Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндокринная функция дофаминергических нейронов целостного мозга в онтогенезе крыс

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эндокринная функция дофаминергических нейронов целостного мозга в онтогенезе крыс"

На правах рукописи

САИФЕТЯРОВА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА

ЭНДОКРИННАЯ ФУНКЦИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ЦЕЛОСТНОГО МОЗГА В ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС

Специальность 03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 М*,Р Ш

Москва - 2012

005012802

Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель:

академик Угрюмов Михаил Вениаминович

Официальные оппоненты:

Манухин Борис Николаевич - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, руководитель группы межклеточных взаимодействий

Раевский Владимир Вячеславович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, руководитель лаборатории нейроонтогенеза

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина» РАМН

Защита диссертации состоится « 25 » апреля 2012 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Сайт: http://idbras.comcor.nl/: e-mail: idbras@bk.ru

Автореферат разослан «/S>> марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее актуальных задач современной физиологии является изучение механизмов нейроэндокринной регуляции, обеспечивающих поддержание постоянства внутренней среды и регуляцию важнейших функций взрослого и развивающегося организма. Исследования формирования нейроэндокринной регуляции развития и функционирования организма в онтогенезе имеют большое значение не только для фундаментальной медико-биологической науки, но и для клинической медицины, поскольку малейшие нарушения метаболизма физиологически активных веществ (ФАВ) нейроэндокринной системы на ранних стадиях развития могут приводить к развитию тяжелых врожденных заболеваний.

Нейроэндокринная система в онтогенезе регулирует развитие целостного организма (Угрюмов, 1999). ФАВ, вырабатывающиеся компонентами нейроэндокринной системы, выступают в роли индукторов развития, оказывая необратимое морфогенетическое влияние на развивающиеся клетки- и органы-мишени (Lauder, 1993; Ugrumov, 1997; Mirochnik et al., 2005).

Мозг является центральным и ключевым звеном нейроэндокринной системы. Долгое время считалось, что мозг включается в нейроэндокринную регуляцию только после окончательной дифференцировки нейронов и формирования нейротрансмиссии (Dlouha et al., 1982). Полученные в последнее время нами и другими исследователями данные, согласно которым нейроны мозга сразу же после их образования и задолго до формирования межнейрональных связей и гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) начинают синтезировать и выделять ФАВ (Ugrumov et al., 1989; Borisova et al., 1991; Ugrumov et al., 1994), позволяют пересмотреть традиционные представления о роли мозга в нейроэндокринной регуляции развития целостного организма. В связи с этим нами была выдвинута гипотеза, согласно которой, мозг в онтогенезе до формирования межнейрональных синаптических связей и ГЭБ,

может рассматриваться как эндокринный орган, участвующий в регуляции развития и функционирования периферических органов и целостного организма.

Ранее при изучении развития моноамин- и пептидергических систем мозга нами были получены косвенные доказательства в пользу выдвинутой гипотезы. Так было показано, что ДА содержится в общей системе циркуляции плодов и новорожденных крыс в концентрации, достаточной для оказания эндокринного влияния на секрецию пролактина гипофизом взрослых крыс (Ben-Jonathan et al., 1980). После закрытия ГЭБ концентрация ДА в периферической крови резко падает (Лаврентьева и др., 2006), что исключает дальнейшее участие ДА мозгового происхождения в эндокринной регуляции. Однако, прямых доказательств того, что ДА, синтезируясь в нейронах мозга, поступает в общую систему циркуляции в онтогенезе до формирования ГЭБ, получено не было.

Кроме того, до сих пор отсутствуют попытки оценить влияние ДА мозгового происхождения на периферические органы-мишени в период отсутствия ГЭБ, тогда как это является одним из важнейших критериев эндокринной функции мозга. Учитывая, что рецепторы к ДА обнаруживаются в разных органах в онтогенезе задолго до формирования ГЭБ (Felder et al., 1989), можно ожидать, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови, способен оказывать влияние на развитие и/или функциональную активность этих органов, что требует дальнейшей экспериментальной проверки.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей диссертационной работы -получить прямые доказательства эндокринной функции ДА-ергических нейронов целостного мозга в онтогенезе до формирования ГЭБ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель фармакологического ингибирования синтеза ДА нейронами мозга в онтогенезе до формирования ГЭБ.

2. Оценить вклад мозга в формирование физиологически активной концентрации ДА в плазме крови после ингибирования его синтеза в нейронах мозга до формирования ГЭБ.

3. Получить доказательства того, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови до формирования ГЭБ, оказывает прямое эндокринное влияние на выделение пролактина из лактотрофов гипофиза в моделях in vivo и in vitro.

Научная новизна работы. Впервые разработана модель фармакологического ингибирования синтеза ДА избирательно в мозгу у крыс в раннем постнатальном периоде. Экспериментально подобрана доза ингибитора, существенно снижающая синтез ДА в мозгу и не влияющая на его синтез в периферических ДА-синтезирующих источниках.

Впервые получено прямое доказательство того, что до формирования ГЭБ ДА поступает из мозга в общую систему циркуляции, обеспечивая поддержание его физиологически активной концентрации в крови.

Впервые на моделях in vivo и in vitro показано, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови у неонатальных крыс до формирования ГЭБ, оказывает специфическое влияние на функциональную активность лактотрофов, ингибируя выделение пролактина из передней доли гипофиза.

Научная и практическая значимость работы. Получены убедительные доказательства в пользу гипотезы о том, что мозг до формирования ГЭБ

функционирует как эндокринный орган, выделяя ФАВ в общую систему циркуляции, которые в дальнейшем участвуют в регуляции функциональной активности органов-мишеней, что принципиально меняют существующую концепцию формирования нейроэндокринной регуляции развития целостного организма.

Новый вариант концепции формирования нейроэндокринной регуляции в онтогенезе и ее роли в развитии целостного организма, а также основанные на этой концепции новые представления о патогенезе врожденных заболеваний, могут быть широко представлены в курсах и учебниках по физиологии и фундаментальной медицине для студентов университетов и медицинских институтов.

Работа вносит вклад не только в экспериментальную физиологию, но и в клиническую медицину, в частности перинатологию. Изучение молекулярно-клеточных механизмов эндокринной регуляции развития периферических мишеней со стороны ФАВ мозгового происхождения позволит по-новому представить себе механизмы развития врожденных заболеваний репродуктивной и выделительной функций, нарушения функционирования сердечно-сосудистой системы и ряда других. Это, в свою очередь, приведет к изменению стратегии ранней диагностики и лечения врожденных заболеваний, существенно повысив их эффективность.

Вклад автора. Все эксперименты, описанные в диссертационной работе, были спланированы и выполнены автором. Анализ всех полученных данных был также проведен автором.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены:

- на конференциях: Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 2008, 2009, 2010 гг.; Конференция,

посвященная 90-летию со дня рождения академика Т.М.Турпаева, Москва, 2008; Конференция молодых ученых Института нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, Москва, 2009; Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций», Сафага, 2010; Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Клязьма, 2010; Международный симпозиум «Molecular Neurobiology Today and Tomorrow», Берлин, 2010; Научно-практическая конференция с международным участием "Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга", Ростов, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК - 1, статей в иностранных рецензируемых журналах - 1, тезисов и материалов конференций - 7.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 238 источников. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные.

Исследование проведено на самцах крыс линии Вистар на третий день постнатального развития (ПЗ). День рождения крысят считали 1-ым постнатальным днем (П1).

Эксперименты.

Разработка модели ингибирования синтеза дофамина в мозгу у крыс на ПЗ.

Подкожное введение ингибитора синтеза дофамина.

Животным подкожно вводили а-метил-пара-тирозин (аМПТ) (Sigma, США) - ингибитор тирозингидроксилазы. В первой серии экспериментов животным однократно вводили 200, 100, 80 или 50 мкг аМПТ в 10 мкл 0.9 % NaCl, а в контроле - только 10 мкл 0.9 % NaCl. Сбор материала производили через 20 часов после инъекций. Во второй серии экспериментов опытным животным вводили 50 мкг аМПТ в 10 мкл 0.9 % NaCl. В контроле животным вводили 10 мкл 0.9 % NaCl. Сбор материала производили через 4 часа после введения ингибитора.

Стереотаксическое введение ингибитора синтеза дофамина в боковые желудочки мозга.

Животным под эфирным наркозом в боковой желудочек мозга однократно вводили 50 мкг аМПТ в 2 мкл 0.9 % NaCl по координатам: 1.2 мм латерально от брегмы, 2.0-2.5 мм вглубь мозга, через стеклянную микроканюлю (d = 50

мкм), соединенную с гамильтоновским шприцем (Ugrumov and Mitskevich, 1980); в контроле крысам однократно вводили 2 мкл 0.9 % NaCl.

Полное или частичное выключение дофаминового ингибиторного контроля секреции пролактииау крыс на ПЗ (in vivo).

Крысам на ПЗ в боковой желудочек мозга вводили 50 мкг аМПТ, контрольным животным вводили 0.9 % NaCl. У одних животных через 4 часа собирали кровь из сердца и выделяли переднюю долю гипофиза. Другим животным через 4 часа после внутрижелудочкового введения аМПТ внутрибрюшинно вводили 0,75 мг/кг галоперидола - ингибитора рецепторов к ДА, а через 1,5 часа собирали кровь и выделяли переднюю долю гипофиза. Сбор материала у крыс проводили под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг).

Инкубация гипофизов крыс на ПЗ и взрослых животных в Кребс-Рингер буфере (in vitro).

Влияние разных концентраций экзогенного дофамина на секрецию пролактина.

Крыс на ПЗ декапитировали, выделяли переднюю долю гипофиза, делили ее пополам и переносили в камеры, содержащие 300 мкл холодного Кребс-Рингер буфера (КРБ) следующего состава (мМ): NaCl - 120, КС1 - 4.8, СаС12 - 2.0, MgS04 - 1.2, NaHC03 - 25, D-глюкоза - 10.1, HEPES - 20, аскорбиновая кислота - 0.13 (Sigma, США). В каждую камеру помещали по 3 половинки гипофизов. После 45-минутной стабилизации в КРБ при температуре 37°С среду заменяли на 300 мкл свежей и проводили две 10-минутные инкубации для оценки спонтанного выделения пролактина. Затем одни половинки гипофизов переносили на 5 минут в КРБ, содержащий ДА в концентрации 1,5 нг/мл или 0,4 нг/мл, в то время как другие половинки тех же

>

самых гипофизов продолжали инкубировать в КРБ без ДА. Полученные образцы инкубационной среды хранили при -70°С до определения пролактина.

Контроль специфичности действия дофамина на секрецию пролактина через Д2-рег1епторы.

Процедуры инкубации, сбора и хранения материала проводились аналогично описанным выше. Разница заключалась в том, что одни половинки гипофизов после предварительной 45-минутной стабилизации и двух 10-минутных инкубаций в КРБ на 5 минут переносили в КРБ, содержащий 1.5 нг/мл ДА, в то время как другие половинки этих же гипофизов переносили также на 5 минут в КРБ, содержащий 1.5 нг/мл ДА и 1О"10М галоперидола.

Инкубация гипофизов крыс на ПЗ в плазме крови, содержащей эндогенный дофамин.

У крыс под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) собирали кровь из сердца и выделяли переднюю долю гипофиза. В собранную кровь добавляли 0,13 мМ аскорбиновой кислоты (для сохранности эндогенного ДА), и затем ее центрифугировали при 7000 об/мин. Полученную у животных плазму пулировали и до проведения инкубации хранили 1 час при температуре +4°С. Гипофизы, после предварительной 45-минутной стабилизации, сначала инкубировали 20 минут при 37°С в КРБ, а затем одни половинки гипофизов в течение 30 минут инкубировали в плазме при 37°С, содержащей 10"'° М галоперидола, в то время как другие половинки тех же гипофизов инкубировали в такой же плазме, но без галоперидола. После этого образцы инкубационной плазмы и сами гипофизы замораживали и хранили при -70°С до определения в них пролактина. Кроме того, по окончании эксперимента образцы инкубационной плазмы отбирали для контроля сохранности

эндогенного ДА с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и хранили при температуре -70°С.

Взятие и обработка материала.

После подкожных инъекций аМПТ у крыс под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) выделяли мозг (одно полушарие за исключением 2/3 мозжечка), орган Цукеркандля, надпочечники и собирали кровь из сердца; после внутрижелудочковых инъекций аМПТ помимо вышеперечисленных образцов собирали почки. На пробу приходился материал от одного животного.

Для определения ДА методом ВЭЖХ кровь переносили в пробирку, содержащую 30 мкл 5% раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Sigma, США) и 10 мкл 10% раствора метабисульфита натрия (Sigma, США). Затем отделяли плазму центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут и добавляли в нее 3,4-дигидроксибензиламин гидробромид (ДГБА) -внутренний стандарт (Sigma, США) в 0,1н НСЮ4. Далее плазму центрифугировали при 14000 об/мин 20 минут, переносили в эппендорф и хранили при -70° С до определения ДА. Перед определением ДА осаждали на оксиде алюминия, элюировали 0,2 н НСЮ4 и полученные образцы центрифугировали при 4000 об/мин. Выделенное полушарие мозга и периферические органы гомогенизировали в 10 объемах 0,1 н НСЮ4, содержащей ДГБА при помощи ультразвукового гомогенизатора (Labsonic М, Sartorius, Франция), центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 20 минут и в полученном супернатанте определяли ДА.

Для определения пролактина в плазме крови у животных под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) брали кровь из сердца, после чего ее центрифугировали при температуре +4°С на скорости 7000 об/мин в течение 20 минут. В полученном супернатанте определяли содержание гормона.

Для определения пролактина в ткани гипофизов проводили предварительную экстракцию гормона. Для этого гипофизы гомогенизировали при помощи ультразвукового гомогенизатора в 0.05 М карбонат-бикарбонатном буфере (pH 10,0), после чего в течение часа проводили экстракцию пролактина. Затем образцы центрифугировали 30 минут при температуре +4 °С и скорости 5000 об/мин и отбирали полученный супернатант. После нейтрализации супернатанта с помощью 0,01н HCl, проводили измерение пролактина.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией.

Измерение ДА в осажденной плазме крови, в супернатантах ткани мозга и периферических органов проводили при помощи обратно-фазной ВЭЖХ с электрохимической детекцией (Amperometric detector LC-4B, Bioanalytical Systems, США) при потенциале 655 мВ. Пробы вводили в инжектор (Rheodyne 7125, США) с петлей объемом 20 мкл. Разделение производили на 10-сантиметровой колонке с внутренним диаметром 4 мм и наполнителем С-18, 3,3 мкм (Dr.Maisch GmbH, Германия). Подвижной фазой служил 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0.3 мМ октансульфоната натрия (Sigma, США), 0.1 мМ ЭДТА (Sigma, США) и 8 % ацетонитрила (Sigma, США) (pH 3.2). Скорость потока 1 мл/мин обеспечивалась насосом (Gilson 307, Франция). Пик ДА идентифицировали, ориентируясь на время его выхода в стандарте, содержание рассчитывали методом внутреннего стандарта, используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце, с помощью программы «Мультихром» (Россия).

Иммуноферментный анализ.

Измерение пролактина в ткани передней доли гипофиза, образцах плазмы и инкубационной среды проводили с помощью метода иммуноферментного анализа, с использованием коммерческих наборов (SPIbio-Rat Prolactin EIA Kit, Bertin Pharma, Франция).

Статистическая обработка результатов.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью F-теста для определения однородности выборки и t-теста Стьюдента для определения достоверности различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Мозг до формирования гемато-энцефалического барьера в онтогенезе -важнейший источник дофамина в крови у крыс

В данной работе на примере ДА изучали возможность поступления ФАВ из мозга в общую систему циркуляции в перинатальном периоде развития до формирования ГЭБ. Для проведения экспериментов были использованы животные на ПЗ, у которых ГЭБ для ДА не сформирован. Для получения прямых доказательств поступления ДА из мозга в кровь нами была разработана принципиально новая модель фармакологического ингибирования синтеза ДА в мозгу. В качестве ингибитора синтеза ДА был выбран аМПТ - конкурентный ингибитор ключевого фермента синтеза ДА - тирозингидроксилазы. На первом этапе данной работы проводился подбор максимальной дозы ингибитора, в которой при системном введении и поступлении в кровь он не влиял бы на синтез ДА в периферических органах и в мозгу. Подкожное введение аМПТ в дозах 200 и 100 мкг через 20 часов приводило к достоверному изменению концентрации ДА в мозгу, плазме и органе Цукеркандля (Рис.1 А, Б, Г). Введение ингибитора в дозе 80 мкг вызывало достоверное снижение концентрации ДА в плазме (Рис.1 Б). Только введение аМПТ в дозе 50 мкг не оказывало влияния на концентрацию ДА в изучаемых органах и плазме крови (Рис.1 А, Б, В, Г). Учитывая, что через 20 часов мы можем наблюдать в организме компенсаторные процессы после воздействия аМПТ, мы проверили результат введения дозы 50 мкг через 4 часа. Оказалось, что результаты, полученные при введении этой дозы не различались - через 20 часов и через 4 часа концентрация ДА в периферических органах, мозгу и плазме не изменялась, что дало возможность использовать нам данную дозу и данное время в последующих экспериментах по стереотаксическому введению ингибитора. Хотя при подкожном введении доза 50 мкг и не оказывала влияния

на концентрацию ДА в мозгу, мы введении ее в мозг она оказала бы продуцирующие нейроны.

предположили, что при непосредственном локальное ингибирующее действие на ДА-

35 30

25

20

1 15

2

и л /*\

-е- 10

200

□ 0.9% №С1 ■ аМПТ 3

§ 1

аМПТ, мкг

аМПТ, мкг

600-

£450

^300

-8-150

о

Ч

аМПТ, мкг

750 г

>600

:450

= 300

■е

о Ч

150

100 аМПТ, мкг

Рис. 1. Концентрация дофамина в мозгу (А), плазме крови (Б), надпочечниках (В) и органе Цукеркандля (Г) через 20 часов после подкожного введения 200, 100, 80 и 50 мкг аМПТ; в контроле вводили 0.9% НаС1.

* Достоверные различия между контролем и опытом (р < 0.05).

Стереотаксическое введение 50 мкг аМПТ в боковые желудочки мозга через 4 часа привело к значительному снижению концентрации ДА в мозгу и плазме

(Рис. 2), в то время как в периферических органах не происходило изменения концентрации ДА (Табл. 1).

□ 0.9% №С1; ■ аМПТ

300г

о 200

^ * ! <100- ■ |

0Ь_1_И_!--

¡Ь

2.5

9 5 ¿ СП ГО С

1.5 с 5

1

0.5

-0

Рис. 2. Концентраг{ия дофамина (ДА) в мозгу (слева) и плазме крови (справа) через 4 часа после внутрижелудочкового введения 50 мкг аМПТ; в контроле вводили 0.9% N00!. * Достоверные различия между контролем и опытом (р < 0.05).

Табл. 1. Концентрация дофамина (ДА) в надпочечниках, органе Цукеркандля и почках через 4 часа после внутрижелудочкового введения 50 мкг аМПТ; в контроле вводили 0.9% №С1.

Орган Надпочечники Орган Цукеркандля Почки

Вводимое 0.9% N801 аМПТ 0.9% №С1 аМПТ 0.9% №С1 аМПТ

вещество

ДА, нг/г 418.2±47.3 354.4+37.2 623.2±64.5 657.3±59.2 22.2±3.4 18.3±2.4

Таким образом, на разработанной нами модели получено прямое доказательство поступления ДА из мозга в кровь в раннем постнатальном периоде развития у крыс до становления ГЭБ, при этом развивающийся мозг вносит существенный вклад в формирование физиологически активной концентрации ДА в общей системе циркуляции.

II. Регуляция секреции пролактина дофаминергическими нейронами развивающегося мозга

Для оценки влияния ДА, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на периферические органы, в качестве мишени мы использовали лактотрофы гипофиза. Для того, чтобы оценить влияние ДА, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на секрецию пролактина передней долей гипофиза в экспериментах in vivo проводили частичное (на разработанной ранее модели введения аМПТ в мозг) или полное (с помощью введения галоперидола) выключение дофаминового ингибиторного контроля секреции пролактина. Как после частичного, так и полного выключения дофаминового контроля происходило увеличение выделения пролактина гипофизом в кровь, в то время как в самом гипофизе концентрация пролактина снижалась только при полном выключении дофаминового контроля (Рис. 3).

□ 0.9% NaCi ■ аМПТ

И аИПТ+галоперидол

Плазма Гипофиз

Рис. 3. Концентрация пролактина (ПРЛ) в плазме (слева) и в гипофизе (справа) после полного (внутрижелудочковое введение аМПТ и системное введение галоперидола) или частичного (внутрижелудочковое введение аМПТ) ипгибирования дофаминового контроля секреции ПРЛ у крыс на третий постнатальный день; в контроле в боковые желудочки мозга вводили 0.9% NaCl.

* Достоверные различия между контролем и опытом (р < 0.05).

ID

12-

Полученные в эксперименте in vivo данные свидетельствуют об ингибиторном влиянии ДА мозгового происхождения на выделение пролактина лактотрофами передней доли гипофиза у неонатальных крыс. Однако следует иметь в виду, что ДА мозгового происхождения до формирования ГЭБ может оказывать влияние на секрецию пролактина как через портальную систему циркуляции, так и через общий кровоток.

Для подтверждения нашей гипотезы о развивающемся мозге как об эндокринном органе принципиально важно было определить, обладает ли ДА именно в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови у неонатальных крыс, ингибирующим влиянием на секрецию пролактина. Для ответа на данный вопрос были проведены эксперименты in vitro.

Нами показано, что концентрация ДА в плазме крови трехдневных животных составляет 1.9 нг/мл, причем она снижается до 0.4 нг/мл после частичного ингибирования синтеза ДА в мозгу с помощью аМПТ. Поэтому для получения доказательства того, что ДА именно мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови, может оказывать влияние на секрецию пролактина гипофиза, в экспериментах in vitro гипофизы трехдневных животных инкубировали в КРБ с разными концентрациями экзогенного ДА: 1.5 нг/мл - концентрация, которая создается в плазме в результате поступления ДА из мозга в кровь, и 0.4 нг/мл - концентрация, которая создается за счет выделения ДА из периферических ДА-синтезирующих органов и частично из мозга. Через 5 минут после начала инкубации передней доли гипофизов с ДА в концентрации 1.5 нг/мл происходит достоверное снижение выделения пролактина в инкубационную среду, в то время как инкубация с ДА в концентрации 0.4 нг/мл не влияет на выделение пролактина (Рис.4А). Концентрация пролактина в ткани гипофизов не изменялась, поскольку при инкубации в КРБ выделяется небольшой процент от общего содержания этого гормона в ткани.

Для оценки специфичности действия ДА на секрецию пролактина, т.е. через рецепторы к ДА, использовали дополнительный контроль с введением в среду, наряду с ДА, ингибитора его рецепторов - галоперидола. Как и ожидалось, введение галоперидола снимало ингибирующее влияние ДА на секрецию пролактина лактотрофами (Рис. 4А).

□ КРБ

■ 0,4 нг/мл ДА И 1,5 нг/мл ДА ЕЗ ДА + галоперидол

□ плазма без галоперидола

■ плазма с галоперидолом

Рис. 4. Концентрация пролактина (ПРЛ) в среде после инкубации передней доли гипофиза крыс на третий постнатстьный день:

(А) в Кребс-Рингер буфере (КРБ), содержащем экзогенный дофамин (ДА) в концентрации 1.5 или 0.4 нг/мл, либо 1.5 нг/мл ДА в присутствии 10~'° М галоперидола; в контроле половинки соответствующих гипофизов инкубировали в КРБ без ДА. * Достоверные различия между контролем и опытом (р < 0.05);

(Б) в плазме после инкубации гипофизов животных на ПЗ в присутствии 10~10Мгалоперидола или без него. * Достоверные различия между концентрацией ПРЛ в плазме с галоперидолом или без (р < 0.05).

Поскольку действие экзогенного ДА в искусственной среде (КРБ) может отличаться от действия эндогенного ДА в крови, т.к. в крови могут находиться другие химические сигналы, модифицирующие эффекты ДА, то следующий этап нашей работы был посвящен проверке действия эндогенного ДА, содержащегося в периферической крови крыс до становления ГЭБ, на выделение пролактина из гипофиза. Как и ожидалось, концентрация пролактина в плазме, содержащей эндогенный ДА и экзогенный галопериодол

в концентрации Ю"10 М, была значительно выше, чем в плазме, содержащей только эндогенный ДА (Рис. 4Б). При этом концентрация пролактина в ткани гипофизов не изменялась. Использование специального контроля показало, что концентрация эндогенного ДА в плазме не изменялась в течение всего периода инкубации гипофизов, сохраняясь примерно на уровне 2 нг/мл. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эндогенный ДА, содержащийся в плазме периферической крови у неонатальных крыс до становления ГЭБ, способен ингибировать выделение пролактина из передней доли гипофиза.

Таким образом, в данной работе представлены доказательства того, что ДА, поступающий из мозга в общую систему циркуляции до формирования ГЭБ, регулирует функциональную активность лактотрофов передней доли гипофиза, и в частности, выделение пролактина.

выводы

1. Впервые разработана экспериментальная модель ингибирования синтеза дофамина в мозгу у крыс в перинатальном периоде до формирования гемато-энцефалического барьера. Подобрана минимальная доза ингибитора, максимально снижающая уровень дофамина в мозгу и не влияющая на его синтез в периферических органах.

2. На разработанной модели показан существенный вклад развивающегося мозга в формирование физиологически активной концентрации дофамина в общей системе циркуляции до формирования гемато-энцефалического барьера, о чем свидетельствует значительное снижение концентрации дофамина в плазме крови после ингибирования его синтеза в мозгу.

3. На примере гипофиза как периферического органа-мишени для дофамина в экспериментах in vivo и in vitro получены доказательства того, что до формирования гемато-энцефалического барьера дофамин, поступающий из мозга в общую систему циркуляции, оказывает прямое эндокринное влияние на выделение пролактина из лактотрофов гипофиза,

4. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что мозг в онтогенезе до формирования гемато-энцефалического барьера играет роль эндокринного органа, секретируя в общую систему циркуляции физиологически активные вещества, и оказывает прямое эндокринное влияние на развитие и функционирование периферических органов-мишеней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сайфетярова Ю. Ю., Дегтярева Е.А., Сапронова А.Я., Угрюмов М. В. Эндокринная функция дофаминергических нейронов мозга у крыс в перинатальном периоде // Нейрохимия. 2011. Т. 28(3). С. 192-199.

2. Ugrumov M.V., Saifetyarova J.Y., Lavrentieva A.V., Sapronova A.Y. Developing brain as an endocrine organ: secretion of dopamine // Mol. Cell. Endocrinol. 2012. V. 348(1). P.78-86.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГЭБ - гемато-энцефалический барьер ДА - дофамин

ДГБА - 3,4-дигидроксибензиламин гидробромид П - постнатальный день ФАВ - физиологически активные вещества ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Заказ № 343-МЗ/2012 Подписано в печать 12.03.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сайфетярова, Юлия Юрьевна, Москва

61 12-3/738

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи

САЙФЕТЯРОВА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА

ЭНДОКРИННАЯ ФУНКЦИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ЦЕЛОСТНОГО МОЗГА В ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС

Специальность 03.03.01 - физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик М.В. Угрюмов

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................................6

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................7

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................11

1.1. Структурно-функциональная характеристика дофаминергической системы мозга взрослых животных и в онтогенезе.......................................................................11

1.1.1. Дофаминергическая система взрослых животных..............................................11

1.1.1.1. Топография и морфология дофаминергических нейронов.....................................11

1.1.1.2. Функциональная характеристика дофаминергических нейронов........................13

1.1.1.2.1. Синтез дофамина....................................................................................................13

1.1.1.2.2. Запасание и выделение дофамина........................................................................15

1.1.1.2.3. Обратный захват дофамина...................................................................................18

1.1.1.2.4. Катаболизм дофамина............................................................................................18

1.1.1.2.5. Рецепторы к дофамину..........................................................................................22

1.1.1.3. Нервная и гуморальная регуляция дофаминергической системы........................22

1.1.1.4. Функциональное значение дофаминергической системы.....................................23

1.1.2. Развитие дофаминергической системы мозга......................................................24

1.1.2.1. Образование дофаминергических нейронов............................................................24

1.1.2.2. Морфогенез развивающихся дофаминергических нейронов..................................25

1.1.2.3. Функциональная характеристика развивающихся дофаминергических нейронов .................................................................................................................................................28

1.1.2.3.1. Синтез дофамина....................................................................................................28

1.1.2.3.2. Запасание и выделение дофамина........................................................................29

1.1.2.3.3. Обратный захват дофамина...................................................................................29

1.1.2.3.4. Деградация дофамина............................................................................................30

1.1.2.3.5. Рецепторы к дофамину..........................................................................................30

1.1.2.4. Нервная и гуморальная регуляция развития дофаминергической системы.......31

1.1.2.5. Роль дофамина в регуляции развития мозга..........................................................32

1.2. Периферическая дофамин-продуцирующая система взрослых животных и в онтогенезе..............................................................................................................................33

1.2.1. Периферическая дофамин-продуцирующая система взрослых животных.....33

1.2.1.1. Синтез дофамина......................................................................................................33

1.2.1.2. Рецепторы к дофамину............................................................................................35

1.2.1.3. Паракринная и аутокринная роль дофамина в регуляции функционирования периферических органов-мишеней.......................................................................................36

1.2.2. Развитие периферической дофамин-продуцирующей системы.........................37

1.2.2.1. Синтез дофамина......................................................................................................37

1.2.2.2. Экспрессия рецепторов к дофамину.......................................................................39

1.2.2.3. Роль дофамина в развитии периферических органов-мишеней...........................39

1.3. Участие дофамина в регуляции секреции пролактина.........................................40

1.3.1. Структурно-функциональная характеристика гипофиза взрослых животных и в онтогенезе.......................................................................................................................40

1.3.2. Морфофункциональная характеристика лактотрофов взрослых животных и в онтогенезе...........................................................................................................................42

1.3.3. Регуляция секреции пролактина у взрослых животных и в онтогенезе..........45

1.3.4. Роль дофамина в регуляции секреции пролактина у взрослых животных и в онтогенезе.............................................................................................................................48

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................51

11.1. Животные......................................................................................................................51

11.2. Эксперименты..............................................................................................................52

11.2.1. Разработка модели специфического ингибирования синтеза дофамина в мозгу крыс на третий день постнатального периода (ш vivo).....................................52

11.2.1.1. Подкожное введение ингибитора синтеза дофамина.........................................52

11.2.1.2. Стереотаксическое введение ингибитора синтеза дофамина в боковые желудочки мозга....................................................................................................................52

11.2.2. Полное или частичное выключение дофаминового ингибиторного контроля секреции пролактина у крыс на третий день постнатального периода (ш vivo). ...52

11.2.3. Инкубация гипофизов крыс на третий день постнатального периода и взрослых животных в Кребс-Рингер буфере (in vitro)..................................................53

11.2.3.1. Определение времени стабилизации спонтанного выделения пролактина.......53

11.2.3.2. Влияние разных концентраций экзогенного дофамина на секрецию пролактина. .................................................................................................................................................54

11.2.3.3. Контроль специфичности действия дофамина на секрецию пролактина через Д2-рецепторы........................................................................................................................54

11.2.4. Инкубация гипофизов крыс на третий день постнатального периода в плазме крови, содержащей эндогенный дофамин.........................................................55

11.2.5. Гомотрансплантация гипофизов под капсулу почки крысам на первый день постнатального периода с последущим полным или частичным ингибированием дофаминового контроля секреции пролактина на третий постнатальный день ...56

11.3. Взятие и обработка материала..................................................................................57

11.4. Методы...........................................................................................................................58

11.4.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией...............................................................................................................................58

11.4.2. Иммуноферментный анализ...................................................................................59

11.5. Статистическая обработка результатов.................................................................59

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ................................................................................................60

III. 1. Моделирование специфического ингибирования синтеза дофамина в мозгу у крыс на третий день постнатального периода..............................................................60

III. 1.1. Концентрация дофамина и его метаболитов в мозгу, плазме крови, надпочечниках и в органе Цукеркандля после подкожного введения ингибитора синтеза дофамина.................................................................................................................60

III. 1.2. Концентрация дофамина и его метаболитов в мозгу, плазме крови, надпочечниках, почках и в органе Цукеркандля после стереотаксического введения ингибитора синтеза дофамина в боковые желудочки мозга...........................................62

III. 1.3. Концентрация дофамина и его метаболитов в тубероинфундибулярной системе и остальной части мозга после стереотаксического введения ингибитора синтеза дофамина в боковые желудочки мозга.................................................................64

111.2. Концентрация пролактина в плазме крови и гипофизах после полного или частичного ингибирования дофаминового контроля секреции пролактина у крыс на третий день постнатального периода (in vivo)..........................................................65

111.3. Оценка влияния экзогенного дофамина на выделение пролактина из гипофизов крыс на третий день постнатального периода и у взрослых животных (in vitro)...................................................................................................................................66

111.3.1. Концентрация пролактина в Кребс-Рингер буфере в ходе оценки времени стабилизации спонтанного выделения пролактина из гипофиза.....................................66

111.3.2. Концентрация пролактина в Кребс-Рингер буфере в ходе оценки влияния разных концентраций экзогенного дофамина на выделение пролактина из гипофиза...............67

111.3.3. Концентрация пролактина в Кребс-Рингер буфере при инкубации гипофиза в среде, содержащей экзогенный дофамин и антагонист Д2-рецепторов.....................699

111.4. Оценка выделения пролактина из гипофиза крыс на третий день постнатального периода под влиянием эндогенного дофамина, содержащегося в плазме крови.........................................................................................................................70

111.5. Концентрация пролактина в плазме, трансплантированном и интактном гипофизах после гомотрансплантации гипофиза под капсулу почки крысам на первый день постнатального периода с последущим полным или частичным ингибированием дофаминового контроля секреции пролактина на третий постнатальный день..........................................................................................................711

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................72

IV. 1. Мозг до формирования гемато-энцефалического барьера - важнейший источник дофамина в периферической крови у крыс.................................................72

IV.2. Регуляция секреции пролактина дофаминергическими нейронами развивающегося мозга........................................................................................................77

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................82

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................83

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ь-ДОФА - Ь-диоксифенилаланин

аМПТ - а-метил-пара-тирозин

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АЯ - аркуатное ядро

ВИП - вазоинтестинальный пептид

ВМАТ - везикулярный моноаминовый транспортер

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГРГ - гонадотропин-рилизинг гормон

ГЭБ - гемато-энцефалический барьер

ДА - дофамин

ДАА - декарбоксилаза ароматических аминокислот

ДГБА - 3, 4-дигидроксибензиламин гидробромида

ДОФУК - 3, 4-дигидроксифенилуксусная кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

КОМТ - катехол-о-метилтрансфераза

КРБ - Кребс-Рингер буфер

КРГ - кортикотропин-рилизинг-гормон

ЛГ - лютеинизирующий гормон

МАО - моноаминоксидаза

МСГ - меланоцитстимулирующий гормон

НА - норадреналин

П - постнатальный день развития

ПРЛ - пролактин

СТГ - соматотропный гормон

ТГ - тирозингидроксилаза

ТИС - тубероинфундибулярная система

ТТГ - тиреотропный гормон

ФАВ - физиологически активные вещества

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

Э - эмбриональный день развития

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Основным условием жизнеспособности организма является поддержание постоянства внутренней среды, что обеспечивается нейроэндокринной системой. Нейроэндокринная система представляет собой сложную высоко иерархическую систему, компоненты которой связаны между собой прямыми и обратными связями (Угрюмов, 1999; Jackson, 1982; Baulieu, 1990; Tanriverdi et al., 2003). Ключевым звеном нейроэндокринной системы является мозг, и, в частности, гипоталамус (Krieger, 1980; Jackson, 1982; Baulieu, 1990). Во взрослом организме эндокринное влияние мозга на периферические органы ограничивается действием вазопрессина и окситоцина, которые, поступая в общую систему циркуляции, влияют на сердечно-сосудистую, выделительную и отчасти репродуктивную системы (Hatton, 1990; Ugrumov, 2002). Гипоталамические физиологически активные вещества (ФАВ), поступая в гипоталамо-гипофизарную портальную систему циркуляции, регулируют секрецию гормонов гипофиза, которые в свою очередь контролируют секрецию гормонов периферических эндокринных желез, таким образом, участвуя в регуляции функций висцеральных органов и самого мозга (Jackson, 1982; Baulieu, 1990). После переноса с кровью из портальной системы циркуляции в гораздо большую по объему общую систему циркуляции ФАВ гипоталамуса многократно разводятся, причем до такой незначительной концентрации, в которой они уже не в состоянии оказывать эндокринное влияние на периферии (Hoffman, 1992). Несмотря на то, что ФАВ вырабатываются не только в гипоталамусе, но и в других отделах мозга, они не могут проникать в общий кровоток из-за гемато-энцефалического барьера (ГЭБ), а, следовательно, и не могут участвовать в прямой эндокринной регуляции периферических органов (Loizou, 1970; Dahlin et al., 2001).

Нейроэндокринная система в онтогенезе, выполняет специфическую функцию регуляции развития целостного организма (Ugrumov, 2010). Это возможно благодаря тому, что на определенном этапе индивидуального развития гипоталамические ФАВ и гормоны эндокринных желез контролируют не столько функциональную активность клеток- и органов-мишеней, сколько их развитие, причем в последнем случае их действие носит необратимый - морфогенетический характер (Lauder, 1993; Ugrumov, 1997; Mirochnik et al., 2005).

До последнего времени считалось, что мозг включается как центральное звено нейроэндокринной регуляции только после полного своего "созревания" (Rajerison et al., 1976; Dlouha et al., 1982). При этом развитие самого мозга контролируется рядом

ФАВ, циркулирующих в крови, и в первую очередь стероидными гормонами (Dorner, 1981; Pakarinen et al., 1994). Тем не менее, полученные нами и другими исследователями данные, согласно которым нейроны мозга начинают синтезировать и выделять ФАВ задолго до формирования межнейрональных связей и ГЭБ (Ugrumov et al., 1989а; Borisova et al., 1991; Ugrumov et al., 1994) позволяют пересмотреть традиционные представления о роли мозга в нейроэндокринной регуляции развития целостного организма (Rajerison et al., 1976; Dlouha et al., 1982; Fuse, 1996). В связи с этим нами была выдвинута гипотеза, согласно которой, мозг в онтогенезе до формирования межнейрональных синаптических связей и ГЭБ, функционирует как эндокринный орган, участвующий в регуляции развития и функционирования периферических органов и целостного организма.

На примере дофамина (ДА), нами ранее были получены косвенные доказательства в пользу выдвинутой гипотезы. Так было показано, что ДА содержится в периферической крови плодов и новорожденных крыс в концентрации, достаточной для оказания эндокринного влияния на периферические мишени и сам мозг (ауторегуляция) (Лаврентьева, 2006). После закрытия ГЭБ концентрация ДА в периферической крови резко падает, что исключает дальнейшее участие ДА мозгового происхождения в эндокринной регуляции (Лаврентьева, 2006). Однако, прямых доказательств того, что ДА, синтезируясь в нейронах мозга, поступает в общую систему циркуляции в период онтогенеза, предшествующий формированию ГЭБ, получено не было.

Для доказательства того, что развивающийся мозг играет роль эндокринного органа не достаточно показать, что секретируемые им ФАВ поступают в общую систему циркуляции, но необходимо также показать действие этих ФАВ на периферические орган-мишени. Учитывая, что рецепторы к ДА обнаруживаются в разных органах задолго до формирования ГЭБ (Felder et al., 1989; Melnikova et al., 1998) можно ожидать, что ДА, содержащийся в периферической крови, способен оказывать влияние на развитие и/или функциональную активность этих органов, что требует дальнейшей экспериментальной проверки.

Цель настоящей диссертационной работы - получить прямые доказательства эндокринной функции ДА-ергических нейронов целостного мозга в онтогенезе до формирования ГЭБ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать экспериментальную модель фармакологического ингибирования синтеза ДА нейронами мозга в онтогенезе до формирования ГЭБ.

• Оценить вклад мозга в формирование физиологически активной концентрации ДА в плазме крови после ингибирования его синтеза в нейронах мозга до формирования ГЭБ.

• Получить доказательства того, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови до формирования ГЭБ, оказывает прямое эндокринное влияние на выделение пролактина из лактотрофов гипофиза в моделях in vivo и in vitro.

Научная новизна полученных результатов

Впервые разработана модель фармакологического ингибирования синтеза ДА избирательно в мозгу у крыс в раннем постнатальном периоде. Экспериментально подобрана доза ингибитор - а-метил-пара-тирозина (аМПТ) - ингибитора тирозингидроксилазы (ТГ) - ключевого фермента синтеза ДА, существенно снижающая синтез ДА в мозгу и не влияющая на его синтез в периферических ДА-синтезирующих источниках.

Впервые получено прямое доказательство того, что до формирования ГЭБ ДА поступает из мозга в общую систему циркуляции, обеспечивая поддержание его физиологически активной концентрации в крови.

Впервые на моделях in vivo и in vitro показано, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови у неонатальных крыс до формирования ГЭБ, способен оказывать специфическое влияние на функциональную активность лактотрофов, ингибируя выделение пролактина из передней доли гипофиза.

Научная и практическая значимость работы

Получены убедительные доказательства в пользу гипотезы о том, что мозг до формирования ГЭБ функционирует