Эпитопное картирование поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней

Костина, Людмила Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эпитопное картирование поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Эпитопное картирование поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней"

На правах рукописи

КОСТИНА ЛЮДМИЛА ВЛАДИМИРОВНА

ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНОГО ГЛИКОПРОТЕИНА Е2 ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

03.00.06. - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

0 5 ДЕК 2008

Москва, 2008

003454234

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Непоклонов Евгений Анатольевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна доктор ветеринарных наук, профессор Куриннов Виктор Васильевич

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина».

Защита состоится « » декабря 2008 г в 12.00 часов на заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан « У» ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е. И. Бурцева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Классическая чума свиней (лат. - Pestus suum; англ. - Hog cholera, Classical swine fever) - особо опасное инфекционное заболевание домашних свиней и диких кабанов [Vilcek, Nettlaton, 2006], которое характеризуется высокой контагиозностью и летальностью [Сергеев, 1993].

КЧС относится к списку А особо опасных инфекций и наносит громадный экономический ущерб свиноводству как развивающихся, так и развитых стран с хорошо организованным ветеринарно-санитарным надзором [Крупальник, Нагасингхе, 2006] Самые крупные эпизоотии произошли в период 1997-1998 гг., включая вспышки в Нидерландах, Германии, Бельгии и Италии. В Нидерландах около 0,7 млн. инфицированных свиней в 429 стадах были убиты. Кроме того, около 10,6 млн незараженных свиней уничтожили вследствие мероприятий по ограничению эпизоотии. В итоге суммарные экономические потери в Нидерландах составили около 2,3 млрд. долларов [Dong, Chen, 2007].

В России и странах СНГ для профилактики и борьбы с КЧС осуществляется поголовная вакцинация с использованием живых аттенуированных вакцин [Сергеев и др., 2005]. Эффективность и безопасность этих вакцин общепризнанны. [Сергеев и др., 2003; Qiu et. al., 2006]. Однако, современные серологические методы диагностики не в состоянии отличить вакцинированных свиней от переболевших, так как животные имеют одинаковый спектр вирусоспецифических антител. В настоящее время ученые многих стран проводят исследования, направленные на разработку маркированных вакцин, создание которых может решить данную проблему [Dong, Chen, 2007].

Гликопротеин Е2 вируса КЧС имеет наиболее важное значение в диагностике данного заболевания, поскольку вызывает образование наибольшего количества вируснейтрализующих антител при вакцинации или заражении. Кроме того, белок Е2 содержит главные антигенные детерминанты, ответственные за протективную активность и нейтрализацию вируса, и, в качестве субъединичной вакцины, обеспечивает защиту против КЧС [Hülst et. al., 1993].

Антигенная структура белка Е2 изучена недостаточно [Wensvoort, 1989; van Rijn, 1993, 1994]. Об отдельных детерминантах этого белка также известно относительно мало [Yu et. al., 1996; Lin et. al, 2000; Peng et. al., 2007]. Для научных и практических целей представляет существенный интерес детальное исследование тонкой антигенной структуры главного поверхностного гликопротеина вируса КЧС, так как данный белок может быть использован в качестве антигенного маркера при создании как субъединичных, так и живых рекомбинантных маркированных вакцин. Кроме того, исследование молекулярных механизмов взаимодействия вируса КЧС с клеткой-хозяином, в частности, изучение природных вирусных белков, необходимо для решения

теоретических проблем: локализации антигенных и иммуногенных детерминант, определения протективных эпитопов. Детальный анализ эпитопов важен для понимания особенностей взаимодействия вируса КЧС с иммунной системой хозяина, а также для разработки и усовершенствования диагностических тест-систем. Выявление более тонких антигенных различий и эпитопное картирование структурных белков возможно только с помощью моноклональных антител (МКА).

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы явилось получение и иммунохимическая характеристика панели моноклональных антител, специфичных к белку Е2 вируса КЧС, и изучение тонкой антигенной структуры данного белка путем картирования антигенных детерминант с помощью полученных моноклональных антител.

Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Получить гибридомные клеточные линии, стабильно продуцирующие моноклональные антитела к гликопротеину Е2 вируса классической чумы свиней.

2. Определить иммунологическую активность, специфичность и иммунохимические свойства полученных моноклональных антител.

3. Оценить возможность использования полученных моноклональных антител для обнаружения антигенов вируса КЧС методом «сэндвич»-варианта ИФА. Определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия моноклональных антител с антигеном Е2 вируса КЧС.

4. Провести топографическое картирование эпитопов белка Е2, распознаваемых полученными МКА, с помощью конкурентного ИФА.

5. Определить способность полученных моноклональных антител конкурировать с поликлональными антителами к вирусу КЧС за связывание с эпитопами на белке Е2. Оценить возможность использования полученных моноклональных антител для выявления антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней методом конкурентного ИФА.

6. Картировать антигенные детерминанты белка Е2 вируса КЧС с помощью синтетических пептидов, используя в качестве антител-мишеней полученные к данному белку моноклональные антитела.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Получена панель, состоящая из 28 моноклональных антител, специфичных к белку Е2 вируса КЧС.

2. На основе «сэндвич»-варианта ИФА разработан лабораторный метод для обнаружения вируса КЧС.

3. Установлено, что нативный белок Е2 вируса КЧС содержит не только конформационо-зависимые, но и линейные эпитопы, способные индуцировать иммунный ответ.

4. Установлена локализация и охарактеризовано 5 линейных В-клеточных эпитопов белка Е2 вируса КЧС, не описанных ранее.

5. Антигенная детерминанта 834-856 а о. белка Е2, в пределах которой с помощью МКА было локализовано 2 В-клеточных эпитопа, высококонсервативна среди различных штаммов вируса классической чумы свиней, но отличается от аналогичных участков белка Е2 других пестивирусов и может представлять интерес для разработки маркированной или субъединичной вакцины против классической чумы свиней.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Моноклональные антитела, полученные в ходе работы, специфичны к белку Е2 вируса КЧС и активно взаимодействуют с данным белком в различных иммунохимических реакциях.

2. Показана способность моноклональных антител выявлять природный белок Е2 в составе вириона вируса КЧС и конкурировать с антителами специфических сывороток крови за связывание с антигенными детерминантами белка Е2 вируса КЧС.

3. Разработан лабораторно-экспериментальный вариант диагностической тест-системы для обнаружения антигенов вируса КЧС на основе «сэндвич»-варианта ИФА, в котором в качестве специфических реагентов были использованы моноклональные антитела к нативному вирусу КЧС.

4. Установлено, что белок Е2 включает, по крайней мере, 8 иммуногенных эпитопов, из которых 5 являются линейными.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (12-16 марта 2007, Москва), VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (18-19 ноября 2007, Москва), VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (28-30 ноября 2007, Москва).

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 25 сентября 2008 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 4 докладов в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка

цитированной литературы, включающего 285 источников. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 13 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы и клетки.

Вирус классической чумы свиней:

Вирулентный штамм: «Ши-Мынь-51» (вирус 51-го пассажа в культуре клеток РК-15, активность 106,0 ККИД50/см3), получен из ФГУ «ВГНКИ» (Москва);

Аттенуированный (вакцинный) штамм: культуральный штамм "КС" с активностью Ю6'0 ККИмД50/см3 в первичнои культуре клеток тестикул ягненка (ТЯ), любезно предоставленный профессором Сергеевым В.А.;

Полевые изоляты (№ 652, 842, 760, 745, 843, 870, 751, 742) в виде культуральной жидкости 5 пассажей в культуре клеток РК-15 из коллекции ГНУ ВНИИВВиМ с активностью 103,0ККИД50/см3.

Вирус диареи крупного рогатого скота (ДКРС) - штамм «Nadl» с активностью Ю50 ТЦД5о/см3 в культуре клеток MDBK. Вирус предоставлен профессором Сергеевым В.А.

Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) -референтный штамм Lelystad (европейский тип вируса) с активностью 107,5 ККИД50/СМ3 в культуре клеток MARC-145. Вирус предоставлен доктором Drew Т. (Вейбридж, Великобритания).

Синтетические пептиды.

Синтетические пептиды были синтезированы на базе ГУ ИБХ имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Москва). В эксперименте использовали набор из 32 пептидов длиной 15 а.о., полностью покрывающих аминокислотную последовательность белка Е2 вируса КЧС штамма «Ши-Мынь» (690-1029 а.о.) (номер последовательности в генбанке AF092448). Из них 21 пептид перекрывался на 7 а.о. (690-864 а.о.), а 11 пептидов синтезировали без перекрытия (865-1029 а.о.). Каждый пептид содержит биотиновую метку, которая присоединена к N-концу молекулы через спейсер SGSS (Ser-Gly-Ser-Ser).

Антигены.

В качестве антигенов были использованы рекомбинантный белок Е2 (гЕ2) из высоковирулентного штамма «Ши-Мынь» вируса КЧС, а также нативный вирус КЧС (штамм «Ши-Мынь»),

Рекомбинантный белок Е2, содержащий последовательность с 689 по 1031 а.о., был синтезирован в культуре клеток SF-21 с использованием бакуловируса в качестве вектора. Очистку гЕ2 проводили в денатурирующих условиях на Ni-NTA агарозе («Qiagen», США) по методике фирмы-изготовителя с небольшими изменениями [Кривонос и др., 2000]. Концентрацию белка в полученном препарате определяли модифицированным методом Лоури с использованием коммерческого набора «MicroBCA Protein Assay Kit» («PIERCE», США). Идентификацию и степень чистоты полученного

препарата проверяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) [Laemmli, 1970], а его активность и специфичность - в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) и иммуноблоттинге [Kyhse-Andersen, 1984] с использованием референтных МКА WH303, специфичных к белку Е2 вируса КЧС, любезно предоставленных доктором Drew Т. (Вейбридж, Великобритания).

Животные.

В работе использовали самок мышей линии BALB/c 3-4 недельного возраста массой 18-20 г, а также взрослых рожавших самок массой 25-30 г (питомник «Пущино», филиал ГУ ИБХ имени M. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Пущино).

Получение МКА.

Для иммунизации использовали самок мышей линии BALB/c. Первой группе животных внутрибрюшинно вводили очищенный гЕ2 вируса КЧС в концентрации 50 мкг/мышь в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) («Difco», США) 4-х кратно с интервалом 2 недели Вторую группу мышей иммунизировали нативным вирусом КЧС с активностью 108'5 ККИД50/см3 (по 200 мкл/мышь) 5-ти кратно с интервалом 2 недели в смеси с ПАФ. Бустерная доза вводилась без адъюванта внутрибрюшинно за 3 дня до выделения селезенки.

Гибридизацию проводили по методу [Kohler, Milstain, 1976]. Культуральные жидкости тестировали на наличие антител к вирусу КЧС в ИФА. Клоны, обнаружившие специфическую активность, реклонировали методом лимитирующих разведений. Позитивные реклонированные гибридомы наращивали в культуральных флаконах увеличивающихся размеров (25 см3, 75 см3) («Greinen>, Германия).

Для получения больших количеств антител гибридомы выращивали in vivo в виде трансплантируемой опухоли у мышей BALB/c, предварительно (за 14 дней до введения клеток) обработанных внутрибрюшинно 2,6,10,14-тетраметилпентадеканом (Pristane) («Sigma», США) в количестве 0,3-0,5 мл/животное.

Асцитные жидкости, содержащие МКА, получали через 7-15 дней после введения 5-10 млн. гибридомных клеток в брюшную полость праймированных мышей линии BALB/c.

Выделение иммуноглобулинов (Ig) класса G из асцитической жидкости проводили осаждением белков при помощи каприловой кислоты («Sigma», США) [McKinney, Parkinson, 1987]. Моноклональные антитела класса IgM выделяли трехкратным осаждением сульфатом аммония (50% насыщения) в течение 18 часов при +4°С.

Оптическую плотность растворов Ig измеряли на спектрофотометре («Eppendorf», Германия) при длине волны 280 нм. Концентрацию белка определяли по формуле:

C=D/1,34, где D - оптическая плотность, С - концентрация белка (мг/мл), 1,34 - оптическая плотность раствора белка с концентрацией 1 мг/мл.

Определение субкласса МКА, синтезируемых гибридомными клеточными линиями, проводили методом ИФА с помощью набора «Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit» («Sigma», США).

Получение препаративного количества очищенного вируса КЧС.

Для очистки нативного вируса КЧС штамма «Ши-Мынь» от клеточных компонентов лизат инфицированных клеток подвергали ультразвуковой гомогенизации с фреоном 113 с последующим 3-х кратным центрифугированием в течение 3-х часов при 210000g. Осадок ультрацентрифугировали в градиенте плотности сахарозы 24-28%, 210000g, в течение 16 часов. Титр вируса после очистки и концентрирования составил 108'5 ККИД50/см3.

Титрование вируса проводили в культуре клеток РК-15, с использованием реакции прямой иммунофлуоресценции. Титр вируса определяли по методу Рида-Менча и выражали в клеточно-культуральных инфекционных дозах (ККИДзо/см3).

Приготовление осветленных лизатов культуральных антигенов.

В качестве культуральных антигенов в «сэндвич»-варианте ИФА использовали сконцентрированные в одинаковом объеме, осветленные лизаты культур клеток РК-15, MDBK и MARK-145, инфицированных вирусами КЧС, ДКРС и РРСС соответственно. Работа с изолятами вируса КЧС выполнялась на базе ГНУ ВНИИВВиМ (г. Покров).

Для этого монослойную культуру клеток, выращенную в культуральных флаконах объемом 75 см3, инфицировали соответствующим вирусом множественностью заражения 0,01-0,001 ККИД50/клетка. Затем культуральную жидкость удаляли, а монослой двукратно промывали ФСБ. Клетки снимали со стекла механически. Отделившиеся клетки ресуспендировали в небольшом количестве физиологического раствора (1/100 от исходного объёма вируссодержащей жидкости), осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 минут. Полученный лизат клеток дважды замораживали -оттаивали. Клеточный детрит удаляли центрифугированием (3000 об/мин в течение 30 минут). Надосадочную жидкость использовали в качестве антигенов.

Препараты антигенов из неинфицированных культур клеток РК-15, MDBK и MARK-145 готовили аналогично.

Методы твердофазного иммуноферментного анализа.

Прямой метод ИФА.

Данный метод был использован для определения активности пероксидазных конъюгатов моноклональных антител.

В лунки полистироловых микропанелей («Greiner», Германия) вносили по 0,1 мл антигена в рабочем разведении или в виде ряда разведений в 0,1 М КББ рН 9,5 и инкубировали в течение 18 часов при +4°С. Во всех используемых методах ИФА остаточные сайты сорбции блокировали 1% Top Block («Yuro», Швейцария) в ФСБ с последующей инкубацией в течение 30 минут при +37°С. Затем вносили специфический конъюгат в рабочем разведении или в виде ряда разведений. Микропанели инкубировали в течение 1 часа при температуре

+37°С. После каждого этапа не связавшиеся реагенты отмывали пятикратно ФСБ с 0,1% Tween-20 (ФСБТ). В качестве субстрата использовали 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) («МДЛ», Россия). Реакцию останавливали через 15 минут, добавлением 1 М Н2 S04. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре Multiscan MCC («Flow», Великобритания) при длине волны 450 нм по коэффициенту оптического поглощения (ОП450). Пробу считали положительной при значении ОП450 в 2,2 и более раза превышающем величину отрицательного контроля.

Непрямой метод ИФА.

Для скрининга и оценки иммунологической активности МКА в лунки иммунологических микропанелей («Greiner», Германия) вносили 0,1 мл очищенного гЕ2 и/или нативного вируса КЧС в рабочем разведении в 0,1 М КББ рН 9,5. Микропанели инкубировали 18 часов при +4 С. Затем вносили в лунки 0,1 мл МКА в различных разведениях. Микропанели инкубировали 1 час при +37°С и добавляли пероксидазный конъюгат антител к IgG мыши («Sigma», США) в рабочем разведении. Инкубировали 1 час при +37°С. После каждого этапа несвязавшиеся реагенты отмывали ФСБТ. В качестве субстрата использовали ТМБ («МДЛ», Россия). Положительной считали реакцию при значении ОП450 в 2,2 раза превышающем величину отрицательного контроля.

Непрямой метод ИФА с синтетическими пептидами.

Стрептавидин («Sigma», США) сорбировали на микропанели («Greiner», Германия) в концентрации 0,1 мкг/100 мкл в 0,1 М КББ (рН 8,5) и инкубировали 18 часов при +4°С. Свободные сайты пластика блокировали добавлением в каждую лунку по 0,1 мл 2%-го раствора БСА в 0,01 М ФСБ (рН 7,4). Инкубировали в течение 30 минут при +37°С. После каждой инкубации микропанели отмывали 4 раза ФСБТ. На следующем этапе в лунки микропанелей в двух повторах вносили по 0,1 мл разведенных биотинилированных пептидов (0,3 мкг/100 мкл) и инкубировали 1,5 часа при +37°С. Затем вносили по 0,1 мл МКА в разведении 1:500 и инкубировали 18 часов при +4°С. В качестве отрицательного контроля использовали МКА к нуклеопротеину вируса гриппа А птиц, полученные нами ранее, в том же разведении. После отмывки вносили пероксидазный конъюгат антител к IgG мыши («Sigma», США) в рабочем разведении с последующей инкубацией в течение 1 часа при +37°С Реакцию после добавления субстратной смеси останавливали через 15 минут добавлением 1 М Н2 S04. Положительной считали реакцию при значении ОП450 в 2,2 раза превышающем величину отрицательного контроля.

Конкурентный ИФА.

В лунки 96-луночной микропанели, предварительно сенсибилизированные гЕ2 и/или нативным вирусом КЧС в рабочем разведении, вносили очищенные МКА в концентрации 0,05 мг/мл и инкубировали 1 час при +37°С. Затем вносили конъюгированные с пероксидазой хрена МКА в разведениях, позволяющих получить оптическую плотность в пределах 1 - 1,5, при взаимодействии с антигеном в отсутствии конкурирующих антител. Определение активности МКА определяли

спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Конкурентные отношения между MICA выражали как процент ингибирования связывания меченых MICA с гЕ2 конкурирующими немечеными МКА.

«Сэндвич»-вариант ИФА.

Для выявления антигенов вируса КЧС в лунки полистироловых микропанелей вносили по ОД мл специфических МКА полученных к нативному вирусу КЧС в рабочем разведении в 0,1 M КББ рН 9,5 и инкубировали в течение 18 часов при +4°С. Затем вносили по 0,1 мл специфических и незараженных культуральных антигенов в одном или в серийных разведениях на 0,1 M КББ, и инкубировали в течение 1 часа при температуре +37°С. Планшеты отмывали ФСБТ и в каждую лунку добавляли по 0,1 мл МКА полученных к нативному вирусу КЧС, конъюгированных с пероксидазой хрена в рабочем разведении. Микропанели инкубировали в течение 1 часа при температуре +37°С, отмывали шестикратно ФСБТ и затем вносили по 0,1 мл субстратного буфера. Через 20 минут проводили учёт результатов, как указано выше. Пробу считали положительной при значении ОП45о в 2,2 и более раза превышающем величину отрицательного контроля.

Иммуногистохимический анализ (ИГХ).

Культуру клеток РК-15, ТЯ и MDBK выращенную в лунках 96-ти луночных культуральных панелей («Sigma», США) в течение 2-х суток, заражали соответствующим вирусом КЧС (штамм «Ши-Мынь», вакцинный штамм «КС») и вирусом ДКРС (штамм «Nadl»), В каждую лунку вносили 0,1 мл культуральной жидкости, содержащей 1000 ККИД50/см3 вируса. Клетки инкубировали при +37 С в атмосфере 95% - ной влажности и 5% С02 в течение 48 часов. Среду для культивирования из лунок удаляли, клеточный монослой промывали двукратно ФСБ, фиксировали смесью 30% ацетона и физиологического раствора в течение 30 минут и высушивали под потоком воздуха в течение 2 часов. В лунки панелей вносили по 0,1 мл испытуемых МКА в серийных разведениях (от 1:20 до 1:2560) в ФСБТ. Панели инкубировали в течение 1 часа при +37° С. Лунки панелей четырёхкратно отмывали ФСБ, вносили по 0,05 мл в лунку рабочего раствора хромогенного субстрата и через 30 минут инкубирования при комнатной температуре проводили световую микроскопию. В качестве субстратного буфера для ИГХ использовали 3 - амино - 9 - этилкарбазол («Sigma», США).

При определении активности МКА в ИГХ за титр принимали их максимальное разведение, при котором обнаруживалось специфическое окрашивание внутриклеточного антигена вируса КЧС в заражённой культуре клеток РК-15 и отсутствовало окрашивание неинфицированных клеток.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка

Е2.

Сравнение аминокислотных последовательностей белка Е2 различных штаммов пестивирусов, взятых из базы данных GeneBank, проводили с использованием пакета программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright © 1997-2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение МКА к гликопротеину Е2 вируса КЧС.

Для получения МКА, специфичных к антигенным детерминантам вируса КЧС, было необходимо индуцировать максимальный иммунный ответ на введение антигенов вируса у мышей линии BALB/c - доноров иммунных спленоцитов. С этой целью 6 мышам линии BALB/c внутрибрюшинно вводили антигены вируса КЧС 4-5 кратно с интервалом 2 недели. Начиная со второй иммунизации, сыворотки мышей тестировали в ИФА на наличие специфических антител. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки крови незаражённых, клинически здоровых мышей линии BALB/c. Двух мышей, имеющих после последней иммунизации наивысший титр специфических антител, бустировали.

После бустерной иммунизации татр антител к вирусу КЧС в гипериммунных сыворотках животных в ИФА был определен как 10"5. В ходе двух последовательно проведенных гибридизаций было получено 1024 гибридных клеточных линий, устойчивых к селективной среде HAT. Начиная с 14 дня, проводили скрининг гибридомных культур на присутствие специфических антител к белкам вируса КЧС методом ИФА. В качестве антигенов, сорбированных на поверхности лунок 96 луночных панелей, использовали нативный вирусный антиген и гЕ2 вируса КЧС.

При первичном тестировании культуральных жидкостей было отобрано 74 клона, реагировавших с гЕ2, либо с нативным вирусом КЧС.

С целью стабилизации хромосомного набора и специфической секреции иммуноглобулинов было проведено трехкратное клонирование гибридом методом предельных разведений. Большинство гибридных клеток оказались нестабильными по продукции МКА. В результате было отобрано 28 гибридом, продуцирующих МКА к белкам вируса КЧС. Из них 18 МКА были получены к гЕ2 из высоковирулентного штамма «Ши-Мынь» вируса КЧС, а 10 МКА - к нативному вирусу КЧС, штамм «Ши-Мынь».

С целью получения препаративных количеств МКА взрослым рожавшим самкам мышей линии BALB/c внутрибрюшинно вводили 5-10 млн. гибридомных клеток в 0,6-1 мл среды RPMI-1640. Отбор асцитической жидкости проводили на 10-14 сутки после введения гибридом. От каждой мыши получали 3-6 мл асцита. Асцитные жидкости были получены от всех 28 гибридомных клонов.

Иммунохимическая характеристика МКА.

Для того чтобы оценить перспективы и диапазон использования полученных гибридом, была проведена первоначальная оценка МКА как в виде асцитов, так и в виде очищенных препаратов иммуноглобулинов. Иммунохимическая характеристика МКА представлена в таблице 1.

Было установлено, что 24 гибридомы продуцировали антитела класса IgG и клетки 4 клонов - IgM. Наиболее высокой активностью в отношении гЕ2

обладали 5 МКА: ЗсЗ, 4е12, ЗЫ1, 5с5 и 5а12. Кроме того, МКА ЗЫ1 и 5а12 взаимодействовали с нативным вирусом КЧС.

Шесть МКА были высоко активны в отношении нативного вируса: 8с4, 8Ь2, За5, 9d7, ЗЫОи 8f7 и реагировали с гЕ2. Четыре МКА (4с4, 2а7, ЗЬ9 и 8Ь4), относящиеся к IgM-изотипу, также взаимодействовали как с вирусом, так и с гЕ2.

Таблица 1.

Иммунохимическая характеристика МКА к вирусу КЧС.

Активность МКА Активность МКА Активность

в культурапьнои в асцитической очищенных

№ п/п МКА Субкласс МКА жидкости в ИФА* жидкости в ИФА* препаратов МКА в ИФА*

Вирус КЧС Рекомб. белок Е2 Вирус КЧС Рекомб. белок Е2 Вирус КЧС Рекомб. белок Е2

1 ЗсЗ1 IgG2a - 640 - 10' - 106

2 4е12' IgGl - 640 - 105 - ЗхЮ5

3 ЗЫ11 IgG2b - 320 - 10" 200 ЗхЮ5

4 5с5' IgG2a - 320 - 10> - 6хЮ4

5 5а12' IgG2b - 160 - ю3 200 6x104

6 2с7' IgG2b 1280 25 450 100 640 100

7 5аб' IgGl - 100 - 5х104 - ЗхЮ3

8 6hl' IgGl - 100 - 5х104 - ЗхЮ5

9 5е10' IgGl - 200 - ЗхЮ5 - ЗхЮ5

10 2а1' IgGl - 100 - 5х Ю4 - 3x10'

И lh9' IgGl - 100 - 5х 104 - ЗхЮ5

12 2Ь6' IgGl - 200 - 10> - ЗхЮ5

13 lelO1 IgGl - 100 - 5хЮ4 - ЗхЮ5

14 4П11 IgGl - 100 - 5хЮ4 - ЗхЮ5

15 5ЬЗ' IgGl - 250 - 5х104 - ЗхЮ5

16 1е8' IgGl - 100 - 5хЮ4 - ЗхЮ5

17 2f4' IgG2b - 250 - 104 - ЗхЮ5

18 4d3l IgGl - 640 - 5x10" - ЗхЮ5

19 4с42 IgM 32 10 500 100 1,5х 103 200

20 ЗЬ9' IgM 10 - 500 100 1,5хЮ3 640

21 8Ь42 IgM 128 - 500 100 320 200

22 2а72 IgM 10 - 500 100 l,5xlOJ 640

23 8с4' IgGl 128 - Ю5 - 10> 450

24 8Ъ2* IgGl 64 - 105 - 10> 1350

25 За52 IgGl 128 - 5x10" - 1хЮ4 100

26 9d72 IgG2b 128 - ЗхЮ4 - 1хЮ4 100

27 ЗЫО" IgG2a 256 - Ю5 - ЗхЮ4 100

28 8f72 IgG2a 256 - ЗхЮ4 - ЗхЮ4 100

Примечание: * - обратные величины титров; прочерк — отсутствие взаимодействия;

1 - МКА, полученные на гЕ2; 2 - МКА, полученные на вирус КЧС.

Специфичность связывания МКА с белком Е2 вируса КЧС была установлена с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН в денатурирующих условиях и иммуноблоттинга. Было показано, что МКА всех изученных клонов связываются с антигенными детерминантами, расположенными на белке Е2 вируса КЧС, и дают специфическую полосу окрашивания в области 55 кДа, что соответствует молекулярной массе данного гликопротеина (рисунки 1 и 2).

1 2 3 4 5 6 7

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

- Е2-

(gpS5)

21 22

- 97 kDa

- 66 kDa

-45 kDa

-31 kDa -21 kDa

Рисунок 1. Иммуноблоттинг с МКА к белку Е2 вируса КЧС.

1 - ЗсЗ, 2 - 4е12, 3 - 5с5, 4 - ЗЫ1, 5 - 5а12, 6 - 2с7, 7 - 5е10, 8 - 4Ш, 9 - 5а6, 10 -2а1, 11 - 6Ь1, 12 - 1е10, 13 - 1Ь9, 14 - 5ЬЗ, 15 - 2Ь6, 16 - 4<13, 17 - 2{4, 18 - 1е8, 19 - К" (асцит содержащий МКА к белку гК вируса РРСС), 20 - К+ (референтные МКА WH303), 21 - белок Е2 0»р55), электрофорез в 12% ПААГ-ДСН, 22 - маркеры молекулярных весов. Антитела брали в рабочем разведении.

1 2

4 5 б 7 8 9 10 И 12

13 14

-Е2 (gp55)

97 kDa-66 kDa-45 kDa-

31 kDa-

I-E2 (gp55)

Рисунок 2. Иммуноблоттинг с МКА к вирусу КЧС.

1 - 8с4, 2 - 8Ь2, 3 - 8Ь4, 4 - ЗЬ9, 5 - 4с4, 6 - 2а7, 7 - 9с17, 8 - ЗЫО, 9 - 8Г7, 10 - За5,11 - К" (ростовая среда), 12 — К (гипериммунная сыворотка мыши после бустерной иммунизации вирусом КЧС), 13 - маркеры молекулярных весов, 14 - очищенный вирус КЧС, электрофорез в 12% ПААГ-ДСН. Антитела брали в рабочем разведении.

Исключение составили клоны За5 и 2а7. Данные МКА, полученные к нативному вирусу, не взаимодействовали с антигеном в иммуноблоттинге, однако реагировали с гЕ2 в ИФА, что позволило определить их белковую специфичность. Отрицательные результаты иммуноблогтинга, вероятно, связаны с конформационной природой детерминант, выявляемых этими МКА. Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о высокой специфичности полученных МКА.

Способность МКА взаимодействовать с натуральными белками вируса КЧС была изучена в ИГХ (рисунок 3). Было показано, что МКА всех изученных клонов реагировали с вирулентным штаммом «Ши-Мынь» и не взаимодействовали с вакцинным штаммом «КС» вируса КЧС. Кроме того, отсутствовала перекрестная реактивность всех изученных МКА с близкородственным вирусом ДКРС, что может говорить о специфичной для вируса КЧС природе эпитопов, к которым направлены данные антитела.

С. Г).

Рисунок 3. Окрашивание цитоплазмы клеток РК-15, инфицированных вирусом КЧС (штамм «Ши-Мынь-51») методом ИГХ с использованием МКА клонов 9с17 (А), ЗЫО (В), 817 (С) (множественность заражения 0,01-0,001 ККИД50/клетка, через 48 часов культивирования); Б -незараженная культура клеток РК-15.

Из 18 МКА, полученных к гЕ2, три антитела (5а12, 2а1, 2Ь6) имели наибольший титр, при котором обнаруживалось специфическое окрашивание внутриклеточного антигена вируса КЧС в заражённой культуре клеток РК-15 и отсутствовало окрашивание неинфицированных клеток.

Определение способности МКА выявлять нативные антигены вируса КЧС в «сэндвич»-варианте ИФА.

Учитывая способность МКА выявлять природные антигенные детерминанты белка Е2 вируса КЧС, представляло интерес выяснить возможность использования данных антител для обнаружения антигенов вируса КЧС методом «сэндвич»-варианта ИФА.

Для выполнения «сэндвич»-варианта ИФА было необходимо подобрать пары немеченых (улавливающих) и меченых (детектирующих) МКА. Для этого первоначальными задачами были определение рабочего разведения МКА для сенсибилизации подложки и определение титра и рабочего разведения конъюгата МКА-ПХ каждого клона. Для разработки «сэндвич»-варианта ИФА использовали МКА, полученные на нативный вирус КЧС.

Результаты экспериментов показали, что методом «сэндвич»-варианта ИФА антиген вируса КЧС (штамм «Ши-Мынь») наиболее эффективно выявляется при концентрации улавливающих (сенсибилизирующих) МКА не менее 0,0125 мг/мл. Рабочие разведения конъюгатов 8с4-ПХ, 8Ь2-ПХ, За5-ПХ, 9сГ7-ПХ, ЗЫО-ПХ и 8П-ПХ составили 1:3000, 1:3300, 1:3000, 1:400, 1:300 и 1:250 соответственно.

В результате было отобрано 7 пар улавливающих и детектирующих МКА (За5:За5-ПХ; 8Г7:За5-ПХ; ЗЫ0:За5-ПХ; 9с17:ЗЬ10-ПХ; 9<17:8с4-ПХ; 8Ь2:8с4-ПХ; 8с4:8Ь2-ПХ) наиболее эффективно выявляющих антиген нативного вируса КЧС. Результаты подбора пар улавливающих и детектирующих МКА представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты обнаружения нативного вируса КЧС методом «сэндвич»-варианта ИФА при различном сочетании улавливающих и

детектирующих моноклональных антител.

Наименование гибридом и используемые пары моноклональных антител: Обнаружение нативного вируса КЧС, штамм «Ши-Мынь» (активностьЮ^ККЩЬ/см3) в разведении:

улавливающие (сенсибилизирующие) МКА детектирующие МКА (конъюгат МКА-ПХ)

8Г7 За5-ПХ 1:1280

За5 За5-ПХ 1:160

ЗЫ0 За5-ПХ 1:1280

9с17 ЗЫО-ПХ 1:640

9с17 8с4-ПХ 1:320

8Ь2 8с4-ПХ 1:640

8с4 8Ь2-ПХ 1:640

Определение специфичности «сэндвич»-варианта ИФА проводили с использованием 4 вариантов пар антител (8П:За5-ПХ, ЗЬ10:За5-ПХ, 8Ь2:8с4-ПХ, 8с4:8Ь2-ПХ). Было установлено, что сорбированные МКА (улавливающие антитела) на планшете и конъюгаты на их основе (детектирующие антитела) реагировали только с антигеном вируса КЧС и не реагировали с антигенно-родственными, гетерогенными антигенами и осветленными лизатами незараженных культур клеток (таблица 3).

Следует отметить, что из 8 полевых изолятов вируса КЧС, использованных в «сэндвич»-варианте ИФА, МКА пар 8Г7:За5-ПХ и ЗЫ0:За5-ПХ выявляли антигены двух (№842, 860), а антитела пар 8Ь2:8с4-ПХ и 8с4:8Ь2-ПХ - антигенные детерминанты четырех изолятов (№ 842, 860, 870, 851). Эти данные свидетельствуют о гетерогенности среди различных полевых изолятов вируса КЧС, которая может быть связана с вариабельностью некоторых эпитопов/доменов белка Е2.

Таблица 3.

Определение специфичности «сэндвич»-варианта ИФА на основе МКА для обнаружения антигена вируса КЧС.

№ п/п Исследуемые материалы Титр вируса 18ККИД(ТЦЩ50/см3 Пары МКА:МКА-ПХ

8П:За5- пх ЗМ0:За5- пх 8Ъ2 :8с4-ПХ 8с4 :8Ь2-ПХ

Полевые изоляты вируса КЧС:

1 №652 3,0 - - - -

2 №842 3,0 1:10 1:20 1:10 1:20

3 №760 3,0 1:20 1:20 1:10 1:20

4 №745 3,0 - - - -

5 №843 3,0 - - - -

6 №870 3,0 - - 1:10 1:20

7 №751 3,0 - - 1:10 1:20

8 №742 3,0 - - - -

9 Вирус ДКРС, штамм «N8(11» 5,5 - - - -

10 Вирус РРСС, штамм Ье1у$1а(1 7,5 - - - -

Осветленные лизаты незараженных культур клеток:

11 РК-15 - - - - -

12 МБВК - - - - -

13 МАМС-145 - - - - -

Примечание: прочерк - отсутствие взаимодействия.

Полученные в результате проведенных экспериментов данные позволяют заключить, что МКА к нативному вирусу КЧС могут быть использованы в качестве специфических реагентов для обнаружения антигенов вируса КЧС методом «сэндвич»-варианта ИФА. Данная система является специфичной и чувствительной, однако для оценки ее практической значимости необходимо провести дальнейшие исследования с использованием биологических образцов инфицированных животных.

Топографическое картирование эпитопов на белке Е2 вируса КЧС с помощью конкурентного ИФА.

На следующем этапе работы представляло интерес выяснить, с одним или несколькими эпитопами взаимодействуют полученные МКА. Для этого был проведен конкурентный ИФА. Анализировали взаимодействие

конъюгированных МКА с гЕ2, либо нативным вирусом КЧС в присутствии немеченых МКА. В связи с тем, что МКА класса IgM были нестабильны и теряли активность в процессе хранения, в последующей работе были использованы антитела только класса IgG.

Было показано, что МКА 5с5 и ЗсЗ полностью подавляли связывание друг друга с гЕ2 вируса КЧС. Между МКА 4d3, 5а6, 6hl, 2al, lh9, 2Ь6, lelO, 4fll и 5ЬЗ наблюдалось симметричное активное подавление связывания с гЕ2, свидетельствующее о конкурентных отношениях. МКА ЗЫ1 не конкурировали ни с одним из антител за исключением 5с5. При других изученных сочетаниях МКА односторонне, несимметрично блокировали связывание друг друга с гЕ2. При исследовании конкурентных отношений МКА, полученных к нативному вирусу КЧС, было установлено, что МКА 8Ь2 и 8с4 полностью подавляли связывание друг друга с вирусом КЧС. Немеченые МКА 8f7 подавляли связывание конъюгата MICA ЗЫО, однако немеченые антитела ЗЫО не обладали способностью конкурировать с конъюгатом 8f7. Аналогичная картина наблюдалась в паре МКА За5 - 2с7. Антитела 9d7 не конкурировали ни с одним из изученных МКА.

Конкуренция между МКА и конъюгатом МКА в конкурентном ИФА говорит о том, что эпитопы, узнаваемые двумя МКА, перекрываются или расположены на антигене рядом друг с другом. Поскольку информация, полученная на основе данных нереципрокной конкуренции, неоднозначна, нами были объединены результаты, указывающие на реципрокные конкурентные отношения между МКА. Сравнительный анализ этих данных позволяет сделать заключение о том, что изученные МКА направлены к 8 различным эпитопам белка Е2 вируса КЧС (рисунок 4).

Рисунок 4. Схематичное изображение 8 групп МКА, направленных к различным эпитопам белка Е2 вируса КЧС. В окружностях обозначены номер группы и соответствующие ей МКА.

Таким образом, на первом этапе работы нами получена коллекция из 28 гибридом, продуцирующих специфические МКА к белку Е2 вируса КЧС. Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что белок Е2 КЧС включает по крайней мере 8 иммуногенных этологов.

Определение способности полученных МКА конкурировать с поликлональными антителами к вирусу КЧС за связывание с эпитопами на белке Е2.

На следующем этапе работы представляло интерес выяснить, способны ли полученные МКА конкурировать с поликлональными сывороточными антителами к вирусу КЧС за связывание с белком Е2.

Эпитопную специфичность МКА и поликлональных антител к вирусу КЧС также определяли в конкурентном ИФА. В нашей работе была выбрана схема анализа, основанная на принципе конкуренции сывороточных антител с конъюгированными с пероксидазой хрена МКА к белку Е2 вируса КЧС за связывание с иммобилизированным на микропанели гЕ2. Такой принцип используется во многих тест-системах, которые используются для оценки иммунитета у вакцинированных животных.

Постановку анализа выполняли согласно наставлению по применению набора «КЧС-серотест» (НПО «Нарвак», Россия), заменив пероксидазный конъюгат МКА из коммерческого набора конъюгатами МКА-ПХ на основе МКА, полученных к гЕ2 в данной работе. Рабочим разведением конъюгатов МКА-ПХ считали разведение, позволяющее получить ОП450В пределах 1-1,5, при взаимодействии с антигеном в отсутствии конкурирующих антител. Результаты анализа выражали в виде коэффициента ингибирования (Кинг).

При постановке анализа использовали 9 положительных и 3 отрицательных на КЧС сыворотки свиней (ЗАО «Троицкий», Губкинского района, Белгородской области) отобранные на наборе «КЧС-серотест» и имеющие Кинг равный 90-120% и 6-27% соответственно.

Считали, что сывороточные антитела конкурируют за связывание конъюгата МКА-ПХ с эпитопами на белке Е2 вируса КЧС при значении Кикг >50%. Результаты конкуренции МКА с поликлональными антителами к вирусу КЧС за связывание с эпитопами на белке Е2 представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Конкуренция между MICA и поликлональными антителами к вирусу КЧС за связывание с эпитопами на белке Е2.

Конъюгаты МКА Положительные на КЧС сыворотки крови свиней:

№1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9

ЗсЗ - - - + + - - + +

4е12 + + + + + + + + + + + + + + + + + +

ЗЫ1 - - - - - - - - -

5с5 - - - + - - - - -

5а12 - - - - - - - - -

4d3 - + + + + + - - +

5а6 + + + + + + - - +

6hl - + + + + + - + + +

5е10 + + + + + + + - + + +

2а 1 - + + + + + + + - + + + +

lh9 + + + + + + + + - + + +

2Ъ6 + + + + + + + + + + + + - + + +

1с10 + + + + + + - + + +

4fl 1 + + + + + + - + +

5ЬЗ + + + + + + - + +

1е8 + + + + + + - + -

2f4 + + + + + + - + +

2с7 + + + - - - - + +

Примечание:

Степень подавления связывания конъюгатов МКА сывороточными антителами (Кинг): прочерк-<50%; +-50-60%; + + -на60-70%.

Конкурентный анализ показал, что поликлональные антитела к вирусу КЧС ингибировали связывание всех МКА, за исключением МКА ЗЫ1 и 5а12, с гЕ2, однако степень ингибирования различалась. При этом Кинг составлял 5070% для разных МКА и разных сывороток. Наиболее активно антитела сывороток конкурировали с МКА 4е12. МКА клона 5с5 конкурировали с поликлональными антителами к вирусу КЧС только одной сыворотки.

Сыворотки крови свиней, не содержащие специфических антител к вирусу КЧС, не конкурировали за связывание с гЕ2 ни с одним из исследуемых МКА.

Неодинаковая конкурентоспособность МКА, видимо, связана с тем, что отдельные антигенные детерминанты гликопротеина Е2 вируса КЧС обладают различной иммуногенностью. В связи с этим уровень сывороточных антител, взаимодействующих с различными эпитопами белка Е2, у иммунных животных значительно отличался.

Отсутствие конкурентных отношений между МКА ЗЫ1 и 5а12 и сывороточными антителами, видимо, связано с тем, что эпитопы, узнаваемые данными MICA, не достаточно хорошо экспонированы на нативном антигене и мало доступны для иммунной системы. Следовательно, в свиной гипериммунной сыворотке содержится небольшое количество антител к ним.

Картирование антигенных детерминант белка Е2 вируса КЧС с помощью синтетических пептидов.

На заключительном этапе работы, для более детального определения антигенных детерминант белка Е2 вируса КЧС, нами проведено эпитопное картирование полученных МКА с помощью синтетических пептидов.

Поскольку основные антигенные домены A-D гликопротеина Е2 расположены в N-терминальной части белка (690-866 а.о.) [van Rijn et. al., 1993], на первом этапе работы использовали набор из 21 перекрывающегося пептида длиной 15 а.о. покрывающий данную последовательность. В дальнейшем были синтезированы еще 11 пептидов аналогичной длины без перекрытия, которые захватывали последовательность (865-1029 а.о.), формирующую высокоскладчатую структуру белка Е2 (рисунок 5).

Ни одно из 6 МКА (8с4, 8Ь2, За5, 9d7, ЗЫО, 8f7), полученных на нативный вирус КЧС штамм «Ши-Мынь», не взаимодействовало в ИФА с синтетическими пептидами. Тем не менее, данные МКА были высокоактивны в отношении нативного вируса КЧС и реагировали с гЕ2. Данные реципрокного конкурентного анализа позволили установить, что эти МКА распознают 3 неперекрывающихся эпитопа на белке Е2. Активность взаимодействия данной группы антител с нативным вирусом КЧС также сохранялась в иммуноблоттинге (за исключением клона За5) (рисунок 2). Отсутствие строгой зависимости данных МКА от конформационной полноценности белка Е2, с одной стороны, и отрицательные результаты анализа взаимодействия с синтетическими пептидами, имитирующими линейные эпитопы - с другой, позволяют предположить, что данные МКА направлены к прерывистым антигенным детерминантам. Подобные эпитопы были описаны ранее для бежа Core вируса гепатита С [Monielli et al., 1993].

22. Ш^УСКХССтУТСЧ'К

23. СЕРУУУТССОУКОСК

24. \газР0тЕР00ЬРНУ

25. РЮКСИ-АЫЕТСУЫ

26. VDSTDCNRDGVV1SA

27. ЕСЗНЕаЖЗЫТТУКУ

28. НАЗОЕЫ,СРМРСЯРК

29. Е^ЗБАОРУЮСТЭСТ

30. РЫУАКТЬКМКУУЕРЯ

31. БЗУРООУМЬКСЕУОУ

32. ШРОЬОУТОЯНЗОУРА

(865-879 а.о.) (880-894 а.о.) (895-909 а.о.) (910-924 а.о.) (925-939 а.о.) (940-954 а.о.) (955-969 а.о.) (970-984 а.о.) (985-999 а.о.) (1000-1014 а.о.) (1015-1029 а.о.)

ЫН2;С

690

В/С

766

866-

1062

1-СООН

ПЬЛСКЕОЧ'ЯУЛ^ЗТ (690-704 а.о.)

1 КУАВЗТШЮЬЬСА (698-712 а.о.)

2 ЕЮЬЬСАССЬТТТОК. (706-720 а.о.)

3 СЬТГТОКЕУБНОЬОЬ (714-728 а.о.)

4 У5НОЬдЬЫООТУКА1 (722-736 а.о.)

5 ОСТУКАЮУАСБРКУ (730-744 а.о.)

6 VAGSFK.VTAL.NWSR (738-752 а.о.)

7 ЛЬМУУБККУЬАБЬНК: (746-760 а о.)

РБТЕЕМСЭОРСРСЬС (778-792 а.о.) 8 УЬАЗЬИКСАЬЬТБУТ (754-768 а.о.)

12 ОРвРвЬСРРОТБРУУ (786-800 а.о.) 9

13 РОТБРУУКСКУЫТТХ (794-808 а.о.)

14 СК.УМТТШЧС8АРУЬ (802-816 а.о.)

15 NGSAFYLVCP1GWTG (810-824 а.о.)

16 CPIGWTGVIECTAVS (818-832 а.о.)

17 1ЕСТАУБРТТЬЯТЕV (826-840 а.о.)

18 ТТЬЯТЕУУКТРКЯЕК ( 834-848 а.о.)

19 ЮТШШКРЕРШШОС (842-856 а.о.)

20 РРНЯМОСУТТТУЕМЕ (850-864 а.о.) 21

Рисунок 5. Диаграмма синтетических пептидов, перекрывающих последовательности антигенных доменов В/С и А (690-866 а.о.) и высокоскладчатой структуры (866-1030 а.о.) белка Е2 вируса КЧС штамм «Ши-Мынь».

Аил-БУТРЕШТСТ (762-776 а.о.)

10 ЕЬЬРООТЫРБТЕЕМС (770-784 а.< 11

Из 18 МКА, полученных к гЕ2 вируса КЧС, 8 антител (ЗсЗ, 4е12, ЗЫ1, 5а 12, 5е10, 2а 1, 2Ь6, 4d3) взаимодействовали с синтетическими пептидами (таблица 5).

Таблица 5.

Эпитопная специфичность и иммунохимическая характеристика МКА к белку Е2 вируса КЧС.

МКА Эпитопная специфичность (пептид, а о.) P/N Активность очищенных препаратов МКА в ИФА*

нативный вирус КЧС гЕ2

ЗсЗ1 834-848 18,2 - 106

842-856 8,57

4с12' 895-909 18,68 - ЗхЮ5

ЗЫ11 834-848 2,52 200 ЗхЮ5

842-856 2,83

985-999 9,87

5с5' - - - 6хЮ4

5а12' 895-909 8,81 200 6х104

2с7' - - 640 100

5аб' - - - ЗхЮ5

6hl1 - - - ЗхЮ5

5е10' 842-856 2,67 - ЗхЮ5

2а1' 842-856 2,77 - ЗхЮ5

1К91 - - - ЗхЮ5

2Ьб' 778-792 2,36 - ЗхЮ5

842-856 2,57

lelO1 - - - ЗхЮ5

4П11 - - - ЗхЮ5

5ЬЗ1 - - - ЗхЮ5

1е8' - - - ЗхЮ3

2F41 - - - ЗхЮ5

4d3] 842-856 2,61 - ЗхЮ5

8с42 - - 105 450

8Ь22 - - 105 1350

За52 - - lxio4 100

9d72 - - lxio4 100

ЗЫО2 - - 3х 104 100

8Í72 - - ЗхЮ4 100

Примечание: * - обратные величины титров;

прочерк - отсутствие взаимодействия; '- МКА, полученные на гЕ2; 2 - МКА, полученные на вирус КЧС;

P/N — отношение положительного сигнала к фону, при разведении МКА 1.500.

МКА 4е12 и 5а12 реагировали в ИФА с одним общим пептидом №24 (WCGFDFNEPDGLPHY, 895-909 а.о.). Однако афинность взаимодействия

данных МКА с указанной последовательностью различалась в 2 раза (таблица 5). Совокупность данных пептидного картирования, конкурентного реципрокного анализа и взаимодействия с денатурированным гЕ2 позволяет заключить, что МКА 4е12 и 5а12 опознают два различных неперекрывающихся линейных эпитопа в пределах последовательности 895-909 а.о. высокоскладчатой структуры белка Е2 вируса КЧС. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка Е2 различных штаммов пестивирусов показал, что данный участок гликопротеина высококонсервативен среди всех изученных штаммов вируса КЧС, за исключением некоторого полиморфизма в позициях 901 и 902, но обладает низкой гомологией с аналогичным участком вирусов ДКРС и ПБО (особенно в регионе 898-904 а.о.) (рисунок 6).

MICA 4е12 конкурировало с поликлональными антителами всех положительных на КЧС сывороток (таблица 4), а также было способно выявлять природные антигенные детерминанты белка Е2 вируса КЧС в ИГХ. Следовательно, можно заключить, что В-клеточный эпитоп для этого МКА обладает достаточно выраженной иммуногенностью и, не смотря на его локализацию в высокоскладчатой структуре гликопротеина, хорошо экспонирован на молекуле белка Е2.

Еще один В-клеточный эпитоп был картирован для МКА ЗЫ1 на участке 985-999 а.о., соответствующем последовательности FNYAKTLKNKYYEPR (пептид №30) главного гликопротеина вируса КЧС (таблица 5). Кроме того, указанное МКА, проявляло небольшую перекрестную реактивность еще с двумя перекрывающимися пептидами №19 (TTLRTEWATFRREK, 834-848 а.о.) и №20 (Á7FRREKPFPHRMDC, 842-856 а.о.), что, вероятно, можно объяснить наличием в последовательностях всех указанных пептидов последовательно расположенных высокополярных лизина (К) и треонина (1). Последовательность 985-999 а.о. консервативна среди всех пестивирусов, за исключением аминокислотных позиций 988, 992 и 994 в которых наблюдается некоторый полиморфизм (рисунок 6).

Антигенная детерминанта, локализованная для МКА ЗЫ1, содержит в себе эпитоп YYEP (995-998 а.о.), описанный ранее Yu М. с соавторами [Yu et. al., 1996], а также часть одного из Т-клеточных эпитопов (996-1010 а.о.) [Armengol et. al., 2002].

Несмотря на то, что МКА ЗЫ1 было способно выявлять природные антигенные детерминанты белка Е2 вируса КЧС, его активность в ИГХ была слабой. Кроме того, данное антитело не взаимодействовало с антигенами вируса ДКРС и не обладало способностью конкурировать с поликлональными антителами к вирусу КЧС за связывание с белком Е2. Суммируя полученные данные можно заключить, что эпитоп, узнаваемый МКА ЗЫ1, является консервативным для всех представителей пестивирусов. Кроме того, антигенная детерминанта для данного МКА, видимо, обладает невысокой иммуногенностью и часть ее скрыта в высокоскладчатой структуре гликопротеина Е2.

AFO9244В CSFV

AF099102 CSFV

mm csfv

J04358 CSFV

AY259122 c8fv

AF0915P7 CSFV

AF326963 CSFV

AF091661 CSFV

X96550 CSFV

ш5478 csfv

D49533 CSFV

DQ127910 CSFV

SC 001461 BTOVla Ш

H96687 BVIJVlb Osloss

AF502399 BVDV2 Hew York'93

Shimen C3

Alfort 187

Alfort/Tuebingen

Riems

HCLV

Eystrup

Brescia

CAP

Glentorf

GPS

SDH

770 780 790 800 «10 820 830 840 850 860 870 880

T3VTFELLFD:T NPs'eEM DDF-F.ICPFDTSPWR miI4a;SAraVCPI'WT-VIE CTAV3PmRTETOTFmKEFFMDCmTmEDLFyCRb"MrCVK:-EEWYT:

890

--QVKQCK

NC 003679 BDV AF002227 BDV

1818 C413

fl L____R

........R8 L....R

n L....R

L....R I....R L....R

...V RR... RKQEDW. .N.N.E ..C.AX.I.R • F..... . P. • CM. .. IVS . 3FEMD. ■ A.T • Я.У. .3. ,...Q .I.QKM13. • И. I. . ....P DQLL.R SIES..

..V..RII. KEQEDW.. D N EL . C.AR.L.R •F.. .. . P. QM. . TVSl HUSKRD. • АКТ •R YR.HR . F.Q .I.QK.I-3 .YD.A. . ....P DILR.VD P.E3..

..AE.MQIS. .1'. DVID. Р... Е. .D.T IR.Y. и .QR.M.TYEKI3. IYE.I., . ...IT DKSRIRD PI.R..

.....IP3 3 AMTE . ...Е ..С.SR ... .Q.I .Y .V RV. Т..КЗ. .A . ..IYKKT. . Q.V\DH.. ,YKQ .YH.Cif . ...MR .V.R.V P..R.E

..АЕ MQIS. •IA.DVID.T...E ..С SR .1. .F.AS.. . P. .QM. • Q . R.. .IANQD. • D.T .ЛЛ. TT .OR.RW.TYEKMI-. IHE.I. . ...IT .H2RIKD PI.R..

AF092448 CSFV

AF099102 CSFV

ХВ79Э9 CSFV

J04358 CSFV

AY259122 CSFV

AF091507 C3FV

AF326963 CSFV

AF091661 CSFV

196550 CSFV

U45478 CSFV

D49533 CSFV

DQ127310 CSFV

NC 001461 BVDVla NAM

«96687 BVDVlb Osloss

AF502399 BVBV2 St* York'93

NC 003679 BDV 1818

AF002227 BDV C413

900

910

920

930

940

950

960

970

990

1000

1010

1020

1030

N3 N>

Shimen CS

Alfort 187

Alfort/Tuchingen

Riems

HC1V

Eystrup

Brescia

CAP

Glentorf GPE

SKH

WC FDFSEPD I1FHYPI--RCILANETrYRIVDSTECHRD-WISAE-SHECLV-NTTVRVKASDERi~FM?CRPREIV35A-PVRKTSCTFNYARTLKb'KYYEFRD3YFQQYMiK--EYQYWFDLDVTDRKSDYFAEFVVIiV

E F..У . D .. ..D .

....Т. ,

.....T...

... I..I ....Т. . ...И. ....TD •I..T.

.....ID ,

.....ID.,

.....TR ,

T...R ... Т.... R Т.... R

YQ R.SE .........R.E.....L....S...E..A.VPQ TIR.RI R...Q.I.H.TR........Y..I.,E,..E.,A...

YK URSE . .F.. ..R.R..3 ..Q..E.S.....A.VPT .VK.KI D.V.Q.i H.DK......У..1Р.Е ..B..A, .

H. .V113E......H.I S ,.Y. D S.D.?. A.VPS TVR.RI V .Q.I TOD. .S.A VIA E .E. A...

YV.HKE ... . R.M.R .. ,.3 D P.D. ... .KT EL.. .1 R ... .FS. .RR ......VI..E..S.IA.

Y NSE.....M I .3 , Y..D.P.D.:- .A.VPT TVX RI .V Q.V.TK4D. .. .9 A.V.A E ,.E. A...

.1.......F.....................E...H R.....SI1V.

,T.........N...........EI .H.R. ..SIIVI

SR .P .....R........V.......3V.H R...S..IIIA

.3. E..............Q......EA .H......IM А

S...P.......R.........W.......SV.H.R...3..IIIA

Рисунок 6. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей антигенного домена А и высокоскладчатой структуры белка Е2 среди 12 штаммов вируса КЧС, 3 штаммов вируса ДКРС и 2 штаммов вируса ПБО.

МКА ЗсЗ активно взаимодействовало с перекрывающимися пептидами №19 (TTLRTEVVKTFRREK, 834-848 а.о.) и №20 (KTFRREKPFPHRMDC, 842-856 а.о.). Поскольку степень связывания МКА ЗсЗ с указанными пептидами отличалась более чем в 2 раза (таблица 5), можно заключить, что большая часть эпитопа для данного антитела расположена в пределах последовательности пептида №19, а меньшая - пептида №20.

Как было показано ранее, между МКА 5-й группы (4d3, 5el0, 5а6, 6hl, 2а 1, lh9, 2Ь6, le 10) наблюдалась реципрокная конкуренция за связывание с гЕ2 в ИФА. Результаты пептидного картирования показали, что из данной группы антител МКА 5е10, 4d3, 2al и 2Ь6 проявили активность с пептидом №20 (KTFRREKPFPHRMDC, 842-856 а.о.), однако аффинность взаимодействия этих антител с данной последовательностью была значительно ниже, нежели у МКА ЗсЗ (таблица 5). МКА 2Ь6 также взаимодействовало с пептидом №12 (PSTEEMGDDFGFGLC, 778-792 а.о.), что может говорить о том, что эпитоп на белке Е2 вируса КЧС для данного МКА является прерывистым.

Таким образом еще два неперекрывающихся линейных В-клеточных эпитопа (один - для МКА ЗсЗ, второй - для группы МКА 5е10, 4d3 и 2а1) были картированы в пределах последовательности 834-856 а.о., которая находится в домене А гликопротеина Е2 вируса КЧС. Данный регион белка Е2 высококонсервативен среди 12 штаммов вируса КЧС, но отличается высокой вариабельностью среди других представителей рода Pestivirus (рисунок 6). Следовательно, эпитопы, узнаваемые данными МКА, являются специфическими для вируса КЧС.

В антигеном домене А белка Е2 вируса КЧС два региона (829-837 а о. и 844-865 а.о.) являются наиболее консервативными среди различных штаммов вируса КЧС, но заметно отличаются от таковых у вирусов ДКРС и ПБО (рисунок 6). Первый регион (829-837 а.о.) является вируснейтрализующим эпитопом для MICA WH303 [Lin et. al., 2000; Zhang et. al., 2006]. Второй регион (844-865 а.о.) представляет собой одну из главных нейтрализующих линейных антигенных детерминант, локализованных Dong X. N. с соавторами [Dong, Chen, 2007].

Последовательность 834-856 а.о. белка Е2 вируса КЧС, в которой с помощью МКА ЗсЗ и группы МКА 5е10, 4d3 и 2а1 были локализованы два В-клеточных эпитопа, содержит в себе часть эпитопа для МКА WH303 и большую часть последовательности нейтрализующей линейной антигенной детерминанты 844-865 а.о. На основании вышесказанного можно предположить, что МКА 1-й (ЗсЗ) и 5-й (2Ь6, 5е10, 4d3 и 2а1) групп, а также узнаваемые ими эпитопы на белке Е2 вируса КЧС, возможно, являются вируснейтрализующими. Антигенные детерминанты, узнаваемые данными МКА, могут быть включены в состав вакцин на основе пептидов или отдельных эпитопов. Кроме того, эти антитела, вероятно, могут служить в качестве специфических реагентов для дифференциации трех представителей рода Pestivirus.

Таким образом, с помощью панели МКА нами было локализовано 5 В-клеточных линейных эпитопов на белке Е2 вируса КЧС. Из них две антигенные

детерминанты картированы в антигеном домене А, а три - в высокоскладчатой структуре данного гликопротеина. Полученные данные могут быть использованы для совершенствования диагностики КЧС, а также для изучения влияния аминокислотных замен в белке Е2 на его антигенные свойства.

ВЫВОДЫ

1. Получена коллекция из 28 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к белку Е2 вируса классической чумы свиней, активно взаимодействующих с рекомбинантным и нативным белком Е2 в иммунохимических реакциях.

2. Показана возможность использования моноклональных антител, полученных к нативному вирусу классической чумы свиней, для обнаружения антигенов вируса методом «сэндвич»-варианта ИФА.

3. Установлено, что полученные моноклональные антитела направлены к 8 различным эпитопам белка Е2 вируса классической чумы свиней.

4. Установлено, что большинство полученных моноклональных антител конкурируют с поликлональными антителами к вирусу КЧС. Показано, что антигенная детерминанта 895-909 а.о. белка Е2, узнаваемая моноклональным антителом 4е12, обладает наибольшей иммуногенностью среди всех локализованных эпитопов.

5. С помощью панели МКА и синтетических пептидов картировано 5 линейных неперекрывающихся B-клеточных эпитопов, не описанных ранее. Из них два эпитопа локализованы в антигенном домене А белка Е2, а три эпитопа - в высокоскладчатой структуре данного гликопротеина.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Костина JI. В, Козлов А. Ю, Непоклонов Е. А., Валихов А. Ф. «Получение моноклональных антител специфичных к белку Е2 (gp55) вируса классической чумы свиней и их иммунологическая характеристика» // Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 12-16 марта 2007, С.283.

2. Kostina L.V., Graboveckiy V.V., Bogdanova V. S., Grebennikova T.V., Nepoklonov Ye. A. «Synthesis of recombinant E2 protein of classical swine fever virus in prokaryotic pET expression system» // Материалы конференции «Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov», Kyiv, Ukraine, 20-22 September 2007, C.65.

3. Костина JI. В., Непоклонов E. А., Козлов А. Ю, Валихов А. Ф. Изучение эпитопной специфичности моноклональных антител направленных к белку Е2 (gp55) вируса классической чумы свиней // Живые системы и

биологическая безопасность населения: Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2007. -С.257.

4. Костина Л. В , Непоклонов Е. А., Козлов А. Ю «Характеристика панели моноклональных антител к белку Е2^р55) вируса классической чумы свиней» // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007», Москва, 28-30 ноября 2007, Т.2, С.27-28.

5. Костина Л. В., Непоклонов Е. А, Забережный А. Д., Валихов А. Ф., Козлов А. Ю. Получение и характеристика моноклональных антител к белкам вируса классической чумы свиней // Вопросы вирусологии. - 2008. - № 5. -С.36-40.

6. Костина Л. В. Эпитопное картирование белка Е2 вируса классической чумы свиней - шаг на пути создания маркированной вакцины // Ветеринария. - 2008. - №11. - С.27-30.

Заказ № 259/10/08 Подписано в печать 12 11.2008 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,75

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 'www.cfr ru ; e-mail:info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Костина, Людмила Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Классическая чума свиней.

1.1.1 Распространенность и экономический ущерб.

1.1.2 Эпизоотологические данные.

1.1.3 Патогенез и течение заболевания.

1.2 Вирус КЧС.

1.2.1 Современная классификация вируса.

1.2.2 Антигенные свойства.

1.2.3 Организация генома вируса КЧС и свойства кодируемых белков.

1.3 Методы картирования антигенных детерминант.

1.4 Гликопротеин Е2 вируса КЧС.

1.4.1 Антигенная структура.

1.4.2 Эпитопное картирование белка Е2 вируса КЧС.

1.5 Иммунный ответ при КЧС.

1.6 Лабораторная диагностика:.

1.6.1 Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики КЧС.

1.6.2 МКА в лабораторной диагностике КЧС.

1.7 Специфическая профилактика и методы борьбы с КЧС.

1.7.1 Стратегии контроля за заболеванием.

1.7.2 Маркированные вакцины.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Вирусы и клетки.

2.1.2 Синтетические пептиды.

2.1.3 Антигены.

2.1.4 Животные

2.2 Методы.

2.2.1 Иммуннизация.

2.2.2 Миеломная клеточная линия.

2.2.3 Культивирование клеток.

2.2.4 Слияние клеток и выращивание гибридом.

2.2.5 Криоконсервация гибридом.

2.2.6 Получение асцитных жидкостей, содержащих МКА.

2.2.7 Получение МКА из асцитных жидкостей.

2.2.8 Определение концентрации белка.

2.2.9 Синтез иммунопероксидазных конъюгатов.

2.2.10 Субтипирование МКА.

2.2.11 Получение препаративного количества очищенного вируса КЧС.

2.2.12 Приготовление осветленных лизатов культуральных антигенов.

2.2.13 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН).

2.2.14 Иммуноблоттинг.

2.2.15 Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

2.2.15.1 Прямой метод ИФА.

2.2.15.2 Непрямой метод ИФА.

2.2.15.3 Непрямой метод ИФА с синтетическими пептидами.

2.2.15.4 Конкурентный ИФА.

2.2.15.5 «Сэндвич»-вариант ИФА.

2.2.16 Иммуногистохимический анализ (ИГХ).

2.2.17 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка Е2.

2.2.18 Статистическая обработка результатов.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Получение МКА к гликопротеину Е2 вируса КЧС.

3.2 Иммунохимическая характеристика МКА.

3.3 Определение способности МКА выявлять нативные антигены вируса КЧС в «сэндвич»-варианте ИФА.

3.4 Топографическое картирование эпитопов на белке Е2 вируса КЧС с помощью конкурентного ИФА.

3.5 Определение способности полученных МКА конкурировать с политональными антителами к вирусу КЧС за связывание с эпитопами на белке Е2.

3.6 Картирование антигенных детерминант белка Е2 вируса КЧС с помощью синтетических пептидов.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эпитопное картирование поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней"

Актуальность проблемы.

В России и странах СНГ для профилактики и борьбы с КЧС осуществляется поголовная вакцинация с использованием живых аттенуированных вакцин [21, 68]. Эффективность и безопасность этих вакцин общепризнанны. Все они характеризуются безопасностью для свиней разных возрастных групп и физиологического состояния, выраженной иммуногенностью, которая проявляется в устойчивости вакцинированных животных к экспериментальному заражению вирулентным штаммом КЧС [20, 196]. Однако, современные серологические методы диагностики не в состоянии отличить вакцинированных свиней от переболевших, так как животные имеют одинаковый спектр вируснейтрализующих антител. В настоящее время ученые многих стран проводят исследования, направленные на разработку маркированных вакцин, создание которых может решить данную проблему [68].

Антигенная структура белка Е2 изучена недостаточно [251, 252, 268]. Об отдельных детерминантах этого белка также известно относительно мало [150, 190, 282]. Для научных и практических целей представляет существенный интерес глубокое исследование тонкой антигенной структуры главного поверхностного гликопротеина вируса КЧС, так как данный белок может быть использован в качестве антигенного маркера при создании как субъединичных, так и живых рекомбинантных маркированных вакцин. Кроме того, детальный анализ эпитопов важен для понимания особенностей взаимодействия вируса

КЧС с иммунной системой хозяина, а также для разработки и усовершенствования диагностических тест-систем. Выявление более тонких антигенных различий и эпитопное картирование структурных белков возможно только с помощью моноклональных антител (МКА).

Цель и задачи исследования.

Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:

Научная новизна и практическая значимость.

1. Получена панель, состоящая из 28 моноклональных антител, специфичных к белку Е2 вируса КЧС.

2. На основе «сэндвич»-варианта ИФА разработан лабораторный метод для обнаружения вируса КЧС.

5. Антигенная детерминанта 834-856 а.о. белка Е2, в пределах которой с помощью МКА было локализовано 2 В-клеточных эпитопа, высококонсервативна среди различных штаммов вируса классической чумы свиней, но отличается от аналогичных участков белка Е2 других пестивирусов и может представлять интерес для разработки маркированной или субъединичной вакцины против классической чумы свиней.

Основные положения, выносимые на защиту.

4. Установлено, что белок Е2 включает, по крайней мере, 8 иммуногенных эпитопов, из которых 5 являются линейными.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Костина, Людмила Владимировна

109 ВЫВОДЫ

5. С помощью панели МКА и синтетических пептидов картировано 5 линейных неперекрывающихся В-клеточных эпитопов, не описанных ранее. Из них два эпитопа локализованы в антигенном домене А белка Е2, а три эпитопа - в высокоскладчатой структуре данного гликопротеина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костина, Людмила Владимировна, Москва

1. Вишняков И. Ф. Диагностика классической чумы свиней // Ветеринария. 1986. - № 3. - С.27-30.

2. Вишняков И. Ф. Цыбанов С. Ж. Молекулярная диагностика пестивирусов // Вестник РАСХН. 1996. -№3. - С.70-73.

3. Вишняков И. Ф., Куриннов В. В., Яшин А. Т. и др. Иммунофлуоресцентное выявление разных штаммов вируса чумы свиней // Ветеринария. 1984. - №3. - С.34-36.

4. Вишняков И. Ф., Мищенко Н. К., Куринов В. В. и др. Классическая чума свиней // Ветеринария. — 1998. — №11. — С. 16-22.

5. Кривонос А. В., Забережный А. Д., Гребенникова Т. В. и др. Синтез и иммунохимические свойства рекомбинантного главного поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней // Вопросы вирусологии. -2000.- №2 — С.29-36.

6. Крупальник В. Д., Нагасингхе С. Классическая чума свиней: лекция // М.: ФГОУ ВПО МГАВМИиБ им. К.И. Скрябина. 2006. - 32с.

7. Куриннов В. В., Вишняков И. Ф., Семенихин A. JL, Карпов Г. М. Эпизоотологические проблемы, клиническое проявление и диагностика классической чумы свиней // Актуал. вопросы вет. вирусологии. — Покров, 1995. — С.63-68.

8. Куриннов В. В., Вишняков И. Ф., Хухоров И. Ю. и др. Эпизоотологические, патогенетические и диагностические особенности классической чумы свиней // Ветеринария. — 1993. — №11-12. — С.6-12.

9. Куриннов В. В., Вишняков И. Ф., Яшин А. Т. и др. Некоторые вирусологические и флуоресцентно-серологические исследования органов и сывороток свиней, вакцинированных против КЧС // Материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ.-Покров, 1983.-С. 111-113.

10. Малярец П. В. и др. Классическая чума свиней: Обзор литературы // Всерос. НИИ защиты животных. Отд. пат. исслед. и науч. информ. — Владимир, 1995.-58с.

11. Методические указания по лабораторной диагностике классической чумы свиней. Департамент ветеринарии, №13-4-2/809 от 30.12.96г.

12. Непоклонов Е. А. Классическая чума свиней: разработка методов лабораторной диагностики и средств специфической профилактики: Автореф. дис. д-ра биол. наук./ Ин-т вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН М., 2000. - 46с.

13. Непоклонов Е.А., Алипер Т.И., Ленева И. А. Применения моноклональных антител для изучения вируса классической чумы свиней // Вопросы вирусологии. 1999. - Т.44. - №2. - С.54-60.

14. Прудников С. И., Панова Н. Е., Глотова Т. И. Стационарно-неблагополучные очаги классической чумы свиней — угроза возникновения эпизоотий//Ветеринария.-2003.- №10.- С.17-22.

15. Сергеев В. А. Вирусные вакцины. Киев, 1993.

16. Сергеев В. А., Корицкая М. А., Непоклонов Е. А., Алипер Т. И. Сравнительная оценка антигенной и иммуногенной активности коммерческих живых вакцин против классической чумы свиней // С.-х. биология. Сер. Биология животных. — 2003. — №4. — С.96-98.

17. Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. Вакцины при классической чуме свиней // Ветеринария. 2005. - №4. - С.6-9.

18. Сергеев О. В. Пестивирусы // Вопросы вирусологии. — 1997. — Т.42.1. — С.5-10.

19. Соболев Б. Н., Поройков В. В., Оленина JI. В. и др. Компьютерное конструирование вакцин // Биомедицинская химия: научно-практический журнал. 2003. - Том 49. - №4. - С.309-332.

20. Хрипунов Е. М., Евсеева С. Д., Жестерев В. И. и др. Диагностика и профилактика классической чумы свиней у диких кабанов // Вестник охотоведения. 2004. - Т.1., №1. - С.65-69.

21. Agapov E.V., Frolov I., Lindenbach В. D. et. al. Noncytopathic Sindbis virus RNA vectors for heterologous gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.- 1998. Vol. 95. - P. 12989-12994.

22. Agapov E.V., Murray C. L., Frolov I. et. al. Uncleaved NS2-3 is required for production of infectious bovine viral diarrhea virus // J. Virol. — 2004. — Vol.78.-P.2414-2425.

23. Aoki H., Ishikawa K., Sakoda Y. et. al. Characterization of classical swine fever virus associated with defective interfering particles containing acytopathogenic subgenomic RNA isolated from wild boar // J. Vet. Med. Sci. — 2001. -Vol. 63. -P.751-758.

24. Armengol E., Wiesmuller К. H., Wienhold D. et. al. Identification of T-cell epitopes in the structural and non-structural proteins of classical swine fever vims // J. Gen. Virol. 2002. - Vol. 83. - P.551-560.

25. Avirutnan P., Malasit P., Seliger B. et. al. Dengue virus infection of human endothelial cells leads to chemokine production, complement activation and apoptosis // Journal of Immunology. 1998. - Vol.161. - P.6338-6346.

26. Barlic-Maganja D., Grom J. Highly sensitive one-tube RT-PCR and microplate hybridisation assay for the detection and for the discrimination of classical swine fever virus from other pestiviruses // J. Virol. Methods. — 2001. — Vol. 95. — P. 101-110.

27. Bauhofer O., Summerfield A., Sakoda Y. et. al. Npro of classical swine fever virus interacts with interferon regulatory factor 3 and induces its proteasomal degradation // J. Virol. 2007. - Vol. 81. - P.3087-3096.

28. Becher P., Konig M., Paton D. J., Thiel H. L. Further characterization of Border Disease Virus isolates: evidence for the more than three species within the genus pestivirus // Virology. 1995. - Vol. 209. - P.200-206.

29. Becher P., Orlich M., Shannon A. D. et. al. Phylogenetic analysis of pestiviruses from domestic and wild ruminants // J. Gen. Virol. — 1997. — Vol. 78. — P.1357-1366.

30. Behrens S. E., Grassmann C. W., Thiel H. J. et. al. Characterization of an autonomous subgenomic pestivirus RNA replicon // J. Virol. — 1998. — Vol. 72. — P.2364-2372.

31. Biagetti M., Greiser-Wilk I., Rutili D. Molecular epidemiology of classical swine fever in Italy // 2001. Vol.83. -P.205-215.

32. Borras-Cuesta F., Petit-Camurdan A., Fedon Y. Engineering of immunogenic peptides by co-linear synthesis of determinants recognized by В and T cells // European Journal of Immunology. — 1987. Vol.l 7. — P.1213-1215.

33. Brocchi E. Development of a panel of anti-pestivirus monoclonal useful for virus identification and antibody assessment // Proc. Sec. Symp. on Pestiviruses. — Lion, 1992.-P.215-218.

34. Bruschke C. J., Hulst M. M., Moormann R. J. et. al. Glycoprotein of pestiviruses induces apoptosis in lymphocytes of several species // J. Virol. — 1997. — Vol.71. -P.6692-6696.

35. Caji A., Muyldermans G., Smet A. et al. Production and characterization of monoclonal antibodies against hog cholera virus (Alfort — 187 Strain) // Arch. Virol.-1993.-Vol.131.-P.185-192.

36. Campos E., Revilla C., Chamorro S. et. al. In vitro effect of classical swine fever virus on a porcine aortic endothelial cell line // Veterinary Research. — 2004. Vol. 35. - P. 625-633.

37. Canal C. W., Hotzel I., de Almeida L. L. et. al. Differentiation of classical swine fever virus from ruminant pestiviruses by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) // Vet. Microbiol. 1996. - Vol. 48. - P.373-379.

38. Carbrey E. A. Diagnostic procedures // Classical Swine Fever and Related Viral Infactions, ed.by Liess B. Boston, 1988. - P.99-114.

39. Carrasco C. P., Rigden R. C., Vincent I. E. et. al. Interaction of classical swine fever virus with dendritic cells // Journal of General Virology. 2004. — Vol.85.-P.1633-1641.

40. Ceppi M., de Bruin M. G., Seuberlich T. et. al. Identification of classical swine fever virus protein E2 as a target for cytotoxic T cells by using mRNAtransfected antigen-presenting cells // Journal of General Virology. — 2005. — Vol.86.-P.2525-2534.

41. Cheville N. F., Mengeling W. L. The pathogenesis of chronic hog cholera (swine fever). Histologic, immunofluorescent, and electron microscopic studies // Laboratory Investigation. 1969. - Vol. 20. - P.261-274.

42. Chou P. Y., Fasman G. D. Prediction of the secondary strucrure of proteins from their amino acid sequence. // Adv. Enzymol. — 1978. — V. 47. — P.145-148.

43. Christmann A., Wentzel A., Meyer C. et. al. Epitope mapping and affinity purification of monospecific antibodies by Escherichia coli cell surface display of gene-derived random peptide libraries // J. Immunol. Methods. — 2001. — Vol. 257. -P.l63-173.

44. Collen Т., DiMarchi R., Doel T. R. A T cell epitope in VP1 of foot-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle // Journal of Immunology. 1991. - Vol.146. -P.749-755.

45. Collett M. S., Moennig V., Horzinek M. C. Recent Advances in Pestivirus Research // J. Jen. Virol. 1989. - Vol.70, part 2. - P.253-266.

46. Collett M. S., Wiskerchen M., Welniak E., Belzer S. K. Bovine viral diarrhea virus genomic organization // Arch. Virol. — 1991. Suppl. 3. — P.l9-27.

47. Cwirla S. E., Peters E. A., Barrett R. W., Dower W. J. Peptides on phage: a vast library for identifying ligands. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. — Vol.87.-P.6378-6382.

48. Depner K. R., Muller A., Gruber A. et. al. Classical swine fever in wild boar (Sus scrofa) experimental infections and viral persistence // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. - 1995. - Vol.102. -P.381-384.

49. Devlin J. J., Panganiban L. C., Devlin P. E. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules. // Science. — 1990. Vol.249. — P.404-406.

50. Dewulf J., Koenen F., Mintiens K. et. al. Analytical performance of several classical swine fever laboratory diagnostic techniques on live animals for detection of infection // J. Virol. Methods. 2004. - Vol.119. - P.137-143.

51. Diaz-de-Arce H., Nunez J. I., Ganges L. et. al. An RT-PCR assay for the specific detection of classical swine fever virus in clinical samples // Vet. Res. — 1998. Vol.29. -P.431-440.

52. Dong X. N., Chen Y., Wu Y., Chen Y. H. Candidate multi-peptide-vaccine against classical swine fever virus induced potent immunity with serological marker // Vaccine. 2005. - Vol.23. - P.3630-3633.

53. Dong X. N., Chen Y. H. Marker vaccine statagies and candidate CSFV marker vaccines // Vaccine. 2007. - Vol.25. - P.205-230.

54. Dong X. N., Chen Y. H. Strategies for mapping neutralizing epitopes: one way and two sides // Vaccine. 2006. - Vol.24. - P.4689-4691.

55. Dong X. N., Qi Y., Ying J. Candidate peptid-vaccine induced potent protection against CSFV and identified a principal sequential neutralizing determinant on E2 // Vaccine. 2006. - Vol.24. - P.426-434.

56. Dong X. N., Wei K., Liu Z. Q., Chen Y. H. Candidate peptide vaccine induced protection against classical swine fever virus // Vaccine. — 2002. — Vol.21. -P.167-173.

57. Edvards S., Moenning V., Wensvoort G. The development of an international referens panel of monoclonal antibodies for the differentiation of hog cholera virus from pestiviruses // Vet. Microbiol. — 1991. Vol.29. - P.101—108.

58. Edwards S. Survival and inactivation of classical swine fever virus // Veterinary Microbiology. 2000. - Vol.73. - P.175-181.

59. Edwards S., Fukusho A., Lefevre P.- C. et. al. Classical swine fever: the global situation // Veterinary Microbiology. 2000. - Vol.73. - P. 109-119.

60. Edwards S., Paton D. Antigenic differences among pestiviruses // Vet. Clin. North. Am. Food Anim. Pract. 1995. - Vol.11,№3. -P.563-577.

61. Edwards S., Sands J. J. Antigenic comparison of hog cholera virus isolates from Europe, America and Asia using monoclonal antibodies // Dtsch. Tieraerztl. Wochenschr. 1990. - Vol.97. - P.78-81.

62. Edwards S., Sands J. J. Harkness J. The application of monoclonal antibody panels to characterize pestivirus isolates from ruminants in Great // Arch. Virol. 1989. - Vol.102. - P. 197-206.

63. Elbers A. R. W., Bouma A., Stegeman J. A. Quantitative assessment of clinical signs for the detection of classical swine fever outbreaks during an epidemic // Vet. Microbiol. 2002. - Vol.85. - P.323-332.

64. Elbers K., Tautz N., Becher P. et. al. Processing in the pestivirus E2-NS2 region: identification of proteins p7 and E2p7 // J. Virol. — 1996. Vol.70. — P.4131-4135.

65. Engelman D. M., Steitz T. A., Goldman A. // Annu. Rev. Biophys. Chem. 1986. - Vol.15. - P.321-353.

66. Fenton A., Entrican G., Herring J. A., Nettleton P.F. An ELISA for detecting pestivirus antigen in the blood of sheep persistently infected with border desis virus. // J. Virol. Meth. 1990. - Vol.27. - P.253-260.

67. Fenton A., Nettleton P. F., Entrican G. et. al. Identification of cattle infected with bovine virus diarrhoea virus using a monoclonal antibody capture ELISA // Arch. Virol. Suppl. 1991. - Vol 3. - P.169-174.

68. Fletcher S. P., Jackson R. J. Pestivirus internal ribosome entry site (IRES) structure and function: elements in the 5" nontranslated region important for IRES function // J. Virol. 2002. - Vol.76. - P.5024-5033

69. Floegel-Niesmann G. Classical swine fever (CSF) marker vaccine. Trial III. Evaluation of discriminatory ELISAs // Vet. Microbiol. 2001. - Vol.83. -P.121-36.

70. Floegel-Niesmann G. Marker vaccines and companion diagnostic tests for classical swine fever//Dev. Biol. (Basel). -2003. Vol.114. -P.185-191.

71. Floegel-Niesmann G., Bunzenthal C., Fischer S., Moennig V. Virulence of recent and former classical swine fever virus isolates evaluated by their clinical and pathological signs // J. Vet. Med. 2003. - Vol.50. - P.214-220.

72. Francki R. I. В., Fauquet С. M., Knudson D. L., Brown F. Classification and nomenclature of viruses // Fifth Report of the Intenational Committee on Taxonomy of viruses: Wien & New York, 1991.

73. Fritzemeier J., Teuffert J., Greiser-Wilke I. et. al. Epidemiology of classical swine fever in Germany in the 1990s // Vet. Microbiol. 2000. — Vol.77. — P.29-41.

74. Gamier J., Osguthorpe D. J., Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins. // J. Mol. Biol. 1978. - Vol.120, №1. - P.97-120.

75. Gay В., Chappuis G. Coulibaly C. et. al. Comparative analysis of monoclonal antibodies against pestiviruses: report of an international workshop // Vrt. Microbiol. 1989. - Vol.20. - P.123-129.

76. Geysen H. M., Rodda S. J., Mason T. J. et.al. Strategies for epitope analysis using peptide synthesis. // J. Immunol. Methods. — 1987. — Vol.102. — P.259-274.

77. Gil L. H., Ansari I. H., Vassilev V. et. al. The amino-terminal domain of bovine viral diarrhea virus Npro protein is necessary for alpha/beta interferon antagonism // J. Virol. 2006. - Vol.80. - P.900-911.

78. Grassmann C. W., Isken O., Tautz N., Behrens S. E. Genetic analysis of the pestivirus nonstructural coding region: defects in the NS5A unit can be complemented in trans // J. Virol. 2001. - Vol.75. - P.7791-7802.

79. Greiser-Wilke I., Blome S., Moennig V. Diagnostic methods for detection of Classical swine fever virus-—Status quo and new developments // Vaccine. 2007. - Vol.25. - P.5524-5530.

80. Greiser-Wilke I., Depner K., Fritzemeier J. et. al. Application of a computer program for genetic typing of classical swine fever virus isolates from Germany // J. Virol. Meth. 1998. - Vol.75. - P.141-150.

81. Grummer В., Fischer S., Depner K. et. al. Replication of classical swine fever virus strains and isolates in different porcine cell lines // Dtsch. Tierarztl.Wochenschr. 2006. - Vol.113. -P.138-142.

82. Gu В., Liu C., Lin-Goerke J. et. al. The RNA helicase and nucleotide triphosphatase activities of the bovine viral diarrhea virus NS3 protein are essential for viral replication // J. Virol. 2001. - Vol.74. - P. 1794-1800.

83. Haegeman A., Dewulf J., Vrancken R. et. al. 2006. Characterisation of the discrepancy between PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection // J. Virol. Methods. 2006. - Vol.136. - P.44-50.

84. Harada Т., Tautz N., Thiel H. J. E2-p7 region of the bovine viral diarrhea virus polyprotein: processing and functional studies // J. Virol. — 2000. — Vol.74. — P.9498-9506.

85. Heimann M., Roman-Sosa G., Martoglio B. et. al. Core protein of pestiviruses is processed at the С terminus by signal peptide Peptidase // J. Virol. — 2006.-Vol.80.-P.1915-1921.

86. Hess R. G., Coulibaly G. O., Greiser-Wilke I. Identification of hog cholera viral isolates by use of monoclonal antibodies to pestiviruses // Ibid. — 1988. -Vol.16.-P.315-321.

87. Hilton L., Moganeradj K.5 Zhang G. et. al. The NPr0 product of bovine viral diarrhea virus inhibits DNA binding by interferon regulatory factor 3 and targets it for proteasomal degradation // J. Virol. 2006. - Vol.80. - P.l 1723-11732.

88. Hopp T. P. Protein antigen conformation: folding patterns and predictive algorithms; selection of antigenic and immunogenic peptides // Ann. Sclavo. Collana. Monogr. 1984. - Vol.1, №2 -P.47-60.

89. Hopp T. P., Woods K. R. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1981. Vol.78, №6. — P.3824-3828

90. Hulst M. M., Himes G., Newbigin E., Moormann R. J. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and ^identification as a ribonuclease // Virology. 1994. - Vol.200. - P.558-565.

91. Hulst M. M., Moormann R. J. Inhibition of pestivirus infection in cell culture by envelope proteins E(rns) and E2 of classical swine fever virus: E(rns) and E2 interact with different receptors // J. Gen. Virol. 1997. - Vol.78. - P.2779-2787.

92. Hulst M. M., Panoto F. E., Hooekmann A. et. al. Inactivation of the RNase activity of glycoprotein Erns of classical swine fever virus results in a cytopathogenic virus // J. Virol. 1998. - Vol.72. - P.151-157.

93. Hulst M. M.,Westra D. F.,Wensvoort G., Moormann R. J. Glycoprotein El of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera // J. Virol. 1993. - Vol.67. - P.5435-5442.

94. Isken О., Grassman С. W., Yu H., Behrens S.-E. Complex signals in the genomic 3' nontranslated region of bovine viral diarrhea virus coordinate translation and replication of the viral RNA // RNA. 2004. - Vol.10. - P.1637-1652.

95. Jemersic L., Greiser-Wilke I., Barlic-Maganja D. et. al. Genetic typing of recent classical swine fever virus isolates from Croatia // Vet. Microbiol. — 2003. — Vol.96. -P.25-33.

96. Konig M., Lengsfeld Т., Pauly T. et. al. Classical swine fever virus: Independent induction of protective immunity by two structural glycoproteins // J. Virol. 1995. - Vol.69. - P.6479-6486.

97. Kaden V., Hanel A., Renner C., Gossger K. Oral immunisation of wild boar against classical swine fever in Baden—W'urttemberg: development of the seroprevalences based on the hunting bag // Eur. J.Wildl. Res. — 2005. — Vol.51. — P.101-107.

98. Kaden V., Heyne H., Kiupel H., Letz W., Kern В., Lemmer U., et al. Oral immunisation of wild boar against classical swine fever: concluding analysis of the recent field trials in Germany // Berl. Munch. Tierarztl. Wschr. 2002. - Vol.115.1. P.179-185.

99. Kamolsiriprichaiporn S., Hooper P. Т., Morrissy C. J., Westbury H. A. A comparison of the pathogenicity of two strains of hog cholera virus. 1. Clinical and pathological studies // Aust. Vet. J. 1992. - Vol.69. - P.240-244.

100. Kamolsiriprichaiporn S., Morrissy C. J., Westbury H. A. A comparison of the pathogenicity of two strains of hog cholera virus. 2. Virological studies // Aust. Vet. J. 1992. - Vol.69. - P.245-248.

101. Karlus P. A., Schulze G. E. // Naturwissenshaften. 1985. - Vol.72. -P.212-223.

102. Katz J. В., Ridpath J. F., Bolin S. R. Presumptive diagnostic differentiation of hog cholera virus from bovine viral diarrhea and border disease viruses by using a cDNA nested-amplification approach // J. Clin. Microbiol. — 1993. -Vol.31.-P.565-568.

103. Kirkland P. D., Frost M. J., Finlaison D. S. et. al. Identification of a novel virus in pigs — Bungowannah virus: A possible new species of pestivirus // Virus Research. 2007. - Vol.129. - P.26-34.

104. Knoetig S. M., Summerfield A., Spagnuolo-Weaver M., Mccollough K. C. Immunopathogenesis of classical swine fever: role of monocytic cells // Immunology. 1999. - Vol.97. - P. 359-366.

105. Koenen F., Vanopdenbosch E., Wellemans G. et. al. Bovine viral diarrhea vaccination fails to protect pigs against classical swine fever challenge // Vol. Diergeneesk. Tijdschr. 1988. - Vol.57. -P.398-404.

106. Kohler G., Milstain C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1976. - Vol.256. - P.495-497.

107. Kosmidou A., Ahl R., Thiel H. et. al. Differentiation of classical swine fever virus (CSFV) strains using monoclonal antibodies against structural glycoproteins // Vet. Microbiol. 1995. - Vol.47. - P.l 11-118.

108. Kosmidou A., Buttner M., Meyers G. Isolation and characterization of cytopathogenic classical swine fever virus (CSFV) // Arch. Virol. — 1998. — Vol.143. — P.1295-1309.

109. Kress J. Sensitivity of swine buffy coat culture to infection with hog cholera virus // Am. J. Vet. Res. 1976. - Vol.37, № 11. - P. 1315-1318.

110. Kummerer В. M., Tautz N., Becher P. et. al. The genetic basis for cytopathogenicity of pestiviruses // Vet. Microbiol. 2000. - Vol.77. - P.l 17-128.

111. Kyhse-Andersen J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose // J. Biochem. Biophys. Methods. 1984. - Vol.l0. -P.203-209.

112. Kyte I., Doolittle R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. // J. Mol. Biol. 1982. - Vol.157. - P.105-132.

113. La Rocca S. A., Herbert R. J., Crooke H. et. al. Loss of interferon regulatory factor 3 in cells infected with classical swine fever virus involves the N-terminal protease, Npro // J. Virol. 2005. - Vol.79. - P.7239-7247.

114. Lackner Т., Muller A., Pankraz A. et. al. Temporal modulation of an autoprotease is crucial for replication and pathogenicity of an RNA virus // J. Virol. -2004.-Vol.78.-P.10765-10775.

115. Lackner Т., Thiel H. J., Tautz N. Dissection of a viral autoprotease elucidates a function of a cellular chaperone in proteolysis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-2006.-Vol.103.-P.1510-1515.

116. Laddomada A. Incidence and control of classical swine fever in European wild boar // J. Gen. Virol. 2000. - Vol.77. - P.1311-1321.

117. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assambly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol.227. - P.680-685.

118. Laevens H., Koenen F., Deluyker H., de Kraif A. Experimental infection of slaughter pigs with classical swine fever virus: transmission of the virus, course of the disease and antibody response // Veterinary Record. — 1999. — Vol.145. — P.243-248.

119. Langedijk J. P. Translocation activity of C-terminal domain of Pestivirus Erns and ribotoxin L3 loop // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - P.5308-5314

120. Laude H., Gelfi J. Diagnostic serologique de la peste porcine classique utilisation d'une souche cytolytique pour la recherche des anticorps neutralisants en microplaque // Ann. Rech. Vet. 1980. - Vol.3. - P.313-319.

121. Launais M., Aynaud J. M., Corthier G. Hog cholera virus: active immunization of piglets with the Thiverval strain in the presence and absence of colostral passive immunity // Vet. Microbiol. 1978. — Vol.3. - P.31-43.

122. Lee В., Richards F.M. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility // J. Mol. Biol. 1971. - Vol.55. - P.379-400.

123. Liess B. Courses of hog cholera virus infection // Regional biotechnology workshop on diagnosis of classical swine fever: Pulawy. — 1994. — P.l-6.

124. Liess B. Persistent infections of hog cholera: a review // Preventive Vetrinary Medicine. 1984. - Vol.2. - P.l09-113.

125. Liess B. Virus persistence a key phenomenon of BVD virus infection // Deutsche Tiera Erztliche Wochenschrift. 1988. - Vol.95. - P.264-266.

126. Liess В., Roder В., Eife K. et. al. Studies on European hog cholera. 5. Discovery of latent infection in piglet producing farms in three villages of Northwest // Berl. Munch. Tierarztl. Wschr. 1975. - Vol.88. - P.397-409.

127. Lin M., Trottier E., Pasick J., Sabara M. Identification of antigenic regions of the Erns protein for pig antibodies elicited during classical swine fever virus infection // J. Biochem. 2004. - Vol.136. - P.795-804.

128. Lindenbach B. D., Rice C.M. Flaviviridae: the viruses and their replication. // In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et. al. (Eds.), Fields Virology. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia 2001. - P.991-1041.

129. Liu L., Widen F., Baule C., Belak S. A one-step, gel-based RT-PCR assay with comparable performance to real-time RT-PCR for detection of classical swine fever virus // J. Virol. Methods. 2007. - Vol.139. - P.203-207.

130. Liu S. Т., Li S. N., Wang D. C. et al. Rapid detection of hog cholera virus in tissues by the polymerase chain reaction // J. Virol. Meth. 1991. — Vol.35. -P.227-236.

131. LoeffenW. Evaluation of five commercially available CSF-ELISA kits. Report on the annual meeting of National Swine Fever Laboratories, Grange European Commission, Brussels; 2005, P. 143.

132. Lowings J. P., Paton D. J., Sands J. J. et. al. Classical swine fever: genetic detection and analysis of differences between vims isolates // J. Gen. Virol. — 1994. Vol.75. - P.3461-3468.

133. Lowings P., Ibata G., de Mia G. M. et. al. Classical swine fever in Sadinia: epidemiology of recent outbreaks // Epidemiology and Infection. — 1999. — Vol.122.-P.553-559.

134. McGoldrick A., Lowings J. P., Ibata G. et. al. A novel approach to the detection of classical swine fever virus by RT-PCR with a fluorogenic probe (TaqMan) // J. Virol. Methods. 1998. - Vol.72. - P. 125-135.

135. McKinney M. M., Parkinson A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid // J. Immunol. Methods. 1987. - Vol.96. -P.271-278.

136. Mengeling W. L., Packer R. A. Pathogenesis of chronic hog cholera: host response // American Journal of Veterinary Research. — 1966. — Vol.30. — P.409-417.

137. Merrifield R. B. The automatic synthesis of proteins // Sci. Am. — 1968. -Vol.218.-P.56-62.

138. Meyer D., Hofmann M. A., Tratschin J. D. Attenuation of classical swine fever virus by deletion of the viral N(pro) gene // Vaccine. — 2004. — Vol.22. — P.317-328.

139. Meyers G., Saalmuller A., Buttner M. Mutation abrogating the RNase activity in glycoprotein Erns of the pestivirus classical swine fever virus lead to virus attenuation // J. Virol. 1999. - Vol.73. - P.l0224-10234.

140. Meyers G., Thiel H.-J. Cytopatogenicity of Classical Swine Fever Virus Caused by Defective Interfering Paticles // Journal of Virology. — 1995. — Vol.69. — P.3683-3689.

141. Meyers G., Thiel H.-J. Molecular characterization of pestiviruses // Adv. Virus Res. 1996. - Vol.47. - P.53-118.

142. Mittelholzer C., Moser C., Tratschin J. D., Hofmann M. A. Analysis of classical swine fever virus replication kinetics allows differentiation of highly virulent from avirulent strains // Vet. Microbiol. 2000. - Vol.74. - P.293-308.

143. Moennig V. Introduction to classical swine fever: virus, disease and control policy // Vet. Microbiol. 2000. - Vol.73. - P.93-102.

144. Moennig V. The hog cholera virus // Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1992. - Vol.15. - P. 189-201.

145. Moennig V., Floegel-Niesmann G., Greiser-Wilke I. Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: a review of new knowledge // Vet. J. — 2003. — Vol.165.-P.l 1-20.

146. Moennig V., Plagemann P. G. W. The pestiviruses // Advances in Virus Research. 1992. - Vol.41. - P.53-98.

147. Monielli M., Cerino A., Beiiotri V. et al. Immunology and pathogenesis of HCV infection // Res. Virol. 1993. - Vol.144. - P.269-274.

148. Moormann R. J. M., Bouma A., Kramps J. A. et. al. Development of a classical swine fever subunit marker vaccine and companion diagnostic test // Vet. Microbiol. 2000. - Vol.73. - P.209-219.

149. Moser C., Ruggli N., Tratschin J. D., Hofmann M. A. Detection of antibodies against classical swine fever virus in swine sera by indirect ELISA using recombinant envelope glycoprotein E2 // Vet. Microbiol. — 1996. Vol.51. — P.41-53.

150. Moser С., Stettler P., Tratschin J. D., Hofmann M. A. Cytopathogenic and noncytopathogenlc RNA replicons of classical swine fever virus // J. Virol. — 1999. Vol.73. - P. 7787-7794.

151. Moulin Herve R., Seuberlich Т., Bauhofer O. et. al. Nonstructural proteins NS2-3 and NS4A of classical swine fever virus: Essential features for infectious particle formation // Virology. 2007. - Vol.365. - P.376-389.

152. Mullen L. M., Nair S. P., Ward J. M. et. al. Phage display in the study of infectious diseases // TRENDS in Microbiology. 2006. - Vol.14, №3. - P. 141-147.

153. Narita M., Kawashima K., Kimura K. et. al. Comparative immunohistopathology in pigs infected with highly virulent or less virulent strains of hog cholera virus // Veterinary Pathology. 2000. - Vol.37. - P.402 - 408.

154. Narita M., Kawashima K., Shimizu M. Viral antigen and В and T lymphocytes in lymphoid tissues of gnotobiotic piglets infected with hog cholera virus // Journal of Comparative Pathology. 1996. - Vol.114. - P.257-263.

155. Nishimori Т., Yamada S., Chimizu M. Production of monoclonal antibodies against classical swine fever virus and their use for antigenic characterization of Japanese isolates // J. Vet. Sci. 1996. - Vol.58. - P.707-710.

156. Pankraz A., Thiel H.-J., Becher P. Essential and nonessential elements in the 3' nontranslated region of bovine viral diarrhea virus // J. Virol. — 2005. — Vol.79. -P.9119-9127.

157. Paton D. J., Greiser-Wilke I. Classical swine fever — an update // Research in Veterinary Science. 2003. - Vol.75. - P.169-178.

158. Paton D. J., Lowings J. P., Barret A. D. T. Epitope mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus // Virology. — 1992. — Vol.190. — P.763-772.

159. Paton D. J., Mcgoldrick A., Greiser-Wilke L. et. al. Genetic typing of classical swine fever virus // Veterinary Microbiology. — 2000. — Vol.73. — P. 137157.

160. Paton D. J., Simpson V., Done S. H. Infection of pigs and cattle with bovine viral diarrhea virus on a farm in England // Vet. Rec. — 1994. — Vol.131. -P.185-188.

161. Paton D. Pesivirus diversity // J. Сотр. Pathol. 1995. - Vol.112. -P.215-236.

162. Pauly Т., Elbers K., Konig M. et. al. Classical swine fever virus-specific cytotoxic T lymphocytes and identification of a T cell epitope // Journal of General Virology. 1995. - Vol.76. - P.3039-3049.

163. Pauly Т., Konig M., Thiel H.-J., Saalmuller A. Infection with classical swine fever virus: effects on phenotype and immune responsiveness of porcine T lymphocytes // Journal of General Virology. 1998. - Vol. 79. - P.31-40.

164. Pejsak Z. L. A., Truszczynski M. Application of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay for serological monitoring of hog cholera (classical swine fever) in Poland // Rev. Sci. Tech. 1993. - Vol.12. - P.879-885.

165. Pellequer J.-L., Westhof E., van Regenmortel M. H. V. Peptide antigens. A practical approach, IRL PRESS, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1994. -P.7-25.

166. Peng W. P., Xia Z. H., Hou Q. et. al. Differences in glycosylation of the E2 protein between virulent Shimen strain and avirulent C-strain of classical swine fever virus // Bing Du Xue Bao. 2007. - Vol.23. - P.389-393.

167. Piriou L., Chevallier,S., Hutet E. et. al. Humoral and cell-mediated immune responses of d/d histocompatible pigs against classical swine fever (CSF) virus // Veterinary Research. 2003. - Vol.34. - P.389-404.

168. Plant I. W. Immunological relationship between Border disease, mucosal disease and swine fever // Vet. Rec. 1973. - Vol.92. - P.80-87.

169. Pratelli A., Martella V., Cirone F. et. al. Genomic characterization of pestiviruses isolated from lambs and kids in Southern Italy // J. Virol. Meth. — 2001. — Vol.94.-P.81-85.

170. Precausta P., Kato F., Brun A. Swine fever. Immunisation of piglets // Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1983. - Vol.6. -P.281-289.

171. Qiu H., Shen R., Tong G. The lapinized Chinese strain vaccine against classical swine fever virus: a retrospective review spanning half a century // Agricultural Science in China. 2006. - Vol.5. - P.l-14.

172. Qu L., McMullan L. K., Rice С. M. Isolation and characterization of noncytopathic pestivirus mutants reveals a role for nonstructural protein NS4B in viral cytopathogenicity // J. Virol. 2001. - Vol.75. - P. 10651-10662.

173. Rau H., Revets H., Balmelli C. et. al. Immunological properties of recombinant classical swine fever vims NS3 protein in vitro and in vivo // Veterinary Research. 2006. - Vol.37. - P. 155-168.

174. Reed К. E., Gorbalenya A. E., Rice С. M. The NS5A/NS5 proteins of vimses from three genera of the family Flaviviridae are phosphorylated by associated serine/threonine kinases // J. Virol. 1998. - Vol.72. - P.6199-6206.

175. Reimann I., Depner K., Trapp S., Beer M. An avimlent chimeric Pestivims with altered cell tropism protects pigs against lethal infection with classical swine fever vims // Virology. 2004. - Vol.322. - P.143-157.

176. RIsatti G. R., Borca M. V., Kutish G. F. et. al. The E2 glycoprotein of classical swine fever virus is a vimlence determinant in swine // J. Virol. — 2005. — Vol.79.-P.3787-3796.

177. Risatti G. R., Holinka L. G., Carrillo C. et. al. Identification of a novel virulence determinant within the E2 structural glycoprotein of classical swine fever virus // Virology. 2006. - Vol.355. - P.94-101.

178. Risatti G. R., Holinka L. G., Lu Z. Mutation of El glycoprotein of classical swine fever virus affect viral virulence in swine // Virology. — 2005. — Vol.343.-P.l 16-127.

179. Risatti G. R., Holinka L. G., Sainz I. F. et. al. Mutations in the carboxyl terminal region of E2 glycoprotein of classical swine fever virus are responsible for viral attenuation in swine // Virology. 2007. - Vol.364. - P.371-382.

180. Rodriguez A., Saiz J. C., Novella I. S. et. al. Antigenic specificity of porcine T cell response against foot-and mouth disease virus structural proteins: identification of T helper epitopes in VP1 // Virology. 1994. - Vol.205. -P.24-33.

181. Roehe P. M., Woodward M. J. Polymerase chain reaction amplification of segments of pestivirus genomes // Arch. Virol. — 1991. — Suppl.3. — P.231—238.

182. Rumenapf Т., Stark R., Heimann M., Thiel H.-J. N-terminal protease of pestiviruses: identification of putative catalytic residues by site-directed mutagenesis // J. Virol. 1998. - Vol.72. - P.2544-2547.

183. Rumenapf Т., Unger G., Strauss J. H., Thiel H.-J. Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses // J. Virol. — 1993. — Vol.67. — P.3288-3294.

184. Ruggli N., Bird B.H., Liu L. et. al. Npro of classical swine fever virus is an antagonist of double-stranded RNA-mediated apoptosis and IFN-alpha/beta induction // Virology. 2005. - Vol.340. -P.265-276.

185. Ruggli N., Tratschin J. D., Schweizer M. et. al. Classical swine fever virus interferes with cellular antiviral defense: evidence for a novel function of Npro // J. Virol. 2003. - Vol.77. - P.7645-7654.

186. Rumenapf Т., Stark, R., Meyers G., Thiel H.-J. Structural proteins of hog cholera virus expressed by vaccinia virus: further characterization and induction of protective immunity // Journal of Virology. — 1991. — Vol.65. — P.589-597.

187. Sanchez-Cordon P. J., Romero-Trevejo J. L., Pedrera M. et. al. The Role of В Cells in the Immune Response to Pestivirus (Classical Swine Fever Virus) // J. Сотр. Path. 2006. - Vol.135. - P. 32-41.

188. Sandvik Т., Paton D. J., Lowings J. P. Detection and identification of ruminant and porcine pestiviruses by nested amplification of 5 untranslated cDNA regions // J. Virol. Methods. - 1997. - Vol.64. - P.43-46.

189. Saunders G. C. Development and Evaluated of an Enzyme-Labeled Antibody Test for the Rapid Detection og Hog Cholera Antibodies // Am. J. Vet. Res. 1976.-Vol.38, № 1. — P.21-25.

190. Schneider R., Unger G., Stark R. et. al. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease // Science. — 1993. — Vol.261. — P.l 169-1171.

191. Scott J. K., Smith G. P. Searching for peptide ligands with an epitope library // Science. 1990. - Vol.249. - P.386-390.

192. Shannon A. D., Richards S. G., Kirkland P. D., Moyle A. An antigen-capture ELISA detects pestivirus antigens in blood and tissues of immunotolerant carrier cattle // J. Virol. Meth. 1991. - Vol.34. - P.233-248.

193. Sidhu S. S., Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces // Curr. Opin. Struct. Biol. — 2007. — Vol.17, №4. — P.481-487.

194. Stadejek Т., Vilcek S., Lowings J. P. et. al. Genetic heterogeneity of classical swine fever virus in Central Europe // Virus Res. — 1997. — Vol.52. — P. 195204.

195. Stark R., Meyers G., Rumenapf Т., Thiel H.-J. Processing of Pestivirus polyprotein: cleavage site between autoprotease and nucleocapsid protein of classical swine fever virus // J. Virol. 1993. - Vol.67. - P.7088-7095.

196. Steffens S., Thiel H.-J., Behrens S. E. The RNA-dependent RNA polymerases of different members of the family Flaviviridae exhibit similar properties in vitro // J. Gen. Virol. 1999. - Vol.80. - P.2583-2590.

197. Stegeman A., Elbers A. R., Bouma A. et. al. Transmission of classical swine fever virus within herds during the 1997-1998 epidemic in The Netherlands // Preventative Veterinary Medicine. 1999. - Vol.42. - P.201-218.

198. Stegeman A., Elbers A. R., Smak J., de Jong M. C. Quantification of the transmission of classical swine fever virus between herds during the 1997-1998 epidemic in The Netherlands // Veterinary Microbiology. 1999. — Vol.42. — P.219 -234.

199. Summerfield A., Hofmann M. A., Mccullough К. C. Low density blood granulocytic cells induced during classical swine fever are targets for virus infection // Veterinary Immunology and Immunopathology. — 1998. — Vol.63. — P.289-301.

200. Summerfield A., Knoetig S. M., McCullough К. C. Lymphocyte apoptosis during classical swine fever: implication of activationinduced cell death // Journal of Virology. 1998. - Vol.72. -P.1853-1861.

201. Summerfield A., Knoetig S. M., Tschudin R., McCullough К. C. Pathogenesis of granulocytopenia and bone marrow atrophy during classical swine fever involves apoptosis and necrosis of uninfected cells // Virology. — 2000. -Vol.272.-P.50-60.

202. Summerfield A., Mcneilly F., Walker I. et. al. Depletion of CD4+ and CD8h,gh+ T-cells before the onset of viraemia during classical swine fever // Veterinary Immunology and Immunopathology. — 2001. — Vol.78. — P.3-19.

203. Summerfield A., Zingle K., Inumaru S., McCullough К. C. Induction of apoptosis in bone marrow neutrophil-lineage cells by classical swine fever virus // Journal of General Virology. -2001. Vol.82. -P.1309-1318.

204. Susa M., Konig M., Saalmuller A. et. al. Pathogenesis of classical swine fever: B-lymphocyte deficiency caused by hog cholera virus // Journal of Virology. -1992.-Vol.66.-P.l 171-1175.

205. Tamura J. К., Warrener P., Collett M. S. RNA-stimulated NTPase activity associated with the p80 protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus // Virology. 1993. -Vol.193. -P.l-10.

206. Tautz N., Elbers K., Stoll D. et. al. Serine protease of pestiviruses: determination of cleavage sites // J. Virol. 1997. - Vol.71. - P.5415-5422.

207. Tautz N., Kaiser A., Thiel H. NS3 serine protease of bovine viral diarrhea virus: characterization of active site residues, NS4A cofactor domain, and protease-cofactor interactions // Virology. 2000. - Vol. 273. - P. 351-363.

208. Terpstra C. Epizootiology of hog cholera. // In: Liess B. (Ed.), Classical Swine Fever and Related Infections. Martinus Nijhoff, Boston, Dordrecht, Lancaster, 1988. — P.201-216.

209. Terpstra C.,Woortmeyer R., Barteling S. J. Development and properties of a cell culture produced vaccine for hog cholera based on the Chinese strain // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1990. - Vol.97. -P.77-79.

210. Thiel H.-J., Plagemann P. G. W., Moennig V. Pestiviruses / In: Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M., et al. (Eds.) // Fields Virology, third ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York. 1996. - Chapter 33. - P. 1059-1073.

211. Thiel H.-J., Stark R., Weiland E. et. al. Hog cholera virus: molecular composition of virions from a Pestivirus // J. Virol. — 1991. Vol.65. — P.4705-4712.

212. Tjissen P. Practical and theory of enzyme immunoassay // Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology. — 1985. — P.280-294.

213. Tratschin J. D., Moser C., Ruggli N., Hofmann M. A. Classical swine fever virus leader proteinase Npro is not required for viral replication in cell culture // J. Virol. 1998. - Vol.72. -P.7681-7684.

214. Vandeputte J, Chappuis G. Classical swine fever: the European experience and a guide for infected areas // Rev. Sci. Tech. — 1999. — Vol.18, №3. — P.638-647.

215. Vannier P., Plateau E., Tillon J. P. Congenital tremor in pigs farrowed from sows given hog cholera virus during pregnancy // American Journal of Veterinary Research. 1981. - Vol.42. - P. 135-13 7.

216. Vengust G., Grom J., Bidovec A., Kramer M. Monitoring of classical swine fever in wild boar (Sus scrofa) in Slovenia // J. Vet. Med. B. 2006. — Vol.53. — P.247-249.

217. Vilcek S., Nettlaton P. F. Pestiviruses in wild animal // J. Vet. Microbiol. -2006.-Vol.116.-P.l-12.

218. Wang Z., Nie Y., Wang P. et. al. Characterization of classical swine fever virus entry by using pseudotyped viruses: El and E2 are sufficient to mediate viral entry // Virology. 2004. - Vol.330. - P.332-341.

219. Warrener P., Collett M. S. Pestivirus NS3 (p80) protein possesses RNA helicase activity // J. Virol. 1995. - Vol.69. - P. 1720-1726.

220. Weiland E. A., Ahl R., Stark R., Weiland F. A second envelope glycoprotein mediates neutralization of a pestivirus, hog cholera virus // J. Virol. — 1992. Vol.66. -P.3677-3682.

221. Weiland E., Stark R., Haas B. et. al. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer // J. Virol. 1990. - Vol.64. - P.3563-3569.

222. Weiland F., Weiland E., Unger G. et. al. Localization of pestiviral envelope proteins Erns and E2 at the cell surface and on isolated particles 11 J. Gen. Virol. 1999. - Vol.80. - P.l 157-1165.

223. Welling G. W., Weijer W. J., van der Zee R., Welling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins. // FEBS Lett. — 1985. — Vol.188, №2. -P.215-218.

224. Wensvoort G. et al. Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis // Vet. Microbiol. — 1986. — Vol.12. — P.101-108.

225. Wensvoort G. Topographical and functional mapping of epitopes on hog cholera virus with monoclonal antibodies // J. Gen. Virol. 1989. - Vol.70. — P.2865-2876.

226. Wensvoort G., Bloemraad M., Terpstra C. An enzyme immunoassay employing monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies to classical swine fever virus // Vet. Microbiol. 1988. - Vol.17. - P.129-40.

227. Wensvoort G., Boonstra J., Bodzinga B. G. Immunoaffinity purification and characterization of the envelope El of hog cholera virus // J. Gen. Virol. — 1990. -Vol.71.-P.531-540.

228. Wensvoort G., Terpstra C., De Kluyver E. P. et. al. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus 11 Vet. Microbiol. 1989. - Vol.21. - P.9-20.

229. Westwood О. M. R., Hay F. C. Epitope mapping: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2001. P.302.

230. Windisch J. M., Schneider R., Stark R. et. al. RNase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virus neutralizing monoclonal antibodies // J. Virol. 1996. - Vol.70. - P.352-358.

231. Wirz В., Tratschin J. D., Mueller H. K., Mitchell D. B. Detection of hog cholera virus and differentiation from other pestiviruses by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31. - P.l 148-1154.

232. Wiskerchen M., Belzer S. K., Collett M. S. Pestivirus gene expression: the first protein product of the bovine viral diarrhea virus large open reading frame, p20, possesses proteolytic activity // J. Virol. 1991. - Vol.65. - P.4508-4514.

233. Xia Y., Chen L., Pan Z., Zhang C. A Novel Role of Classical Swine Fever Virus Erns Glycoprotein in Counteracting the Newcastle Disease Virus (NDV)-mediated IFN-p Induction // Journal of Biochemistry and Molecular Biology.- 2007. Vol.40. - P.611 -616.

234. Xiao M., Chen J., Li B. RNA-dependent RNA polymerase activity of classical swine fever virus NS5B protein expressed in natural host cells // Acta Virol.- 2003. Vol.47. - P.79-85.

235. Xiao M., Gao J., Wang W. et. al. Specific interaction between the classical swine fever virus NS5B protein and viral genome // Eur. J. Biochem. — 2004. Vol.271. - P.3888-3896.

236. Yang Z., Delgado R., Xu L. et. al. Distinct cellular interactions of secreted and transmembrane Ebola virus glycoproteins // Science. — 1998. — Vol.279.- P.983-984.

237. Yu H., Grassman C. W., Behrens S.-E. Sequence and structural elements at the 3" terminus of bovine viral diarrhea virus genomic RNA: functional roleduring RNA replication // J. Virol. 1999. - Vol.73. - P.3638-3648.

238. Yu M., Wang L. F., Shiell B. J. et. al. Fine mapping of a C-terminal linear epitope highly conserved among the major envelope glycoprotein E2 (gp51 to gp54) of different pestiviruses // Virology. 1996. - Vol.222. - P.289-292.

239. Zhang F., Yu M., Weiland E. et. al. Characterization of epitopes for neutralizing monoclonal antibodies to classical swine fever virus E2 Mid Erns using phage-displayed random peptide library // Arch. Virol. 2006. - Vol.151. — P.37-54.

Информация о работе

Костина, Людмила Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.06

Диссертация

Эпитопное картирование поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы