Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

Шутова, Мария Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека"

ШУТОВА Мария Владимировна

Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

Специальность 03.02.07- генетика

2 4 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2011

005003503

Работа выполнена в лаборатории Генетических основ клеточных технологий Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Киселев Сергей Львович Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Томилин Алексей Николаевич Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Воротеляк Екатерина Андреевна Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития РАН, г. Москва

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт Цитологии и Генетики Сибирского Отделения РАН, г. Новосибирск

/V 1<г

Защита диссертации состоится декабря 2011 года в ' часов на

заседании объединенного диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: 8(499)1328962, электронный адрес: aspirantiira@vige.ni. адрес в Интернете: www.vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

!Н

Автореферат разослан ' ноября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, Д) ^

кандидат биологических наук СинелыциковаТ.А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В процессе индивидуального развития многоклеточного организма млекопитающих, клетки эмбриона проходят через множество стадий, постепенно теряя способность к дифференцировке: от тотипотентной зиготы через стадию плюрипотентных клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты, к мультипотентным региональным стволовым клеткам и, наконец, к терминально дифференцированным клеткам. На молекулярном уровне процесс дифференцировки клеток и обретение ими определенного фенотипа сопровождается изменением экспрессии генов, и эпигенетическими изменениями, такими как: статуса метилирования генома, модификацией гистоновых белков и т.д. При нормальном развитии этот процесс необратим. Первые попытки провести дедифференцировки клеток in vitro были предприняты еще в середине прошлого века. Оказалось, что при переносе ядра соматической клетки в энуклеированный ооцит с низкой эффективностью происходит восстановление потенциала дифференцировки соматической клетки, что может приводить к полноценному развитию эмбриона. Эти исследования доказали принципиальную возможность репрограммирования генома соматической клетки до плюрипотентного состояния in vitro, более того, из них стало очевидно, что в клетках содержатся все необходимые факторы для репрограммирования. Однако, еще некоторое время набор этих факторов, необходимых для дедифференцировки клеток оставался неизвестным. Впервые прямое репрограммирование соматических клеток с помощью набора определенных факторов было осуществлено в 2006 году японскими исследователям Такаши и Яманака. Оказалось, что вполне достаточно экспрессии четырех генов, кодирующих транскрипционные факторы Oct3/4, Sox2, KLF4, и с-Мус для того чтобы фибробласты кожи мыши перешли в плюрипотентное состояние. Полученные клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, iPS клетками (induced pluripotent stem cells). По своим свойствам они оказались практически идентичны -их природным аналогам, получаемым из ВКМ бластоцисты - эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК). Как и ЭСК, iPS клетки в отсутствии сигналов дифференцировки и в присутствии факторов, обеспечивающих самоподдержание, продолжают симметрично делиться в течении неограниченного времени. В то же время, сменив условия культивирования, можно получить контролируемую дифференцировку ЭСК и iPS клеток в клетки-производные трех зародышевых листков. iPS клетки можно получить для каждого человека персонально, исследовать молекулярные механизмы возникновения патологии, и попытаться подобрать лекарственные средства для устранения причин

патологии или, более того, устранить генетическую причипу заболевания и использовать клетки для трансплантации. Все это открывает новые возможности для персонализированной медицины. Однако, до сих пор остается нерешенным целый ряд вопросов фундаментального характера: как именно происходит репрограммирование, какие процессы обеспечивают возвращение клетки в плюрипотентное состояние, и насколько похожи «искусственные» шиорипотентные клетки ¡РЭ на их «природные» аналоги — ЭСК? Настоящая диссертационная работа посвящена актуальным вопросам репрограммирования генома соматической клетки до плюрипотентного состояния. Цели и задачи исследования. Целыо настоящей работы явилась разработка модели репрограммирования и поиска наиболее оптимальных для репрораммирования соматических клеток, анализ эпигенома рспрограммировапных клеток, а также сравнение ¡РБ клеток с генетически идентичными им ЭСК человека. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- разработать протоколы по получению клеток с индуцированной плюрипотентностью из соматических клеток;

- провести генетическую и эпигенетическую характеристику полученных ¡Рв клонов;

- создать модельную систему для изучения процессов репрограммирования;

Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа вносит существенный вклад в современные представления о репрограммировапии клеток человека. Впервые проведено репрограммирование эндотелиальиых клеток пупочной вены человека. Показано, что полученные клопы близки к эмбриональным стволовым клеткам человека по своим морфологическим, функциональным, и молекулярным характеристикам, в том числе па эпигенетичеком уровне. Подтверждена ключевая роль гена Ос14 в приобретении и поддержании плюрипотентного состояния. Впервые продемонстрировано, что уровень иолногеномного метилирования плюрипотентных клеток выше, чем соматических. Создана модельная система для изучения точности процесса репрограммирования в изогенных условиях. Проведена ее проверка при репрограммировапии нейропальных клеток человека.

Практическая ценность работы заключается в разработке протокола репрограммирования легко доступных клеток эндотелия пуповины, доказательстве высокого сходства индуцированных плюрипотентных клеток, полученных из эндотелия и ЭСК. Это дает возможность дальнейшего их применения для персонализированной регенеративной медицины. Созданная модельная система позволит оптимизировать протоколы получения индуцированных плюрипотентных клеток из различных тканей взрослого организма.

Участие автора в получении результатов исследования. Основные результаты получены автором самостоятельно. Биоинформатический анализ был проведен совместно с к.б.н. Васиной Е.М., анализ кариотипа - совместно с к.б.н. Богомазовой А.Н., эксперимент по образованию тератом - совместно с д.б.н. Лагарьковой М.А. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), 7й и 9й ежегодной международной конференции общества исследователей стволовых клеток (International Society for Stem Cell Research) (Барселона, 2009; Торонто, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ. Из них статей - 5, тезисов докладов и материалов конференций - 8.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах, содержит

рисунков и таблиц, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы, включающего источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Репрограммирование эидотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).

Предыдущие опыты по репрограммированию различных типов клеток мыши и человека доказали, что тип клеток влияет на эффективность и кинетику этого процесса. К тому же, выбор типа клеток важен для возможного будущего использования репрограммированных клеток в биомедицинских целях. Доступность выбранного типа клеток, а также их возраст могут быть ключевыми факторами при репрограммировании. Например, клетки кожи человека часто используют для репрграммирования из-за их доступности и простоты манипуляций, несмотря на то, что они подвергаются ультрафиолетовому излучению и могут накапливать мутации, которые ограничивают их терапевтическое применение. Наряду с этим, культивирование клеток in vitro, добавление разнообразных факторов роста, необходимых для увеличения стартового количества клеток, также могут вызывать изменения на эпигенетическом и генетическом уровнях. Таким образом, выбор экспериментального типа клеток влияет как на генетическую «чистоту» получаемых клеток, так и на прохождение всего процесса репрограммирования.

Для индукции плюрипотентного состояния в человеческих соматических клетках были выбраны клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC). Их легко выделить в достаточном для репрограммирования количестве, и они практически не требуют манипуляций в культуре. Также, эти клетки еще не подверглись действию факторов внешней среды, что уменьшает количество приобретенных повреждений ДНК. Даннные по репрограммированию клеток эндотелия в литературе отсутствовали.

Для репрограммирования были использованы ретровирусы, несущие гены транскрипционных факторов. С помощью клеток Phoenix но стандартному протоколу были получены ретровирусы, несущие в своем составе гены Octi/4, So.x2, KLF4 и с-Мус. Диплоидные клетки HUVEC, полученные из пупочной вены новорожденной были инфицированы вирусами. Гомогенность и идентичность HUVEC была определена с помощью проточной цитофлуориметрии с использованием анител к антигенам CD31 и CD 144. Антитела к CD90 были использованы для того, чтобы обнаружить контаминацию фибробластами, которая могла произойти при выделении клеток IIUVEC. Проведенный анализ показал чистоту популяции выделенных клеток, и доказал их принадлежность к эндотелиальным клеткам пупочной вены человека, IIUVEC.

Протокол получения iPS клеток описан в разделе «Материалы и методы» и схематично приведен на рис. 1А. IIa третий и пятый день после инфекции часть репрограммируемых клеток была отобрана для анализа индукции экспрессии эндогеных Nanog и FoxDJ (рис. IB). Эти ТФ в норме не экспрессируются в клетках HUVEC. Их экпрессия была обнаружена уже на третий день после вирусной инфекции. Оба ТФ являются генами-мишенями Oct4, таким образом начало процесса репрограммирования в клетках HUVEC происходит уже на третий день после инфекции. Клетки велись на среде для IIUVEC в течении пяти дней, и потом пересаживались на инактивированные митомицином мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ). IIa шестой день после инфекции среда менялась па среду для ЭСК. Примерно на 12 день после инфекции появились первые колонии, морфологически отличающиеся от фидерного слоя фибробластов или эндотелиальных клеток (рис. 1С-К). На 16 день колонии приобрели морфологию, близкую к ЭСК человека, что становится явно видно примерно на 20 день (рис. 1F и G). На 21 день по морфологическому сходству с ЭСК с фидерного слоя были отобраны одиночные колонии. Они механически разбивались на маленькие кусочки без обработки ферментом, и пересевались на инактивированные МЭФ или матригель с добавлением соответствующей среды. Часть колоний изначально была неотличима от клеток ЭСК человека (клоны 10 и 12, рис. 1I-K), а часть (например, «несовершенный» клон 6) приобрели ЭСК-подобную морфологию только через шесть пассажей на фидере. При этом, клон 6 разделился на два субклона - с морфологией похожей, и непохожей на ЭСК. Из литературных данных известно, что первоначальный отбор следует совершать именно исходя из ЭСК-подобной морфологии трансформированных клеток, т.к. после анализа полученных клонов оказывается, что клоны, морфологически неотличимые от ЭСК, обладают самыми близкими к ЭСК характеристиками, и, таким образом, являются наиболее совершенными.

Все отобранные клоны с первого пассажа параллельно велись на матригеле в среде тТеЗШ, а также в фидерных условиях. Всего из 3 х 105 НЦУЕС было выделено 12 клонов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток эндотелия (епскйРЗ).

Рисунок 1. Получение и характеристика линий endo-iPS клеток человека. (А) Схема получения iPS клеток. Колонии iPS отбирались на основании морфологической схожести с ЭСК. (В) ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов Nanog и FoxD3 после вирусной инфекции. В указанные дни клетки отбирались для выделения РНК для анализа на эндогенную экспресию ТФ. (С-К) Морфологические изменения в течении прямого репрограммирования. Показаны характерные колонии: (С) клетки HUVEC сразу после вирусной инфекции; (D и Е) первые колонии репрограммированных клеток появились на 16 день, после переноса на фидер большинство HUVEC погибло или стало неотличимыми от фидерных клеток; (F и G) ЭСК-подобные колонии перед пересевом на 20 день; (Н) после пересева некоторые колонии все еще морфологически отличались от ЭСК; (I) другие оказывались неотличимы от ЭСК (например, клон 10 на фидере). (J и К) Пример морфологии колонии iPS клона (клон 12, пассаж 2), и линии ЭСК (hESMOl), растущих на матригеле. (L) ОТ-ПЦР анализ на экспрессию генов плюрипотентных (FoxD3, Nanog, Ocl3/4, Hesxl) и эндотелиально-специфичных (РЕСАМ, VE-cadh, GATA2, GATA3) маркеров в клонах iPS, ЭСК (как позитивный контроль), и HUVEC (негативный контроль). В качестве контроля количества матрицы был использован ген домашнего хозяйства GAPDH. (М) Анализ кариотипа растущего на матригеле endo-iPS клона 12, 20 пассаж.

Таким образом, эффективность процесса репрограммирования в нашем случае оказалась довольно низка, около 0,03%. При создании еп(1о-1Р8 клопов для повышения эффективности не были использованы малые молекулы, которые могут модулировать эпигенетическое состояние генов и гистонов, а также влиять на прохождение тех или иных сигнальных путей во время репрограммирования. Такая, «чистая», методика репрограммирования с использованием только соответствующих экзогенных транскрипционных факторов и условий культивирования позволяет говорить о том, что в полученных еп(1о-1Р5 клонах эпигеном остается интактен, и не подвержен никаким воздействиям кроме самого процесса репрограммирования.

Динамика репрограммирования (как появление первых клонов на 16 день, так и полное репрограммирование на 21) была аналогична опубликованным данным по репрограммированию фибробластов. 1.1. Характеристика еп(1о-!Р8 клеток.

Хотя морфологически все отобранные колонии епс!о-1Р5 были похожи на ЭСК, ОТ-ПЦР анализ показал, что в разных линиях епёомРБ клеток уровень экспрессии плюрипотентных и эндотелиальных маркеров варьирует (рис. 2Ц. В некоторых клонах мы не наблюдали экспрессии генов РЕСАМ (СОЗ!) и УЕ-саМегт, в то время как клетки других клонов экспрессировали эти специфичные для эндотелия гены на разных уровнях. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало присутствие ОаЗ/4 и в ядрах всех

клонов репрограммированных клеток (рис. 2А-С, табл. 1). Также во всех клонах наблюдалась экспрессия характерных для ЭСК поверхностных антигенов 55ЕА-4 и ТЯА1-60 (рис. 2Э-Е). Во всех проанализированных клонах также наблюдалась экспрессия СЭЗО (рис. ЗА), который, по нашим данным, также характерен для плюрипотнетных клеток.

Несмотря на присутствие мРНК РЕСАМ в некоторых епскйРБ клонах, мы не смогли детектировать этот поверхностный антиген с помощью антител в этих клонах репрограммированных клеток (рис. ЗВ). В епс1о-1Р8С также отсутствовала экспрессия СР105 (рис. ЗС, табл. 1). Эти наблюдения показывают, что 1ШУЕС в процессе репрограммирования приобретают не только ЭСК подобную морфологию, но также начинают экспрессировать гены, характерные для плюрипотентного состояния и теряют эндотелиальные маркеры.

Таблица 1. Экспрессия специфических маркеров endo-iPS клонами.

Важно заметить, что после прохождения процесса репрограммирования в «совершенных» iPS клонах экспрессия экзогенов

прекращалась (по данным ОТ-ПЦР). Для того, чтобы подтвердить, что endo-iPS клоны были получены непосредственно из клеток HUVEC, а не являются результатом случайной контаминции клетками ЭСК, мы провели генотипирование клеток по STR локусам. Паттерн из 18 STR полностью совпадал между endo-iPS клонами и родительской линией HUVEC, в то же время, отличаясь от линий ЭСК человека, которые мы используем в лаборатории. Таким образом было доказано, что endo-iPS линии оригинальны, и были получены из клеток HUVEC без контаминаций другими линиями ЭСК. Полученные линии endo-iPS клеток были разделены на две группы на основе экспрессии маркеров ЭСК, иммуноцитохимической и морфологической характеристик. Две линии (endo-iPS 10 и 12) были наиболее близки к ЭСК, в то время как другие не имели всех свойств полностью репрограммированных клеток (табл. 1). 1.2. Анализ кариотипа и уровня пролиферации линий endo-iPS.

Пролиферация и стабильность кариотипа - важные требования для роста и выделения клеток iPS in vitro. Клоны endo-iPS 10 и 12 росли на матригеле в среде mTeSRl с первого пассажа и показывали сходную с ЭСК кинетику роста. Популяция endo-iPS удваивалась каждые 31-34 часа, а ЭСК - раз в 30-36 часов. Эти endo-iPS клоны пассировались в той же пропорции (1:3) и с той же частотой (каждые 5-6 дней), что и ЭСК человека, и не меняли своих свойств течении как минимум 21 пассажа.

Кариотипирование endo-iPS клеток был проанализирован через 5 и через 20 недель после получения, используя стандартный протокол по окрашиванию клеток красителем Гимза после трипсинизации (GTG бэндинг). У обеих выбранных endo-iPS линий (10 и 12) был нормальный XX кариотип (рис. 1М, рис. 3D). Это говорит о том, что выбранные линии стабильны в течении пассажей, и, вероятно, полностью репрограммированы.

Expression of hESC-specific and cndothelial-specifíc markers evaluated by RT-PCR

line gene -„ hhSC iPS clones HUVliC

1 2 4 6 7 10 12

loxD3 ♦ ♦ ♦ ♦ + + * —

llesxl * ♦ ♦ ♦ * * ♦ —

Ocü.4 + » * + + • + -

Nanog * * ♦ ♦ » * —

CD3I — ♦ ♦ — * ♦ —

Vli-cadh — * * — + — — +

GATA2 — — ♦ — * — ♦ — ♦

GATA3 — _ _ + + — *

Expression of hESC-spcclfie and endothclial-specific markers evaluated by Immunocjlochcmistry

line gene ■ iPS clones uuvtc

1 2 4 6 7 10 12

Oct3-4 * * ♦ ♦ * * + —

Nanog + + * + * * + -

Tra-1-60 + — — — * — * —

SSLA-4 + — + — + * + —

CU30 ♦ - - - + ♦ » -

CD3! ♦

CDI05 *

CD90 ♦ * + < ♦ + 1- + *

Таким образом мы доказали, что полученные линии endo-iPS клеток могут стабильно поддерживаться в безфидерных условиях в среде с полностью охарактеризованными компонентами, что приближает их к «золотому стандарту» плюрипотентных клеток - ЭСК.

1.3. Дифференцировочный потенциал endo-iPS клонов.

Функционально плюрипотентные клетки характеризуются возможностью дифференцироваться в клетки, принадлежащие к трем зародышевым листкам. Для подтверждения плюрипотентности полученных линий endo-iPS клеток in vitro мы провели тест на образование эмбриоидных телец (ЭТ) из клонов 10 и 12. Через 6 дней в суспензии endo-iPS 10 и 12 сформировали сферические структуры, подобные ЭТ (рис. 2F), которые в дальнейшем образовали типичные цистоподобные структуры (рис. ЗЕ). Иммуногистологический анализ ЭТ выявил участки, позитивные на МОС-31, cytokeratin-7, vimentin и nestin (рис. 3F-I). Характерное расположение этих антигенов внутри ЭТ позволило нам различить слой экстраэмбриональной эндодермы, внутренний цистный эпителий, нейрональные предшественники, и другие показатели первых шагов дифференцировки. Таким образом, ЭТ полученные из обоих клонов, экспрессировали маркеры трех зародышевых листков. При дальнейшей спонтанной дифференцировке и культивировании в определенных условиях, описанных в разделе «Материалы и методы», endo-iPS клетки продолжали дифференцировку в клетки, принадлежащих к трем зародышевым листкам (эндо-, мезо-, и эктодерма). Дифференцировка endo-iPS в разные клеточные типы была подтверждена иммуноцитохимическим окрашиванием на соответствующие антигены. Эктодермальные клетки были окрашены на наличие GFAP и нейрон-специфичной энолазы, мезодермальные фибробластоподобные клетки - на пролин 4-гидроксилазу (рис. 2J-I, рис. ЗК и L). Эндотелиальные клетки, полученные из endo-iPS были окрашены на специфические маркеры vWF и CD31 (рис. 2J-L). Полученные дифференцированные производные были полностью функциональны. Например, клетки, положительные на CD31, были успешно сепарированы с помощью магнитных частиц, и прошли функциональный тест на формирование сосудо-подобиых структур in vitro (рис. ЗМ). Эндодермальная дифференцировка была подтверждена окрашиванием на альфафетопротеин и GATA-6 (рис. 2М-0).

Рисунок 2.

Иммуноцитохимическая характеристика endo-iPS и их

дифференцированных производных. (А-Е) Недифференцированные endo-iPS клоны

экспрессируют маркеры, характерные для ЭСК. (A) 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (синий) окрашивание показывает обшее количество клеток в поле зрения. ИЦХ с антителами, специфическими для ОСТЗ/4 (В), NANOG (С), Тга-1-81 (D), SSEA4 (Е). Показаны

характерные колонии endo-iPS 10 и 12. (F) Формирование ЭТ. (G, J, М) Различные типы морфология прикрепленных ЭТ. (G-I) Эктодермальная дифференцировка (нейроны и глия). (G) На просвет, (Н)

окрашивание на

антитела к GFAP (красные), (I) на нейрон-специфическую энолазу (зеленые). (J-L)

Дифференцировка в мезодерму (эндотелиальные клетки). (J) В проходящем свете, (К) окрашивание на vWF (кр.), (L) на CD31 (кр.). (М-О) Энтодермальная дифференфировка. (М) На просвет, (N) окрашивание на альфафетопротеин (зел.), (О) на GATA-6 (кр.). Показаны репрезентативные ЭТ, сформированные при дифференцировке линий endo-iPS-10 и endo-iPS-12. (Р) Гемтоксилиновое и эозиновое окрашивание тератомоподобных структур, полученных при инъецировании endo-iPS-12 в иммунодифицитных мышей. Показанные срезы представляют три эмбриональных зародышевых листка: нейрональную ткань (эктодерма), хрящь (мезодерма), и кишечный эпителий (энтодерма).

Для того, чтобы подтвердить плюрипотентность endo-iPS человека in vivo мы использовали стандартный тест формирования тканей, принадлежащих трем зародышевым листками при введении плюрипотентных клеток человека в иммунодифицитных мышей. Опыты с иммунодифицитными (пи/пи) мышами, были проведены в НИИ Канцерогенеза. 106 клеток вводилось подкожно иммунодефицитным

животным. Через 8-9 недель после инъекции мы обнаружили опухоли, которые содержали дифференцированные ткани, принадлежащие к трем зародышевым листкам (рис. 2Р).

Рисунок 3.

Иммуноцитохимическая характеристика endo-iPS и их

дифференцированных производных. (А)

Недифферецированные линии endo-iPS также экспрессируют на совоей поверхности CD30

антиген. (В) Экспрессия эндотелио-специфичного маркеров CD31 и (С) CD 105 теряется в процессе репрограммирования. 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) окрашивание показывает обшее

количество клеток в поле зрения (синий). (D) Кариотин endo-iPS-10 на седьмом пассаже. (Е) Цистоподобные ЭТ на 12й день

культивирования. (F-I) ИЦХ анализ

дифференцировки клона endo-iPS-12 внутри ЭТ. (F) Окрашивание на МОС-31 (кр.), (G) цигокератин 7 (кр.), (Н) виментин (зел.). (I) Окрашивание на нестин того же серйного среза, что и (G) (кр.). (К) Фибробластоподобные клетки на просвет, их окрашивание на (L) пролил 4-гидроксилазу. (М) Тест на образование сосудистых структур (cord-formation assay) отсортированных эндотелиальных клеток, полученных из endo-iPS.

Таким образом, мы доказали возможность дифференцировки endo-iPS in vivo и in vitro в клетки трех зародышевых листков. Это, совместно с данными об экспрессии плюрипотентных маркеров и морфологической характеристикой, демонстрирует, что две линии (10 и 12) полученных endo-iPS клеток отвечают всем параметрам плюрипотентного состояния. Для выяснения более тонких сходств и различий между ЭСК и endo-iPS клетками мы провели анализ эпигенетических характеристик этих линий.

1.4. Анализ СрС метилирования регуляторных районов генов у епйо-|Р8.

Одной из существенных характеристик эпигенетического состояния генома является метилирование ДНК. Литературные данные свидетельствуют о том, что в течении репрограммирования происходят глобальные изменения в метилировании ДНК и

ремоделирование хроматина. При дифференцировке ЭСК происходит замолкание плюрипотентных генов, и частично это осуществляется за счет метилирования ДНК. В то же время гены, ассоциированные с разными типами соматических клеток, деметилируются в процессе дифференцировки ЭСК. На основе этих наблюдений мы предположили, что CpG островки внутри промоторов эндотелиальных генов после репрограммирования должны гиперметилироваться. Для этого был проведен полногеномный анализ метилирования ДНК с использованием Illumina HumanMethylation27 BeadChip. Он позволяет проанализировать около 27,000 значимых сайтов метилирования в промотерных регионах, а также горячие точки метилирования более 14,000 генов с точностью до одного нуклеотида. Для бисульфитной конверсии и гибридизации к BeadChip была взята геномная ДНК двух линий ЭСК, двух линий endo-iPS клеток, родительская линия HUVEC, и не связанная с ними линия РВМС (peripheral blood mononuclear cells - мононуклеарная фракция периферической крови) человека.

Для изучения изменения CpG метилирования при репрограммировании было выбрано 25 генов, специфичных для эндотелия. Промоторные элементы двух генов (EDN2, NOSS) были гиперметилированы во всех исследованных линиях клеток (рис. 4А), в то время как промоторы 10 генов (KDR, МСАМ, SERPINE1, EFEMP1, THBD, FLT1, CTGF, EDG1, EDNI, PROCR) были слабо метилированы. Интересно, что в процессе репрограммирования примерно половина эндотелий-специфичных генов подвергались гиперметилированию до уровня, который наблюдается у этих генов в ЭСК человека. Гиперметилирование регуляторных районов генов часто связано с уменьшением их транскрипционной активности. Как следует из наших данных по анализу транскрипционной активности генов РЕСАМ (CDU), ENG (CD105), и CDH-5 (VE-cadherin), их экспрессия в репрограммированных клонах обратно коррелирует со степенью метилирования их промоторных районов (рис. 1L).

Известно, что метилирование CpG промоторных районов генов влияет на их транскрипционную активность. В частности, деметилирование промоторов генов плюрипотентности (Oct3/4, Nanog) наблюдается в процессе индукции плюрипотентности в фибробластах человека. Для изучения этого феномена при репрограммировании клеток эндотелия мы проанализировали изменение уровня метилирования промоторных элементов генов, связанных с плюрипотентным состоянием. Почти 60% CpG участков внутри промоторных элементов генов плюрипотентности были гипометилированы, в то время как менее 30% - гиперметилированы (рис. 4В).. Для того, чтобы идентифицировать дифференциально метилированные гены, мы сравнили уровни метилирования индивидуальных CpG сайтов в соматичиских клетах (HUVEC и РВМС), двух линиях

endo-iPSC, и двух линиях ЭСК человека. Мы обнаружили, что различия между соматическими или плюрипотентными клетками были статистически значимы для 9 из 33 изучаемых генов плюрипотентности (р < 0.05) (рис. 4С). Следует отметить, что при этом анализе только CpG гена Oct3/4 (POU5F1) удовлетворили самому строгому критерию (р < 0.001). Это косвенно свидетельствует о том, что наиболее важным для репрограммирования клеток до плюрипотентного состояния является гипометилирование промотора гена Oct4 и его транскрипционная активность.

Анализ изменения метилирования CpG островков промоторных районов на уровне целого генома показал, что у всего набора анализируемых линий большинство генов (61%) гипометилированы (average Beta value <0.2) и только 10% - гиперметилированы (average Beta value >0.8). Тем не менее, уровень метилирования всего генома у обоих типов плюрипотентных клеток (ЭСК и iPS) был выше, чем у соматических клеток. При этом, уровень метилирования endo-iPS был немного выше, чем у ЭСК (рис. 4D). Проведенный иерархический кластерный анализ (рис. 4Е) показал, что плюрипотентные клетки - ЭСК и iPS - кластеризуются вместе. Полученные результаты принципиальным образом меняют сложившуюся на сегодняшний момент картину метилирования ДНК в раннем эмбриональном развитии. Считается, что на стадии морулы и бластоцисты мыши ДНК гипометилирована, и метилирование нарастает по мере специализации эмбриональных тканей. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что большинство генов имеют повышенный уровень метилирования в ЭСК по сравнению с соматическими клетками. Это позволяет спекулировать о роли метилирования в развитии организма. Можно предположить, что в начале развития, на стадии ЭСК, осуществляется строгий контроль экспрессии генов через метилирование основного пула генов, контролируемых метилированием. В процессе развития часть генов, ответственных за контроль дифференцировки в ту или иную ткань, деметилируется, позволяя работать соответствующим сигнальным путям, направляющим дифференцировку. В дальнейшем, после прохождения всего процесса развития клетки, гипометелированные гены, вероятнее всего, не претерпевают de novo метилирования, что дает пониженный уровень метилирования на полногеномном уровне при анализе соматических клеток. Работа «открытых», гипометилированных, генов у соматических клеток может контролироваться другими способами, тем не менее, это позволяет говорить о более низком уровне контроля экспрессии генов у соматических клеток по сравнению с плюрипотентными.

Для полногеномного анализа сходства профиля метилирования промоторных районов 14000 генов линий ЭСК и iPS был использован Пирсоновский коореляционный анализ. Построенная матрица Пирсоновских коэффициентов корреляции показала что

линии ¡РЭ клеток также близки к ЭСК (коэф. 0,970-0,973) как и две независимые линии ЭСК (коэф. 0,975).

Рисунок 4.

Полногеномный и геноспецифичный анализ метилирования Срв в промотерах соматических и

плюрипотентных клеток. (А) Карта Меа1Мар Срй

метилирования 25 широко известных эндотелио-специфических генов,

(B) и 33 генов, связанных с

плюрипогентностью.

специфичных генов с значительно уменьшенным в

плюрипотентных клетках уровнем метилирования. (О) Сравнение полногеномного уровня Срй метилирования между соматическими и плюрипотентными клетками. ¡Р8 клетки показаны красным, ЭСК - зеленым. Расстояние до черной линии показывает уровень Срв метилирования в ¡РЭ и ЭС клетках. (Е) Классификация линий клеток на основе их паттерна метилирования. В качестве иллюстрации полногеномного иерархического кластеринга показана дендрограмма, выделяющая две группы клеток - соматические и плюрипотетные.

Для того, чтобы увидеть сходства между линиями ешЬ^РЭС и ЭСК, а также различия между плюрипотетными и соматическими клетками, мы исследовали паттерн полногеномного метилирования генов с помощью дифференциального анализа. Мы обнаружили 2,226 генов, которые были дифференциально метилированы между плюрипотентыми и соматическими клетками (это составило 8,4% из 26210 Срй, вошедших в анализ, р < 0.05) (рис. 6). Используя более строгий уровень значимости (р < 0.001,), мы выделили группу из 378 дифференциально метилированных Срв (1,4% из 26210), из которых метилирование 306 Срв значительно отличалось между епскыРБ и соматическими клетками, 372 - между ЭСК и соматическими клетками, и только 46 генов были дифференциально метилированы между линиями епс1о-1Р8 и ЭСК. Разделение дифференциально метилированных Срв между соматическимиЛРБ клетками и соматическими/ЭСК позволило нам идентифицировать 282 локуса Срй, которые

Р ..щ. Hai1iiti.il типу!«поп Нч1ис«1 т.ШуИнпл

ifiiPac.li, п Е6 »11*

<О.М1 РОЩИ1 роизи

1*т».еслти. (лгрмесатн,

<0 03 НЕЗЛ1 3*111 НИИ' ИЗЗХ1 3*1 И. 'ООН 60*13 60М1 СЮ* SOX15.C1.C1te

отличались между соматическими клетками и обоими классами плюрипотентных клеток. Таким образом, наш анализ подтвердил высокий уровень сходства между линиями епс!о-¡РБ и ЭСК, и их отличия от соматических линий НЦУЕС и РВМС. В тоже время, необходимо отметить, что наблюдаются некоторые различия в метилировании промоторных районов небольшого количества генов между ЭСК и епсккРЭ клонами, отобранными для анализа.

Таким образом, мы получили и охарактеризовали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Был разработан протокол репрограммирования этих клеток, а также было доказано, что линии епдочРБ 10 и 12 отвечают всем требованиям к плюрипотентным клеткам, и по своим свойствам, в том числе и эпигенетическим, сходны с ЭСК человека. Небольшие различия между ними существуют, но, как в большинстве подобных анализов, могут быть связаны с различной генетической природой клеток эндотелия и клеток ЭСК, которые использовались в экспериментах. Поэтому в качестве следующего этапа было интересно разработать такую схему эксперимента, которая бы позволяла получить ¡Рв клетки, генетически идентичные той или иной линии ЭСК. Такая модельная система позволила бы проследить процессы, проходящие во время репрограммирования вне зависимости от генотипа. Сведения о проведении таких исследований в литературе отсутствуют. 2. Создание модельной системы для изучения процесса репрограммирования в изогенных условиях.

Следующим шагом после разработки протокола репрограммирования клеток

человека и характеристики клонов ¡РЭ было получение модельной системы для изучения

процесса репрограммирования. На рис. 7 отражена схема эксперимента.

Рис. 5. Общая схема эксперимента по созданию модельной системы для изучения процессов

репрограммирования.

Как уже говорилось, «золотой стандарт»

плюрипотентных клеток - это ЭСК. Но часто при сравнении разных линий ¡РБ и ЭСК бывает невозможно отделить различия, связанные с прохождением процесса репрограммирования, от различий, продиктованных разной генетической природой этих клеток. В нашем исследовании (см. раздел 1.4) и других работах (Ниа^А) а1., 2008Ь)

НЕБМ05 + Еип1й-иг.шш5!й

клоны ¡РБ

«+» клоны

релрограммированме

ди.ф45.е.р.еяциравка

+ Пах

нейроны

сепарация, характеристика

было показано, что линии ЭСК настолько же различаются между собой, насколько они различны с линиями iPS. Чтобы нивелировать различия, возникающие за счет различной генетической природы линий ЭСК и iPS клеток нами было решено получить iPS клетки, которые имеют идентичный с ЭСК генотип. Свой вклад в различия между линиями iPS клеток и ЭСК могут также давать процессы интеграции в геном вирусов, которые используются для введения в клетки генов ТФ. Поэтому для получения iPS клеток мы использовали индуцибельную систему экспрессии трансгенов. Для этого на первом этапе было необходимо получить линии ЭСК человека, содержащие ТФ. необходимые для репрограммирования (Oct3/4, Sox2, KLF4, с-Мус) под индуцируемыми доксициклином промотором.

2.1. Получение линии ЭСК человека, содержащей ТФ Oct4, Sox2, KLF4, с-Мус под индуцибельными промоторами.

На настоящий момент самой распространенной индуцибельной системой экспрессии трансгенов является Dox-система, в нашей работе мы использовали tet-on (при индукции доксициклином целевой ген начинает экспрессироваться) систему. Для создания линии ЭСК со встроенными генами ТФ, необходимыми для репрограммирования (Oc/3/4, Sox2, KLF4, с-Мус), геном трансактиватора (rtTA), и геном устойчивости к антибиотику (Neo) была выбрана линия hESM05, обладающая всеми свойствами ЭСК и нормальным кариотипом. Вирусы для трансфекции получали как описано в «Материалах и методах». После инфекции клеток hESM05 вирусами (МОГ 5 для вирусов, содержащих rtTA и Neo, MOI 2 - для вирусов, содержащих гены ТФ) были отобраны клоны ЭСК, устойчивые к действию антибиотика G418. Полученные клоны были охарактеризованы с помощью ПЦР анализа па наличие необходимых вставок. Всего было получено 48 клонов, из них в 7 наблюдались вставки всех трансгенов. Для того, чтобы проверить работу индуцибельных трансгенов в полученных клонах hESM05, мы провели спонтанную дифференцировку этих клеток в течении 14 дней, и после этого индуцировали их работу доксициклином. Иммуноцитохимический и ОТ-ПЦР анализ до и после индукции выявил клоны, успешно экспрессирующие все четыре трансгена (Oct3/4, Sox2, KLF4, с-Мус) (рис.5).

_______________ Рис- 6- ОТ-ПЦР анализ

GAPDi i ОЗНЕЭ^ЕЭШЕШ^ЦЕИ^ЕЯЕНИ дифференцированных

'■' I производных клона 2

^^линии hESM05 после

■ |k,i -Doí +Do* -Do* -Do* -Dox *Dox -Dox

индукции доксициклином.

Для дальнейшей работы была выбрана линия, названная hESM05neo2. Она имела в своем составе все экзогены, экспрессия которых появлялась после добавления в среду

доксициклина. Как и все ЭС клетки человека, клетки линии ИЕ8М05пео2 экспрессировали гены плюрипотентного состояния, также она показывала способность образовывать эмбриоидные тельца и дифференцироваться в производные трех зародышевых листков.

2.2. Дифференцировка линии |1Е8\105пе<>2 в нейросферы.

В качестве направления дифференцировки были выбраны нейрональные клетки из-за быстроты и простоты такой дифференцировки. Также важно отметить, что при нейрональной дифференцировке практически отсутствуют клетки других фенотипов, что упрощает их характеристику и работу с ними. Линия ЬЕ8М05пео2 была дифференцирована по нейрональному пути в соответствии протоколом, представленным в «Материалах и методах». В результате направленной дифференцировки ЭСК были получены нейросферы. Они были посажены на матригель и, через неделю дифференцировки, охарактеризованы морфологически и иммуногистохимически на наличие соответсвующих маркеров(рис. 9).

Рис. 7. Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика полученных нейросфер на

соответствующие маркеры.

Проведенный РАС5 анализ дифференцированной клеточной популяции не

выявил клеток, которые экспрессировали бы ген Ос14 (рис.8). Это говорит о том, что в изучаемой популяции клеток все они потеряли свойство плюрипотентности и приобрели фенотип диффренцированных

neuron-specific enolase

клеток.

Рис. 8. РАСБ анализ клеток нейросфер, полученных из ЬЕ8М05пео2, на Ос! 3/4. Синяя область - опыт, прозрачная - изотип контроль.

2.3. Использование индуцибельиой системы для репрограммирования иейральпых

клеток.

Поскольку основные работы с использованием Оох-системы были выполнены на клетках мыши, то нами было решено дополнительно изучить влияние условий культивирования на эффективность и кинетику репрограммирования. При репрограммировании клеток с использованием лентивирусных систем конститутивно экспрессирующихся ТФ в процессе приобретения соматическими клетками плюрипотентности, происходит постепенное замолкание траисгенных факторов и активация эндогенных ТФ. В случае использования Оох-системы замолкание индуцибельного промотора происходит только в случае отмены доксициклина. Если «выключить» систему слишком рано, клетки могут недорепрограммироваться и уйти в дифференцировку, а если слишком поздно - то можно получить ¡РБ клетки, зависимые от экспрессии экзогенных транскрипционных факторов. Например, для фибробластов мыши доксициклин необходимо убирать через 16 дней, а для кератиноцитов - через 14. Эта разница во времени может возникать из-за того, что разные типы клеток имеют разное эпигенетическое состояние и экспрессируют разный уровень генов, вовлеченных в процесс репрограммирования. Так, известно, что в большинстве нейроиальных клеток наблюдается экспрессия с-Мус и К1_Р4, поэтому для них время работы индуцибельной системы можно уменьшить до 14 дней. Схемы проведенных экспериментов по репрограммированию приведены на рис. 9. Принципиально они отличались временем смены нейрональной культуральной среды на среду для плюрипотентных клеток, которая происходила или на нулевой день после индукции факторов репрограммирования, или на седьмой, а также присутствием или отсутствием фактора механического пересева репрограммируемых клеток.

Рисунок 9. Схемы параллельных экспериментов по репрограммированию нейрональных клеток

человека. Сверху (А) «классическая» схема

репрограммирования с

пересевом через 7 дней после индукции экзогенных ТФ; снизу (Б) схема

репрограммирования, разработанная для Оох-системы.

о г

) нейрональная среда I

перенос на желатин

добавление доксициклина

пересев

на фидер

первые отмена

клоны доксициклина

отбор клонов

-2 О

н^ирональная срфа

перенос на добавление первые фидер доксициклина клоны

отмена доксициклина

-Л

отбор

клонов

Первые морфологические признаки репрограммирования нейрональных клеток человека мы наблюдали уже на 4 день при использовании схемы рис. 9Б, в то время как при использовании схемы репрограммирования, представленной на рис. 9А первые морфологически измененные клетки были обнаружены только через 8 дней. Таким образом, не только экспрессия генетических факторов репрограммирования влияет существенным образом на процесс приобретения плюрипотентности, но и условия внешней среды, которые поддерживают и обеспечивают поддержание клетками плюрипотентности. На 15 день доксициклин исключался из среды для репрограммируемых клеток и дальнейшее репрограммирование происходило исключительно за счет экспрессии эндогенных факторов. На 20 день был проведен отбор первых ЭСК-подобных клонов. Клоны отбирались вручную, всего было отобрано 72 клона с обоих параллельных экспериментов, они были названы пеиго-1Р82.1(2,3,4 и т.д.). Количество клонов, полученных по двум схемам, статистически достоверно не различалось, принципиальные различия были выявлены в кинетике процесса репрограммирования: чем раньше репрограммируемые клетки оказывались в условиях культивирования плюрипогентных клеток, тем раньше появлялись ЭСК-подобные клоны. Эффективность репрограммирования, т.е. отношение количества получившихся ЭСК-подобных клонов к общему количеству нейрональных клеток, использовавшихся для репрограммирования, составила 10%. Это - более, чем в 300 раз больше, чем эффективность репрограммировании клеток НЦУЕС. Такая высокая эффективность репрограммирования может быть объяснена тем, что мы имели дело с нейрональными клетками, полученными из стабильного клона ЭСК, содержащего в своем геноме все четыре необходимых транскрипционных факторов, причем отобранные для исследования клоны ЭСК были проверены на индуцибельную экспрессию трансгенов. В случае использования стандартной системы ретровирусной инфекции каждый вирус интегрирует с различной копийностью в разные места генома, что приводит к неравномерной экспрессии факторов репрограммирования в соматических клетках. Вместе с тем необходимо отметить, что даже в случае использования индуцибельной системы эффективность репрограммирования не составляет 100%. Это говорит о том, что помимо условий окружающей среды (способов культивирования клеток) и экспрессии транскрипционных факторов репрограммирования, на эффективность репрограммирования оказывают влияние еще не определенные до конца клеточные факторы. Важно отметить, что в этом эксперименте, в отличие от репрограммирования НЦУЕС, практически все трансформированные клетки морфологически были полностью репрограммированы, т.е. с момента формирования похожи на ЭСК. Вероятно, что это

также связано с унифицированным и стабильным действием экзогенных ТФ на все репрограммируемые клетки.

2.4. Характеристика псипйР82.0.

Полученные клоны были охарактеризованы на молекулярном уровне на экспрессию маркеров плюрипотентого состояния (рис. 10, 11).

Тг» 1-60 Ос13/4 Ыапод

Рис. 10. Иммуноцитохимический анализ клонов пеипиР52.0 на маркеры плюрипотентного

состояния. Красным показано свечение соответствующих

маркеров, синим - окраска ядер на ОАР1.

SSEA4 DAPI DAPI

ESikot2 2исшо UD-lPS 2.29 2.35 2.36 2.38 2.51 2.52 2.54 2.56 GAPDH Oct Ntuiog FoxD? Hesxl Dppa5

Рис. 11. ОТ-ПЦР анализ клопа ESneor2, полученных из него нейрональных клеток (2neuro), недорепрограммированных клонов (un-iPS), а также клонов neuroiPS2.0. Анализ проводился на маркеры плюрипотентного состояния Oct3/4, Nanog, FoxD3, Hesxl, Dppa5, Salll, а также нейрональные маркеры Рахб, NeuroDl.

Рис. 12. Иммуноцитохимический анализ дифференцировки

neuroiPS2.0 клонов в сторону эктодермы (vimentin, PAN-cytokeratin), мезодермы (CD 105, desmin, troponin, CD31), и энтодермы (AFP - Alpha Fetoprotein, Alpha-1-antitrypsin) через стадию эмбриоидных телец (ЭТ). Свечение соответствующих маркеров обозначено красным, окрашивающий ядра DAPI синим.

Проведенный анализ показал экспрессию во всех клонах маркеров плюрипотентного состояния, и почти полный сайленсинг тканеспецифичных маркеров. В качестве функционального теста на плюрипотентное состояние пештаР52.0 клонов была проведена т у//го дифференцировка трех репрезентативных клонов через стадию

PAN-cytokerali

CD 105

эмбриоидных телец (рис. 12). Также в результате спонтанной дифференцировки были получены сокращающиеся кардиомиоциты.

В качестве следующего шага мы решили сравнить эпигенетические характеристики полученных iPS клеток и изогенных им ЭСК человека. Для этого было проведено бисульфитное секвенирование регуляторного района (-565; -299) промотера гена Nanog в ЭСК, полученных из них нейрональных клетках, и двух iPS клонах - производных этих нейрональных клеток. Метилирование восьми CpG островков, находящихся в изучаемом регуляторном районе было повышено (около 69% заметилированных CpG) у нейрональных клеток, и понижено (16% заметилированных CpG) у ЭСК. В изученных iPS клонах 2.52 и 2.56 было обнаружено расхождение по уровню метилирования изучаемого региона: клон 2.56 оказался по этому признаку ближе к соматическим клеткам (59% заметилированых CpG), а клон 2.52 - к плюрипотентным (23% заметилированных CpG). Это говорит о том, что в процессе репрограммирования разные клоны могут оказываться «дальше» или «ближе» к ЭСК. Интересно отметить, что, по результатам общепринятых морфологических, молекулярных, и функциональных тестов на плюрипотентность, оба клона были аналогичны друг другу и ЭСК. Поэтому можно утверждать, что эпигенетическая характеристика абсолютно необходима для понимания внутренних процессов, происходящих в получаемых iPS клетках, и их характеристики. Причем, для анализа iPS клеток можно применять как данные, полученные на уровне изучения полного эпигенома, так и данные о регуляции работы отдельного гена. Важно, что анализ регуляции всего одного гена плюрипотентности позволяет судить о «совершенстве» iPS клона.

Для дальнейшего сравнения полученных iPS клонов с изогенными ЭСК мы провели их протеомный анализ в НИИ ФХМ РАМН (рис.13).

Рис. 13. Протеомный анализ клеток iPS (отмечены зеленым) и ЭСК (отмечены красным). Стрелками обозначены белки, которые присутствуют только в одном типе клеток. Цифры соответствуют следующим белкам: 3 - Annexin V A [Homo sapiens]; 7 - protein phosphatase inhibitor 2 [Homo sapiens]; 10 -cytokeratin 8 [Homo sapiens]; 15 - unnamed protein product [Homo sapiens]; 17 - basonuclin [Homo sapiens].

Оказалось, что эти клетки различаются всего по пяти белкам (Annexin V A, protein phosphatase inhibitor 2, cytokeratin 8, unnamed protein product, basonuclin), специфических функций которых в плюрипотентных клетках показано не было. Это говорит о крайней близости изогенных линий iPS и ЭСК, что подтверждает успешность полученной модельной системы. Таким образом, мы создали и проверили работу модельной системы, позволяющей с высокой эффективностью провести репрограммирование разнообразных типов клеток человека, сравнить репрограммированные клоны с изогенными им ЭСК и дифференцированными производными. Эта технология позволяет как проанализировать процессы, происходящие во время репрограммирования, и оценить вклад используемых для репрограммирования дифференцированных клеток в генетическое и эпигенетическое состояние получаемых iPS клеток, так и еще на один шаг приблизиться к возможному использованию iPS клеток в биомедицине путем лучшего понимания природы этих клеток, и возможного совершенствования протоколов по их получению.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С первого эксперимента по прямому репрограммироваиию прошло около пяти лет.

За это время было проведено множество работ, посвященных повышению эффективности

репрограммирования, варьированию состава ТФ и методов их введения, а также типов

клеток, используемых для экспериментов. В рамках настоящей работы перед нами стояло

несколько задач. В тот момент было репрограммировано всего три типа клеток человека,

поэтому было необходимо провести прямое репрограммирование других типов

соматических клеток человека. Мы выбрали клетки эндотелия пупочной вены человека

(IIUVEC) из-за их легкой доступности иеиивазивными методами, а также безопасности

(вероятность обнаружения в их геноме спонтанных мутаций сводится к минимому

благодаря отсутствию влияния внешних мутагенов и небольшому количеству пассажей in

vitro перед репрограммирванием). Характеристика полученных endo-iPS клонов показала,

что среди них два клопа полностью удовлетворяли всем условиям плюрипотснтности.

Эпигенетическое сравнение endo-iPS клеток, ЭСК человека, и клеток HUVEC выявило

несколько закономерностей. Во-первых, было показано, что репрограммирование ведет к

полногаюмным эпигенетическим изменениям, которые в целом характеризуются

гиперметилированием генов, характерных для клеток HUVEC, и уменьшением уровня

метилирования генов, связанных с плюрипотентпым состоянием. Интересно, что общий

уровень метилирования плюрипотентных клеток оказался выше, чем у соматических

клеток, что заставляет пересмотреть "классическую" теорию, согласно которой

повышение общего уровня метилирвоапия приводит к дифференцировке клеток. Также,

была подтверждена ключевая роль гена 0&4 в поддержании и индукции плюрипотентности. При сравнении эпигеномов епскыР5 клеток и ЭСК было показано, что они очень близки друг к другу, и степень сходства между ними (около 0,97%) соответствует сходству между разными линиями ЭСК. Это может говорить о том, что различия между ними могут быть связаны с разницей в их геномах. Для того чтобы иметь возможность более детального изучения репрограммирования вне зависимости от генетического и эпигенетического состояния различных клеточных типов и линий мы создали модельную систему, которая бы позволяла проводить эффективное репрограммирование разнообразных типов соматических клеток человека, и сравнивать полученные 1РЭ клетки с изогенными им ЭСК. Для этого мы получили и охарактеризовали клон линии ЭСК человека НЕ5М05, который содержал в своем составе гены ТФ «коктейля Яманаки» под промоторами, индуцируемыми доксициклином. В рамках такой модели генетические и эпигенетические различия между плюрипотентными клетками будут следствием прохождения процессов дифференцировки-репрограммирования. Для проверки работы разработанной модельной системы мы дифференцировали полученный клон Е5пео2 по нейрональному направлению. С помощью двух различных методик были получены пеигомРЗ клоны, которые были охарактеризованы морфологически, на соответсвующие молекулярные маркеры, а также функционально. Таким образом была экспериментально подтверждена эффективность разработанной модельной системы. В качестве эпигенетического сравнения было проведено бисульфитное секвенирование регуляторного района промотера гена Nanog, одного из важнейших генов плюрипотентности. Было показано, что метилирование восьми Срй островков, находящихся в изучаемом регуляторном районе было повышено у нейрональных клеток, и понижено у ЭСК, что соответсвует литературным данным. Среди двух изученных педамРв клонов по уровню метилирования один оказался ближе к нейрональным клеткам, а другой - к ЭСК. Это говорит о том, что в процессе репрограммирования отдельной клетки (клона) может произойти как полная, так и не полная перестройка работы генома и эпигенома, и, несмотря на одинаковые морфологические и функциональные характеристики, ¡РБ клоны могут сильно отличаться на молекулярном уровне. Это еще раз подтверждает необходимость разработки унифицированной характеристики получаемых ¡РЭ клеток.

выводы

1. Впервые было проведено генетическое репрограммирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека до плюрипотентного состояния. Показано, что полученные линии полностью реирограммированных endo-iPS клонов по морфологическим, генетическим, эпигенетическим и функциональным свойствам соответствуют эмбриональным стволовым клеткам человека.

2. Был проведен полногеномный анализ изменения уровня метилирования промоторов 14 тысяч генов человека при приобретении соматическими клетками плюрнпотнетного состояния. В результате анализа впервые продемонстрировано репрограммирование соматических клеток на эпигенетическом уровне.

3. Впервые продемонстрировано, что in vitro уровень полногеиомного метилирования плюрипотентпых клеток выше, чем соматических.

4. В результате полногеномного анализа метилирования промоторных участков 14 тысяч генов плюрипотентпых и соматических клеток была подтверждена ключевая роль гена Oct4 в приобретении и поддержании плюрипотентного состояния.

5. Впервые создана и опробована модельная система индукции плюрипотентного состояния в дифференцированных клетках человека, позволяющая изучать генетические и эпигенетические характеристики процесса репрограммироваиия различных типов соматических клеток до плюрипотентного состояния.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

Список опубликованных работ:

1. Bogomazova AN, Lagarkova MA, Tskhovrebova LV, Shutova MV, Kiselev SL. Error-prone nonhomologous end joining repair operates in human pluripotent stem cells during late G2. Aging (Albany NY). 2011 Jun;3(6):584-96.

2. Elena S. Philonenko, Maria V. Shutova, Ilya V. Chestkov, Maria A. Lagarkova, and Sergey L. Kiselev. Current Progress and Potential Practical Application for Human Pluripotent Stem Cells. Chapter 4, International Review of Cell and Molecular Biology, Volume 292 # 2011, pp 145-188, Elsevier Inc.

3. MA Lagarkova, MV Shutova, AN Bogomazova, EM Vassina, EA Glazov, P Zhang, AA Rizvanov, IV Chestkov, SL Kiselev. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. Cell Cycle (2010) vol. 9 (5) pp. 937-46

4. Киселев С.Л., Шутова M.B. Репрограммирование клеток: прыжок вверх по лестнице, ведущей вниз. Природа №5 2010 стр 3-10

5. М.В. Шутова, А.Н. Богомазова, М.А. Лагарькова, С.Л. Киселев. Получение и характеристика клеток человека с индуцированной плюрипотентностью. Acta Naturae, 2009, vol 2 pp 104-106

Тезисы научных конференциий и симпозиумов:

1. Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009 г., доклад в секции «Биология развития» на тему «Создание линий iPS клеток (стволовых клеток с индуцированной плюрипотентью) из эндотелиальных клеток человека», диплом за лучший секционный доклад.

2. International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 7th Annual Meeting July 8-11, 2009. Centre Convencions Internacional, Barcelona. Стендовый доклад на тему «Generation of induced pluripotent stem (iPS) cells from the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)».

3. Всероссийская конференция «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования», 21-23 сентября 2009 года, стендовый и устный доклад на тему «Создание линий iPS клеток (стволовых клеток с индуцированной плюрипотентью) из эндотелиальных клеток человека», диплом победителя конкурса работ в номинации «Лучшее фундаментальное исследование».

4. The international conference chromosome 2009, 31 августа — 6 сентября 2009, Новосибирск, доклад на тему «Эпигенетические изменения при индукции плюрипотентного состояния в соматических клетках человека».

5. 7th international conference molecular genetics of somatic cells, 22-25 октября 2009, Звенигород, доклад на тему «Эпигенетический статус клеток человека с индуцированной плюрипотентностью».

6. 1st international conference on frontiers of regenerative medicine and biomedical science, 13-14 мая 2010, Гуаньчжоу, Китай, доклад на тему «Epigenetics of human pluripotent stem cells».

7. International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 9th Annual Meeting, June 15 - 18, 2011. Metro Toronto Convention Centre. Toronto, Ontario Canada. Стендовый доклад на тему «Comparison of genetically identical human embryonic stem cell and anduced pluripotent stem cell lines».

8. ШКОЛА-КОНФЕРЕНЦИЯ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ "ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ-2011", Москва, 29-30 сентября 2011 г., Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. Доклад на тему "Разработка метода получения клеток с индуцированной плюрипотентностью из эндотелиальных клеток пупочной вены человека".

Автореферат Шутовой Марии Владимировны

«Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток _человека.»_

Заказ №3671, подписано в печать 09.11.2011, тираж 75 экз., Усл. п л. 1,25

«Сору General», 101000, Москва, Большой Златоустинский переулок, дом 7, строение 1 Тел./факс: +7(495)775-08-44/43, e-mail: bz@copygeneral.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шутова, Мария Владимировна

Введение.

Обзор литературы.

1. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).

1.1. Общая характеристика.

1.2. Поддержание плюрипотентности: молекулярные механизмы.

1.2.1. Транскрипционные факторы, связанные с поддержанием плюрипотентности в ЭСК.

1.3. Поддержание плюрипотентности: эпигенетические механинизмы.

2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

2.1 Способы получения.

2.2 Общая характеристика индуцированных плюрипотентных клеток.

2.3 Индукция плюрипотентности: молекулярные и эпигенетические механизмы.

2.3.1 Транскрипционные факторы, участвующие в репрограммировании.

2.3.2 Взаимодействие транскрипционных факторов во время репрограммировании.

2.3.3 Изменение эпигенетического статуса при репрограммировании.

2.4 Сравнение ]Р8 клеток и ЭСК.

2.5 Практическая значимость технологии получения 1Р8 клеток.

Материалы и методы.

Ферменты и реактивы.

Клеточные линии.

Культивирование клеток НЦУЕС.

Приготовление фидерного слоя мышиных эмбриональных фибробластов.

Приготовление покрытых матриксом культуральных чашек и планшетов.

Культивирование ЭСК человека.

Формирование и культивирование эмбриоидных телец.

Дифференцировка ЭСК человека в клетки нейронального пути.

Тест на образование тератом.

Протокол по получению вирусных частиц для репрограммирования клеток.

Репрограммирование клеток HUVEC.

Иммуномагнитная сепарация - MACS (Magnetic cell sorting).

Тест на матригеле (Matrigel Assay).

Иммуноцитохимический анализ.

Окраска антителами клеточных культур.

Окраска антителами срезов эмбриоидных телец.

Видеомикроскопия.

Компьютерный анализ (определение сайтов рестрикции, выбор зондов, выбор праймеров).

Агарозный гель-электрофорез ДНК.

Выделение хромосомной и плазмидной ДНК.

Выделение тотальной РНК из клеточных культур.

Реакция обратной транскрипции.

Полимеразная цепная реакция.

Анализ кариотипа и STR анализ.

Полногеномный анализ метилирования ДНК.

Получение клонов ЭСК человека, устойчивых к неомицину.

Индукция трансгенов в клонах ЭСК с помощью доксициклина.

Бисульфитное секвенирование.

Анализ протеома.

Результаты и обсуждение.

1. Репрограммирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).

1.1. Характеристика endo-iPS клеток.

1.2. Анализ кариотипа и уровня пролиферации линий endo-iPS.

1.3. Дифференцировочный потенциал endo-iPS клонов.

1.4. Анализ CpG метилирования endo-iPS.

2. Создание модельной системы для изучения процесса репрограммирования.

2.1. Получение генетически модифицированной линии ЭСК, содержащей ТФ

Ой4, $ох2, К1Л?4, с-Мус под индуцируемыми промоторами.

2.2. Дифференцировка линии ЪЕ$М05пео2 в нейросферы.

2.3. Использование индуцибельной системы для репрограммирования нейральных клеток.

2.4. Характеристика пеиго-1Р82.0.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека"

В процессе индивидуального развития организма млекопитающих, клетки эмбриона проходят через множество стадий, постепенно теряя способность к дифференцировке: от тотипотентной зиготы через стадию плюрипотентных клеток ВКМ бластоцисты, к мультипотентным региональным стволовым клеткам и, наконец, к терминально дифференцированным клеткам. На молекулярном уровне процесс дифференцировки клеток и обретение ими определенного фенотипа сопровождается изменением экспрессии генов, статуса метилирования генома, модификацией гистоновых белков и т.д. При нормальном развитии этот процесс необратим. Первые попытки провести де-дифференцировку клеток />; vitro были предприняты еще в середине прошлого века: сначала эксперименты проводились на амфибиях, а потом и на млекопитающих. Оказалось, что при переносе ядра соматической клетки в энуклеированный ооцит с низкой эффективностью происходит восстановление дифференцировочного потенциала соматической клетки до плюрипотетного состояния in vivo (Gurdon and Wilmut, 2011). В экспериментах по слиянию ЭСК (выведенные в культуру клетки ВКМ блистоцисты), с соматическими клетками получаются плюрипотентные гибридные клетки, способные принимать участие в формировании организма химерных животных (Sanges et al., 2011). Эти исследования доказали принципиальную возможность репрограммирования генома соматической клетки до плюрипотентного состояния in vitro, более того, из них стало очевидно, что в ЭСК содержатся все необходимые факторы для репрограммирования. Однако, еще некоторое время набор этих факторов, необходимых для де-дифференцировки клеток, оставался неизвестным.

Впервые прямое репрограммирование соматических клеток с помощью набора определенных факторов было осуществлено в 2006 году японскими исследователями Такаши и Яманака, что явило собой начало отдельного направления исследований в области биологии развития (Takahashi et al., 2006). В элегантном эксперименте было показано, что вполне достаточно экспрессии четырех генов, кодирующих транскрипционные факторы Oct3/4, Sox2, KLF4, и с-Мус для того чтобы фибробласты кожи мыши перешли в плюрипотентное состояние. Самое интересное заключалось в том, что транскрипционные факторы индуцировали работу своих эндогенных ортологов, которые, потом поддерживали плюрипотентное состояние репрограммированной клетки. Полученные клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, iPS. По своим свойствам они оказались практически идентичны другим плюрипотентным клеткам - ЭСК. Как и ЭСК, iPS клетки в отсутствии сигналов дифференцировки и в присутствии факторов, обеспечивающих самоподдержание, продолжают симметрично делиться. В то же время, сменив условия культивирования, можно получить контролируемую дифференцировку ЭСК и ¡РБ клеток в клетки-производные трех зародышевых листков.

РБ клетки можно получить для каждого человека персонально, именно поэтому им пророчат большое будущее в практической медицине. Получив соматические клетки пациента (например, клетки кожи), можно из них сделать 1РБ клетки, получить пораженный патологическим процессом тип клеток или тканей, исследовать молекулярные механизмы возникновения патологии и попытаться подобрать лекарственные средства для устранения причин патологии. Более того, можно устранить генетическую причину заболевания и использовать клетки для трансплантации. Все это открывает новые возможности для персонализированной медицины.

Однако, до сих пор остается нерешенным целый ряд вопросов фундаментального характера: как именно происходит репрограммирование, какие процессы обеспечивают возвращение клетки в плюрипотентное состояние, и насколько похожи «искусственные» плюрипотентные клетки ¡РБС на их «природные» аналоги — ЭСК?

Настоящая диссертационная работа посвящена актуальным вопросам репрограммирования генома соматической клетки до плюрипотентного состояния, а именно, разработке модели репрограммирования и поиску наиболее оптимальных для репрораммирования соматических клеток, анализу эпигенома репрограммированных клеток, а также сравнению ¡РБ клеток с генетически идентичными им ЭСК человека.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Шутова, Мария Владимировна

Выводы.

1. Впервые было проведено генетическое репрограммирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека до плюрипотентного состояния. Показано, что полученные линии полностью репрограммированных endo-iPS клонов по морфологическим, генетическим, эпигенетическим и функциональным свойствам соответствуют эмбриональным стволовым клеткам человека.

2. Был проведен полногеномный анализ изменения уровня метилирования промоторов 14 тысяч генов человека при приобретении соматическими клетками плюрипотентного состояния. В результате анализа впервые продемонстрировано репрограммирование соматических клеток на эпигенетическом уровне.

3. Впервые продемонстрировано, что in vitro уровень полногеномного метилирования плюрипотентных клеток выше, чем соматических.

4. В результате полногеномного анализа метилирования промоторных участков 14 тысяч генов плюрипотентных и соматических клеток была подтверждена ключевая роль гена Oct4 в приобретении и поддержании плюрипотентного состояния.

5. Впервые создана и опробована модельная система индукции плюрипотентного состояния в дифференцированных клетках человека, позволяющая изучать генетические и эпигенетические характеристики процесса репрограммирования различных типов соматических клеток до плюрипотентного состояния.

Заключение.

С первого эксперимента по прямому репрограммированию прошло около пяти лет. За это время было проведено множество работ, посвященных повышению эффективности репрограммирования, варьированию состава ТФ и методов их введения, а также типов клеток, используемых для экспериментов. Также были предприняты многочисленные попытки использовать полученные iPS клетки в качестве модельной системы для поиска причин наследственных заболеваний и возможных путей их лечения. Огромные надежды возлагают на применение пациент-специфичных iPS клеток в персональной медицине как на возможный материал для трансплантологии. Однако, до сих пор в этой области остается множество вопросов. Точно неизвестно, какие молекулярные механизмы направляют соматическую клетку по пшорипотентному пути, насколько направленно действие ТФ «коктейля Яманака», можно ли заменить их все, и почему до конца путь репрограммирования проходит только очень маленькая часть клеточной популяции. До сих пор не разработаны критерии, которые позволили бы унифицировать получаемые в разных лабораториях iPS клетки, но уже понятно, что существующие критерии плюрипотентности, хорошо применимые к ЭСК, не до конца характеризуют индуцированные плюрипотентные клетки. Без ответа на эти вопросы невозможно понять, что из себя представляет процесс прямого репрограммирования, и, соответственно, нельзя будет говорить о биомедицинском применении iPS клеток.

В этой работе перед нами стояло несколько задач. В момент планирования работы было репрограммировано всего три типа клеток человека, поэтому, во-первых, было необходимо провести прямое репрограммирование выбранного типа соматических клеток человека Мы выбрали клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) из-за их легкой доступности неинвазивными методами, а также безопасности (вероятность обнаружения в их геноме спонтанных мутаций сводится к минимому благодаря отсутствию влияния внешних мутагенов и небольшому количеству пассажей in vitro перед репрограммированием). Для индукции плюрипотентности мы инфицировали выделенные и охарактеризованные клетки HUVEC лентивирусами, содержащими гены ТФ «коктейля Яманаки». Такой метод был выбран из-за своей максимальной эффективности, которая ранее была продемонстрирована на других типах клеток мыши и человека. Нами было получено 14 репрограммированных клонов, которые были охарактеризованы морфологически, по молекулярным маркерам, кариотипически, а также функционально. Характеристика полученных endo-iPS клонов показала, что среди них всего два (10 и 12) удовлетворяют всем условиям плюрипотентности. STR анализ подтвердил происхождение endo-iPS клеток из клеток

НиУЕС. Сравнение епс!сйР8 клеток, ЭСК человека, клеток НЛУЕС, а также клеток РВМС, взятых в качестве контрольного типа соматических клеток, выявило несколько закономерностей. Во-первых, было показано, что репрограммирование ведет к полногеномным эпигенетическим изменениям, которые в целом характеризуются гиперметилированием генов, характерных для клеток ХШУЕС, и уменьшением уровня метилирования генов, связанных с плюрипотентным состоянием. Полногеномное метилирование ДНК плюрипотентных клеток оказалось выше, чем у соматических клеток. Можно предположить, что в плюрипотентных клетках происходит более строгий контроль работы генов, контролируюемых метилированием, который в процессе развития ослабевает. На основе анализа метилирования промоторных районов генов, связанных с плюрипотентностью, была подтверждена ключевая роль гена 0&4 в поддержании и индукции плюрипотентности. При сравнении эпигеномов епскмРБ клеток и ЭСК было показано, что они очень близки друг к другу, и степень сходства между ними (около 97%) соответствует сходству между разными линиями ЭСК. Полученные результаты могут говорить о том, что различия между ЭСК и ¡РЭ могут быть связаны с разницей в их геномах. Для того чтобы изучить возможный вклад индивидуальных генетических и эпигенетических различий между различными типами клеток и иметь возможность сравнивать полученные ¿РБ клетки с изогенными им ЭСК, нами была создана модельная система. Для этого мы получили и охарактеризовали клон линии ЭСК человека НЕ8М05, который содержал в своем составе гены ТФ «коктейля Яманака» под промоторами, индуцируемыми доксициклином. Для проверки работы разработанной модельной системы мы дифференцировали полученный' клон Е8пео2 по нейрональному пути. В полученных нейрональных клетках с помощью доксициклина была индуцирована экспрессия четырех ТФ «коктейля Яманака». С помощью двух различных методик были получены пешхыР8 клоны; которые были охарактеризованы морфологически, на соответствующие молекулярные маркеры, а также функционально. Проведенный сравнительный анализ пешхмРЗ и изогенных ЭСК показал высокое сходство репрограммированных клеток, однако, были обнаружены и различия, которые требуют дальнейшего изучения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шутова, Мария Владимировна, Москва

1. Aasen T, Raya A, Barrero MJ, Garreta E, Consiglio A, Gonzalez F, et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratino- cytes. Nat Biotechnol 2008;26:1276-84.

2. Akao, Y., Nakagawa, Y., Naoe, T., 2006. let-7 microRNA functions as a potential growth, suppressor in human colon cancer cells. Biol Pharm Bull 29(5), 903-6.

3. Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T., Yamanaka, S., 2008. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 321(5889), 699-702.

4. Araki R, Jincho Y, Hoki Y, Nakamura M, Tamura C, Ando S, Kasama Y, Abe M., 2010. Conversion of ancestral fibroblasts to induced* pluripotent stem cells. Stem Cells. 2010 Feb;28(2):213-20.

5. Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K., 2007. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129(4), 823-37.

6. Baudino TA, McKay C, Pendeville-Samain H, Nilsson JA, Maclean KH, White EL, Davis AC, Ihle JN, Cleveland JL. , 2002. c-Myc is essential for vasculogenesis and angiogenesis during development and tumor progression. Genes Dev. 2002 Oct l;16(19):2530-43.

7. Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, Kamal M, Huebert DJ, Cuff J, et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 2006; 125:315-26

8. Bhutani, N., Brady, J.J., Damian, M., Sacco, A., Corbel, S.Y., Blau, H.M., 2010. Reprogramming towards pluripotency requires AID-dependent DNA demethylation. Nature 463(7284), 1042-7.

9. Bleiloch R, Venere M, Yen J, Ramalho-Santos M. Generation of induced pluripotent stem cells in the absence of drug selection. Cell Stem Cell 2007; 1:245- 7.

10. Boiani M, Schöler HR., 2005. Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 Nov;6(ll):872-84. Review.

11. Borowiak M, Melton DA., 2009. How to make beta cells? Curr Opin Cell Biol. 2009 Dec;21(6):727-32. Epub 2009 Sep 24. Review.

12. Brambrink, T., Foreman, R., Wei stead, G.G., Lengner, C.J., Wernig, M., Suh, H., Jaenisch, R., 2008. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell 2(2), 151-9.

13. Brandenberger, R., Khrebtukova, I., Thies, R.S., Miura, T., Jingli, C., Puri, R., Vasicek, T., Lebkowski, J., Rao, M., 2004. Mpss profiling of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 4, 10 (2004).

14. Buchholz, D.E., Hikita, S.T., Rowland, T.J., Friedrich, A.M., Hinman, C.R., Johnson, L.V., Clegg, D.O., 2009. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells 27(10), 2427-34.

15. Carey, B.W., Markoulaki, S., Beard, C., Hanna, J., Jaeniseh, R., 2010. Single-gene transgenic mouse strains for reprogramming adult somatic cells. Nat Methods 7(1), 56-9.

16. Cedar, H., Bergman, Y., 2009. Linking DNA methylation and histone modification: patterns and paradigms. Nat Rev Genet. 10(5), 295-304.

17. Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A., 2003. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 2003 May 30;113(5):643-55.

18. Chang TC, Yu D, Lee YS, Wentzel EA, Arking DE, West KM, Dang CV, Thomas-Tikhonenko A, Mendell JT. , 2007. Widespread microRNA repression by Myc contributes to tumorigenesis. Nat Genet. 2008 Jan;40(l):43-50. Epub 2007 Dec 9.

19. Chen, Y., Li, X., Eswarakumar, V.P., Seger, R., Lonai, P., 2000. Fibroblast growth factor (FGF) signaling through» PI 3-kinase and Akt/PKB is required for embryo id body differentiation. Oncogene 19(33), 3750-6.

20. Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, Zucker JP, Wang S, Morton CC, McMahon AP, Powers D, Melton DA, 2004. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 2004 Mar 25; 350(13): 1353-6.

21. Dang CV, O'Donnell KA, Zeller KI, Nguyen T, Osthus RC, Li F. , 2006. The c-Myc target gene network. Semin Cancer Biol. 2006 Aug;16(4):253-64. Epub 2006 Jul 25.

22. Dang, D. T., Pevsner, J., & Yang, V. W., 2000. The biology of the mammalian Kruppel-like family of transcription factors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 32, 1103-1121. doi: 10.1016/S1357-2725(00)00059-5.

23. Davis AC, Wims M, Spotts GD, Hann SR, Bradley A., 1993. A null c-myc mutation causes lethality before 10.5 days of gestation in homozygotes and reduced fertility in heterozygous female mice. Genes Dev. 1993 Apr;7(4):671-82.

24. De Felici, M., Farini, D., Dolci, S., 2009. In or out sternness: comparing growth factor signalling in mouse embryonic stem cells and primordial germ cells. Curr Stem Cell Res Ther. 4(2), 87-97.

25. Deaton AM, Bird A., 2011. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 2011 May 15;25(10):1010-22. Review.

26. Deb-Rinker, P., Ly, D., Jezierski, A., Sikorska, M., Walker, P.R., 2005. Sequential DNA methylation of the Nanog and Oct-4 upstream regions in human NT2 cells during neuronal differentiation. J Biol Chem. 280(8), 6257-60.

27. Doi, A., Park, I.H., Wen, B., Murakami, P., Aryee, M.J., Irizarry, R., Herb, B., Ladd-Acosta,

28. Duinsbergen, D., Eriksson, M., 't Hoen, P.A., Frisén, J., Mikkers, H., 2008. Induced pluripotency with endogenous and inducible genes. Exp Cell Res. 314(17), 3255-63.

29. Efroni, S., Duttagupta, R., Cheng, J., Dehghani, H., Hoeppner, D.J., Dash, C., Bazett-Jones,

30. D.P., Le Grice, S., McKay, R.D., Buetow, K.H., Gingeras, T.R., Misteli, T., Meshorer, E., 2008. Global transcription in pluripotent embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2(5), 437-47.

31. Eminli, S., Utikal, J., Arnold, K., Jaenisch, R., Hochedlinger, K., 2008. Reprogramming of neural progenitor cells into induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2 expression. Stem Cells 26(10), 2467-74.

32. Evans, M.J., Kaufman, M.H., 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292(5819), 154-6.

33. Evans, P.M., Zhang, W., Chen, X., Yang, J., Bhakat, K.K., Liu, C., 2007. Kruppel-like factor 4 is acetylated by p300 and regulates gene transcription via modulation of histone acetylation. J Biol Chem. 282(47), 33994-4002.

34. Ghosh, Z., Wilson, K.D., Wu, Y., Hu, S., Quertermous, T., Wu, J.C., 2010. Persistent donor cell gene expression among human induced pluripotent stem cells contributes to differences with human embryonic stem cells. PLoS One 5(2), e8975.

35. Gidekel, S., Bergman, Y., 2002. A unique developmental pattern of Oct-3/4 DNA methylation is controlled by a cis-demodification element. J Biol Chem. 277(37), 34521-30.

36. Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J., 2007. Silencing of core transcription factors in human EC cells highlights the importance of autocrine FGF signaling for self-renewal. BMC Dev Biol. 7, 46.

37. Guenther, G., Arauz, A., 2010. Cerebral venous thrombosis: a diagnostic and treatment update.. Neurologia. [Epub ahead of print] Spanish.

38. Hajkova, P., Jeffries, S.J., Lee, C., Miller, N., Jackson, S.P., Surani, M.A., 2010. Genome-wide reprogramming in the mouse germ line entails the base excision repair pathway. Science 329(5987), 78-82.

39. Han J, Sachdev PS, Sidhu KS., 2010. A combined epigenetic and non-genetic approach for reprogramming human somatic cells. PLoS One. 2010 Aug 19;5(8):el2297.

40. Ho, L., Jothi, R., Rouan, J.L., Cui, K., Zhao, K., Crabtree, G.R., 2009a. An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is an essential component of the core pluripotency transcriptional network. Proc Natl Acad Sci USA. 106(13), 5187-91.

41. Hochedlinger K, Plath K., 2009. Epigenetic reprogramming and induced pluripotency. Development. 2009 Feb;136(4):509-23. Review.

42. Huangfu, D., Maehr, R., Guo, W., Eijkelenboom, A., Snitow, M., Chen, A.E., Melton, D.A., 2008a. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26(7), 795-7.

43. Huangfu, D., Osafune, K., Maehr, R., Guo, W., Eijkelenboom, A., Chen, S., Muhlestein, W., Melton, D.A., 2008b. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol. 26(11), 1269-75.

44. Humphrey, R.K., Beattie, G.M., Lopez, A.D., Bucay, N., King, C.C., Firpo, M.T., RoseJohn, S., Hayek, A., 2004. Maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells is STAT3 independent. Stem Cells 22(4), 522-30.

45. Kaji, K., Norrby, K., Paca, A., Mileikovsky, M., Mohseni, P., Woltjen, K., 2009. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature 458(7239), 771-5.

46. Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z:, Gao, S., 2009. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell 5(2), 135-8.

47. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S.H., 2008a. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell 132(6), 1049-61.

48. Kim, J.B., Zaehres, H., Araûzo-Bravo, M.J., Schôler, H.R., 2009. Generation of induced pluripotent stem cells from neural stem cells. Nat Protoc. 4(10), 1464-70.

49. Knoepfler, P.S., 2008. Why myc? An unexpected ingredient in the stem cell cocktail. Cell Stem Cell 2(1), 18-21.

50. Lagarkova MA, Volchkov PY, Lyakisheva AV, Philonenko ES, Kiselev SL, 2006. Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines. Cell Cycle; 5:416-20.

51. Lagarkova MA, Volchkov PY, Philonenko ES, Pfannkuchc K, Prokhorovich MA, Zabotina T, Kiselev SL, 2008a. CD30 is a marker of undifferentiated human embry- onic stem cells rather than a biomarker of transformed hESCs. Cell Cycle; 7:3610-2.

52. Lagarkova MA, Volchkov PY, Philonenko ES, Kiselev SL, 2008b. Efficient differentiation of hESCs into endothelial cells in vitro is secured by epigenetic changes. Cell Cycle; 7:2929-35.

53. Lebofsky R, Walter JC., 2007. New Myc-anisms for DNA replication and tumorigenesis? Cancer Cell. 2007 Aug; 12(2): 102-3.

54. Levenstein, M.E., Ludwig, T.E., Xu, R.H., Llanas, R.A., VanDenHeuvel-Kramer, K., Manning, D., Thomson, J.A., 2006. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells 24(3), 568-74.

55. Liang J, Wan M, Zhang Y, Gu P, Xin H, Jung SY, Qin J, Wong J, Cooney AJ, Liu D, Songyang Z., 2008. Nanog and Oct4 associate with unique transcriptional repression complexes in embryonic stem cells. Nat Cell Biol. 2008 Jun;10(6):731-9. Epub 2008 May 4.

56. Liu, L., Luo, G.Z., Yang, W., Zhao, X., Zheng, Q., Lv, Z., Li, W., Wu, H.J., Wang, L., Wang, X.J., Zhou, Q., 2010. Activation of the imprinted Dlkl-Dio3 region correlates with pluripotency levels of mouse stem cells. J Biol Chem. 285(25), 19483-90.

57. Loh, Y.H., Zhang, W., Chen, X., George, J., Ng, H.H., 2007. Jmjdla and Jmjd2c histone H3 Lys 9 demethylases regulate self-renewal in embryonic stem cells. Genes Dev. 21(20):2545-57.

58. Ludwig TE, Levenstein ME, Jones JM, Berggren WT, Mitchen ER, Frane JL, Crandall LJ, Daigh CA, Conard KR, Piekarczyk MS. Lianas RA, Thomson JA, 2006. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotcchnol. 24(2): 185-7.

59. Maherali N, Sridharan.R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Hochedlinger K, 2007. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution; Cell Stem Cell; 1:55-70.

60. Maherali, N., Ahfeldt, T., Rigamonti, A., Utikal, J:, Cowan, C., Hochedlinger, K., 2008. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 3(3), 340-5.

61. Marchetto, M.C., Yeo, G.W., Kainohana, O., Marsala, M., Gage, F.H., Muotri, A.R., 2009. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PLoS One 4(9), e7076.

62. Matoba, R., Niwa, H., Masui, S., Ohtsuka, S., Carter, M.G., Sharov, A.A., Ко, M.S., 2006. Dissecting Oct3/4-regulated gene networks in embryonic stem cells by expression profiling. PLoS One 1, e26.

63. Mattout, A., Meshorer, E., 2010. Chromatin plasticity and genome organization in pluripotent embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 22(3), 334-41.

64. McConnell BB, Ghaleb AM, Nandan MO, Yang VW, 2007. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 2007 Jun;29(6):549-57. Review. Erratum in: Bioessays. 2007 Sep;29(9):946.

65. Mikkola, M., Olsson, C., Palgi, J., Ustinov, J., Palomaki, Т., Horelli-Kuitunen, N., Knuutila, S., Lundin, K., Otonkoski, Т., Tuuri, Т., 2006. Distinct differentiation characteristics of individual human embryonic stem cell lines. BMC Dev Biol. 6, 40.

66. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A., 1998. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12(13), 2048-60.

67. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S., 2007. Generation of germline-competent induced pluripotent stem'cells.Nature 448(7151), 313-7.

68. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S., 2008. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 322(5903), 949-53.

69. Pan, G., Tian, S., Nie, J., Yang, C., Ruotti, V., Wei, H., Jonsdottir, G.A., Stewart, R., Thomson, J.A., 2007. Whole-genome analysis of histone H3 lysine 4 and lysine 27 methylation in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 1(3), 299-312.

70. Park, S.H., Park, S.H., Kook, M.C., Kim, E.Y., Park, S., Lim, J.H., 2004. Ultrastructure of human embryonic stem cells and spontaneous and retinoic acid-induced differentiating cells. Ultrastruct Pathol. 28(4), 229-38.

71. Patel JH, Loboda AP, Showe MK, Showe LC, McMahon SB., 2004. Analysis of genomic targets reveals complex functions of MYC. Nat Rev Cancer. 2004 Jul;4(7):562-8.

72. Pfannkuche K, Fatima A, Gupta MK, Dieterich R, Hescheler J., 2010. Initial colony morphology-based selection for iPS cells derived from adult fibroblasts is substantially improved by temporaryUTFl-based selection: PEoS One. 2010 Mar8;5(3):e9580.

73. Popp, C., Dean, W., Feng, S., Cokus, S.J., Andrews, S., Pellegrini, M., Jacobsen, S.E., Rcik, W., 2010. Genome-wide erasure of DNA methylation in mouse primordial germ cells is affected by AID deficiency. Nature 463(7284), 1101-5.

74. Prigione A, Adjaye J., 2010. Modulation of mitochondrial biogenesis and bioenergetic metabolism upon in vitro and in vivo differentiation of human ES and iPS cells. Int J Dev Biol. 2010;54(11-12): 1729-41.

75. Reik, W., Dean, W., Walter, J., 2001. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science 293(5532), 1089-93.

76. Richards, M., Tan, S., Fong, C.Y., Biswas, A., Chan, W.K., Bongso, A., 2003. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells 21, 546-56.

77. Richards, M., Tan, S.P., Tan, J.H., Chan, W.K., Bongso, A., 2004. The transcriptome profile of human embryonic stem cells as defined by SAGE Stem Cells 22, 51-64.

78. Santos, A.P., Abranches, R., Stoger, E., Beven, A., Viegas, W., Shaw, P.J., 2002. The architecture of interphase chromosomes and gene positioning are altered by changes in DNA methylation and histone acetylation. J Cell Sci. 115, 4597-605.

79. Scheper W, Copray S. , 2009. The molecular mechanism of induced pluripotency: a two-stage switch. Stem Cell Rev. 2009 Sep;5(3):204-23. Epub 2009 Jun 24.

80. Scholer, H.R., Hatzopoulos, A.K., Balling, R., Suzuki, N., Grass, P., 1989. A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor. EMBO J. 8(9), 2543-50.

81. Shi, Y., Desponts, C., Do, J.T., Hahm, H.S., Scholer, H.R., Ding, S., 2008. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds. Cell Stem Cell 3(5), 568-74.

82. Shields JM, Christy RJ, Yang VW., 1996. Identification and characterization of a gene encoding a gut-enriched Kriippel-like factor expressed during growth arrest. J Biol Chem. 1996 Aug 16;271(33):20009-17.

83. Simonsson, S., Gurdon, J., 2004. DNA demethylation is necessary for the epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Nat Cell Biol. 6(10), 984-90;

84. Singhal, N., Graumann, J., Wu, G., Arauzo-Bravo, M.J., Han, D.W., Greber, B., Gentile, L., Mann, M., Scholer, H.R., 2010. Chromatin-Remodeling Components of the BAF Complex Facilitate Reprogramming. Cell 141(6), 943-55.

85. Smith, A.G., Hooper, M.L., 1987. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121(1), 1-9.

86. Smyth GK, 2004. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 2004;3:Article3. Epub 2004 Feb 12.

87. Sridharan, R., Tchieu, J., Mason, M.J., Yachechko, R., Kuoy, E., Horvath, S., Zhou, Q., Plath, K., 2009. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell 136(2), 364-77.

88. Stadtfcld, M., Apostolou, E., Akutsu, H., Fukuda, A., Follett, P., Natesan, S., Kono, T., Shioda, T., Hochcdlinger, K., 2010. Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qFl in mouse induced pluripotent stem cells. Nature 465(7295), 175-81.

89. Stadtfcld, M., Brcnnand, K., Hochedlinger, K., 2008a. Reprogramming of pancreatic beta cells into induccd pluripotent stem cells. Curr Biol. 18(12), 890-4.

90. Stadtfcld, M., Hochedlinger, K., 2010. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24(20), 2239-63.

91. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K., 2008b. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 322(5903), 945-9.

92. Sumi, T., Fujimoto, Y., Nakatsuji, N., Suemori, H., 2004. STAT3 is dispensable for maintenance of self-renewal in nonhuman primate embryonic stem cells. Stem Cells 22(5), 861-72.

93. Szutorisz, H., Dillon, N., 2005. The epigenetic basis for embryonic stem cell pluripotency. Bioessays. 27(12), 1286-93.

94. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S, 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined fac- tors. Cell; 131:861-72.

95. Takahashi, K., Yamanaka, S., 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126(4), 663-76.

96. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., Jones, J.M., 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282(5391), 1145-7.

97. Utikal, J., Maherali, N., Kulalert, W., Hochedlinger, K., 2009. Sox2 is dispensable for the reprogramming of melanocytes and melanoma cells into induced pluripotent stem cells. J Cell Sci. 122, 3502-10.

98. Vallier, L., Alexander, M., Pedersen; R.A., 2005. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J Cell Sci. 118, 4495509.

99. Viswanathan, S.R., Daley, G.Q., Gregory, R.I., 2008. Selective blockade of microRNA processing by Lin28. Science 320(5872), 97-100.

100. Wang, J., Rao, S., Chu, J., Shen, X., Levasseur, D.N., Theunissen, T.W., Orkin, S.H., 2006. A protein interaction network for pluripotency of embryonic stem cells. Nature 444(7117), 364-8.

101. Wei D, Kanai M, Huang S, Xie K., 2006. Emerging role of KLF4 in human gastrointestinal cancer. Carcinogenesis. 2006 Jan;27(l):23-31.Epub 2005 Oct 11. Review.

102. Wernig M, Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K, 2007. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007; 448:318-24.

103. Wernig, M., Lengner, C.J., Hanna, J., Lodato, M.A., Steine, E., Foreman, R., Staerk, J., Markoulaki, S., Jaenisch, R., 2008. A drug-inducible transgenic system for direct reprogramming of multiple somatic cell types. Nat Biotechnol. 26(8), 916-24.

104. Wilson, K.D., Venkatasubrahmanyam, S., Jia, F., Sun, N., Butte, A.J., Wu, J.C., 2009. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18(5), 749-58.

105. Wu, Q., Chen, X., Zhang, J., Loh, Y.H., Low, T.Y., Zhang, W., Zhang, W., Sze, S.K., Lim, B., Ng, H.H., 2006. Sall4 interacts with Nanog and co-occupies Nanog genomic sites in embryonic stem cells. J BioLChem. 281(34), 24090-4.

106. Xiao, L., Yuan, X., Sharkis, S.J., 2006. Activin A maintains self-renewal and regulates fibroblast growth factor, Wnt, and-bone morphogenic protein pathways in human embryonic stem cells. Stem Cells 24(6), 1476-86.

107. Xu, R.H., Peck, R.M., Li, D.S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J.A., 2005. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods 2(3), 185-90.

108. Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D., 2010; Reprogramming of human; fibroblasts to pluripotent stem cells using' mRNA of four transcription, factors. Biochem Biophys Res Commun. 394(1), 189-93.

109. Yang, J., Chai, L., Fowles, T.C., Alipio, Z., Xu, D., Fink, L.M., Ward, D.C., Ma, Y., 2008. Genome-wide analysis reveals Sall4 to be a major regulator of pluripotency in murine-embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 105(50), 19756-61.

110. Yeo S, Jeong S, Kim J, Han JS, Han YM, Kang YK. Characterization of DNA methylation change in stem cell marker genes during differentiation of human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun 2007; 359:536-42.

111. Ying, Q.L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A., 2003. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell 115(3), 281-92.

112. Yoshida Y, Yamanaka S., 2010. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 2010 Jul 6;122(l):80-7. Review.

113. Yuan H, Corbi N, Basilico C, Dailey L., 1995. Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3. Genes Dev. 1995 Nov l;9(21):2635-45.

114. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A., 2009. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nat Methods 6(5), 363-9.

115. Zeng, X., Miura, T., Luo, Y., Bhattacharya, B., Condie, B., Chen, J., Ginis, I., Lyons, I., Mejido, J., Puri, R.K., Rao, M.S., Freed, W.J., 2004. Properties of pluripotent human embryonic stem cells BG01 and BG02. Stem Cells 22(3), 292-312.

116. Zhao XD, Han X, Chew JL, Liu J, Chiu KP, Choo A, et al. Whole-genome mapping of histone H3 Lys4 and 27 trimethylations reveals distinct genomic compartments in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2007; 1:286-98.

117. Zhou, W., Freed, C.R., 2009. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells 27(11), 2667-74.

Информация о работе

Шутова, Мария Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы