Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эмбриоинженерные аспекты повышения эффективности технологии получения трансгенных животных

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попова, Елена Алексеевна

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Современное состояние и перспективы развития технологии получения трансгенных животных.

1.2. Методы введения чужеродных генов в геном животных.

1.3. Основные факторы, влияющие на эффективность технологии получения трансгенных животных.

1.4. Использование РСЯ-анализа для определения интеграции трансгена на стадии эмбриона.

2. Собственные исследования

2.1. Материал и методы исследований.

2.1.1. Получение эмбрионов мышей.

2.1.2. Микроинъекция различных веществ в пронуклеус и цитоплазму зигот.

2.1.3. Кратковременная инкубация и культивирование зародышей в питательных средах.

2.1.4. Трансплантация эмбрионов псевдобеременным самкам-реципиентам.

2.1.5. Определение интеграции трансгена с помощью РСЯ-анализа на стадии эмбриона и у потомства мышей, полученного из зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией.

3. Результаты исследований.

3.1. Изучение влияния непродолжительной инкубации мышиных зигот в различных манипуляционных средах на их дальнейшее развитие и приживляемость в организме самок-реципиентов.

3.2. Исследование влияния генно-инженерных конструкций, используемых для микроинъекции, на развитие мышиных зигот in vitro.

3.3. Изучение влияния механического повреждения цитоплазматической мембраны и оболочки пронуклеуса мышиных зигот на их развитие in vitro.

3.4. Исследование влияния различных растворов, используемых для разведения генно-инженерных конструкций при микроинъекции, на развитие мышиных зигот in vitro.

3.5. Влияние концентрации генно-инженерной конструкции aSl-Cn-G-CSF на развитие мышиных зигот in vitro, их приживляемость и частоту интеграции трансгена.

3.6. Интеграция генно-инженерной конструкции - aSl-Cn-G-CSF в геном эмбрионов и потомства мышей в зависимости от стадии клеточного цикла зиготы.

3.7. Изучение факторов, влияющих на приживляемость микроинъецированных зародышей.

3.7.1. Влияние промежуточного культивирования микроинъецированных зародышей на их приживляемость в организме самок-реципиентов.

3.7.2. Зависимость приживляемости эмбрионов и беременности самок-реципиентов от количества трансплантированных зародышей.

Обсуяадение Выводы

Практические предложения Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эмбриоинженерные аспекты повышения эффективности технологии получения трансгенных животных"

Успехи, достигнутые в последние годы в области эмбрио- и генетической инженерии, способствуют совершенствованию основных принципов технологии прямого переноса дополнительных генов в геном животных. Разработка биоинженерных технологий получения животных с заданным потенциалом продуктивности и улучшенным качеством продукции позволила бы за одно поколение достичь большего генетического совершенства, чем за несколько десятилетий в результате применения методов классической селекции.

В настоящее время основным методом получения трансгенных млекопитающих является микроинъекция генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот (Gordon J.W. et al., 1980; Palmiter R.D. et al., 1982; Hogan B. et al., 1986). Несмотря на широкое использование техники микроинъекции, эффективность переноса генов остается на достаточно низком уровне, что является серьезной проблемой в получении трансгенных сельскохозяйственных животных (Palmiter R.D., 1985; Brem G. and Muller M., 1994; Wall R. J., 1997; Chan A., 1999). Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют о том, что доля сельскохозяйственных трансгенных животных от числа инъецированных эмбрионов варьирует у свиней в пределах 0,3-4,0, овец -0,1-4,4, крупного рогатого скота - 0,7-3,2 % (Gagne M. et al., 1997).

По современным представлениям низкая эффективность получения трансгенных сельскохозяйственных животных связана, во-первых, с низкой частотой интеграции рекомбинантных генов в геном животных, во-вторых, с пониженной выживаемостью инъецированных зигот (Брем Г. и др., 1995). Исходя из этого, особый интерес представляет изучение факторов эмбриологического и молекулярно-биологического характера, от которых может зависеть частота интеграции трансгена и общая эффективность технологии получения трансгенных животных.

На каждом этапе технологии получения трансгенных млекопитающих эмбрионы подвергаются воздействию различных биотехнологических манипуляций, таких как инкубация зародышей в манипуля-ционных средах, микроинъекция чужеродной ДНК, культивирование микроинъецированных зигот in vitro и трансплантация эмбрионов псевдобеременным реципиентам. Результатом такого рода воздействий может быть снижение жизнеспособности зародышей и их последующая гибель, что значительно снижает общую эффективность технологии получения трансгенных животных. Наряду с пониженной жизнеспособностью эмбрионов, одной из основных проблем технологии трансгеноза является низкая частота интеграции генно-инженерных конструкций в геном хозяина, механизм которой до настоящего времени остается недостаточно изученным (Bishop J.O. and Smith P., 1989; Wall R.J. and Seidel G.J., 1992; Chen C.M. et al., 1995; Pawlik K.M. et al., 1995). Повышение интеграции трансгена в геном эмбрионов и полученного потомства позволило бы значительно увеличить выход трансгенных животных и общую эффективность технологии трансгеноза.

В связи с тем, что основные этапы технологии трансгеноза базируются на общебиологических принципах, совершенствование технологии трансгеноза чаще всего проводится на лабораторных животных. Это позволяет в относительно короткие сроки выявить некоторые факторы, влияющие на эффективность получения трансгенных животных.

Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы было изучение влияния некоторых эмбриоинженерных факторов на эффективность технологии трансгеноза.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние непродолжительной инкубации мышиных зигот в различных манипуляционных средах на их дальнейшее развитие in vitro и приживляемость в организме самок-реципиентов.

2. Исследовать влияние генно-инженерных конструкций, используемых для микроинъекции, на развитие мышиных зигот in vitro.

3. Выяснить влияние механического повреждения цитоплазма-тической мембраны и оболочки пронуклеуса зигот на их развитие in vitro.

4. Исследовать влияние различных буферных растворов, используемых для разведения генно-инженерных конструкций, на жизнеспособность микроинъецированных мышиных зигот in vitro.

5. Уточнить влияние концентрации генно-инженерной конструкции, вводимой в пронуклеус, на выживаемость зародышей и частоту интеграции трансгена в экспериментах in vitro и in vivo.

6. Исследовать зависимость между частотой интеграции и фазой клеточного цикла зиготы, во время которой проводилась инъекция генно-инженерной конструкции в опытах in vitro и in vivo.

7. Изучить влияние промежуточного культивирования микроинъецированных эмбрионов in vitro на их приживляемость в организме самок-реципиентов.

8. Изучить зависимость между числом трансплантированных микроинъецированных эмбрионов и их приживляемостью в организме самок-реципиентов.

Научная новизна работы.

Впервые получены трансгенные мыши, с интегрированной в геном генно-инженерной конструкцией, содержащей нуклеотидные последовательности гена человеческого гранулоцит-колониестимулирующего фактора под промотором aSl-казеина крупного рогатого скота (aSl-Cn-G-CSF). Впервые изучена зависимость между фазой клеточного цикла зигот, на которой в пронуклеус вводится генно-инженерная конструкция, и интеграцией трансгена в геном эмбрионов доимплантационных стадий развития и родившегося из микроинъецированных зигот потомства. Выявлена зависимость выживаемости зародышей в условиях in vitro от концентрации генно-инженерной конструкции (размер 3,5 т. п. н.), микроинъецируемой в пронуклеусы зигот. Определены оптимальные условия трансплантации мышиных эмбрионов, при которых достигается наибольшая эффективность получения потомства из зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией. Показано, что кратковременная инкубация мышиных зигот в растворе Дюльбекко или среде М2, обогащенных 0,3% БСА, не оказывает отрицательного влияния на их дальнейшее развитие in vitro и приживляемость в организме самок-реципиентов. 8

Положения, выносимые на защиту.

1. Микроинъекция генно-инженерной конструкции в пронук-леусы зигот, находящихся на стадии клеточного цикла, способствует несколько большей частоте интеграции трансгена в геном эмбрионов и потомства, полученного из микроинъецированных зигот.

2. Генно-инженерная конструкция - а81-Сп-0-С8Р, разведенная в ТЕ-буфере, может быть использована в работе по получению трансгенных лабораторных и сельскохозяйственных животных в концентрации от 5,0 до 10,0 нг/мкл без существенного снижения жизнеспособности эмбрионов и частоты интеграции трансгена.

3. Основными факторами, влияющими на жизнеспособность микроинъецированных зигот млекопитающих, является прокол про-нуклеуса и генно-инженерная конструкция, введенная в пронуклеус.

4. Трансплантация мышам-реципиентам первого дня псевдобеременности от 11 до 14 зигот, инъецированных генно-инженерными конструкциями, позволяет увеличить процент беременности самок-реципиентов и приживляемость зародышей. 9

Практическая значимость.

Результаты исследований, направленных на изучение влияния генно-инженерных конструкций на развитие зигот in vitro; стадии клеточного цикла зигот на частоту интеграции трансгена; буферных растворов и культуральных сред, вводимых в пронуклеусы зигот, на их жизнеспособность in vitro; концентрации генно-инженерной конструкции, вводимой в пронуклеусы, на развитие зигот in vitro и частоту интеграции трансгена могут быть использованы в работах по получению трансгенных лабораторных и сельскохозяйственных животных. Оптимизированные условия трансплантации микроинъецированных мышиных эмбрионов псевдобеременным реципиентам могут найти применение при получении трансгенных лабораторных животных. Данные по развитию мышиных эмбрионов после различных биотехнологических манипуляций могут быть использованы при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Попова, Елена Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены трансгенные мыши с интегрированной в геном генно-инженерной конструкцией, содержащей нуклеотидные последовательности гена человеческого гранулоцит-колониестимулирующего фактора под промотором aSl-казеина крупного рогатого скота и предназначенной для получения трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества фармакологического назначения.

2. С целью повышения эффективности технологии получения трансгенных животных микроинъекцию генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот целесообразно проводить в период, соответствующий фазе G1 клеточного цикла.

3. Генно-инженерная конструкция - aSl-Cn-G-CSF может быть использована для получения трансгенных сельскохозяйственных животных в концентрации от 5,0 до 10,0 нг/мкл без существенного снижения жизнеспособности эмбрионов и частоты интеграции трансгена в их геном.

4. Основными факторами, снижающими жизнеспособность зигот млекопитающих животных в результате микроинъекции, являются прокол пронуклеуса и генно-инженерная конструкция, введенная в пронуклеус.

5. Инкубация мышиных зигот в течение 2 ч в среде Дюльбекко или М2 не оказывает существенного отрицательного влияния на их способность к развитию in vitro и приживляемость микроинъециро-ванных эмбрионов в организме самок-реципиентов.

6. Для повышения процента беременности реципиентов и при-живляемости эмбрионов целесообразно трансплантировать самкам

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Обязательным этапом работ по транегенозу на сельскохозяйственных животных должно быть предварительное тестирование генно-инженерных конструкций на зиготах мышей, что позволит выявить возможную токсичность некоторых конструкций и повысить эффективность получения трансгенных животных.

2. До тех пор, пока не будет установлен точный механизм интеграции чужеродной ДНК в геном хозяина, микроинъецировать генно-инженерные конструкции необходимо в пронуклеусы зигот, находящихся в фазе клеточного цикла, то есть в более ранние сроки, как только позволяет четкая видимость пронуклеусов.

3. С целью исключения ложноположительных результатов при анализе интеграции трансгена методом ПЦР, тотальную ДНК, выделенную из биопсированных фрагментов трофобласта бластоцист, необходимо обрабатывать рестриктазой Брп1 в концентрации 0,1 ед./мкл.

4. Созданная во ВНИИФБиП генно-инженерная конструкция, содержащая нуклеотидные последовательности гена человеческого гранулоцит-колониестимулирующего фактора под промотором а81-казеина крупного рогатого скота, может быть рекомендована для получения трансгенных сельскохозяйственных животных в концентрации от 5,0 до 10,0 нг/мкл.

5. Для манипуляций с зиготами большинства видов млекопитающих животных в пределах двух часов может быть использован фосфатный буферный раствор Дюльбекко, обогащенный 0,3% БСА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попова, Елена Алексеевна, Боровск

1. Андреева Л. Е., Серова И. А. Влияние различных манипуляций, используемых для трансгеноза на развитие мышей // Онтогенез.- 1992.- Т. 23, N 6.-С. 637-643.

2. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве. М.: Рос. сельхоз. акад., 1995. С. - 239.

3. Гоголевский П. А., Гольдман И. Л., Жаданов А. Б. Изучение возможности использования рестриктных эндонуклеаз для повышения частоты интеграции рекомбинантной ДНК в геном животных // Докл. ВАСХНИЛ. 1991. - N 12.

4. Гольдман И. Л., Башкеев У. Д., Гоголевский П. Д. и др. // Докл. РСХАН. 1992.-N 9-10. С. 25-30.

5. Гольдман И. Л., Кадулин С.Г., Букаров Н.Г. и др. Ксенотрансплантация свинья-человек. Сообщение 1. // Биотехнология. 1998. - № 2. - С. 3-17.

6. Зиновьева Н. А., Безенфельдер У., Мюллер С. и др. Использование синтетической среды яйцеводов при микроинъекции зигот кроликов в программах по получению трансгенных животных // С.-х. биология. 1998. - N 6. - С. 34 -39.

7. Исабеков Б.С., Конюхов Б.В. Анализ факторов, влияющих на эффективность получения трансгенных мышей // Онтогенез. 1989. - Т. 20, N 1. - С. 28-32.

8. Кривохарченко А. С. Вильянович Л. И.,Татаринова Л. В., Рябых В.П. Развитие мышиных эмбрионов in vitro в среде безбелка в зависимости от количества зародышей в микрообъеме среды // Онтогенез. 1993. - Т. 24, N6.-0. 53-60.

9. Кузнецова И. В., Щит И. Ю., Кузнецов А. В. Эффективность переноса сперматозоидами рекомбинантных ДНК в яйцеклетки кроликов // С.- х. биология. 1998. N6.-0. 40-44.

10. Кузнецов А. В., Кузнецова И. В. Связывание экзогенной ДНК рРК31асЬ сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты и экспрессия в доимплантационных эмбриона // Онтогенез.-1995. Т. 26, N4.-0.300-310.

11. Кузнецов А. В., Щит И. Ю., Кузнецова И. В., Дворянчиков Г. А. Перенос чужеродной ДНК сперматозоидами кролика в яйцеклетки хомячка // Онтогенез.- 1995. Т. 30, № 6. - С. 405410.

12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

13. Пратт X. Эксперименты с предимплантационными эмбрионами мыши. В кн.: Биология развития млекопитающих. Методы /По ред. М. Манк. М. 1990. С. 28-38.

14. Рябых В. П., Сапунова Е. Г., Трубицина Т. П., Маркина Л. И. Эффективность получения потомства кроликов из зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями. // Сб. науч. тр. ВНИИФБиП.- 1999. Т. 28. - С. 546.

15. Самошкина H.A., Голинский Г.Ф., Дыбан А.П. Исследование первого цикла репликации ДНК в эмбриогенезе мышей при помощи микроинъекций Н-тимидина в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток// Онтогенез. 1988. - Т. 19, N 6. - С. 582-590.

16. Свердлов Е. В. Очерки современной молекулярной генетики. Трансгенез и новая молекулярная генетика // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 1996. - N 4.

17. Серова И. А., Андреева Л. Е., Кузнецов Ю. М. и др. Изменение онкологической характеристики при трансгенезе у мышей, не обусловленное наличием трансгена // Эксперим. онкология. -1991. Т. 13, N 2. - С. 33-35.

18. Сураева Н. М., Трухан Р. С. Некоторые методологические приемы введения чужеродного гена в зиготы животных // Генно-инженерные животные. 1995. - N 1. - С. 227-243.

19. Эрнст Л. К. Принципы применения популяционной и молекулярной генетики в селекции сельскохозяйственных животных // С.-х. биология. 1990. N 2. - С. 3.

20. Эрнст Л. К., Гольдман И. Л., Кадулин С. Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца //Биотехнология. 1993. - N 5. С.2.

21. Эрнст Л. К., Прокофьев М. И., Мезина Н. И. и др. Наследование гена химозина у трансгенных овец. Тезисы докладов

22. VIII конференции "Новые направления биотехнологии". Москва. 1998. - С. 49.

23. Эрнст JI. К. и др. Получение трансгенных кроликов с геном ас РНК против ELA области аденовируса. Доклады ВАСХ-НИЛ. - 1988а.

24. Эрнст Л. К. и др. Получение трансгенных кроликов, содержащих генповерхностного антигена гепатита В человека. Вестн. с.-х. науки. 1987.

25. Эрнст Л. К., Гольдман И. Л., Семенова В. А. и др. Докл. ВАСХНИЛ- 1990.-N6.-С. 32-36.

26. Anderson G. В. Isolation and of embryonic stem cells from livestock species // Animal Biotech. 1992. - V.3. - P. 165-175.

27. Archibald A.L., McClenagan M. Et al. High-level expression of biological active human a 1-antitrypsin in the milk of transgenic mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 87. - P. 51785182.

28. Blin N., Stafford D. V. Nucl Acids Res. 1976. - V. 3. - P. 23032308.

29. Bishop J.O. and Smith P. Mechanism of chromosomal integration of microinjected DNA // Mol. Biol. Med. 1989. - V. 6. - P. 283.

30. Bondioli K.R. and Wall R.J. Transgenic livestock. 1997. - P. 215 in agricultural biotechnologies: principles and practices. A. Alt-man, ed. Marsel Dekker, Inc., New York, NY.

31. Brackett B. G., Baranska W., Sawicki W., Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and itstransfer to ova through fertilization // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1971.-V. 68.-P. 353-357.

32. Brem G. Transgenic animals. In Biotechnology./ Biotechnology NSH Press. -1993. V.2. P. 809-811.

33. Brem G., Brenig B. Goodman H.N. et al. Production of transgenic mice, rabbit and pigs by microinjection into pronuclei // Zuchthygiene.- 1985. V. 20.- P. 251-252.

34. Brem G., Springmann K., Maier E. et al. Factors in the success of transgenic pig programs. In: R. B. Church (ed.), Transgenic Models in Medicine and Agriculture, New York 1990. - V. 116. - P. 61-72.

35. Brem G., Besenfelder U., Hartl. P. Production of foreign proteins the mammary glands of transgenic mammals // Int. J. Chem. Bio-technol.-1993.- P. 21-25.

36. Brem G., Haryi P. High-level expression of prochymosin in the milk of transgenic rabbits, Frontiers of Biotechnology in Agriculture Irael. 1991. 1.-4.

37. Brem G. and Muller M. Large transgenic mammals. In Animals with Novel Genes. N. Maclean, ed. (Cambridge University Press, Cambridge, MA). 1994. - P. 179-245.

38. Brem G., Besenfelder U., Zinovieva N. et al. Mammary gland specific expression of chymosin constructs in transgenic rabbits. Theriogenology. -1995. N. 43.- P. 175.

39. Brem G., Brenig M., Muller M. et al. Production of transgenic pigs and possible application to pig breeding. Occ. Publ. Br. Soc. Anim. Prod.- 1988.- № 12. P. 15-31.

40. Bremel R.D. Yom H.C. and Bleck. Alteration of milk composition using molekular genetics. J. Dairy Sei.- 1989.- V. 72.- P. 2826.

41. Brinster R. L., Chen H. Y., Traumbauer M. E. et al. Somatic expression of hepes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs // Cell. -1981.- V. 27.- P. 223-231.

42. Brinster R. L., Chen H. Y., Traumbauer M. E. et al. Factors affecting the efficiency of introducting foreing DNA into mice by microinjection eggs // Proc. Natl. Acad. Sei USA.- 1985. V. 82.1. P. 4438-4442.

43. Brinster R. L., ChenH. Y., Warren A. et al. Regulation of met-allothionein-thymidine kinase fusion plasmids injected into mouse eggs // Nature.- 1982. V. 296. - P. 39-42.

44. Buchler T.A., Bruyere T., Went D.F. et al. Rabbit beta-casein promotor direct secretion of human interleukin-2 into the milk of transghenic rabbits // Bio/Technology.- 1990.- N 8. P. 140-146.

45. Burdon T.G. and Wall RJ. Fate of microinjected genes in preim-plantation mouse embryos /Mol. Rep. Dev. 1992. - N 33. -P.436-442.

46. Carison J.P. // Mol.Cell. Biol. 1988. - V.8. - P. 2638.

47. ChadaK., Magram J., Raphael K. et al. Specific expression of a foreign beta-globin gene in erytroid cells of transgenic mice // Nature. 1985. - V. 314.- P. 377.

48. Chan A.W., Homan E.J., Ballou L.U. et al. Transgenic cattle produced by reverse transcribed gene transfer in oocytes // Proc. Natl. Acad. Sei. 1998. V. 24. - P. 14028-14033.

49. Chan A.W. Transgenic animals: current and alternative strategies // Cloning. -1999. V. 1, № 1. - P. 25-46.

50. Chen C. M., Choo K. B. and Cheng W. T. K. Frequent deletions and sequence aberrations at the transgene junctions of transgenic mice carryng the papillomavirus regulatory and the SV40 Tag gene sequences. Transgenic Res. 1995. - V. 4. - P. 52-59.

51. Chen T. T., Powers D. A. Transgenic fish // TIBTech. 1991. - V. 266.-P. 209-215.

52. Clark A.G., Bessas H., Bishop J et al. Expression of human anti-hemophylic factor IX in the milk of transgenic sheep Bio/Technology. 1989. - V. 7. - P. 487-492.

53. Crabtree H. G. Observations on the carbohydrate metabolism of tumours // Biochem J. 1929. - V. 23. - P. 536-545

54. Corea G., de Wit C. Current development and issues: A summary // Reprod. and Genet. Engineering. 1989. - V.2, N 3. - P. 253277.

55. Cousens C. et al. Use of PCR-based methods for selection of integrated tragenes in preimplantation embryos // Mol. Rep. Dev. -1994. V. 39.-P. 384-391.

56. Constantini F., Lacy E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line // Nature. 1981. - V. 294. - P. 92-94.

57. Covarrubias L., Nishida Y., Terko M. et al. Cellular DNA rearrangement and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos // Mol. Cell. Biol. 1987. - V. 7. - P. 2243-2247.

58. Dobrovolsky V.N., Lagutin O.V., Vinogradova T.V. et al. Human gamma-interferon expression in the mammary gland of transgenic mice. FEBS Lett. P. 319.

59. Ebert K.M. and Schindler J.E.S. Transgenic farm animals: progress report // Theriogenology. 1993. - N 39. - P. 121-135.

60. Ebert K.M., Smith T.E. et al. Porcine growth hormone gene expression from viral promotors in transgenic swine // Anim. Bio-chem.- 1990.-V. l.-P. 145.

61. Ebert K.M., Selgrath J.P., DiTullio et al. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminoden activator in goat milk: Generation of goat and analysis of expression // Bio Technology. -1991. N9. - P. 835-838.

62. Ernst L.K., Zakcharchenko, Suraeva T.I. et al. Transgenic rabbits with antisence RNA gene tergeted at adenovirus H5 // Therioge-nolody. 1991. - V.35. - P. 1257-1271.

63. Erlith H.A. PCR technology: principles and applications for DNA amplification // Stockton Press, New York. 1989.

64. Evans M. J., Kaufman M. H. Establishment in culture of pluripo-tential cells from mouse embryos // Nature. 1981. - V. 292. - P. 154-156.

65. Evans M. J., Gilmour D.T. and Colledge W.H. Transgenic rodents. In animal with novel genes. N. Maclean, ed. (Cambridge University Press, ambridge, MA). P. 138-178.

66. Fujiwara Y., Miwa M., Takahashi R. et al. High-level expressing YAC vector for transgenic animal bioreactors // Mol. Reprod. Dev. 1999. -V. 52, N4. - P. 414-420.

67. Fox P.F. Heat -induced coagulation of milk. In: Developments in dairy chemistry. 1982. - V. 1. - P. 189-228.

68. Gagne M., Pothier F., Sirard M. A. Gene microinjection into bovine pronuclei. In: Transgenic animals: generation and use. -1997. P. 27.

69. Glover D. M. Gene Cloning: The mechanism of DNA manipulation. London. 1989.

70. Gagne M., Pothier F., Ebert K.M., Di Tullio P., Barry C.A. et al. Introduction of human tissue plasminogen activator in mammary gland of transgenic goats // Bio/ Technology.- 1994. -V. 12.- P. 699.

71. GandolfiF., LavitravoM., CamaioniA. et. al. The use of spermmediated gene transfer for the generation of transgenic pigs // J. Reprod. Fert. Abstr. -1989. -V. 4.- P. 21.

72. Gerfen R. W., Wheeler M. B. Isolation of embrionic cell-lines from porcine blastocyst // Animal Biotechnology. 1995. -V.6, N 1.-P. 1-14.

73. Gordon J. W., Scangos G.A., PlotkinDJ. et. al. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA // Poc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V.77. - P. 7380-7384.

74. Gordon J. W., Rudle R. H. Integration and germline transmission of genes injected into mouse pronuclei // Science. 1981. - V. 214.-P. 1244-1246.

75. Gordon K., Ruddle F.H. Gene transfer into mouse embryos // Dev. Biol. 1986. -№4. .p. 136.

76. Goto Y., Noda Y., Shiotani M. et al. The fate of embryos transferred into the uterus // J Assist Reprod Genet. 1993. - V. 10, N3.-C. 197-201.

77. Gruenbaum Y. Revel E., Yarns S., Frainsod A. Sperm cell as vectors for generation of transgenic chickens // J. Cell Biochem. -1991. Suppl. 15.-P. 194.

78. Gutierrez A., Meade H.M., Jemrnez-Flores R. et al. Expression analysis of bovine k-casein in the mammary gland of transgenic mice // Transgenic Res. 1996. - V. 5. - P. 271.

79. Hagemann L. J. Pronuclear injection of MOPS-buffered medium does not affect bovine embryo development // Theriogenology. -1995.-V. 43, N1.-P. 229.

80. Hammer R.E., Pursel V. G., Rexroad C. E. et al. Production of transgenic rabbit, shepp and pigs by microinjection // Nature. -1985.-V. 315.- P. 680-683.

81. Hawk H. W., Wall R. J. and Conley H. H. Survival of DNA injected coww embryos temporarily cultured in rabbit oviducts // Theriogenology. 1989. -V. 32. - P. 243 - 253.

82. H askell R.E., Bowen R.A. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos // Mol. Reprod. Dev. 1995. - V. 40. - P. 386-390.

83. Houdebine L.M. Production of pharmaceutical proteins from transgenic animals // Biotechnol.- 1994. V. 34. - P. 269.

84. Howlett S.K., Bolton V.N. Sequence and regulation of morphological and molecular events during the first cell cycle of mouse embryogenesis // J. Embryol. and Exp. Morphol. 1985. - V.87. -P. 175-206.

85. Hogan B., Constantini F. and Lacy E. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. 1986. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

86. Hogan B., Constantini F. and Lacy E. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. 1994. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

87. Jaenisch R. Germ line integration and mendelian transmission of the exogenouus moloney leukemia virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V. 73. - P. 1260 - 1264.

88. Jaenisch R., Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. - V. 71. -P. 1252-1254.

89. Janne J., Hyttinen J.M., Peura T. et al. Transgenic animals as bio-producers of therapeutic proteins. Ann Med. 1992. - N 24. - P. 273-280.

90. Jimenes-Flores R. et al. Casein engineering of the caseins to modify the behaviour of milk during processing: a review. J. Dairy Sci.- 1988. -V. 71. -P.2640-2654.

91. Kang Y., Jemens-Flores R. et al. Casein genes and genetic engineering of the caseins. In: Genetic ingineering of animals. N.Y.:Plenum Press. 1986. - P. 95-111.

92. King D. and Wall R.J. Identification of specific gene sequences in preimplantation embryos by genomic amplification: Detection of a transgene // Mol. Reprod. Develop. 1988. - V. 1. - P. 57-62.

93. Krimpenfort P., Rademakers A., Eyestone W. et al. Generation of transgenic dairy cattle using in vitro embryo production // Bio/Technology. 1991. - V.9. - P. 844.

94. Korhonen V, P., Tolvanen M., Hyttinen J. M. et al. Expression of beta-lactoglobulin/human erythropoietin fusion protein in the milkof transgenic mice and rabbits. Eur. J. Biochem. 1997. - Apr 15; 245 (2). - P. 482-489.

95. Koobs D. H. Phosphate mediation of the Gratree and Pasteur effects // Science. 1972. - V.178. - P. 127-133.

96. Krishna M., Generoso W. Timing of sperm penetration, pronuclear formation, pronuclear DNA synthesis and first cleavage in naturally ovulated mouse eggs // J. Exp. Zool. 1977. - V. 202. -P. 245-251.

97. Krisher R. L., Gibbons J. R., Canseco R. S. et al. Influence of time of gene microinjection on development and DNA detection frequency in bovine embryos // Transgenic Res. 1994. - V. 3, N 4. -P. 226-231.

98. Lee S., Hand de Boer H.A. Production of biomedical proteins in the milk of transgenic dairy cows: state of the art. J. Controlled Release. 1994. -V.29. - P. 213.

99. Lo D., Pursel V., Linton P. et al. Expression of mouse IgA by trsnsgenic mice, pigs and sheep Eur. J. Immunol. 1991. - V. 26. -P. 1001-1006.

100. Maga E.A., Anderson G.B. and Murray J.D. The effect of mammary gland expression of human lysozyme on the properties of milk from transgenic mice // J. Dairy Sci. 1996. - V. 78. - P. 2645.

101. Martin M. J., Houtz J., Adams C. et. al. Effect of pronuclear DNA microinjection on the development of porcine ova in utero // Theriogenology. -1996. V. 46, N 4. - P. 695 - 701.

102. Martin M. J., Pinkert C.A. Production of transgenic swine : transgenic animal technology. Academ Press, Inc. 1994. - P. 315-338.

103. Massoud M., Attal J., Thepot D. et al. The deleterious effects of human erytropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promotor in transgenic rabbits // Reprod. Nutr. Dev. 1996. -V. 36.-P. 555-563.

104. Mahadevan M. M., Fleetham J., Church R. B., Taylor P. J. Growth of mouse embryos in bicarbonate media buffered by varbon dioxide, Hepes of phosphate // J.Vitro Fertil. and Embryo Transfer. 1986. - V. 3. - P. 304-307.

105. McFadden T.B., Akers R.M., Karmer G.W. a-lactalbumin in bovine serum: relationship with udder development and function // J. Dairy Sei.- 1987. V. 70. - P. 259-264.

106. Melton D.A. (Ed.) Mol. Biol. Cold Spring Harbor Lab., New York, 1988.

107. Mercier J.C. Genetic engineering applied to milk produced animals: Some expectations. In: Explioting new technologies in animal breeding (eds. C.Svith et al.), Oxford. 1986. P. 121-131.

108. Minhas B. S., Randall G. M., Dodson M. G., Robertson J. L. A limited exposure of murine oocytes and zygotes to phosphate buffered saline retards development in vitro // Theriogenology. -1989.-V. 31, N1.- P. 229.

109. Miroshnichenco O.L., Borisenco A.S. Ponomereva T.L. et al. // Biomed. Sei. 1990. - V.l. - P. 267-273.

110. Monis H., Bavister B. D. Analysis of the inhibitory effect of inorganic phosphate on development of four-cell hamster embryos in vitro // J. Exp. Zool. 1990a.- V. 256, N 1. - P. 75-83.

111. Monis H., Bavister B. D. Development of 4-cell hamster embryos to the blastocyst stage in vitro and its regulation by components of the culture milieu // Reprod. Fertil. Dev. 1990b. - V. 2. - P. 1-9.

112. Muller F., Ivies Z., Erdelyi F et. al. Introduction foreign genes into fish eggs with electroporated sperm as a carrier // Mol. Marine Biol, and Biotech. -1992. V. 1, N 4/5.- P. 276-281.

113. Muller M. and Brem G. Transgenic strategies to increase disease resistance in livestock Reprod. Fertil. Dev. // V. 6. P. 605-613.

114. Murray J.D., Nancarrow C. D., Marschall J.T. et al. Production of transgenic merino sheep by microinjection of ovine metal-lothionein-ovine growth hormone fusion gens // Reprod. Fertil. Dev.- 1989.-V.l.-P. 147-155.

115. Nancarrow C., Marshall J., Murray J. T. et al. Production of a sheep transgenic with ovine growth hormone gene // Therioge-nology.- 1989.-V. 27. P. 263.

116. Nichols J., Gardner R.L. Effect of damage to the zona pellucida on develorment of preimplantation embryos in the mouse // Hum. Reprod. 1989. - V.4. - P. 180 - 187.

117. Nimoniya T., Hoshi M., Mizuno et al. Selection of mouse preimplantation embryos earring DNA by polymerase chain reaction // Mol. Reprod. Develop. 1989. - V.l. - P.242-248.

118. Page R.L. Caneso R.S., Russell C.G. et al. Transgene detection during early murine embryonic development after pronuclear microinjection // Transgenic Res. 1995. - V.4. - P. 12-17

119. Paleyanda R.K., Velander W.H., Lee T.K. et al. Transgenic pigs produce functional human factor VIII in milk // Nat. Biotechnology. 1997. - V. 15. - P. 971-975.

120. Palmiter R.D. and Brinster R.L. Transgenic mice // Cell. 1985. -V. 41.-P. 343-345.

121. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E. et. al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with met-allothionein-growht hormone fusion genes // Nature. 1982. - V. 300.-P. 611-615.

122. Palmiter R.D., Norstedt G., Gelinas R.E. et al., Metallothionein-human GH fusion genes stimulate growth of mice // Sci. 1983. -V. 222.-P. 809-814.

123. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer M.E. et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with a met-allothionein-growh hormone fusion gene // Nature. 1982. - V. 300.-P. 611-615.

124. Palmiter R.D., Brinster R.L. Germ-line transformation of mice // Annu. Rev. Genet. 1986. - V. 20. - P. 465-499.

125. Palmiter R.D., Sandgren E.P., Avarbock M.R. et al. Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice // Proc. Natl.Acad. Sci. USA.- 1991. V. 88. - P. 478-482.

126. Pawlik K.M., Sun C.W., Higgins N.P. et al. End joining of genomic DNA and transgene DNA in fertilized mouse eggs. // Gene. -1995.-V. 165.-P. 173-181.

127. Pascoe W. S., Kember R., Wood S. A. Genes function: trapping and targeting in embryonic sterm cells // Biochim. Biophys. Act. -1992.-V. 1114.- P. 209-271.

128. Persuy M.A., Stinnakre M.G., Printz C. et al. High expression of caprine beta-casein gene in transgenic mice. Eur. J. Biochem. -1995.-V.205.-P. 887.

129. Petters R. M., Johnson B. H., Reed M. L., Archibong A. E. Glucose, glutamine and inorganic phosphate in early development of pig embryo in vitro J. Reprod. Fert. 1990.- V. 89.- P. 269-275.

130. Peura T. T., Janne J. Effect of fluid injection or membrane piercing on the development of in vitro produced bovine zygotes // Theriogenology. -1994. V. 41. - P. 273.

131. Peura T.T., Hyttinen, Tolvanen M. et al. Effects of microinjection related treatments on the subsequent development of in vitro-produced bovine oocytes // Theriogenology.- 1994. V.42. - N3.

132. Pursei V.G., Bolt D. J. Miller K.F. et al. Insertion of growth hormone genes into pig embryos. Biotechnology in growth regulation. Butterwoth. London. 1989. P. 181 -188.

133. Pursei V.G., Bolt K.J., Muller K.F. et al. Expression and performance in transgenic pigs. J. Reprod. Fert. 1990. - V.40. - P. 235245.

134. Pursei V.G., Campbell R.G., Muller K. F. et al. Growth poßaictential of transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene. J. Anim. Sei.- 1988. N 66. - P. 267.

135. Pursei V.G., Hammer R.E. et al. Genetic engineering of swine: integration, expression and germline transmission of growth-related genes. J. Reprod. Fertil. 1990 (Suppl).- V. 41.- P. 77.

136. Pursei V.G., Pinkert C.A. et al. Genetic engineering of livestock //Science. 1989. - V. 244. - P. 1981.

137. Reik W., Williams G., Barton S.C. et al. Eur. J. Immunol. 1987. -V.17.-P.465.

138. Rexroad C.E. J., Wall R.J. Development of one-cell fertilized sheep ova following microinjection into pronuclei // Theriogenol-ogy. 1987.-V.27, N4.-P. 611-619.

139. Rexroad C.E., Hammer R.E. et al. Production of transgenic sheep with growh regulating genes // Mol. Reprod. Dev. 1989. - V.l. -P. 164.

140. Richardson T. Chemical modifications and genetic engineering of food proteins // J. Dairy Sci. 1985. - V. 68. - P. 2753.

141. Rijnkels M., Kooiman P.M., Krimpenfort PJ.A. et al. Expression analysis of the individual bovine , (3-, a S2 and K-casein genes in transgenic mice. Biochem. J. 1995. - V. 311. - P. 929.

142. Rieth R., Pothier F., Gagne M. et al. Use bovine satellite se-guences to increase transgene integration by homologous recombination in bovine embryos. // Mol. Reprod. Dev. 1999. - V. 53, N. 1. - P. 1-7.

143. Robinson G.W., McKnight R.A., Smith G.H. et al. Mammary epithelial cells undergo transient differentiation in cycling virgins but require pregnancy for the establishment of terminal differentiation / Development. 1995. - V. 121. - P. 2079-2083.

144. Saiki R.K., Gelfand, Stoffel D.H. et al. Primer-detected ensymatic amplification of DNA with a thermolabile DNA polymerase // Science. V. 239.- P. 487-491.

145. Salter D. W., Smith E. J., Hughes S. et al. Gene insertion into the chicken germ line by retroviruses // Poultry Sci. 1986. - V. 65. -P.1445-1458.

146. Salter D. W. and Crittender L. B. Artificial insertion of a dominant gene for resistance to avian leucosis virus into the germ line of the chicken. Theor. Apple. Genet. 1989. - V. 77. - P.457-461.

147. Salter D. W., Smith E. J., Hughes S. et al. Transgenic chicken: insertion of retroviral genes into the chicken germ line // Virology.1987.-V. 157.-P. 236-240.

148. Sang H. Transgenic chickens methods and potential applications // Trens inBiotechnol.- 1994. V. 12, N. 10.- P. 415-420.

149. Schini S. A., Bavister B. D. Development of hamster 2- cell embryos in vitro is bloked by phosphate and glucose // Biol. Reprod.1988.-V. 39.-P.l 183-1192.

150. Seshagiri P. B., Bavister B. D. Phosphate is required for inhibition by glucose of development of hamster 8-cell embryos in vitro// Biol. Reprod. -1989b. V.40.- P. 607-614.

151. Seshagiri P. B., Bavister B. D. Clucose and phosphate inhibit respiration and oxidative metabolism in cultured hamster eight-cell embryos: evidence for the "Crabtree effect" // Mol. Reprod. De-vel.-1991.-V. 30.-P. 105-111.

152. Southern E. M. Detection of specific sequensec among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - V.98.- P.503-517.

153. Shamay A., Solinas S., Pursel V.G et al. Production of the mouse whey acidic protein in transgenic pigs during lactation. J. Anim. Sci.-1991.- V. 69.-P.4552.

154. Simons J.P., Wilmut I., Clark A.L. et al. Gene transfer into shepp // Bio/Technology. 1988. - V. 6. - P. 179.

155. Sirard M. A. Development potential of early bovine zygotes submitted to centrifugation and microinjection following in vitro maturation of oocytes // Theriodenology. 1990. - V. 34. - P. 417 -425.

156. Tada N., Sato M., Hayashi et al. In vitro selection of transgenic mouse embryos in the presence of G-418. Transgenics. 1995.-V.I.- P.535-540.

157. Uusi-Oukari M., Hyttinen J.M., Korhonen V.P. et al. Bovine alpha sl-caseine gene stimulating factor in the milk of transgenic mice // Transgenic Res.- 1997. V.6, N 1. - P.75-84.

158. Voss A.K., Sandmoller A., Suske G. et al. A comparison of mouse and rabbit embryos for the production of transgenic animals by pronuclear microinjection // Theriodenology. 1990. - V. 34. - P. 813-824.

159. Van der Putten H.,Botteri P.M., Miller A.D. e.a. Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors // Proc. Natl. Acad. Sei.- 1985. V. 82.- P. 148-152.

160. Wall R.J., Kerr D.E., Bondioli K.R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. J. Dairy Sei. 1997. - V.80.- P. 2213-2224.

161. Walker S.K., Heard T.M., Verma P.J. et al. In vitro assessment of the viability of sheep zygotes after pronuclear microinjecton // Reprod. Fertil. Dev. 1990. - V. 2. - P. 633-640.

162. Wall R.J., Hawk H. W. Development of centrifuged cow zygotes cultured in rabbit oviducts // J. Reprod. Fertil. 1988. - V. 82. - P. 673-680.

163. Wall R.J. and Seidel G.E. Transgenic farm animals a critical analysis. // Theriogenology. - 1992. - V.38. - P. 337-357.

164. Wall RJ., Korr D.E., Bondioli K.R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale / J. Dairy Sci. 1997. - V. 80. -P. 2213-2224.

165. Wall R.J., Pursel V.G., Shamay A. et al. High-level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine /Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 1696.

166. Wall R.J., Rexroad C.E., Powell J. et al., Synthesis and secretion of the mouse whey acidic protein in transgenic sheep // Transgenic Res. 1996. - V. 5. - P. 67.

167. Walton J.R., Murray J.D., Marshall J.M. et al. Zygote viability in gene transfer experiments // Biol. Reprod.- 1987. V. 37. - P. 67957.

168. Ward K.A. and Nancarrow C.D. The engineering of production traits in domestic animals. Experimentia. 1991. - V. 47. - P. 913922.

169. Ward K.A., Nancarrow, Byene C.R. et al. Thepotential of transgenic animals for improved agracultural productivity. Rev. Sci. Tec. Off. Int. Epiz. -1990. V.9. - P. 847-864.

170. Ward K.A., Franklin I. R., Murray J. D. et al. The directtransfer of DNA by embryo microinjection. Proc. 3 rd World Cong. Genetics Appl. Livestock Prod. P. 6-21. Nebraska.

171. Welander W.H., Johnson J.L. et al. High level expression in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding human protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V.89. - P.12003.107

172. Whittingham D.G. Culture of mouse ova. J. Reprod. Fertil. (suppl.) -1971. -N 14.- P. 7-21.

173. Wilkie T.M. et al. Germline and somatic mosaicism in transgenic mice // Dev. Biol. 1986. - V.l 18. - P.9-18.

174. WilmutL, Archibald A.L., Harris S. et al. Modifikation of milk composition. J. Reprod. Fertil. 1990. - V. 41 (Suppl.). - P. 135.

175. Yom H.C. and Bremel R.D. Genetic engineering of milk composition: modifikation of milk components in lactating transgenic animals. Am J. Clin. Nutr. 1993. - V. 58. - P. 299.

176. Yorifuji T., Mikawa H. Co-transfer of restriction endonucleases and plasmid DNA into mammalian cells by electroporation. Effect on stable transformation // Mutation Res. 1990. - V.243, N 2.- P. 121-126.