефератом - на сайте университета: www.bsau.ru и Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан «12» февраля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных

наук, профессор

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сибирская язва (Anthrax) представляет собою издавна известную инфекционную болезнь животных и человека. Но возбудитель ее впервые был увиден под микроскопом Pollenderom в 1849 году. Он исследовал кровь трупов животных, погибших от сибирской язвы. Его наблюдения были подтверждены Брауллем, Давайне, Пастером. Окончательную точку в этиологии этой болезни поставил Роберт Кох, выделившей возбудителя антракса в чистой культуре.

Интерес ученых к сибирской язве не исчез и сегодня. Свидетельством тому является данная диссертационная работа.

В настоящее время сибирская язва встречается в виде спорадических случаев и редко в виде вспышек, но расслабляться еще рано. Болезнь продолжает регистрироваться во многих странах мира, в том числе и в Республике Чад. Экономическим анализом установлено, что сибирская язва крупного рогатого скота нанесла ущерб экономике животноводства Республики Чад за 2000 - 2011 г. в сумме 55,66 млн. руб. (959,65 млн. франков СФА).

Возбудитель сибирской язвы, активно распространяясь в абиотической среде, представляет потенциальную угрозу (опасность) для диких и сельскохозяйственных животных, а также человека.

Исходя из этого, разработка новых подходов к совершенствованию противосибиреязвенных мероприятий остаются актуальными для ветеринарной науки и практики.

Цель и задачи исследований. Целью работы является создание эпизоотологического благополучия путем совершенствования

противосибиреязвенных мероприятий на территории Республики Чад.

Для выполнения основной цели исследований поставлены следующие задачи:

1. Провести ретроспективный анализ распространенности и возникновения сибирской язвы в Республике Чад.

2. Определить степень напряженности поствакцинального иммунитета у животных на неблагополучных пунктах по сибирской язве.

3. Изучить роль почвы в сохранении почвенных очагов на территории Республики Чад.

4. Установить фено- и генотипическую принадлежность и происхождение вновь выделенных изолятов культур возбудителя сибирской язвы.

5. Совершенствовать противосибиреязвенные мероприятия на неблагополучных пунктах Республики Чад.

Научная новизна. Впервые в сравнительно-историческом и географическом аспекте проведен анализ развития эпизоотологической ситуации по сибирской язве в стационарно неблагополучных пунктах Республики Чад. При этом получены данные о напряженности иммунитета у вакцинированных против сибирской язвы зебу.

Углублены и расширены сведения о роли почвы в сохранении сибиреязвенных очагов.

Установлено территориальное происхождение выделенных изолятов путем секвенирования отдельных локусов, амплифицированных в ПЦР, с последующим их сравнительным анализом.

Результаты проведенных исследований позволяют обосновать современное представление об эпизоотическом процессе и осуществить прогноз возникновения сибирской язвы на территории Республики Чад.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследования эпизоотической ситуации по сибирской язве в Республике Чад, могут быть использованы специалистами ветеринарных служб для прогноза распространения возбудителя болезни среди животных.

Результаты исследований вошли в рекомендации по снижению риска распространения и возникновения сибирской язвы на территории Республики Чад, утвержденные Департаментом ветеринарии и рыболовства Республики Чад.

Апробация работы. Результаты выполненных исследований доложены и обсуждены на ежегодных отчетных сессиях ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» (Казань, 2009-2012 гг.). Отдельные положения диссертации доложены на Международной научно-практической конференции по актуальным проблемам Агропромышленного комплекса (Казань, 2012).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано пять статей, в том числе в рекомендуемых ВАК РФ журналах.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Эпизоотическая ситуация по сибирской язве животных на неблагополучных территориях Республики Чад.

2. Почва Республики Чад и ее роль в сохранении почвенных очагов.

3. Фено- и генотипический анализ выделенных изолятов возбудителя сибирской язвы на территории Республики Чад и определение их территориальной принадлежности.

4. Рекомендации по снижению риска возникновения и распространения сибирской язвы на территории Республики Чад.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 107 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение

результатов, выводы, практические предложения, библиографический список (289 источника, в том числе 147 иностранных авторов) и приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 7 рисунками.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материал и методы исследований

Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии при ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана» с использованием эпизоотологических, бактериологических и иммунологических методов исследований с 2009 по 2012 гг.

Для решения поставленных задач исходные данные получали на основании результатов собственных исследований, использования архива ветеринарных служб Республики Чад и анализа официальных отчетов префектур, отчетов ветеринарных лабораторий. Использовали также материалы оперативных донесений, поступающих с мест событий в Департамент ветеринарии и рыболовства Республики Чад и доступных публикаций по изучаемым проблемам.

В работе проводили посевы культур на следующие питательные среды:

- мясо-пептонный агар (МПА ТУ 46-12-252-78);

- мясо-пептонный бульон (МПБ ГОСТ 29730-75);

- бульон Хоттингера;

- среда ГКИ;

- 5%-ный кровяной агар;

- обезжиренное молоко;

- 12%-ная желатина.

В экспериментах были использованы следующие животные:

- белые мыши живой массой 15-18 г - 100 голов;

- морские свинки живой массой 300-350 г - 50 голов;

- сыворотка крови зебу - 2560 проб.

Заражение животных исследуемым материалом, а также исследование зараженного материала проводили согласно санитарным правилам по работе с микроорганизмами I и II группы патогенности (СП 1.3 1285-03).

Изучение культурально-морфологических свойств выделенных изолятов культур микроорганизмов проводили согласно методикам, описанным в справочнике «Лабораторные исследования в ветеринарии» (1986).

Вирулентность штаммов определяли заражением белых мышей, а выделение чистой культуры проводили путем подкожного заражения морских свинок (по 0,5 мл) и белых мышей (по 0,2 мл).

Отбор проб почвы массой 50-100 г, проводили с помощью почвенного бура по углам и в центре обследуемого участка на глубине 15, 25, 50, 75, 100 см; предварительно сняв верхний слой почвы (2-3 см). Почву освобождали от корней, камешков и тщательно перемешивали, пробу массой 50 г, помещали в

колбу, заливали 5-й кратным объемом физиологического раствора, шуттелировали 25 мин, отстаивали 5-8 мин и фильтровали через 2-3 слоя марли. Подготовку проб к микробиологическому анализу проводили согласно «Методических указаний по обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды», утвержденных ГУВ СССР от 01.11.1979 года.

Изучение иммунологического статуса вакцинированных против сибирской язвы зебу проводили в РНГА и ИФА согласно наставлению по применению набора диагностических препаратов, путем определения титра антител в сыворотке крови животных.

Постановку иммуноферментного анализа проводили по общепринятой методике на полистероловых планшетах. Сенсибилизацию лунок антигеном возбудителя сибирской язвы выполняли по 200 мкл в концентрации белка 10 мкг/мл в течение 2-х часов при температуре (37±1)°С. Раствор из лунок удаляли и трехкратно промывали ФСБ-Т. Исследуемые сыворотки в 2-х кратных разведениях в лунки планшет вносили по 200 мкл. Затем после промывания вносили антитела диагностические против IgG (H+L) быка меченные пероксидазой, сухие (антивидовой конъюгат) в рабочем разведении 1:1200. Экспозиция в каждом случае в термостате при температуре (37±1)°С составила два часа. Реакцию с субстратной смесью останавливали внесением в лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента.

Наряду с опытными пробами ставили следующие контроли:

1. С заведомо известным антигеном и антителами. Этот контроль проверяет правильность выбора рабочего титра иммунопероксидазного конъюгата. Контроль должен быть положительным;

2. Контроль неспецифической сорбции конъюгата. В 'лунку сначала вносят рабочее разведение конъюгата, затем после соответствующей промывки рабочий раствор субстрата. Контроль должен быть отрицательным;

3. Контроль субстрата. В лунку вносят только рабочий раствор субстрата. Содержимое лунки должно оставаться без изменения.

Регистрацию результатов ИФА проводили визуально или на ИФА анализаторе «Multiskan». При учете реакции на приборе проводили расчет по коэффициенту специфичности (Ken), который был равен отношению оптической плотности субстрата в лунках без антигена к оптической плотности субстрата с антигеном, который должен быть не ниже 2,0, а при учете визуально по среднему титру антител в сыворотке крови.

Постановка реакции непрямой гемагглютинации происходила в несколько этапов, строго следующих один за другим. Вначале подготавливали необходимые растворы, затем готовили сыворотку и контрольные образцы, после чего данные образцы вносили на планшет. Далее наносили на планшет сенсибилизированные (Д+) и несенсибилизированные (Д-) эритроциты. Данные препараты инкубируются, и через некоторое время производят учёт результатов реакции. Результаты реакции учитывали в крестах по четырёх бальной системе. Интенсивность реакции зависит от количества осаждённых эритроцитов на дне лунок: (-) отрицательная реакция, которая характеризуется

осаждением эритроцитов на дно лунок в виде небольшого колечка с гладкими краями или «пуговки»;

(+) слабая интенсивность агглютинация эритроцитов, для данной реакции характерно небольшое кольца на дне лунки;

(++) средняя интенсивность аглютинации, ей свойственно образование на дне лунки «широкого кольца» из агглютинированных эритроцитов;

(+++) интенсивная реакция, агглютинированные эритроциты образуют так называемые «зонтик», в центре которых, явно видно кольцо;

(++++) резко интенсивная реакция, в которой агглютинируются все эритроциты и, образуют «зонтик» и выстилают дно лунки.

Титром антител данной реакции считают последнее разведение сыворотки, при котором выявляется явная агглютинация эритроцитов не менее на (+++) креста.

Для выделения ДНК были использованы следующие компоненты:

молодые культуры микроорганизмов, выращенные на мясопептонном агаре; агароза; лизоцим; ПГ (ЭДТА, саркозина, гуанидина); ацетата аммония; лед; фенол-хлороформ-спиртовый; хлороформ; изоамиловый спирт; изопропанол; этанол 80; перчатки; эппендорфские пипетки; центрифуга.

Для постановки электрофореза были использованы: агарозы; КЭ буфер (трис-ЭДТА Борат); маркер ДНК (лямбда ДНК, Hind III, дайджест лямбда ДНК); бромистый этидий; миски; расчески; плита; пробирки; ультрафиолетовые поляроиды; камера.

ПЦР (полимеразная цепная реакция): очистка и идентификация, выделенных изолятов культур проводили в лаборатории Фарша согласно инструкции по постановке ПЦР.

Для решения отдельных вопросов краевой эпизоотологии сибирской язвы (распространение, источник и факторы передачи возбудителя инфекции) использовали способы, представленные в «Рекомендациях по методике эпизоотического исследования» под редакцией Бакулова И.А.

Разработка приложения баз данных по сибирской язве проводилась на платформе Microsoft Excel®. В эту базу данных вошла информация по эпизоотическим вспышкам на всей территории Республики Чад за период 20002011 гг.: дата, название, административная принадлежность и предшествующий эпизоотический статус населенного пункта, вид и число заболевших животных, данные о вакцинации.

Статистический анализ сформированного банка данных проводился в статистических модулях программы Microsoft Excel® и в специализированных программах - SPSS® и Statistica®.

Для изучения географического распространения сибирской язвы, выявления пространственных связей эпизоотического процесса с предполагаемыми причинными факторами среды использовали методы цифровой картографии. Работа проводилась на компьютере следующей конфигурации: Intel® Pentium® 4-2200/256 DDR/40GB/64 МВ, под управлением Windows Millenium.

Объекты исследования

Рисунок 1. Общая схема исследований

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Эпизоотическая ситуация по сибирской язве животных на

территории Республики Чад 2.2.1.1 Климатогеографическая характеристика Республики Чад

Республика Чад расположена к северу от экватора в тропической зоне. Климат ее континентальный, на севере - тропический пустынный, на юге -экваториально-муссонный. Характерны два главных типа растительного покрова: саванны и леса.

В Республике Чад различают гри климатические зоны. В северной части, пустыня, годовое количество осадков незначительное (25 мм). Центральная часть «Сахель» получает больше осадков (от 250 мм до 500мм в год). Южный регион имеет типичный тропический климат (1200 мм).

В центре и на юге республики, установлено три сезона: жаркий сезон с марта по июль, дождливый сезон с июля по октябрь в зависимости от региона и прохладный сезон в течение остальной части года. Средняя дневная температура воздуха колеблется от 30 до 33°С, в декабре (14°С в течение ночи) н 42°С в апреле (23°С в течение ночи).

Центральная часть страны степная, где расположены основные пастбища, которые простираются к югу страны и соединяются саваннами, где имеются пахотные земли. На территории республики находится Национальный парк «Закума» и «Манза».

Большую часть территории страны занимают равнины и плато, чередующиеся с плоскими впадинами, в одной из которых находится одноименное озеро «Чад». На севере расположено массивное древнее нагорье «Тибести» с вулканом «Эми-Куси» (3415 м)" самой высокой точкой страны.

На востоке - плато Эрди, Эннеди и Вадаи. На севере, входящем в пределы пустыни Сахара, распространены песчаные дюны и останцовые холмы (кагас). Юг занимают полупустыни и саванны, встречаются болота, занимающие довольно большие площади. Общая площадь территории 1284000 км , суша -1289200 км2, водоёмы - 24800 км2. Протяженность границ с Камеруном - 1094 км, Центрапьноафриканской Республикой - 1197 км, Ливией - 1055 км, Нигером - 1175 км, Нигерией - 87 км, Суданом - 1360 км.

В саваннах обитают слоны, носороги, буйволы, антилопы, жирафы, львы, леопарды, шакалы и гиены. В озерах живут гиппопотамы и крокодилы. В больших количествах водятся змеи, ящерицы, насекомые. Из птиц характерны страусы, различные болотные и водяные птицы, встречающиеся по берегам рек и озер. Берега рек изобилуют ибисами, фламинго, пеликанами, аистами, в реках и озерах - бегемоты и крокодилы, в верхнем течении Шари - обезьяны. Население Чада около 9,3 млн. человек (данные на 2003 г.).

Климат в Республике Чад определяется двумя воздушными массами: арматан - жаркий и сухой континентальный воздух, который приносит ветры с востока и севера, от Сахары; муссоны - неустойчивый, влажный, которые поступают с Юго-Запада.

На границе между этими двумя массами внутритропического фронта, возникают дожди. В зависимости от количества осадков, которые перемещаются с севера на юг и возникают три основные климатические зоны, такие как зона Сахары, Сахеля и Суданиан. Зона Сахары занимает площадь 600350 км2, или 48% от площади территории и состоит из трех регионов (Тибести в Западной, Центральной и Борку Эннеди Восточной). Пустынный климат на севере и тропический на юге. В северной части Чада днем жарко, а ночью прохладно. Изменение климата, происходит с юга на север. В центре дождливый сезон с марта по октябрь. В южной части Чада, сезон дождей начинается в мае и заканчивается в конце сентября.

Во время сухого сезона с декабря по апрель, температура очень высокая (с середины февраля по апрель) дует сухой и горячий ветер из Сахары пересекает страну с севера на юг. Республика Чад не имеет выхода к морю, страна расположена в самом сердце Африки. Пахотные земли занимают 19 млн. га. Посевная площадь составляет 3630 тысяч га, менее чем 3 % от общей площади территории и только 0,03 млн. га занята многолетними культурами. Лесные ресурсы занимают 32400 тысяч га, или 25 % территории страны.

На юго-западе страны тип почвы черноземный, в то время как на севере простираются песчаные дюны непригодные для сельскохозяйственной деятельности. Плодородные почвы располагаются вокруг озера Чад, которая богата растительностью, где возделываются многие сельскохозяйственные культуры. Максимальная температура достигает 47°С в апреле. Индекс засушливости отмечается в Сахаре, полным отсутствием дождей в течение 340 дней.

В жаркий и сухой сезон дикие животные преодолевают длинные расстояния в поисках воды и пищи, часто через населенные пункты и тропы кочевников. Многие животные погибают по дороге по тем или иным причинам, их трупы остаются там же, образуя «проклятые поля».

2.2.1.2 Изучение иммунологического статуса животных в стационарно неблагополучных пунктах

При изучении эпизоотической ситуации на территории Республики Чад мы применили методику клинического наблюдения. Однако на первом этапе исследования были направлены на определение напряженности иммунитета у вакцинированных зебу.

Как было установлено, напряженность иммунитета у вакцинированных зебу в отдельно взятых префектурах сильно варьируют. По результатам иммунохимических реакций (РИГА, ИФА) наиболее слабый иммунитет против сибирской язвы был отмечен у вакцинированных зебу в префектуре Бар-Эльгазал, где чаще были отмечены случаи возникновения сибирской язвы у животных. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, РНГА и ИФА выявляли наличие противосибиреязвенных антител в сыворотках крови иммунизированных зебу. Причем, количество их зависело от сроков исследования после иммунизации. Максимальные титры антител в РНГА отмечались через один месяц (51,5±10,0)

у зебу, принадлежащих префектуре Шари-Багирми. Низкие титры антител сыворотки крови у вакцинированных зебу (21,8*0,9) были отмечены в Батах и (10,1±0,9) в Бар-Эльгазал, далее они снижались к седьмому месяцу соответственно.

Таблица 1 Противосибиреязвенные антитела в сыворотке крови зебу,

вакцинированных против сибирской язвы

Префектуры Срок исследования (мес.) РИГА титры Ат Серопозит ивные, положит, реагирую щие (%) ИФА Титры Ат Положит, реагирую щие (%)

Батха 1 21,8±0,9 73 56,4±1,9 72

7 9,3±1,2 65 23,3±1,3 69

Бар-Эльгазал 2 10,1±0,9 81 19,3±1,4 75

8 6,6±0,3 75 19,0±1,7 69

Шари-Багирми 1 34,7±10,2 92 53,8±14,5 91

7 12,9±2,7 79 29,0± 18,7 89

Гера 1 51,5±10,0 90 66,0±7,9 91

7 41,7±3,3 89 58,9±7,4 89

Корреляцию между титром антител в сыворотке крови вакцинированных животных и устойчивостью их к заражению изучали на лабораторных животных. Для этого морских свинок иммунизировали вакциной против сибирской язвы и через один, семь месяцев заражали вирулентным штаммом возбудителя сибирской язвы. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 Напряженность иммунитета в зависимости от титра антител в сыворотке крови

Группа животных Количество голов Сроки исследования после вакцинации, мес. Средний титр антител Выжившие после заражения, %

РИГА ИФА

Первая 10 1 57.5±10,0 69,0±7,0 92

Вторая 10 7 11,9±2,7 24,0±9,7 65

Исследованиями установлено, что в сыворотке крови морских свинок через один месяц после иммунизации титр антител в РНГА составил 57,5±10,0, спустя семь месяцев - 11,9±2,7, в ИФА 69,0±7 и 24,0±9,7, соответственно. После заражения подопытных животных через один мес. после вакцинации выжило 92% опытных животных. Спустя семь месяцев, отмечали снижение титра антител и при контрольном заражении выжило, только 65% подопытных животных. Это указывает на то, что животные, вакцинированные однократно против сибирской язвы вакциной Б^егп, устойчивы к заражению первые семь месяцев, в дальнейшем напряженность иммунитета идет на снижение.

Учитывая выше изложенное обстоятельство, опыты по выяснению данной причины были продолжены. Для этого морских свинок вакцинировали двукратно с интервалом шесть месяцев и заражали через один и семь месяцев. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 Напряженность иммунитета животных после двукратной вакцинации

Группа животных Количество голов Сроки исследования после вакцинации, месяц Выжившие после заражения, %

Первая 25 1 92,5

Вторая 25 7 89,5

Как видно из таблицы, зараженные животные после двукратной иммунизации выжили 92,5% и 89,5%, соответственно.

Таким образом, двукратная иммунизация животных вакцинным штаммом увеличивает напряженность иммунитета и количество выживших животных.

2.2.1.3. Анализ эпизоотической ситуации на территории Республики Чад

Для установления основных причин возникновения вспышек сибирской язвы у животных, исследования были продолжены по изучению эпизоотологической ситуации на территории Республики Чад.

Первый зарегистрированный случай заболеваемости животных антраксом в Республике Чад пришелся на 1955 г., тогда еще Фор-Лами была Французской колонией (старое название Республики Чад) и инфекционным болезням не уделялось достаточного внимания. Однако, согласно архивным материалам и в то время, самой неблагополучной зоной по сибирской язве были префектуры Лак Чад, Шари-Багирми, Восточный и Западный Логон, Батха, Мунду. Эти территории до настоящего времени остаются не благополучными по данной инфекции.

Как видно из таблицы 4, на территории Республики Чад неблагополучными по сибирской язве признаны 127 пунктов. Из 16 префектур

благополучными остаются шесть префектур, на остальных территориях случаи сибирской язвы регистрируются ежегодно. На неблагополучных территориях болезнь отмечается по два и более раза в год. На 2000-й год на территории Республики Чад зарегистрировано 86 неблагополучных пунктов и только за последние 10 лет на этих же территориях появились 41 новых очагов. Новые очаги появлялись в основном, там, где проходят караванные пути или прогон скота из одной местности в другую.

Согласно отчетным данным Департамента ветеринарии Республики Чад, нынешние трудности в ликвидации сибирской язвы на территории Чад состоят в следующем:

•устойчивость возбудителя сибирской язвы к антибиотикам и химиотерапии;

•невозможности ограничить распространение инфекционных заболеваний в Африканском континенте;

• высокий уровень бедности и незащищенности населения;

• отсутствие доступной медицинской помощи;

• нехватка питьевой воды;

• угроза возрождения и появления, новых стационарно неблагополучных пунктов' по сибирской язве, так как не все места захоронения павших животных выявлены.

Таблица 4 Неблагополучные сибиреязвенные пункты на территории Республики Чад, данные на 2011 год

Число очагов Количество животных

Префектуры зарегистриров анных новые случаи всего очагов заболевших павших

Батха 5 2 7 7 2

Бар-эль Газал - - - - -

Шари-Багирми 3 - 3 3 3

Гера 8 1 9 12 6

Хаджар Ламис 10 16 26 34 23

Канем 15 8 23 23 12

Лак 8 4 12 12 9

Западный Логон 5 3 8 8 8

Восточный Логон 6 2 8 29 15

Мандуль 5 3 8 8 8

Майо Кебби 18 - 18 27 14

Средний Шари 1 I 2 2 -

Уаддай 1 1 2 2 2

Саламат - - - - -

Танджилэ - - - - -

Уази Фира 1 - 1 1 1

Всего 86 41 127 168 103

2.2.1.4. Динамика заболеваемости животных сибирской язвой в Республике Чад

Видовой состав сельскохозяйственных животных, чаще подверженных заболеванию сибирской язвой изучали с 2000 по 2011 гг.

х

I

н о

со £

X

3

со 03 С

о о =г

о

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

ГОД

Рисунок 2 Динамика падежа животных, заболевших сибирской язвы в Республике Чад

За исследуемый период с 2000 по 2011 гг. зарегистрировано 1995 павших животных, это в основном не вакцинированные. В видовом отношении в основном сибирская язва возникала среди одно- и парнокопытных, при этом 1925 случаев (96,4%) приходится на долю зебу, овец, антилоп и на долю лошадей 60 случаев (3,0%). Верблюды заболевали в меньшем количестве - 10 случаев (0,5%).

Наибольший падеж наблюдался в 2004 и 2009 годы на территориях Батха, Гера, Шари-Багирми, Хаджер-Ламис, Канем, Западный и Восточный Логон, Мандул, Муаен- Шари среди крупного и мелкого рогатого скота и в меньшей степени среди ослов и лошадей. Вспышки болезни связаны с большим скоплением скота в этих регионах, так как по этим территориям проходят торговые пути в соседние республики. На отдельных территориях, где нет скопление большого количества животных, и не ведется торговля скотом, заболевших животных меньше (2-3%), а в некоторых регионах и вовсе отсутствует.

В настоящее время заболеваемость животных снижается с каждым годом на пять и более раз, но продолжает быть, и это связано чаще всего с отсутствием или пропуском вакцинации животных, среди крупного рогатого скота на территориях: Батха, Шари-Багирми, Гера, Хаджер-Ламис, Канем, Лак, Восточный и Западный Логон. Основной причиной распространения инфекции является:

400

300 / \

250 / \ Д

/ \ / \

;: \

* V

водопой животных из временных водоемов, образующихся в сезон

дождей;

кормление животных инфицированными кормами; передача возбудителя кровососущими насекомыми; неполный охват поголовья восприимчивых животных предохранительными прививками против сибирской язвы.

Для прерывания эпизоотической цепи распространения сибирской язвы на неблагополучных территориях необходимо проводить двукратную иммунизацию восприимчивого поголовья животных. При этом создать единый банк числа заболевших и павших животных, что позволит вести контроль за эпизоотической ситуацией в отдельных префектурах РЧ.

2.2.1.5 Почва и её роль в сохранении сибиреязвенных очагов на территории Республики Чад

По мнению многих исследователей (И.С. Григоров Б.В. Вертинский, и др., 1988.) климатогеографические особенности местности создают иногда благоприятные условия для вегетации возбудителя. В связи со сложными процессами взаимодействия возбудителя сибирской язвы с внешней средой, важное значение имеет исследование почвы. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Таблица 5 Эпизоотическая ситуация по сибирской язве в зависимости от структуры почвы

Тип почвы Количество вспышек за 2000-2011 гг. Процентное соотношение вспышки заболевания в зависимости от структуры почвы

Глинистые 118 3,4

Красные Ферраллитные 122 3,6

Черно- глинистые 1644 47,8

Железистые тропические 1554 45,2

ИТОГО: 3438 100,0

Как видно из данных таблицы 5 и рисунка 3, большинство вспышек сибирской язвы приходится на черно-глинистые почвы 47,8 % и 45,2% на железистые тропические почвы, соответственно на территориях таких регионов как Западный и Восточный Логон, Мунду, Муаен-Шари, Хаджер-Ламис, где

количество вспышек с 2000 по 2011 год составило 1644 и 1 554, соответственно. В таких префектурах, как Мунду, Средний-Шари, где почвы глинистые и красные ферраллитные, количество вспышек сибирской язвы не велико, т.к. структура почвы не оказывает благоприятного влияния на вегетацию и распространение Bacillus anthracis. В этих районах в указанные годы зарегистрировано 118 (3,4%) и 122 (3,5%) вспышек сибирской язвы.

3,4%

3,6%

47,8%

1

шш Ш

Ш Глинистые В красно-ферралитные В черно-глинистые Я железистые тропические

«чнр ' I

Рисунок 3 Структура почвы и количество вспышек сибирской язвы

Таким образом, эпизоотические вспышки сибирской язвы возникали в населенных пунктах, где преобладают черно-глинистые и железисто-тропические почвы.

2.2.2 Изучение фенотипических признаков выделенных шалят ов на территории Республики Чад

Для выделения изолятов возбудителя сибирской язвы и установления причины заболевания совершали выезды в возникшие очаги инфекции, где были отобраны пробы кормов, почвы на месте содержания животного. Из патологического материала изоляты были выделены специалистами Республиканской ветлаборатории. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 Биологические свойства изолятов культур возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории Республики Чад

Префектуры, где выделены изоляты Тинкториаль-ные свойства Капсуло-образование Биотип Патогенность для лабораторных животных МПБ мпж Наличие плазмид

Западный Восточный -Погон, Муаен-Шари, Хаджер-Ламис Гр+ Положит VNTR2 Морские свинки Преет, кольцо Переверн утая «елочка» Рх01 Рх02

Лак, Канем, Батха, Гера Гр+ Положит VNTR2 Морские свинки Преет, кольцо Переверн утая «елочка» PxOl Рх02

Мунду, Средний- Шари Гр+ Гр- Не всегда VNTR3 Б.мыши Осадок в виде комочка ваты Отсутств ует PxOl

Бурку-Энеди-Тибести, Билтин, Канем ГР+ ГР- Не всегда VNTR2 Б.мыши Осадок в виде комочка ваты Отсутств ует PxOl

Исследованиями установлено, что культуры, выделенные из почвы на территории Республики Чад, по культурально-морфологическим свойствам относятся к возбудителю сибирской язвы. Колонии серые, желтые, встречаются и пигментированные. Все изученные изоляты культур являются патогенными для белых мышей. В ГТЦР выявляется наличие двух плазмид рх01 и рх02, которые принадлежат к штамму VNTR - 2-му подвиду. Данный подвид чаще выявляется в Центральной Африке.

Наряду с изучением фенотипических признаков у выделенных изолятов были установлены также устойчивость возбудителя к антибиотикам. Результаты представлены в таблице 7.

Как видно из таблицы 7 у выделенных изолятов культур отсутствует устойчивость к пенициллину, но при этом выявлена 100% устойчивость к цефалоспорину.

Традиционная чувствительность возбудителя сибирской язвы к пенициллину сделала этот антибиотик' дифференциальным тестом для возбудителя сибирской язвы. К сожалению, резистентные к пенициллину штаммы все чаще встречаются в различных континентах земного шара (Odendaal et al. 1991; Badaric et Punda-Polc, 1992; Lalitha et Thomas, 1992).

Однако наши результаты отличаются от описанных выше исследований. Пенициллин до настоящего времени остается эффективным антибиотиком в Республике Чад для лечения людей и животных, больных сибирской язвой.

Таблица 7 Чувствительность изолятов культур к антибиотикам, выделенных на территории Республики Чад

№ п/п Наименование Минимальная ингибирующая концентрация в зависимости от чувствительности золотистого стафилококка Содержится в различных концентрациях скважин пластин

А В С D Е

1 Гентамицин GEN (0,12-1) 128 64 32 16 8

2 Эритромицин ERY (0,25-1) 32 16 8 4 2

3 Клиндамицин CLI (0,25-1) 32 16 8 4 2

4 Стрептогамин SYN (0,12-1) 64 32 16 8 4

5 Тетрациклин ТЕТ (0,25-1) 128 64 32 16 8

6 Хлорамфеникол CHL (4-6) 256 128 64 32 16

7 Энрофлоксацин ENRO (0,06-0,25) 32 16 8 4 2

8 Цефтиофур (Цефалоспориновые) третьего поколения XNL (0,25-1) 64 32 16 8 4

9 Ванкомицин VAN (0,5-2 128 64 32 16 8

10 Оксацшшин 2% NaCl ОХА (0,12-1) 32 16 8 4 2

11 Пеницилин PEN (0,12-1) 16 8 4 2 1

12 Амоксициллин/ лавулановой AUG2(0,12/0, 060,5/0,25) 98/64 64/32 32/16 16/8 8/4

Устойчивость некоторых штаммов к цефалоспорину по нашему мнению связана с синтезом цефалоспорина самими спорообразующими микроорганизмами.

2.2.3 Изучение приуроченности выделенных культур сибирской язвы на территории Республики Чад

Индикация возбудителя сибирской язвы традиционными методами зачастую бывает не достаточной, по причине невысокого уровня чувствительности и специфичности тестов. Наиболее перспективным является обнаружение межштаммовых различий в генетической структуре и методологический подход, основанный на анализе генома.

Для установления источника инфекции и дифференциации природных вспышек сибирской язвы от вспышек искусственного происхождения важную роль играет изучение структурно-функциональной организации генома. Оно

позволит уловить тонкие генетические различия, проводить межштаммовое и внутривидовое типирование изолятов и штаммов, устанавливать их филогенетическое родство, а также выявлять эволюционные взаимосвязи между штаммами из различных географических регионов молекулярно-генетическими в комплексе с традиционными методами диагностики.

Одновременно с изучением фенотипии выделенных культур изолятов из трупов и почвы, нами были проведены исследования по их генотипизации с помощью ПЦР (рисунок 4).

ЗАВ 1 3 Primer

М 12345 57 В У 1011 12 13

= Marker Hind 111

I = +ko (W514) 2= Chad A1

3= Chad A2 4= Chad A3 5= Chad A4 6= Chad A5 7= Chad A6 8= Chad A7 9= Chad A8 10= Chad A9

II = Chad A10-12= Chad A11 13= Chad A12 14= Chad A 13 15= Chad A14 16= Chad A15 17= Chad A16

M= 18= B0 19=

Marker Hind III Stern Vaccin * Ко (Water) +Ko (W514) Chad A1

21- Chad A2 22= Chad A3 23= Chad A4 24= Chad A5 25= Chad A6 26= Chad A7 27= Chad A8

Рисунок 4 Демонстрация хромосомной последовательности Ba8l3

~АРВ Pnmor

M= Marker Hind 111 28= Chad A9 29= Chad A10 30= Chad A11 31= Chad A12 32= Chad A13 33= Chad A14 34= Chad A15 35= Chad A16 36= Stern vaccine C0= -Ko (Water)

Рисунок 5 Демонстрация хромосомной последовательности (Ва813) и фактор летального фактора ответственного за синтез капсулы (САР). Штаммы из Чада пронумерованы от сІїасІАІ до сИас1А 16.

Результаты ПЦР подтвердили патогенность изолятов и позволили дифференцировать вакцинные штаммы от вирулентных изолятов культур.

Таким образом, выделенные культуры из трупа овец, зебу и почвы были

идентифицированы как сибиреязвенные.

Помимо выяснения этиологии заболевания и индикации возбудителя в объектах ветнадзора, необходимо было также определить территориальную приуроченность выделенных изолятов и установить их таксономическое

родство.

Сиквенс-анализу были подвергнуты культуры изолятов и известные штаммы, ранее выделенные на территории Республики Чад.

В результате амплификации, на матрице ДНК были синтезированы более 16 уникальных ампликонов, которые позволили провести межштаммовое

генотипирование (рисунок 5).

Сиквенс-анализ изученных штаммов показал, что выделенные изоляты являются по своей генетической структуре близкородственными культурами, ранее выделенными на территории Республики Чад в 2000 году. От музейного штамма они отличались по одному маркерному локусу рХ01. Изоляты отличались по генотипу от трех вышеуказанных штаммов, сродство с которыми составляло всего 25%. О возможности определения территориальной принадлежности бациллы антракса пишут и американские исследователи (Keim

Р., Price L.B. et al. 2000.).

Следовательно, изоляты возбудителя сибирской язвы не были занесены из других регионов Африканского континента, а являются местными штаммами Республики Чад.

2.2.4 Рекомендации по снижению риска распространения и возникновения сибирской язвы на территории Республики Чад

В настоящее время Министерство здравоохранения Республики Чад дает подробную информацию о клинических признаках сибирской язвы человека для тех районов, где болезнь является эндемичной.

Несмотря на все старания властей, в изучении сибирской язвы в центральной Африке, до сих пор инфекция имеет довольно широкое распространение на территории Республики Чад. Способность Bacillus anthrac.s длительно сохраняться на многие годы в почве и размножаться приводит к

образованию стойких очагов инфекции.

В этих условиях действие властей должно быть направлено на:

- строгий запрет на перемещение животных из неблагополучных по

сибирской язве регионов;

- своевременное оповещение по глобальной сети интернет о вспышках болезней, передающихся от животных к человеку, согласно резолюции ВОЗ;

- быструю идентификацию возбудителя болезни современными методами

исследования;

- обязать граждан не забивать больных животных;

-обеспечить государственное финансирование проводимых профилактических мероприятий.

По результатам проведенных исследований рекомендовано выполнить, следующие ветеринарно-санитарные мероприятия:

- места захоронений огородить металлическим забором с табличкой «Сибирская язва»;

- запретить выпас животных на территориях старых захоронений и

скотомогильников;

- обязательно проводить двукратную вакцинацию всего восприимчивого поголовья животных против сибирской язвы;

- ежегодно перед выгоном на пастбище у 10% животных изучить иммунологический статус;

- обязательно сжигать сибиреязвенные трупы на месте возникновения

болезни.

Таким образом, соблюдение ветеринарно-санитарных норм в стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктах обеспечит стойкое благополучие ведения животноводства на территории Республики Чад.

ВЫВОДЫ

1. Первый случай сибирской язвы в Республике Чад зарегистрирован в 1955 году. При этом самыми неблагополучными регионами по сибирской язве являются префектуры Лак Чад, Шари-Багирми, Восточный и Западный Логон, Батха, Мунду.

2. За исследуемый период всего зарегистрировано 1995 павших животных. Заболеваемость сибирской язвой регистрируется в южных префектурах в основном среди одно- и парнокопытных животных, при этом 1925 случаев (96,4%) приходится на долю зебу, овец, антилоп и на долю лошадей - 3,0%. Заболеваемость среди верблюдов в меньшем количестве -

0,5%. 0

3. Наибольший падеж крупного рогатого скота пришелся с 2004 по 2009 годы на территориях Батха, Гера, Шари-Багирми, Хаджер-Ламис, Канем, Западный и Восточный Логон, Мандул, Муаен-Шари. Вспышки болезни в этих регионах связаны с большим скоплением скота, так как по этим территориям проходят торговые пути в соседние республики.

4. Эпизоотические вспышки сибирской язвы (1644 случаев), зарегистрированные на территории Республики Чад в 2000-2011 гг., возникали в населенных пунктах, где преобладают черно-глинистые (47,8 %) и железисто-

тропические (45,2%) почвы.

5. У культур изолированных с объектов ветеринарного надзора, выявлено наличие двух плазмид рх01и рх02, которые принадлежат штамму УКТЯ-2-му подвиду.

6. Выделенные изоляты по своей генетической структуре являются близкородственными к возбудителю сибирской язвы выделенному в

2000 году на территории Республики Чад. От музейного штамма они отличаются по одному маркерному локусу рх01.

7. Двукратная иммунизация животных против сибирской язвы повышает напряженность иммунитета и количество выживших животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для снижения риска возникновения и распространения сибирской язвы в стационарно неблагополучных пунктах Республики Чад руководствоваться рекомендациями, утвержденными Департаментом ветеринарии и рыболовства РЧ от 10 июля 2012 года.

2. Восприимчивое поголовья животных следует вакцинировать двукратно, что позволит увеличить напряженность иммунитета и защитить животных от вегетативных форм возбудителя болезни.

2. Ежегодно перед выгоном на пастбище изучать поствакцинапьный иммунитету 10% от общего числа поголовья животных.

3. При заболевании животных сибирской язвой необходимо исследовать пробы почвы, взятых в местах содержания и падежа на предмет обнаружения возбудителя. При обнаружении в почве возбудителя сибирской язвы рекомендуется: а) дезинфицировать места содержания и падежа животных 10%-ым раствором щелочи; б) на местах падежа животных провести выемку грунта на глубину 15-20 см; в) вынутый грунт обработать в соотношении 1:3 хлорной известью, активностью не менее 25%; г) место выемки фунта засыпать на глубину 15-20 см слоем свежей глины.

4. Все скотомогильники взять под строгий учет, произвести их паспортизацию, ограждение, покрыть эти территории бетонным саркофагом, установить аншлаги.

5. Сибиреязвенные трупы, как и другие, следует сжигать в специальных или приспособленных печах. Запретить захоронение сибиреязвенных трупов в скотомогильниках и биотермических ямах.

СПИСОК РАБОТ, ОБУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шериф Л.А. Состав почвы и ее роль в сохранении почвенных сибиреязвенных очагов в Республике Чад // Ученые записки КГАВМ. -Казань, 2012. - Т.211. - С.197 - 202.

2. Семенова С.А. Изучение антагонизма микроорганизмов к патогенным микробам в бинарных культурах почвенных моделей /С.А.Семенова, А.К. Галиуллин, Э.И.Семенов, Шериф Л.А. // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2012.-Т.211,-С.138-142.

3. Семёнова С.А. Поиск микробов-антагонистов для биологической санации почвы / С.А. Семёнова, Шериф Л.А., А.К. Галиуллин // Научно-практическая конференция: «Проблема медицинской микологии им. П.Н. Кашкина». - Санкт-Петербург, 2012. - Т.14, №2. - С. 127-128.

4. Шериф Л.А. Структура заболеваемости животных по сибирской язве в Республике Чад/ Л.А.Шериф, А.К. Галиуллин // Ученые записки КГАВМ. -Казань, 2013. - Т.213.-С.64-68.

5. Шериф Л.А. Эпизоотологический мониторинг сибирской язвы в Республике Чад/ Л.А.Шериф // Вестник Брянской государственной сельскохозяйственной академии. - Брянск, 2013. - №1. - С.89-94.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань,ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 04.12.2012 г. Печ.л.1,5 Заказ № К-7234. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризографам.