Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронно-зондовые исследования баланса элементов (К, Na, Сl) в клетках миокарда на этапах ранней ишемии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электронно-зондовые исследования баланса элементов (К, Na, Сl) в клетках миокарда на этапах ранней ишемии"

На правах рукописи УДК 582.264

РГ6 од

2 5 ДЕК 7Щ

ПОГОРЕЛОВ АЛЕКСАНДР ГРИГОРЬЕВИЧ

ЭЛЕКТРОННО-ЗОНДОВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БАЛАНСА ЭЛЕМЕНТОВ (К, N3, С1) В КЛЕТКАХ МИОКАРДА НА ЭТАПАХ

РАННЕЙ ИШЕМИИ

03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПУЩИНО — 2000

Работа выполнена в лаборатории термодинамики и энергетики биологических систем (заведующий - доктор медицинских наук, профессор Е.И.Маевский) и группе аналитической электронной микроскопии (руководитель - Б.Л.Аллахвердов) Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.Э.Шноль доктор биологических наук, профессор В.П.Зинченко доктор биологических наук, профессор Я.Ю.Комиссарчик

Ведущее учреждение - Институт эволюционной физиологии и биохимии РАН им.И.М.Сеченева (г. С-Петербург)

Защита состоится " -Л4 " _2000 г.

в «/З30и часов на заседании диссертационного Ученого Совета Д.200.22.01 при ИТЭБ РАН по адресу: 142290, Московская обл., г.Пущино, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Ученом Совете ИТЭБ РАН и в читальном зале НЦБП (г.Пущино)

Автореферат разослан ЛР.9 //Ш- 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Е.И.Маевский

кандидат физ-мат. наук

р ч/с - /</с- а - , о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Ишемия является одной из причин нарушения функции сердца (Bolli, 1982). Ранняя стадия ишемии характеризуется нарастающей гипоксией, с которой связывают обратимые изменениями физиологии мышечной клетки, прежде всего дисбаланс ионов на мембране кардиомиоцита (Allen, Orchard, 1987; Silverman, Stern, 1994; Pierce, Czubryt, 1995). Уже в начале ишемических условий регистрируется выход калия из мышечной ткани (Kleber, 1984). Предполагается, что наблюдаемое увеличение концентрации калия в плазме крови определяется перераспределением катиона К+ из миоцита во внеклеточное пространство и . является реакцией клетки на замедление доставки кислорода (Benndorf et al., 1991 ; Lindinger, 1995). Индуцированный ишемией внутриклеточный дефицит калия сопровождается накоплением в цитоплазме кардиомиоцита натрия, что провоцирует вход в клетку экзогенного кальция. Именно кальциевая перегрузка цитозоля вызывает необратимую потерю сократительной функции сердца (Steenbergen et al., 1990; Du Toit, Opie, 1992). По-видимому, механизмы регуляции ионного баланса кардиомиоцита, специфичные для ранней ишемии, лежат п основе ряда явлений, которые изучаются фундаментальной кардиологией. К ним можно отнести: гибернацию, как состояние ткани сердца в условиях гипоксии (Heusch, Schulz, 1996); явление, обозначенное термином "preconditioning", которое заключается в защитном эффекте кратковременной ишемии/реперфузии для последующей длительной ишемии (Zellner et al., 1996); феномен долговременной потери сердцем сократительной функции после кратковременной ишемии — "stunning" (Shen, Vatner, 1995), а также запуск механизмов апоптоза и некроза миоцита (Skulachev, 1998; Crompton, 1999; Bernardi et al., 1999; Halestrap et al., 2000; Loeffler, Kroemer, 2000).

Постоянный интерес к проблеме регуляции баланса калия, натрия и хлора в мышечной клетке сердца при ишемии объясняется возможностью использования результатов экспериментальных исследований в клинической практике. Например, один из способов коррекции ранней ишемии основан на предупреждении накопления натрия в клетке (Murphy et al., 1991; Scholtz et al., 1992; Fliegel, Fruhlih, 1993; Karmazyn et al., 1993; Pike et al., 1993). С другой стороны, требуют своего исследования механизмы, лежащие в основе подходов, широко и успешно используемых в клинике, например, применение тройной смеси калия, инсулина и глюкозы при ранней ишемии (Laborit, 19650). Представляет интерес также тестирование на модельных системах фармакологических препаратов (Cheung et al., 1983; Liu et al., 1993; Tosnki et al., 1993, VanEmous et al., 1997; Goodwin et al., 1998) и действия различных условий (Lopez et al., 1996), корректирующих ищемию.

С начала 80-х годов накоплен большой объем данных, полученных на сердце, препаратах ткани сердца и первичной культуре кардиомиоцитов, которые косвенно подтверждают наличие последовательных изменений состава элементов в мышечной клетке сердца на стадии ранней ишемии. Показано, чго ионный баланс кардиомиоцита регулируется прежде всего механизмами на мембране клетки, которыеактивируются в условиях недостатка кислорода и нарушения транспорта метаболитов, среди них: АТФ зависимый (Кдхф) и натрий зависимый (Кма) калиевые каналы, Na+-H+ обмен, транспорт лактата из кардиомиоцита

(Noma 1983; Kameyama et al., 1984; Lazdunsky et al., 1985; Gaspardone et al., 1986). Многочисленные экспериментальные работы посвящены исследованию метаболических и морфологических нарушений в миоците при ишемии (Jennings, Reimer ,1981; Reimer et al., 1983; Piper et al., 1984, Allen, Orchard,1987; Ely, Berne, 1992; Kaul et al., 1993; Tanonaka et al., 1996). Однако, до сих пор остается неясной последовательность событий, вызывающих изменение содержания элементов в клетке в ответ на ишемические условия. По-прежнему, не имеет прямого подтверждения наличие калиевого дефицита в кардиомиоциге и накопление в цитоплазме натрия, не ясен способ перераспределения калия из клетки в просвет капилляра, не исследована значение транспорта лактата и хлора в регуляции ионного баланса кардиомиоцита, нет полной картины взаимосвязи ионных и метаболических изменений в миоците в течение ишемии. Следует особо отметить проблему роли эндотелия капилляра в реакции сердечной ткани на условия ишемии, т.к. эндотелиальная клетка является не просто морфологическим барьером, но осуществляет активную функцию в формировании ионого гомеостаза кардиомиоцита.

Последние двадцать лет во многих лабораториях проводились исследования, цель которых была получить ответ на поставленные вопросы. Однако, полученные данные носили косвенный характер, причиной чего было отсутствие адекватных методов анализа элементного состава одиночной клетки в ткани. Анализ проводили on mass на изолированном сердце (ЯМР спектроскопия, изотопный анализ) и препаратах ткани сердца (пламенная фотометрия, атомно-адсорбционный анализ, калий селективные электроды) или на мембране изолированного кардиомиоцита. Развитие электронно-зоцдового микроанализа и криогенных методов подготовки ткани в сочетании с экспериментальными технологиями, моделирующими условия(близкие к интактному состоянию, дает подход к решению сформулированных выше проблем.

Цель и основные задачи

В связи с изложенным( целью настоящей работы было разработать технологию, позволяющую применить электронно-зондовый микроанализ в эксперименте, моделирующем условия ранней ишемии. Затем, используя созданную экспериментальную базу, исследовать динамику изменения ионного баланса и последовательность активации специфичных мембранных механизмов в мышечной клетке сердца на биологических системах разного уровня организации. При выполнении работы решалось несколько задач:

• Изучить связь изменения внутриклеточного элементного состава и ультраструктуры мышечной клетки сердца в условиях целостного организма при функциональной ишемии, вызванной действием на животное длительной гипертермии.

• Исследовать изменение элементного состава мышечной клетки сердца при гибернации теплокровного животного - эволюционно обусловленном физиологическом состоянии в условиях гипотермической ишемии суслика (Citellus undulatus).

• Анализ изменения элементного состава (К, Na, С1) в мышечной клетке изолированного сердца, вызванного длительной нормоксической перфузией, полной ишемией и аноксической перфузией.

• Оценить влияние ингибиторов Na/K-АТФазы на внутриклеточную концентрацию элементов (К, Na, С1) при аноксической перфузии.

• Исследовать действие кратковременной реперфузии на элементный состав (К, Na, С1) мышечной клетки изолированного сердца после ишемии различной длительности.

• Изучить возможность использования первичной культуры кардиомиоцитов для изучения in vitro действия ишемии на внутриклеточный элементный состав ( К, Na, CI).

Научная новизна работы

О Получены прямые данные, подтверждающие наличие дефицита калия и накопление натрия в мышечной клетке сердца крысы при ранней ишемии. Получены свидетельства участия эндотелиальной клетки капилляра в формировании гомеостаза кардиомиоцита.

О Показано накопление, калия в мышечной клетке сердца суслика (Citellus undulatus) при гибернаиии.

О Установлено, что длительная нормоксическая проточная перфузия физиологическим раствором, насыщенным кислородом, приводит к характерному для гипоксии изменению состава ионов (К, Na, С1) в миоците изолированного сердца.

О Показано, что гипотермия (10°С) при перфузии предотвращает гипоксические изменения содержания элементов (К, Na, С1) в миоците изолированного сердца.

О Определена временная зависимость изменений концентрации элементов (К, Na, С1) в миоците изолированного сердца при полной ишемии. Показано наличие активного транспорта калия на этапе ранней ишемии.

О В условиях аноксической перфузии изолированного сердца показано, что

ишемия создает условия, которые предполагают функциональную взаимосвязь в работе Na/K-АТФазы и Кдуф канала.

О Раскрыт механизм опосредованного действия ингибиторов Na/K-АТФазы на состояние кардиомиоцита. Согласно развиваемым в работе представлениям о роли взаимодействия эндотелиальной и мышечной клетки, первичной мишенью действия ингибиторов является Na/K-АТФаза эндотелиоцита.

О На первичной культуре ткани сердца показано, что кардиомиоциты в культуре представляет из себя клеточные образования — микросинцитии. Среди них наибольшей интактностью обладают те образования, в которых сохраняются межклеточные контакты. Научно-практическая ценность

Создана технология анализа содержания элементов в цитоплазме мышечной клетки, которая включает перфузию изолированного сердца, криотомию свежевыделенной папиллярной мышцЫсердца и электронно-зоняовый микроанализ элементного состава миоцита на криосрезе. Данная технология позволяет тестировать различные физиологически активные соединения, химические агенты и способы

воздействия на клетку изолированногосердца по критерию изменения внутриклеточного элементного состава.

=> Разработан эффективный метод быстрого снижения концентрации кислорода (<3% от нормоксической перфузии) в перфузирующем растворе путем

предварительной вакуумной дегазации раствора, что позволило создать условия аноксической перфузии сердца.

Установлено, что гипотермическая перфузия изолированного сердца, которая проводилась при 10 С, вызывает консервацию элементного состава кардиомиоцита. Данный факт имеет значение для разработки новых способов трансплантации, консервации органов или реконструирующей хирургии. => Показано, что кратковременная перфузия раствором строфантидина (0.1 мМ) стимулирует Ыа/К-АТФазу мышечной клетки изолированного сердца в условиях аноксии. Для получения прямого эффекта ингибирования Na/K-АТФазы при перфузии следует использовать более высокую концентрацию гликозида или увеличивать время его действия. => Показано, что реперфузия приводила к накоплению натрия в мышечной клетке изолированного сердца только в середине периода ишемии. Таким образом, повреждающий эффект реперфузии обусловлен не столько длительностью ишемии, но ее стадией (состоянием миоцита), что необходимо учитывать в практике консервации и реперфузии сердца. =s> Показано, что первичная культура миоцитов ткани сердца гетерогенна. По критерию внутриклеточного содержания калия и натрия не более 25% кардиомиоцитов в культуре сохраняют интактное содержание элементов в клетке, что следует учитывать при разработке эксперимента на первичной культуре ткани сердца.

Апробация работы. Фрагменты работы доложены и обсуждены на международных конференциях: 12 ICXOM (Cracow, 1989), "Low temperature microscopy and microanalysis" (Cambridge, 1990), 12th Pfefferkorn Conference "The Science of Biological Microanalysis" (Cambridge, 1993),"MICRO 96" (London, 1996), "CRYO 97" (York, 1997), "Scanning 97" (California, 1997), "Biological Motility: modern methods for studying" (Pushchino, 1998), "Heart disease-new trends in research, diagnosis and treatment" (Washington, 1999), "Electron probe microanalysis today-practical aspects" (Trest, 2000), а так же на Всероссийских конференциях: "Криогенные методы в электронной микроскопии" (Пущино, 1985),"Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996), "Гипоксия: механизмы, адаптация и коррекция" (Москва, 1997), "Профилактическая кардиология" (Москва, 2000), "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000) и на заседании Физиологического клуба ВКНЦ (2000, г.Москва)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 51 печатная работа, из них 25 статей (16 в зарубежных изданиях) и 26 тезисов докладов (15 в материалах международных конференций).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, объектов и протоколов эксперимента, изложения полученных результатов, их обсуждения и комментариев, выводов, заключения и списка цитируемой литературы.

Текст диссертации изложен на 211 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 4 рисунка со схемами, 5 рисунков с фотографиями, 7 рисунков с диаграмами и графиками. Указатель литературы включает 317 цитируемых источников.

МЕТОДЫ, ОБЪЕКТЫ И ПРОТОКОЛЫ ЭКСПЕРИМЕНТА

Несмотря на важность исследования внутриклеточного ионного баланса, не были получены прямые данные, описывающие изменение элементного состава интактной мышечной клетки при ишемии сердца. Прежде всего это объясняется отсутствием адекватного метода анализа внутриклеточного содержания элементов морфологически идентифицированного миоцита в ткани. Электронно-зондовый микроанализ (ЕРМА) принципиально позволяет провести измерение концентрации элементов на уровне отдельной клетки и ее органелл. Физические принципы метода ЕРМА и его техническая реализация на базе электронного микроскопа достаточно полно описаны в ряде обзоров (Birks, 1963; Chandler, • 1976; Goldstein et al., 1992). Метод основан на регистрации интенсивности характеристического рентгеновского излучения анализируемого элемента, возбуждаемого в образце ускоренными электронами зонда. Учитывая специфику биологической ткани, нами разработана для ЕРМА методика расчета концентрации элемента (Pogorelov, Allachverdov, 1984), получены уравнения для оценки морфологического разрешения метода и его чувствительности (Pogorelov, 1987; Pogorelov et al., 1991,1994a).

Большинство методик подготовки оводненных образцов для ЕРМА основаны на низкотемпературной фиксации внутриклеточного состава элементов с последующей криотомией свежевыделенной ткани (Echlin, 1992). В процессе выполнения данной работы нами разработано несколько протоколов подготовки срезов папиллярной мышцы сердца (Pogorelov et al., 1991) и культуры клеток (Pogorelov et al., 19946). Дальнейшее развитие работы путем введения в схему эксперимента перфузии сердца позволило создать технологию анализа элементного баланса миоцита при ишемии, условия которой моделируются экспериментально на изолированном сердце (Pogorelov et al., 1998; 1999, 2000).

Электронно-зондовый микроанализ проводили в сканирующем электронном микроскопе-микроанализаторе JSM-U3 (JEOL, Япония), оснащенном кристалл-дифракционными спектрометрами рентгеновского излучения. При ускоряющем напряжении электронов 25 кВ ток зонда устанавливался в пределах 5-10 нА. Эксперименты проводились на животном, первичной культуре ткани сердца и изолированном перфорированном сердце. Измерение внутриклеточной концентрации элементов проводили на лиофилизированном криосрезе папиллярной мышцы, выделенной из левого желудочка сердца. Криосрез толщиной 4 цм получали при -60°С в криотоме Porter Blum МТ2 (Ivan Sorvell, USA) или толщиной 20 цм при -25°С в криостате.

В эксперименте по исследованию действия функциональной ишемии на мышечную клетку сердца животное (крыса Wistar) помещалось в термокамеру (42°С) с дневным освещением. В камере обеспечивался проток свежего подогретого воздуха и свободный доступ животного к питьевой воде. Крыса находилась в спокойном состоянии. В таких же

условиях, но при комнатной температуре, содержалось контрольное животное. Сравнительный анализ действия зимней спячки на элементный состав кардиомиоцита проводили на срезах папиллярной мышцы сердца суслика (Citellus undulatus). Часть результатов, представленных в данной работе, получена на миоцитах первичной культуры ткани сердца. Суспензия кардиомиоцитов была предоставлена Ю.М. Кокоз (ИТЭБ РАН, г.Пущино). Внутриклеточный состав

кардиомиоцитов в культуре анализировали на срезах залитой в смолу лиофилизированной суспензии клеток. Морфологический контроль осуществлялся на срезах папилярной мышцы сердца или суспензии кардиомиоцитов, подготовленных по традиционной методике электронной микроскопии.

Элементный состав мышечной клетки в регулируемых экспериментально условиях изучался на изолированном сердце крысы (Wistar). Нормоксическая перфузия (38°С) проводилась непрерывно оксигенируемым растовором Тироде (95% 02, 5% СС>2). Полная ишемии моделировалась прекращением перфузии изолированного сердца. В эксперименте по схеме ишемия/реперфузия нормоксическая перфузия восстанавливалась на 5 минут после полной ишемии разной длительности (15 мин, 30 мин, 45 мин и 60 мин). Аноксическая перфузия изолированного сердца моделировалась в условиях перфузии раствором Тироде при содержании кислорода в нем менее 3% от нормоксической перфузии и в отсутствии глюкозы. Низкий уровень кислорода достигался предварительной дегазацией раствора вакуумной откачкой с созданием в последующем аргонового затвора над его поверхностью. Для анализа роли активного транспорта калия в условиях ранней ишемии в эксперименте использовали аноксическую перфузию с одновременным ингибированием Ыа/К-АТФазы гипотермией или калиевой блокадой. Применение двухканального перфузатора с малоинерционным переключателем позволило, комбинируя условия аноксической перфузии, исследовать действие сердечного гликозида строфантидина на элементный состав миоцита на разных стадиях ранней ишемии. Для электронно-зондового микроанализа использовали лиофилизированные криосрезы папиллярной мышцы, выделенной из изолированного сердца после завершения перфузии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Анализ элементного состава мышечной клетки папиллярной мышцы сердца в эксперименте на животном

В разделе представлены данные, полученные при исследовании элементного состава миоцита папиллярной мышцы сердца. Получение папиллярной мышцы занимает около 40 сек с момента декапитации. Последующая криофиксация ткани (0.1-0.01 сек) позволяет получит препарат наиболее близкий к интактному состоянию по критерию сохранности внутриклеточного состава элементов. На фотографии (рис.1, 2) представлен характерный вид участка поперечного среза папиллярной мышцы, на котором проводился ЕРМА. Изображение получено в сканирующем электронном микроскопе JSM-U3 (JEOL,Япония), режим вторичных электронов. Ультраструктурные наблюдения (рис.3) папиллярной мышцы проводились на ультратонких срезах в просвечивающем электронном микроскопе JEM 100В (JEOL, Япония).

Рисунок 1. Вид участка поперечного криосреза папиллярной мышцы сердца крысы (\Vistar). Срез, толщиной 4 цм, резали в крностате при -25°С. Изображение получено в световом микроскопе. Обозначения: п- ядро мышечной клетки, ш- мышечная клетка, Ьу-капилляр крови. Деление соответствует 8 цт

Рисунок 2. Вид участка криосреза папиллярной мышцы сердца крысы (\Vistar) в норме ( а) и при функциональной ишемии (Ь). Внизу представлены карты распределения калия (с, с!) по соответствующему участку среза. Обозначения, что и на рис.1. Деление соответствует 9цш

Рисунок 3. Микрофотография узла капилляра папиллярной мышцы сердца крысы (\Vistar) в норме (вверху) и при функциональной ишемии. Обозначения: Г-сократительный аппарат миоцита, g-rликoreнoвыe глыбки, п-ядро эндотелиальной клетки капилляра крови, ш-митохондрии, г - эритроцит в просвете капилляра. Деление соответствует 2цт

В таблице 1 приведены результаты сравнительного электронно-зондового микроанализа эдементного состава мышечной клетки сердца на срезах пап иллярной мышцы контрольного животного, приготовленных различ ными методиками: криотомия, лиофилизация ткани в вакууме с последующей заливкой в эпоксидную смолу Эпон-812, лиофилизация ткани в среде жидкого пропана с последующей заливкой ткани в смолу Ьо\¥шгу1 4М. Таблица 2 соответствует таблице 1, но данные относятся к мышечной клетке сердца животного в состоянии функциональной ишемии (гипотермия).

Таблица 1. Содержание К, Ыа и С1 в миоците папиллярной мышцы сердца контрольного животного (крыса \Vistar), определяемое методом электронно-зондового микроанализа в зависимости от способа подготовки образца_

ПОДГОТОВКА* КОНЦЕНТРАЦИЯ ЭЛЕМЕНТА (мМ)**

СРЕЗА ТКАНИ КАЛИИ НАТРИИ ХЛОР***

лиофилизированный 4 цш 110 ±1.3 35 ±1.0 22 ±0.65

криосрез (62) (62) (59)

лиофилизированная в 130 ±1.5 n.d. 25 ±0.55

вакууме ткань (98) (83)

лиофилизированная в 127 ±1.4 n.d. 26 ±1.1

пропане ткань (87) (41)

* - результаты получены на 4 цгп лиофилизированном криосрезе и на 2 цгп срезе ткани залитой в смолу (Spun) после лиофилизации в вакууме или в жидком пропане; n.d. -концентрация элемента ниже чувствительности метода

** - данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (mean±sem), в скобках указано количество анализируемых клеток

*** - измерение хлора на срезе ткани залитой в среду без хлора (Lowicryl 4М).

Таблица 2. Содержание К, Na и С1 в миоците папиллярной мышцы сердца крысы (Wistar) при функциональной ишемии (гипертермия 42°С, 1 час), определяемое методом электронно-зондового микроанализа в зависимости от способа подготовки образца *

ПОДГОТОВКА КОНЦЕНТРАЦИЯ ЭЛЕМЕНТА (мМ)

СРЕЗА ТКАНИ КАЛИЙ ' НАТРИИ ХЛОР

лиофилизированный 4 цш 76 ±1.1 55 ±1.6 60±1.0

криосрез (38) (38) (33)

лиофилизированная в 85±0.98 65±1.1 70±1.4

вакууме ткань (83) (83) (32)

лиофилизированная в 87±0.86 65±1.3 68±1.7

пропане ткань (87) (87) (29)

* — все условия и обозначения как в таблице 1

Чувствительность ЕРМА по калию достаточна для измерения внутриклеточной концентрации элемента на всех типах срезов. Наличие заливочной среды ухудшает чувствительность микроанализа и делает невозможным анализ натрия в миоците. Поэтому внутриклеточную концентрацию [ТЧа] измеряли на криосрезах. Содержание хлора в цитоплазме измеряли на криосрезах и срезах лиофлизированной ткани, залитой в среду Ьоичсг/1 К4М, так как в заливочной смоле Бригг собственное содержится хлора составляет не менее 150 мМ.

Анализ данных, представленныхбтаблицах 1 и 2, показывает более высокую внутриклеточную концентрацию элементов на срезах залитой ткани, по сравнению с криосрезами. Этот факт отражает различие между физическими условиями подготовки срезов в разных методиках. Интенсивность характеристичекого рентгеновского излучения пропорциональна толщине среза и объемной концентрации элемента. При лиофилизации криосрезов возможно их сжатие по толщине, которое вызывает пропорциональное увеличений

концентрации элемента. В используемом методе расчета регистрируемая интенсивность нормируется к начальной толщине среза. Поэтому, рассчитываемая величина концентрации элемента на криосрезе не зависит от его сжатия. При работе с образцами залитой ткани срезы получают после лиофилизации ткани, т.е. когда сжатие образца уже произошло. В этом случае расчет дает на срезе залитой ткани папиллярной мышцы величину концентрации элемента примерно на 10% выше, чем на криосрезе той же мышцы.

Увеличение концентрации элемента, вызванное сжатием ткани при лиофилизации папиллярной мышцы, регистрируется для калия и не регистриуется для натрия, содержание которого в клетке ниже чувствительности ЕРМА на срезах залитых образцов (Ро§оге1оу е1 а1., 1987). Полученные результаты позволяют рекомендовать криотомию как более сохранный и универсальный способ получения срезов ткани для электронно-зондового микроанализа (Ро£оге1оу е1 а1., 1991; 1994). На фотографии (рис.2) представлен характерный вид участка поперечного криосреза папиллярной мышцы, на котором проводился ЕРМА. Сравнение значения внутриклеточной концентрации показывает, что при ишемических условиях в миоците наблюдается в среднем снижение концентрации калия на 39 мМ, увеличение содержания натрия на 26 мМ и хлора на 42 мМ.

В данном разделе представлены также результаты сравнительного анализа содержания калия в миоците папиллярной мышцы сердца суслика (СиеНиэ ипёЫаШэ) в активном состоянии и гибернации. Электронно-зондовый микроанализ проводили на срезах лиофилизированной ткани залитой в эпоксидную смолу (Р0£0ге10У е! а!., 1996). Значение внутриклеточной концентрации калия в кардиомиоците активного суслика и животного в состоянии-зимней спячки показаны в таблице 3.

Таблица 3. Содержание калия в миоците папиллярной мышцы сердца суслика (СиеНиБ ипсМаШБ), определяемое методом электронно-зондового микроанализа*

СОСТОЯНИЕ концентрация калия (мМ) КОЛИЧЕСТВО

животного ** ИЗМЕРЕНИИ

суслик активный 120±1.4 (50)

СУСЛИК спящий (3°С) 141±1.5 (54)

* - 2 цт срез свежезамороженной лиофилизированной ткани, залитой в смолу Бригг.

**- данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (теап±5ет), в

скобках указано количество анализируемых клеток

Сравнительный анализ данных (таблица 3) показывает, что в состоянии зимней спячки регистрируется увеличение содержания (16%) калия в цитоплазме мышечной клетки сердца суслика. Рассматривая животное, как объект для моделирования, следует отметить трудность в контроле начала и длительности ишемии. Поэтому, в эксперименте на

животном затруднительно фиксировать фазы ишемии и проводить направленно ее коррекцию. Более "регулируемой" моделью для анализа кинетики изменений внутриклеточного элементного состава является первичная культура кардиомиоцитов и изолированное сердце.

Анализ элементного состава мышечной клетки в суспензии первичной культуры

ткани сердца

Образцы миоцитов первичной культуры ткани сердца крысы (\Vistar) были представлены нам Ю.М.Кокоз (ИТЭБ РАН, г.Пущино). Электронно-зондовый микроанализ содержания элементов (К, Ыа) в цитоплазме кардиомиоцита выполняли на 2 цм срезах лиофилизированной суспензии миоцитов, залитой в среду Эпон-812. Результаты анализа внутриклеточной концентрации калия и натрия в миоците первичной культуры ткани сердца крысы суммированы в таблице 4.

Таблица 4. Содержание калия и натрия в кардиомиоците первичной культуры ткани сердца, рассчитанное по данным электронно-зондового микроанализа

Тип кардиомиоцита в КОНЦЕНТРАЦИЯ ЭЛЕМЕНТА Размер клетки

первичной культуре (мМ)*

ткани сердца КАЛИИ НАТРИИ (цм)

суспензия миоцитов 116±2.8 30+2.4 12-15

(клетки типа I) (21) (21)

суспензия миоцитов 76± 1.4 50+3.7 5-7

(клетки типа 11) (33) (33)

суспензия миоцитов 50±1.1 97±4.5

(округлые клетки) (41) (41)

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (теап+эет), в скобках указано количество анализируемых клеток

Результаты электронно-зондового микроанализа показывают, что первичная культура кардиомиоцитов содержит три типа клеток, отличающихся по концентрации элементов (К, Ыа), форме и поперечному размеру. Сравнивая содержание калия для миоцита в ткани папиллярной мышцы сердца (табл. 1) и в первичной культуре (табл.4), следует отметить, что только кардиомиоциты прямоугольной формы (тип I), которые при электрофизиологических измерениях классифицированы как "нормальные'', имеют содержание калия, близкое по величине к концентрации элемента в цитоплазме интактной клетки.

Анализ элементного состава мышечной клетки папиллярной мышцы изолированного сердца В данном разделе представлены данные анализа элементного состава миоцита, полученные на срезах папиллярной мышцы изолированного сердца крысы (\Vistar) в различных условиях: нормоксическая перфузия при 38°С (табл.5), полная ишемия (табл.6), аноксическая перфузия (табл. 7), действие строфантидина (0.1 мМ) при

аноксической перфузии (табл.8), полная ишемия с последующей реперфузией (табл.9), ингибирование Na/K-ATФaзы при гипотермии (10°С) и калиевой блокаде в условиях аноксической перфузии (табл.10), нормоксическая перфузия при гипотермии (10°С) (табл.11).

Таблица 5. Изменение концентрации элементов (К, N3, С1) в мышечной клетке изолированного сердца крысы (У^аг) в зависимоти от длительности нормоксической перфузии при 38°С

Концентрация ДЛИТЕЛЬНОСТЬ НОРМОКСИЧЕСКОИ ПЕРФУЗИИ

(мМ)* 15 мин. 30 мин. 45 мин. 60 мин.

КАЛИЙ 114±3 93±4 95±3 102±5

НАТРИИ 104±5 88±5 76±5 70±4

ХЛОР 46±1 55±2 54±1 48±1

* -- данные представлены как среднее и среднеквадратичная ощибка среднего (гпеап+зеш) для 80 клеток от трех животных

Таблица 6. Изменение концентрации элементов (К, Ыа, С1) в мышечной клетке изолированного сердца крысы (\Vistar) в зависимости от длительности полной ишемии

Концентрация ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ПОЛНОЙ ИШЕМИИ

(мМ)* 15 мин. 30 мин. 45 мин. 60 мин.

КАЛИИ 98±2 96±2 96+2 94±2

НАТРИЙ 89+3 56+2 74+5 72±4

ХЛОР 47+2 42±2 53+1 42±1

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (теап+зет) для 80 клеток от трех животных

Таблица 7. Изменение концентрации элементов (К, С1) в мышечной клетке изолированного сердца крысы (\Vistar) в зависимости от длительности аноксической перфузии без глюкозы при 38°С

Концентрация ДЛИТЕЛЬНОСТЬ АНОКСИЧЕСКОИ ПЕРФУЗИИ

(мМ)* 15 мин. 30 мин. 45 мин. 60 мин.

КАЛИИ 96±3 91±2 71±2 54±2

НАТРИИ 44±3 40+1 56+2 66±3

ХЛОР 45+1 26±1 25+1 60±2

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ощибка среднего (теап+хет) для 80 клеток от трех животных.

Таблица 8. Изменение концентрации элементов (К, Ыа) в мышечной клетке изолированного сердца крысы (МЫаг) после действия строфантидина (0.1 мМ, 10 мин) в зависимости от длительности предшествующей строфантидину

аноксической пер< )узии при 38°С

Концентрация ДЛИТЕЛЬНОСТЬ АНОКСИЧЕСКОИ ПЕРФУЗИИ

(мМ)* 10 мин 20 мин 35 мин 50 мин

КАЛИИ 115+3 99+2 101±2 123+3

НАТРИИ 45±2 39±1 54±2 52±3

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ощибка среднего (теагйзет) для 80 клеток от трех животных

Таблица 9. Изменение концентрации элементов (К, С1) в мышечной клетке изолированного сердца крысы (\Vistar) после реперфузии (5 мин) в зависимоти от длительности полной ишемии .предшествующей реперфузии_

Концентрация ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ПОЛНОЙ ИШЕМИИ

(мМ)* 15 мин 30 мин. 45 мин. 60 мин.

КАЛИИ 99+3 81±2 104+3 105±2

НАТРИИ 94+6 118±5 80+4 60+2

ХЛОР 59+1 65+2 57±1 42±1

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (шеап±5еш) для 80 клеток от трех животных

Таблица 10. Изменение концентрации элементов (К, Ыа) в мышечной клетке изолированного сердца крысы (\Vistar) после ингибирования активного транспорта в последние 30 минут аноксической перфузии длительностью 45 минут посредством гипотермии (10°С) или перфузии без калия (калиевая блокада)

Концентрация Блокада Na/K-АТФазы в последние 30 минут аноксической

(мМ) * перфузии (45 мин)

гипотермия (100Q перфузия без калия

КАЛИИ 111±3 81+2

НАТРИИ 21±2 43+3

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (теап±5ст) для 80 клеток от трех животных

Таблица 11. Изменение концентрации элементов (К, С1) в мышечной клетке изолированного сердца крысы (\Vistar) в зависимости от длительности нормоксической перфузии при гипотермии (10°С)

Концентрация ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ЭКСПЕРИМЕНТА

(мМ)* 30 мин. 60 мин.

КАЛИИ 120+3 123+4

НАТРИИ 24+2 28 ±2

ХЛОР 27+1 24±1

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (шеап±5ет) для 80 клеток от трех животных

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ • Изменение балансвэлементов в мышечной клетке сердца в условиях функциональной ишемии

Современная гипотеза о механизме действия ишемии на мышечную клетку сердца рассматривает прежде всего изменение ионного состава в цитоплазме кардиомиоцита (Allen, Orchard, 1987; Silverman, Stern, 1994; Pierce, Czubryt, 1995; Vermeuien et a!., 1996). Характерным показателем ишемических условий является увеличение концентрации калия в плазме крови (Kleber, 1984; Sjogaard, 1990; Lindinger, 1995), что объясняется перераспределением элемента из мышечной клетки в межклеточное пространство (Hill, Gettes, 1980; Shine, 1981; Weiss, Shine, 1982; Kleber, 1984; Gaspardone et al., 1986). Выход калия из миоцита на стадии ранней ишемии косвенно подтверждается накоплением элемента вне

ткани в экспериментах in situ (Kleber, 1983; Yan et al., 1996) и уменьшением средней концентрации элемента on mass в ткани (Tanonaka et al., 1996). Образование дефицита калия в цитоплазме миоцита является первым этапом обратимых ишемических изменений ионного баланса, дальнейшая последовательность событий представлена на рисунке 4.

Рисунок 4. Последовательные изменения ионного баланса в мышечной клетке сердца при ишемии (Pierce, Czubryt, 1995)

Na*--

Ранняя ишемия характеризуется усилением гликолиза в клетке. В результате, в цитоплазме накапливается протоны, что активирует Na+-H+ обмен и, как следствие, в клетке увеличивается концентрация натрия (Lazdunsky еу al., 1985). На данном этапе выход калия из миоцита определяется активацией натрий-зависимых калиевых каналов (К^а) и сопряженным транспортом лактата из миоцита.

Необратимые нарушения функции мышечной клетки на заключительной фазе ишемии обусловлены входом в клетку экзогенного кальция через Na+-Ca2+ обмен, что приводит к кальциевой перегрузке цитозоля. Поэтому, особый интерес вызывает механизм накопления натрия, что связано с возможностью коррекции ишемии фармакологическими средствами через ингибирование входа натрия в кардиомиоцит. Следует отметить, что реальная картина намного сложнее той, что описывается гипотезой последовательных изменений ионного баланса в клетке при ишемии. Это объясняется тем, что в формировании функции сердца существенную роль играет эндотелий капилляра крови, так как in vivo эндотелиальная клетка регулирует ионный гомеостаз кардиомиоцита (Pogorelov et al., 1991; Close et al., 1994).

Функциональная ишемия возникает при воздействии на организм условий окружающей среды, которые вызывают быстро нарастающую гипоксию сердца и сердечную недостаточность. Моделью функциональной ишемии является действие на животное гипертермии (Engin, 1996), которая, например, наблюдается на "горячих" производствах металлургических цехов и шахт. При гипертермии, даже в спокойном состоянии, наблюдается интенсивная нагрузка на сердце, обусловленная необходимостью поддержания температуры тела.

Гипертермическая функциональная ишемия вызывает характерные морфологические (рис.2) и ультраструктурные (рис.3) изменения, которые как видно из диаграммы (рис.5), соответствуют уменьшению в клетке концентрации калия на 40 мМ (от 122 мМ в контроле) и увеличению натрия на 25 мМ (от 36 мМ в контроле). Таким образом, нами подтвержден один из выводов гипотезы- наличие калиевого дефицита и накопление натрия в миоците на первой стадии ишемии.

К настоящему времени накоплен большой объем экспериментального материала по измерению средней концентрации натрия в изолированном сердце on mass методом ЯМР спектроскопии (Anderson et al., 1990; Van Echteid et al., 1991; Murphy et al., 1391; Van Emous et al., 1997) и атомно-абсорбционного анализа. (Piwnika-Worms et al., 1986; Tosaki et al., 1993; Tanonaki etal., 1996). Несовпадение в величинах концентрации элемента, отмеченные для указанных работ, можно объяснить отличием протоколов ишемии, особенностями методов расчета концентрации и методик подготовки препаратов для анализа. Несмотря на различие абсолютных значений, динамика изменения тканевого содержания натрия относительно контроля сходна для всех указанных выше работ.

Анализ внутриклеточного содержания калия и натрия при функциональной ишемии позволяет сделать вывод о том, что в нашем эксперименте с гипертермией регистрируется вторая фаза ишемии, которая характеризуется дефицитом внутриклеточного калия и накоплением в цитоплазме натрия.

140 т

§ 120-«г

в 100806040 ■■ о 20-0-

я а а, н

а> Я

Щ

IL, / Цi

"N

•V - ?!fi

fv • - f* ' щ

H f' 4kl 1- " Л

ff,' . «Й

*Y

r U Tl.:'* ■ fV-

£ ; ^ *t

Иконтроль □ишемия

калии

натрии

Рисунок 5. Значение концентрации (мМ) калия и натрия в мышечной клетке сердца крысы (\Vistar) в контроле и при функциональной ишемии (гипертермии 42°С, 60 мин). Данные представлены как среднее. Уровень значимости между средними значениями элемента, оцененный по критерию Стьюдента, составляет р<0.03

Для сравнения в таблице 12 сведены средние значения внутриклеточной концентрации элементов (К, Ыа, С1) в контроле и при ишемии (табл. 1,2).

Представленные данные позволяют оценить величину изменения заряда в клетке, обусловленного внутриклеточным дефицитом калия и накоплением в цитоплазме натрия и хлора.

Таблица 12. Содержание элементов (К, С1) в миоците папиллярной мышцы сердца крысы (\Vistar) в контроле, при ишемии (60 мин.) и изменение заряда, обусловленное внутриклеточным дефицитом калия и накоплением в цитоплазме натрия и хлора (рассчитано по данным электронно-зондового микроанализа)

СОСТОЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЯ ЭЛЕМЕНТА (мМ)*

ЖИВОТНОГО КАЛИИ НАТРИИ ХЛОР

Контроль 122±1.40 36+1.0 24±0.77

Ишемия 83±0.98 62±1.3 66±1.40

Д тМ (-39) (+26) (-42)

* - данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (mean±sem), для всех элементов уровень значимости составляет р<0,03.

Из таблицы 12 видно, что при ишемии изменение (ДшМ ) катионов (Na+, К+) и аниона Cl* в клетке не равносильно. Суммарный внутриклеточный баланс указанных ионов (К+, Na+, Cl") смещается в сторону накопления отрицательного заряда эквивалентного 55 мМ одновалентного аниона. Эта величина может увеличиться до 80 мМ, если учесть, что внеклеточный натрий поступает и накапливается в кардиомиоците через электронейтральный Na^-Hf1" обмен (Lazdunski et al., 1985). Компенсацию в миоците отрицательного заряда по сумме ионов К + и Cl* можно объяснить увеличением выхода аниона лактата из клетки, т.к. показано, что транспорт лактата увеличивается при активации гликолиза в ишемических условиях и является электронейтральным за счет сопряженного выхода Kj+ (Cascio et al., 1992; Wang et al., 1993; Shieh et al., 1994) или входа в

клетку Cl0~ (Poole, Halestrap, 1993; Jentsh, Gunter, 1997). В зависимости от выраженности ишемии, по-видимому, возможна одновременная работа обоих

механизмов, что описывалось как активированный лактатом Kj+ - С10 обмен (Case, 1972). Таким образом, по нашей оценке при ишемии в кардиомиоците образуется от 55 мМ до 80 мМ лактата. Эта величина близка к данным других авторов (Jennings, Reimer, 1981; Reimeret al., 1983; Piper et al., 1984; Cross et al., 1995).

На криосрезе папиллярной мышцы сердца выявляется увеличение объема пространства вне кардиомиоцита после ишемии по сравнению с контрольным состоянием (рис.2). На микрофотографии ультратонкого среза мышцы видны изменения в ультраструктуре клетки(характерные для гипоксических условий ранней ишемии,— исчезновение гликогеновых гранул в кардиомиоците и увеличение размера эндотелиальной клетки за счет уменьшения просвета капилляра (рис.3). Таким образом, наши наблюдения показывают, что увеличение внеклеточного пространства связано с уменьшением просвета капилляра и набухайием клетки эндотелия. Этот результат согласуется с данными ЯМР спектроскопии (Cross et al., 1995). Одновременно с увеличением объема эндотелия в нем регистрируется относительно высокое, по сравнению с миоцитом, содержание калия (рис.2).

Приведенные выше факты позволяют прийти к заключению, что регистрируемое при ишемии перераспределение ионов К+ из мышечной клетки в просвет капилляра происходит при участии эндотелиальной клетки. По-видимому, ишемическое увеличение объема эндотелия, наблюдаемое нами на ультратонких срезах, связано с накопением в эндотелиальной клетке калия, что вызывает набухание ее цитоплазмы. Среди причин, обуславливающих накопление калия в эндотелии, следует отметить диффузию лактата и активацию Na/K-АТФазы на мембране эндотелиальной клетки при ишемическом накоплении калия в интерстиции (Wang et al., 1993; Shieh et al., 1994). Наше заключение о том, что клетка эндотелия капилляра участвует в регуляции гомеостаза кардиомиоцита, поддерживая во внеклеточном пространстве постоянный уровень калия и удаляя из него лактат, согласуется с выводом ряда авторов о роли эндотелиальной клетки в адаптации мышечной ткани к гипоксическим условиям (Close et al., 1994, Jentsh, Gunter, 1997).

Выше мы отмечали, что при ишемии в эндотелиальной клетке накапливается калий. Следует подчеркнуть, что депонирование калия наблюдается на клеточном и субклеточном уровне разных биологических систем (Burovina et al., 1978; Sobota et al., 1984; Burovina et al., 1985; Pogorelov et al., 1990; Somlyo et al., 1991; Pogorelov et al., 1995). На уровне клетки накопление калия осуществляется как внутриклеточными структурами (митохондрии, пигментные гранулы, гликогеновые глыбки), так и внеклеточными образованиями (бактериальная стенка, оболочка ооцита, капсула цисты). Аккумуляция калия вне клетки "про запас" наблюдается для одноклеточных и изолированной клетки и является способом обеспечить калиевый гомеостаз при недостаточной скорости активного транспорта калия, например, при трансформации амебы в цисту или для ооцита в начальной фаза оогенеза.

Более сложная регуляция уровня внеклеточного калия осуществляется в сообществе специализированных клеток разного типа, каким представляется биологическая ткань. Показано, что гомеостаз клетки, функция которой определяет специализацию ткани, может поддерживаться клетками другого типа. Примером таких клеточных взаимодействий может служить система нейрона и глиальной клетки "калиевого электрода" в нервной ткани (Kuffler, Nichols, 1976), фоторецепторной и пигментной клетки омматидия сложного глаза насекомого (Burovina et al., 1978), энтероцита и бокаловидной клетки всасывающего эпителия тонкой кишки (Pogorelov et al., 1990). Показанное нами увеличение содержания калия клеткой эндотелия капилляра также является результатом клеточной регуляции гомеостаза, в данном случае кардиомиоцита при ишемии. Прямой эффект такого калиевого депонирования заключается в предотвращении значительного вымывания калия из сердечной ткани при длительных ишемических условиях. Этому способствует и уменьшение просвета капилляра при набухании эндотелиальной клетки, что одновременно затрудняет обратный ток плазменного кальция в кардиомиоцит.

Как было показано нами, при длительной функциональной ишемии в миоците регистрируется уменьшение концентрация калия до 83 мМ и накопление в цитоплазме натрия до 62 мМ (табл.12). Такой сдвиг во внутриклеточном элементном составе характерен для делящейся клетки и критичен для дифференцированной клетки, так как может вызвать ее трансформацию (Cone,

Tongier, 1971; Smith et al., 1978;Cameron etal., 1979; Cameron etal., 1980; Fernandez-Segura et al., 1999a; 19996). Возможно, именно изменение внутриклеточного баланса калия и натрия в мышечной клетке при ишемии запускает нарушение синтеза сократительных белков и их модификацию, активацию протеолитических ферментов и свободных радикалов (Kaul et al., 1993).

Описанные выше изменения в морфологии и гистохимии эндотелия капилляра и мышечной клетки отражают действие ишемических условий на сердечную ткань. Следует отметить, что для стадии ранней ишемии эти изменения обратимы и состояние кардиомиоцита можно рассматривать как результат компенсаторно-приспособительной реакции сердца. Исследование причин, лежащих в основе такой реакции, привело к открытию ряда специфичных для ишемии мембранных механизмов: Na Н -+обмена (Lazdunsky et al., 1985), КдТф канала (Noma, 1983), канала (Kameyama et al., 1984), транспорта лактата из клетки, сопряженного с электронейтральным выходом в межклеточное пространство калия и входом в клетку хлора (Gaspardone et al., 1986). • Изменение балансаэлементов в мышечной клетке сердца суслика (Ciíellus undulatus) при гибернации

Предполагается, что у гибернантов охлаждение тела вызывает увеличение концентрации калия в мышечной клетке сердца (Roland et al., 1986; Willis, 1986). При понижении температуры скорость активного транспорта калия на мембране миоцита сердца суслика относительно более высокая, чем пассивный ток иона из клетки, что объясняется эволюционно-обусловленными специфическими свойствами каналов, регулирующих пассивный транспорт калия в клетке зимоспящего. Данная гипотеза исследуется в эксперименте, результаты которого представлены на рисунке 6. Для измерения внутриклеточной концентрации калия в миоците суслика (Citellus undulatus) использовали электронно-зондовый микроанализ криосреза папиллярной мышцы сердца суслика (Pogorelov et al., 1996). Сравнительные данные по концентрации калия в мышечной клетке сердца гибернанта (активное состояние, зимняя спячка) и крысы (Wistar) представлены на рисунке 6.

160 т

суслик суслик крыса Wistar активный спящий

Рисунок 6. Концентрация калия (мМ) в клетке папиллярной мышцы сердца суслика (активного и спящего) и крысы (Wistar). Представлены средние данные. Уровень значимости, оцененный по критерию Стыодента, между средними значениями в норме и в состоянии гибернации составляет р< 0.03.

Ранее было показано, что концентрации калия в миоците кролика (Warley, 1989) и крысы (Pogorelov et al., 1991) не отличаются по величине. Из диаграммы (рис.6) видно, что ряд животных может быть дополнен сусликом в активном состоянии. Таким образом^для указанных животных соотношение активного и пассивного транспорта калия на мембране мышечной клетки не имеет видового различия. Однако, наблюдается увеличение концентрации калия на 16% (гиперкалиемия) в миоците сердца спящего суслика относительно активного состояния. Известно, что Ыа/К-АТФаза у всех теплокровных ингибируется с одинаковой скоростью при понижении температуры (Honing et al., 1994). При гипотермии пассивный выход калия также замедляется, но с разной скоростью у зимоспящих и обычных животных. У крысы он ингибируется медленнее относительно Ыа/К-АТФазы, что должно вызвать дефицит внутриклеточного калия. У гибернанта наблюдается обратная ситуация - быстрая инактивация пассивного выхода, что объясняет гиперкалиемию в мышечной клетке сердца суслика (рис.6).

При ишемии основным источником для увеличения содержания калия в клетке является внеклеточное пространство, объем которого составляет 7-12% объема клетки, а концентрация в нем калия 2-3 мМ. Поэтому, уровень накопления калия, регистрируемый у суслика в состоянии гибернации (рис.6), соответствует многократному изменению баланса элемента на мембране, что предполагает ее гиперполяризацию. Полученные данные подтверждают гипотезу о накоплении калия в миоците гибернанта при понижении температуры тела. Возможно, этот фактор является одной из причин замедления частоты биения сердца в десятки раз при понижении температуры тела суслика. Сохранение

внутриклеточной концентрации калия на уровне интактного миоцита делает возможным с повышением температуры тела возвращение нормального балланса ионов на мембране сразу в момент восстановления кровотока. По-видимому, гипотермическую регуляцию калия в мышечной клетке гибернанта следует рассматривать как эволюционно- обусловленный механизм адаптации суслика к низким температурам.

Выше обсуждались результаты, полученные на животном в условиях функциональной ищемии и гибернации. Следует отметить, что влияние нейрогуморального контроля и особенности конкретного организма делают затруднительным точное воспроизводство эксперимента и фиксацию состояния мышечной клетки сердца для разных животных. Прежде всего трудно оценить начало и длительность ишемии, ее фазу, быстро и направленно менять условия ишемии. По-видимому, более "регулируемой" моделью с контролируемыми условиями может быть изолированное сердце.

• Изменение элементного состава мышечной клетки изолированного сердца при ишемии, моделируемой в различных условиях перфузии

Нормоксическая перфузия в условиях нормо- и гипотермии Анализ нарушений элементного баланса (К, Ыа, С1) в мышечной клетке изолированного сердца крысы (\Vistar), которые вызывает ишемия, проводится в сравнении с изменениями, вызванными нормоксической перфузией. В качестве контроля используется значение внутриклеточного уровня элементов, полученное для мышечной клетки изолированного сердца сразу после выделения органа из животного (контроль), что является наиболее близким к интактному состоянию миоцита. В данном разделе рассматриваются результаты электронно-зондового микроанализа концентрации элементов в миоците при нормоксической перфузии изолированного сердца, которые сравниваются с данными, полученными для функциональной ишемии (табл. 13).

Таблица. 13. Содержание элементов в миоците папиллярной мышцы сердца крысы (\Vistar) в нормоксических условиях и при функциональной ишемии

ПРОТОКОЛ КОНЦЕНТРАЦИЯ ЭЛЕМЕНТА (мМ) ♦

ЭКСПЕРИМЕНТА Калий Натрий Хлор

Животное (контроль) 122±1.4 36±1.0 24±0.77

Перфузия (60 мин, 38"С) 102±5.0 70±4.0 48±1.0

Перфузия (60 мин, Ю^С) 121±4.0 38±2.0 26±1.0

Животное (ишемия) 83±1.0 62±1.3 66±1.4

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (теалйет), уровень значимости между средними значениями для элемента составляет р<0,03.

Из таблицы 13 видно, что содержание элементов в мышечной клетке изолированного сердца после нормоксической перфузии не соответствует состоянию интактной клетки (контроль) и зависит от температуры перфузии. После нормоксической перфузии регистрировали снижение внутриклеточной концентрации калия и повышение содержания натрия и хлора, свойственные для ишемии. Отмеченные изменения близки, по результату действия на внутриклеточный баланс мышечной клетки, гипертермии, при которой развивается функциональная ишемия. Следует отметить, что смещение баланса

элементов в миоците изолированного сердца при нормоксической перфузии (38^С) не имеет столь выраженной формы, как в условиях ишемии.

Анализ полученных данных позволяет прийти к заключению, что в условиях длительной нормоксической перфузии (38^С) наблюдается изменение внутриклеточного баланса элементов, свойственное для гипоксии. Этот вывод согласуется с результатами других авторов, которые регистрировали выход калия во внеклеточное пространство при нормоксической перфузии (Vermeulen et al.,

1996). Развитие гипоксии на изолированном сердце можно объяснить тем, что доставка кислорода к клетке при перфузии не столь эффективна, как кровотоком in vivo (Jonson, 1980). Действительно, при насыщении перфузирующего раствора концентрация кислорода, растворенного в физиологическом растворе, составляет 0.022 лС>2/л. Эта величина для крови, с учетом кислородной емкости гемоглобина, составляет около 0.22 л02/л (Smidt, Thews, 1983). Возможно, развитие гипоксии при длительной нормоксической перфузии активирует специфичные механизмы и, в результате, изменение элементного состава в миоците, которое регистрируется электронно-зондовым микроанализом (табл. 13). Например, увеличение внутриклеточной концентрации натрия после длительной нормоксической перфузии может быть обусловлено активацией Na+-H+ обмена (Lazdunski et al., 1985), а изменение содержания в клетке калия и хлора -электронейтральным транспортом лактата (Poole, Halestrap, 1993; Wang et al., 1993).

Понижение температуры рассматривается как способ блокады Na/K-АТФазы, вызывающий уменьшение концентрации калия в клетке (Aslanidi et al.,

1997). В нашем эксперименте гипотермию начинали через 5 минут перфузии при 380с, за следующие 2 минуты температуру перфузата на входе в аорту снижали до юОс. При этом частота сокращения сердца уменьшалась со 200-240 уд/мин до 2-3 уд/мин. В отличие от нормотермической перфузии, при длительной гипотермической перфузии концентрация элементов (K,Na,Cl) в мышечной клетке изолированного сердца соответствовала интактному состоянию (табл. 13). На внутриклеточный баланс элементов не влияла и сопутствующая гипотермии гипоксия, вызванная длительной перфузией. Таким образом, быстрое охлаждение сердца при гипотермической перфузии "консервирует" элементный состав мышечной клетки сердца.

Полученный результат на сердце при гипотермической перфузии не согласуется с поведением изолированной клетки, у которой гипоксия и/или гипотермия вызывают потерю внутриклеточного калия (McDonald, Don MacLead, 1972; Honing et al., 1994; Pogorelov et al., 1996; Aslanidi et al., 1997). Данное несоответствие между концентрацией калия в клетке in vivo и in vitro можно объяснить наличием в ткани эндотелия капилляра. Как уже было нами показано, в сердце эндотелиальная клетка выполняет барьерную функцию между миоцитом и просветом капилляра и тем самым регулирует ионный гомеостаз мышечной клетки сердца (Pogorelov et al., 1991). По-видимому, консервирующий эффект гипотермической перфузии на состав элементов (К, Na, Cl) в миоците изолированного сердца является результатом компенсаторно-приспособительной реакции сердца к гипотермии. Связанное с этим падение в 50-60 раз скорости перфузии может отражать как сужение капилляра, наблюдаемое, например, при

функциональной ишемии, так и уменьшение транспорта воды через эндотелий-межклеточное пространство.

Анализ полученных данных позволяет прийти к заключению, что в условиях нормоксической перфузии активируются механизмы, специфичные для гипоксии, что следует учитывать при изучении действия ишемии на элементный баланс мышечной клетки сердца. Оценивая влияние гипотермической перфузии на изолированное сердце, следует еще раз отметить активную роль клеток эндотелия капилляра в регуляции гомеостаза кардиомиоцита.

Полная (глобальная) ишемия

Схема эксперимента для моделирования ишемии на изолированном сердце, используемая в данной работе, была выбрана в соответствии с принятым протоколом (Kleber, 1983; Murphy et al., 1991; VanEchteld et al., 1991; Tosaki et al., 1993). После 5 минут нормоксической перфузии (Зв^С) полностью перекрывался проток раствора через изолированное сердце, что через 2-3 минуты приводило к полной остановке сердца. Рассматривая зависимость изменения внутриклеточного содержания элементов от времени при полной ишемии (рис.7) видно, что уже на 15 мин ишемии значительно уменьшается содержание калия в миоците, затем оно стабилизируется на уровне около 96 мМ. Следует отметить, что уменьшение в клетке концентрации калия от 120 мМ (контроль) до 96 мМ согласуется с 15% понижением содержания элемента в ткани сердца, регистрируемом через 30 минут полной ишемии on mass (Tani, Neely, 1989). Рассмотрим причины, вызывающие дисбаланс элементов в мышечной клетке сердца во времени при ишемии.

—ф—калий —Я—натрий —4—хлор —X—лактат

длительность полной ишемии Рис. 7. Зависимость содержания элементов в мышечной клетке изолированного сердца от длительности полной ишемии. Количество лактата, выведенного из клетки, рассчитывали по изменению баланса калия и хлора

Первые 15 минут полной ишемии

Зависимость изменения внутриклеточного калия со временем (рис.7) соответствует кинетике накопления ионов калия во внеклеточном пространстве

(Kleber, 1984; Wilde et al., 1990; Van de Voorde, 1995; Vanheel, Lindinger, 1995; Vermeulen et al., 1996). Было показано, что в начале ишемии (до 15 мин) вклад АТФ-зависимых калиевых каналов (КдхФ канал) в регуляцию выхода калия из клетки незначителен (Wilde et al., 1990; Vanheel, DeHemptinne, 1992). Наличие калиевого тока при ингибировании Кдуф канала глибенкламидом позволило предположить участие других механизмов в формировании калиевого баланса в миоците на начальной фазе ишемии (Kleber, 1984). В ряду таких механизмов выделяют натрий-зависимый калиевый канал (K[\ja канал) (Kameyama et al., 1984) и лактат- сопряженный транспорт калия из клетки (Poole, Halestrap, 1993; Wang et al., 1993). Полученные нами результаты указывают на значительное накопление натрия в цитоплазме миоцита в первые 15 минут полной ишемии, что соответствует накоплению элемента в ткани сердца (Murphy et al., 1991; VanEchteld et al., 1991; VanEmous et al., 1997). Этот эффект объясняется

усилением Na.+-HQ+ обмена в результате интенсивного анаэробного гликолиза (Lazdunski et al., 1985) или/и входящим током натрия через натриевый канал (VanEmous et al., 1997). В результате, увеличение концентрации натрия в миоците активирует Kf\ja канал (Luk, Carmeliet, 1990), чем и обусловлено резкое снижение внутриклеточного [К] в начале ишемии (рис. 7).

Период 15мин-30 мин полной ишемии

Установлено, что увеличение концентрации натрия в клетке и накопление калия во внеклеточном пространстве стимулируют Na/K-АТФазу (Piwnica-Worms et al., 1986; Mogul et al., 1990). Этим можно объяснить стабилизацию уровня внутриклеточного [К] и уменьшение концентрации натрия в миоците после 15 минут ишемии (рис.7). В начале 70-х годов такая ситуация была описана как "электрогенный натриевый насос" (McDonald, MacLeod, 1971; 1972} в основе феномена лежит электромеханическое разобщение функции сердца (Ruigrok et al., 1987). В первые минуты ишемии концентрация АТФ и креатинфосфата в миоците уменьшается до 80% нормального уровня. Падение внутриклеточного содержания макроэргов приводит к прекращению сократительной функции миоцита, но при этом значительно увеличивается энергетическое обеспечение Ыа/К-АТФазы (электромеханическому разобщению). Другими словами после первого этапа ишемии (15 мин) миоцит переходит в состояние характерное для одиночной клетки, когда сохраняется только эволюционно более древняя функция мембранного потенциала.

Заключительной период полной ишемии

В отсутствие перфузии определяющим фактором клеточного гомеостаза является быстрое накопление калия и метаболитов во внеклеточном пространстве и ионов Na+ и Cl" в клетке, чему способствует лактат-зависимое ингибирование гликолиза (Vanheel, VandeVoorde, 1994; Cross et al., 1995). Время установления равновесия электролитов на мембране зависит от объема пространства вне клетки. Учитывая, что межклеточное пространство составляет около 12% объема миоцита; можно предположить, что это произойдет достаточно быстро. Полученные данные (рис.7) подтверждают наличие равновесного состояния на мембране миоцита сердца после 30 минут ишемии. На это указывает постоянный уровень в клетке калия, натрия и хлора.

По-видимому, на этапе после 30 минут ишемии в формирование состояния миоцита вносит свой вклад и активация Кдтф канала (Noma, 1983). Следует отметить, что даже при нормоксических условиях стимуляция Na/K-АТФазы может приводить к открытию Кдхф канала, предполагается, что за счет падения локального уровня АТФ у мембраны (Hurst et al., 1993). Поэтому, усиление активного транспорта после 15 минут ишемии должно открыть Кдхф канал. Это предположение становится еще более обоснованным, если учесть, что при ишемии в клетке создаются условия, стимулирующие Кдхф канал (падение уровня АТФ, повышение концентрации Н+, лактата, неорганического фосфата, АДФ). Таким образом, равновесие калия на мембране миоцита при ишемии является динамическим процессом, в котором результат активации Na/K-АТФазы может маскироваться открытием Кдхф канала.

Описанная динамика изменений внутриклеточного баланса элементов соответствует кинетике накопления лактата и неорганического фосфата как в изолированном кардиомиоците (Geisbuhler et al., 1984; Piper et al., 1984), так и в ткани сердца (Reimer et al., 1983). Следует отметить, что увеличение концентрации метаболитов в клетке и во внеклеточном пространстве является одним из условий опосредованной регуляции баланса ионов в миоците (Allen, Orchard, 1987; Cuevas et al., 1991; Cross et al., 1995; Vanheel, VanDeVoorde, 1995). Например, активация Кдхф канала наблюдается при гораздо более высоких концентрациях АТФ, чем в нормоксических условиях.

Анализируя изменения внутриклеточной концентрации ионов калия, натрия и хлора, можно сделать заключение, что на стадии ранней ишемии активируется ряд специфичных мембранных механизмов. Их чередование во времени можно представить последовательностью событий, представленных на схеме I. Выраженность и длительность каждого периода в разных схемах эксперимента зависят от скорости анаэробного гликолиза, генерирующего не только АТФ, но также Н+ и метаболиты (Kakei et al., 1986; Keung, Li, 1991; Cuevas et al., 1991; Dart, Standen, 1993; Dart, Standen, 1995), и определяются эффективностью активации мембранных механизмов при ишемии (Cameron et al, 1988; Ferrero et al., 1996). Ишемия приводит к исчезновению градиента электролитов на мембране кардиомиоцита. Установление равновесия калия, натрия, хлора, протонов и лактата между вне- и внутриклеточным пространством является динамическим процессом, в который последовательно вовлекаются различные мембранные механизмы. К таким механизмам, специфичным для

ишемических условий, можно отнести электро-механическое разобщение, NaQ -

Н.+обмен, К,. канал, К. канал. Все изменения в мышечной клетке сердца при i Na А1Ф

ишемии происходят на фоне электронейтрального транспорта лактата, сопряженного с разнонаправленным переносом аниона (С1") в клетку и однонаправленым выходом катиона (К+, Н+) из клетки.

Регуляцию элементного баланса в кардиомиоците при ишемии следует рассматривать как приспособитедьно-компенсаторную реакцию мышечной клетки на нарастающую гипоксию. Установление равновесия электролитов на мембране кардиомиоцита в результате длительной ишемии . не означает

критического нарушения внутриклеточного элементного состава. Величина и скорость изменения концентрации элементов в клетке обусловлены емкостью

внеклеточного пространства, уровнем активного транспорта на мембране эндотелиальной клетки и скоростью диффузии электролитов через эндотелий в просвет капилляра. Ишемическое изменение ткани сердца во многом зависит от состояния эндотелия капилляра. Известно, что вазоактивные соединения значительно меняют состояние сердечной мышцы (Furchgott, Zawadzki, 1980; Luscher, Tanner, 1993). В ряду воздействий, определяющих проводимость коронарного эндотелия, интенсивно изучается секреция эндотелина (Garjani et al., 1995; Ercan et al., 1996; Toth et al., 1998) и активация NO-синтетазы (Smith et al., 1992).

Схема I. Последовательность активации специфичных мембранных механизмов при полной ишемии

Аноксическая перфузия сердца солевым составом без глюкозы

Основной причиной активации мембранных механизмов, специфичных для полной ишемии (схема I), является гипоксия быстро переходящая в аноксию. В отсутствии перфузии состояние мышечной клетки сердца обусловлено скоростью установления равновесия электролитов на мембране, что определяется буферным объемом внеклеточного пространства. По сравнению с полной ишемией, аноксическая перфузия солевым раствором без глюкозы позволяет регулировать параметры внеклеточного объема, т.е. обеспечивает поддержание вне клетки баланса электролитов, рН и "вымывает" метаболиты из межклеточного пространства. На рисунке 8 представлены кривые изменения концентрации ион ов в мышечной клетке изолированного сердца при аноксической перфузии

аноксическая перфузия (38Q

Рис. 8. Зависимость содержания элементов (К, Na, С1) в мышечной клетке изолированного сердца от длительности аноксической перфузии (<3% 02) солевым раствором без глюкозы. Количество лактата, выведенного из клетки, рассчитывали по изменению баланса калия и хлора

Рассмотрение результатов, полученных для аноксической перфузии (рис.8) показывает, что в данной схеме эксперимента реализуется совершенно другая ситуация, чем при полной ишемии. Видно, что в течение всего эксперимента внутриклеточная концентрация калия уменьшается. Данный факт можно интерпретировать как результат снижения активности Ыа/К-АТФазы. При этом можно было ожидать увеличение содержания натрия в миоците, чему

способствует также активация Na -Н . обмена при гипоксическом ацидозе.

Однако, при аноксической перфузии содержание натрия в цитоплазме начинает увеличиваться только к 45 минуте. До этого накопления натрия в миоците не наблюдается, что согласуется с наблюдением других авторов (Poole-Wilson, Tones, 1988). Более того, концентрация элемента близка к его уровню в интактной клетке (36 мМ), что значительно меньше величины, регистрируемой при полной ишемии (70 мМ).

Наличие нормальной концентрации натрия в мышечной клетке на фоне интенсивного гипоксического Na -H . обмена позволяет нам предположить активацию Na/K-АТФазы в условиях аноксичекой перфузии. Для этого есть несколько причин: увеличение концентрации протонов и натрия в цитозоле, падение градиента калия на мембране клетки (Thomas, 1984; Piwnica-Worms et al., 1986; Bielen et al., 1990; Luk, Carmelit, 1990; Mogul et al., 1990; Carmeliet, 1992; Everts, Clausen, 1994). Наблюдаемое нами уменьшение внутриклеточного калия (рис.8) при усилении Na/K-АТФазы объясняется ишемическим выходом калия из клетки как через Кдхф канал, так и с лактатом при его транспорте в капилляр. В процессе аноксической перфузии равновесие электролитов на мембране не устанавливается, так как мешает "вымывание" калия и метаболитов из межклеточного пространства. По-видимому, электронейтральная диффузия лактата связана с выходом калия из миоцита и происходит без входа в клетку хлора, что подтверждается снижением концентрации ионов Cl" (рис. 8). Начало резкого роста внутриклеточного хлора после 45 минут ишемической перфузии совпадает с увеличением объема выведенного лактата и, по-видимому, связано с игибированием Na/K-АТФазы на последнем этапе перфузии.

Следует подчеркнуть, что в нормоксических условиях Кдхф канал активируется при падении концентрации АТФ в клетке ниже 1 мМ (Cameron et al., 1988). Такое низкие содержание АТФ не регистрируется даже при самой глубокой ишемии (Geisbuhler et al., 1984; Piper et al., 1984; Reimer et al., 1983; Cross et al, 1994). Однако, канал модифицируется при увеличении в цитоплазме концентрации протонов (Cuevas et al., 1991), АДФ (Kakei et al., 1986) и лактата (Keung, Li, 1991), что характерно для ишемии. Таким образом, изменение условий сопровождается открытием Кдхф каналятри средней внутриклеточной концентрации АТФ в несколько раз выше той, при которой канал мог бы активироваться в нормоксических условиях (Vanheel, Van de Voorde, 1995).

Рядом авторов обсуждался механизм более тонкой регуляции мембранного транспорта через локальное изменение концентрации АТФ, метаболитов и ионов в примембранной области (Isenberg, Wendt-Gallitelli, 1990; Luk, Carmeliet, 1990; Guth et al., 1993; Hurst et al., 1993; Everts, Clausen, 1994; Lindinger, 1995; Pribe et al., 1996). В последней работе, на основе результатов эксперимента со строфантидином, высказывалась гипотеза о том, что даже при нормоксических условиях активация Na/K-АТФазы истощает примембранный запас АТФ и открывает Кдхф канал. Данное предположение закономерно, если учесть что основным источником АТФ для обеспечения электрической активности является гликолиз, локализованный в примембранной области цитоплазмы (Weiss, Lamp, 1987; Carmelit, 1992; Everts, Clausen, 1994; Dizon et ai., 1998). Полученные нами результаты и приведенные выше доводы позволяют прийти к заключению о возможности одновременного действия Ыа/К-АТФазы и Кдхф канала при ишемии. Сопряжение активного (Na/K-АТФаза) и пассивного (Кдхф канал) транспорта калия через изменение уровня АТФ в примембранном пространстве может выполнять роль регулятора содержания ионов К+ в миоците при аноксической перфузии. Мы полагаем, что активация Кдхф канала при одновременной работе

Ыа/К-АТФазы является одним из компонентов предложенного нами механизма регуляции ионного состава мышечной клетки при ишемии (схема I). При аноксической перфузии это сопряжение сопровождается более выраженным дисбалансом калия в миоците(чем при полной ишемии, так как ионы К+, вышедшие из клетки, не накапливаются в интерстиции (как при полной ишемии), но "вымываются" в процессе перфузии. Анализ полученных результатов для мышечной клетки изолированного сердца при нормоксической перфузии, полной ишемии и перфузии без глюкозы в аноксических условиях показывает, что наряду с активацией мембранных механизмов, специфичных для ранней ишемии, наблюдается усиление Ыа/К-ФТФазы (схема II).

Схема II. Комплекс мембранных механизмов, активируемых в мышечной клетке сердца на стадии ранней ишемии

+ . + Обозначения: К - АТФ зависисмый калиевый канал; Ь -К - сопряженный

атф г

электронейтральный транспорт лактата и калия из клекти; Ь -С1 - сопряженный

+ +

электронейтральный антипорт лактата и хлора; Н -Ыа - обмен клеточного протона на +

внеклеточный натрий; К - натрий зависимый калиевый канал

Аноксическая перфузия сердца солевым составом со строфантидином -механизм "опосредованного действия"

Роль активного транспорта при ишемии проверяли в эксперименте со строфантидином - сердечным гликозидом, который используется в лабораторных исследованиях для ингибирования Na/K-АТФазы изолированной клетки (Balazs, 1981; Kleber 1983; Piwnica-Worms et al„ 1986; Bahinski et al., 1988; Pribe et al., 1990). В результате подавления активного транспорта можно было ожидать более выраженное, по сравнению с ишемией, уменьшение концентрации калия и накопление натрия в цитоплазме мышечной клетки. Однако, как показано нами, действие строфантидина, вопреки предположению об ингибировании им активного транспорта, не привело к падению калия и накоплению натрия в мышечной клетке относительно аноксической перфузии без препарата. Получен обратный эффект, который заключается в значительном увеличении внутриклеточного уровня калия и уменьшении натрия под действием строфантидина на фоне аноксической перфузии (рис.9).

а; s

го о. ь

X ф

IT X

о

140т 120 100806040 20 +

■катни

■натрии

-+-

0 мин • 15 мин 30 мин 45 мин 60 мин ишемическая перфузия(38С)

Рис. 9. Изменение содержания натрия и калия в миоците под действием строфантидина (0.1 мМ) при аноксической перфузии сердца. Индекс "С" указывает момент начала действия препарата. Стрелка отмечает концентрацию элементов в клетке в конце перфузии со строфантидином. Изменения концентрации калия под действием препарата значимы. Уровень значимости составляет р<0.03. Для натрия значимо только изменение в период 45 мин и 60 мин

Видно (рис.9), что относительно короткое действие гликозида (10 мин) устраняет ишемические изменения баланса элементов в миоците. В результате

аноксической перфузии соггрофантидином в клетке наблюдается компенсация дефицита калия и нормализация содержания натрия. При этом внутриклеточная концентрация элементов (К, Ыа) стремится к уровню интактной клетки, что особенно заметно на заключительном этапе аноксической перфузии (рис.9). Наблюдаемую тенденцию изменения элементов в цитоплазме миоцита сердца под действием строфантидина можно охарактеризовать как восстановление состояния мышечной клетки в условиях ишемии. Другими словами, малые дозы препарата, вопреки ожиданиям, оказывают стимулирующие действие на функцию сердца, что согласуется с клинической практикой.

Чем можно объяснить не-специфическое действие строфантидина на кардиомиоцит при аноксической перфузии? При анализе механизма функциональной ишемии для животного (табл.12) и полной ишемии для изолированного сердца (рис.7) приводились данные об участии эндотелия капилляра в регуляции гомеостаза миоцита. Ишемическое повышение уровня ионов К+ в межклеточном пространстве вызывает активацию Ыа/К-АТФазы эндотелиальной клетки и накопление калия в эндотелиоците. По-видимому, при кратковременной перфузии сердца раствором строфантидина малой концентрации мишенью действия препарата в первую очередь становится пространственно более доступная Ыа/К-АТФаза эндотелиальной клетки капилляра. В результате подавления активного транспорта эндотелий теряет функцию "регулятора" баланса калия в интерстиции, перестает транспортировать калий из межклеточного пространства в просвет капилляра и становится только морфологическим барьером для диффузии. В такой ситуации, при наличие активной Ыа/К-АТФазы на мембране миоцита и пассивного переноса веществ между межклеточным пространством и капилляром, возможно кратковременное восстановление баланса калия и натрия в мышечной клетке сердца. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение о наличии механизма опосредованного действия малых доз сердечного гликозида на состояние миоцита через подавление Ыа/К-АТФазы только на мембране эндотелиальной клетки. По-видимому, для получения прямого эффекта строфантидина в эксперименте с перфузией изолированного сердца следует брать концентрацию препарата выше той, которая используется при работе с культурой клеток (0.1 мМ), или/и увеличивать время действия препарата.

Аноксическои перфузия сердца солевым составом без глюкозы при

гипотермии или калиевой блокаде

В предыдущем разделе обсуждался механизм "опосредованного" действия блокады Ыа/К-АТФазы эндотелиальной клетки капилляра на состояние миоцита сердца в условиях ишемии. В основе этого механизма лежит кратковременное ингибирование активного транспорта калия из внеклеточного пространства миоцита в просвет капилляра при интактной Ка/К-АТФазе на мембране мышечной клетки. В данном разделе обсуждается эффект длительного действия подавления активного транспорта калия и натрия на баланс элементов в миоците при ишемии посредством ингибирования Ыа/К-АТФазы гипотермической (100с) перфузией или перфузией раствором без калия (калиевая блокада). Для сравнения рассматриваются данные по внутриклеточной концентрации калия и натрия после обычной ишемической перфузии (без ингибирования Ка/К-АТФазы) длительностью 15 мин и 45 мин, что по времени

соответствует моменту начала и окончания действия блокады Na/K-АТФазы (рис.10).

Шкали-и Пнаприи,

без калия 30 мин

15мин 45мин 45мин 45мин

длитлъноспъ аноксической перфузии

Рис. 10. Содержание калия и натрия в мышечной клетке сердца после аноксической перфузии (38°С) разной длительности (15 мин и 45 мин) и после аноксической перфузии на фоне ингибирования Иа/К-АТФазы (последние 30 мин) в условиях гипотермии (10°С) или перфузии раствором без калия. Средние значения для перфузии 15 мин и 45 мин при гипотермии (10°С) значимо не отличаются. Для остальных величин уровень значимости по элементам составляет р<0.03.

Видно (рис. 10), что длительная аноксическая перфузия в условиях гипотермии (10°С) не вызывает изменение содержания элементов в мышечной клетке по сравнению с их начальным уровнем (38°С, 15 мин). Данный эксперимент подтвердил факт фиксации внутриклеточного элементного состава гипотермией, что было показано нами ранее на изолированном сердце при нормоксической перфузии (табл.14), и соответствует данным других авторов (Ely, Berne, 1992). Возможно, действие низких температур на миоцит в изолированном сердце осуществляется опосредованно через механизм, который ранее обсуждался для малых доз строфантидина. В его основе лежит подавление Na/K-АТФазы на мембране эндотелиалыюй клетки капилляра и прекращение активного транспорта калия из внеклеточного пространства миоцита в просвет капилляра.

Блокада активного транспорта при аноксической перфузии сердца (30 мин) раствором без калия по своему действию является промежуточной между гипотермией (10°С) и длительной ишемией (38°С, 45 мин). Как и в случае действия малых доз строфантидина и гипотермии, этот результат можно объяснить механизмом "опосредованного действия" через ингибирование Na/K-АТФазы на мембране эндотелиальной клетки при калиевой блокаде. Барьерный эффект эндотелия для диффузии калия зависит от градиента иона между интерстицием и

просветом капилляра и температуры , Поэтому, в случае без калиевой перфузии (38°С, 45 мин) скорость пассивногоперераспределения калия в просвет капилляра должна быть выше, чем при гипотермической перфузии нормальным по солевому составу раствором. Однако, диффузионный поток калия при аноксической перфузии с калиевой блокадой меньше чем при аноксической перфузии с активной Na/K-АТФэзой на мембране эндотелиальной клетки (рис.10). Другими словами, в зависимости от условий аноксической перфузии, внеклеточный калий перераспределяется в капилляр посредством диффузии или асимметричного активного транспорта через эндотелиальную клетку. Наличие пассивного транспорта калия из интерстиция в просвет капилляра дополняет предложенную нами модель взаимодействия специфичных механизмов регуляции элементного баланса в мышечной клетке сердца при ишемии (схема I).

Полная ишемия с последующей нормоксической реперфузией

Наши наблюдения показывают, что кратковременная (5 мин) реперфузия всегда приводила к восстановлению сокращения изолированного сердца, которое прекращалось в начале полной ишемии (1-2 мин). Это указывает на то, что при полной ишемии длительностью до 60 минут не наступает необратимая потеря сократительной функции, которая связана с повышением концентрации кальция в цитозоле (Allen, Orchard, 1987; Silverman, Stern, 1994; Pierce, Czubryt, 1995). В то же время, сравнительный анализ концентрации элементов (К, Na, С1) в мышечной клетке свидетельствует, что реперфузия оказывает разное действие на миоцит в зависимости от длительности предшествующей ей полной ишемии (рис. 11). По-видимому, состояние мышечной клетки сердца после ишемии/реперфузии обусловлено совокупностью специфичных мембранных механизмов, которые активируются в ишемических условиях к моменту начала реперфузии.

Реперфузия в начале полной ишемии (15 мин) - preconditioning

Видно (рис.11), что реперфузия, восстанавливая сократительную функцию сердца, не меняет внутриклеточный состав элементов^ характерный для начального этапа ишемии. В данный момент состояние мышечной клетки после реперфузии соответствует эффекту, описанному как "preconditioning" (Zellner et al., 1996). Это явление возникает после кратковременной ишемии /реперфузии и способствует лучшей адаптации ткани к последующей длительной ишемии.

I калий □ натрий Вхлор

КМ)

15 ЛЯП! ЗОмш! бОмнн

длительность поплюй ишемии без реперфузии

120

15мш + 5м101 30мш+5м1ш 60 мин+ 5 мин

диггелыюсгь полной ишемии с рсперфузисй (5 ляп!.)

Рис. 11. Сравнительные данные изменения содержания элементов в миоците изолированного сердца при полной ишемии/реперфузии. Концентрация элементов после ишемии различной длительности (верхний рисунок) и последующей нормоксической (5 мин) реперфузии.

Для начала ишемии характерно усиление гликолиза. Исходя из рассматриваемой нами гипотезы последовательных изменений элементного баланса миоцита в ишемических условиях (схема I), это является причиной активации -Н. обмена и К^ канала, накопления калия и лактата в межклеточном пространстве и, возможно, усиления Ыа/К-АТФазы на мембране эндотелиальной клетки. На начальном этапе ишемии еще не установилось равновесие электролитов на мембране миоцита, так как буферный объем эндотелия и капилляра еще достаточен для обеспечения оттока метаболитов и калия из межклеточного пространства. Кратковременная реперфузия, восстанавливая внешний гомеостаз и нормоксические условия в примембранной области клетки, останавливает ишемическое перераспределение ионов между

миоцитом и капилляром. В таких условиях не следует исключать фактор перераспределения калия&утри клетки и его накопления во внутриклеточных органеллах. По-видимому, ключевым моментом "preconditioning" может быть аккумуляция калия в митохондриях при активации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала (Mironova et al., 1996; 1997).

Реперфузия после 30 минут полной ишемии

Реперфузия изолированного сердца после полной ишемии длительностью 30 минут характеризуется значительным накоплением натрия в цитоплазме миоцита (рис.11). Эффект увеличения внутриклеточной концентрации натрия при восстановлении перфузии наблюдается во многих работах и его выраженность зависит от схемы эксперимента. Следует отметить, что причины быстрого увеличения натрия

в цитоплазме при реперфузии не совсем понятны. Данное явление интенсивно изучается прежде всего из-за его ключевой роли в развитии необратимых повреждений функции кардиомиоцита. Ингибирование входа натрия в клетку рассматривается как перспективный способ коррекции ишемии (Murphy et al., 1991; Scholtz et al., 1992; Fliegel, Fruhlih, 1993; Karmazyn et al., 1993; Pike et al., 1993).

С позиции рассматриваемого нами компенсаторно-приспособительного механизма (схема I), изменение реакции миоцита на реперфузию после 30 минут полной ишемии сердца обусловлено изменением условий, по сравнению с начальной фазой ишемии (15 мин). Прежде всего следует отметить активацию Na/K-АТФазы и наличие градиентопротонов (гипоксический ацидоз) на мембране кардиомиоцита. Реперфузия ускоряет удаление метаболитов из межклеточного

пространства и, как результат, активирует Na^ -II. обмен (накопление натрия), K>ja канал (уменьшение концентрации калия) и разнонаправленный транспорт лактата и хлора (увеличение хлора). Ситуация, регистрируемая при реперфузии сердца после 30 минут ишемии, наиболее критична для нарушения функции сердца, так как инициирует перегрузку миоцита кальцием через активацию Na. -CaQ обмена (VanEchteld et al., 1991). По-видимому, описанная последовательность событий лежит и в основе кальциевого парадокса, когда реперфузия следующая за ишемической перфузией без натрия вызывает кальциевую перегрузку мышечной клетки (Ganóte, Nayler, 1985).

Реперфузия после 60 минут полной ишемии

Из данных на рисунке 11 видно, что после длительной ишемии кратковременная реперфузия восстанавливает баланс элементов (К, Na, С1) до уровня, соответствующего нормоксической перфузии. Это указывает на сохранение Ыа/К-АТФазы при ишемических условиях (60 мин). Данные, полученные для реперфузии на заключительной фазе ишемии, отражают реакцию мышечной клетки, которая определяется наличием мембранных механизмов, специфичных для рассматриваемого периода полной ишемии (схема I). В данный период ситуация характеризуется установлением равновесия электролитов и лактата между всеми компартментами ткани сердца (миоцит, межклеточное пространство, эндотелиальная клетка, просвет капилляра), лактатным ингибированием гликолиза и Na/K-АТФазы, активацией К. тл канала. По-

видимому, реперфузия, в отсутствие Ыа обмена и активного транспорта, посредством диффузии восстанавливает физиологический уровень лактата во всей ткани и калия в межклеточном пространстве, после чего активируются механизмы, характерные для нормоксических условий.

Опыт работы с изолированным сердцем показывает, что минимальное время интервала (шага), при котором достоверно можно фиксировать изменения в клетке, связанные с фазами ишемии или с длительностью перфузии, ограничено периодом 10-15 мин. Для отслеживания более тонкой динамики, по видимому, более адекватной моделью может быть мышечная клетка в первичной культуре ткани сердца.

• Связь морфологии и элементного состава кардиомиоцита в первичной культуре ткани сердца

Электронно-зондовый микроанализ изолированного кардиомиоцита проводили на препарате первичной культуры сердца крысы (\Vistar), выделенной в лаборатории Ю.М.Кокоза (ИТЭБ РАН, г.Пущино). В таблице 14 представлены сравнительные данные микроанализа суспензии кардиомиоцитов.

Таблица 14. Содержание элементов в кардиомиоците первичной культуры ткани через 4 часа инкубации в нормоксических условиях и в клетке папиллярной мышцы сердца *

ОБРАЗЕЦ КОНЦЕНТРАЦИЯ количество

срез суспензии культуры или ЭЛЕМЕНТА (мМ) клеток

папиллярной мышцы КАЛИИ НАТРИИ %

Культура кардиомиоцитов 116±2.8 30+2.4 22%

крысы (клетки типа I)

Культура кардиомиоцитов 76±1.4 50±3.7 25%

крысы (клетки типа II)

Культура кардиомиоцитов 50+1.1 97+4.5 53%

крысы (округлые клетки)

Папиллярная мышца сердца 129±1.5 35±1.0

крысы (контроль)

Папиллярная мышца сердца 8710.86 65±1.3 ■

крысы (ишемия)

Культура миоцитов 128 40

сердца кролика* *

* — данные представлены как среднее и среднеквадратичная ошибка среднего (теап±$ет), уровень значимости между средними значениями для элемента составляет р<0,03. ** — данные взяты из литературы (\Varley.l989)

Из таблицы видно, что первичная культура сердца неоднородна по форме и размеру клетки, а также внутриклеточному содержанию калия и натрия. Гетерогенность культуры по форме миоцита согласуется с наблюдениями других авторов (Kameyama, 1983; Cheung et al., 1984; Geisbuhler et al., 1984; Piper et al., 1984). В перечисленных работах клетка прямоугольной формы характеризуется как близкая к состоянию кардиомиоцита in vivo. Наши данные показывают, что прямоугольные клетки составляют около 60% культуры. По внутриклеточной

концентрации элементов (К, Na) прямоугольные клетки можно разделить на две группы (табл. 14). Следует отметить, что только для миоцита типа I внутриклеточная концентрация калия и натрия соответствует интактному состоянию клетки. Кардиомиоцит типа II сохраняет прямоугольную форму, но по значению внутриклеточного [К] и [Na] ближе к округлой клетке культуры и мышечной клетке сердца при ишемии.

В таблице 14 вместе с нашими результатами приведены для сравнения данные электронно-зондового микроанализа кардиомиоцита в культуре сердца кролика, полученные другими авторами (Warley, 1989). В указанной работе не отмечается наличие кардиомиоцитов типа II, что

может отражать видовые различия между крысой и кроликом. Более вероятно, однако, отнести это к несовпадению условий эксперимента. Например, инкубация культуры кардиомиоцитов сердца кролика длилась 1 час, тогда как в нашем эксперименте миоциты инкубировались в течение 4 часов. Большое влияние на результаты анализа клеток в культуре может оказывать и различие в инкубационных средах, используемых в разных лабораториях.

Зафиксированные различия между кардиомиоцитами в содержании элементов (табл.14) отражают степень повреждения мембраны клетки, которое происходит при ферментативной и механической дезинтеграции ткани во время получения культуры. Следует отметить, что вклад в нарушение морфологии и функции клетки вносит не только процедура выделения кардиомиоцтов, но и гипоксия, которая развивается при инкубации культуры (Piper et al., 1984; Reimer et al., 1985). Возможно, при культивировании, последующем за выделением кардиомиоцитов, идет процесс восстановления функции части клеток. Предпосылкой к этому является механизм "healing over" - залечивания миоцита при повреждении его клеточной мембраны (De Mello, 1977). Предполагается, что в основе механизма healing over лежат белково-ионные взаимодействия в области повреждения мембраны, в которых участвует экзогенный кальций. При этом образуется примембранный цитоплазматический барьер, который предотвращает проникновение внеклеточной среды в клетку и утечку калия из кардиомиоцита. Поэтому, процесс "healing over" должен сопровождаться локальным накоплением у мембраны клетки кальция и уменьшением внутриклеточного калия. Выраженность изменения концентрации калия и локализации кальция зависит от степени нарушения клеточной мембраны. Примером полного механического разрушения сердечной клетки может быть область обреза ткани сердца, которая возникает при препаровке папиллярной мышцы. Действительно, в области повреждения ткани наблюдается значительное уменьшение содержания калия до 60 мМ и накопление кальция до 10 мМ.

В электронном микроскопе на срезе суспензии лиофилизированных кардиомиоцитов в округлой клетке видны темные примембранные структуры. Учитывая, что препарат не был контрастирован тяжелыми металлами, их высокая электронная плотность скорее всего обусловлена наличием кальция - элемента с относительно высоким атомным номером (Oschman, Wall, 1972). Локальное накопление кальция у мембраны кардиомиоцита подтверждается электронно-зондовым микроанализом. В электронно-плотных участках интенсивность характеристического излучения кальция в несколько раз выше, чем в остальной цитоплазме и оценивается нами величиной до 6 мМ. По-видимому, обнаруженные

кальциевые структуры указывают на наличие эффекта "healing over" в местах повреждения мембраны, которые образуются при распаде клеточных ансамблей в первичной культуре кардиомиоцитов.

При инкубировании, в течение какого то времени у части прямоугольных клеток (тип I) поврежденный участок мембраны "залечивается", что позволяет сохранить внутриклеточный баланс калия и натрия близкий к интактному. Изменение формы кардиомиоцита на округлую свидетельствует о необратимом повреждении мембраны кардиомиоцита. Прямоугольные кардиомиоциты большего размера,

которым присуща ступенчатая форма (тип I), следует рассматривать как клеточные ансамбли, которые при инкубировании распадаются на отдельные клетки. О такой возможности свидетельствует наличие в культуре двух типов прямоугольных кардиомиоцитов с разным поперечным размером (табл.14) и присутствие ветвящихся клеток (Freiherr, 1986). Таким образом, прямоугольные кардиомиоциты типа II находятся в промежуточном состоянии между интактными клетками (тип I) и трансформированными в округлую форму.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о неоднородности культуры кардиомиоцитов, что обусловлено различной степенью повреждения клеточной мембраны в процессе получения культуры и распада клеточных ансамблей при культивировании. Способность кардиомиоцита к восстановлению функции связана с механизмом залечивания мембраны клетки, который характеризуется образованием локальных примембранных структур с высоким содержанием в них кальция. Гетерогенность первичной культуры ткани сердца и, возможно, несоответствие элементного состава клетки в культуре ее интактному состоянию вносят неопределенность при исследовании действия ишемии на ионный баланс кардиомиоцита. Длительный и неконтролируемый гипоксический фон, на котором происходит выделение и инкубация кардиомиоцитов, также является трудноучитываемым артефактом при оценке действия ишемических условий на кардиомиоцит. Поэтому, более адекватной моделью, которая позволяет более четко контролировать параметры ишемии в условиях, приближенных к интактным, пока является изолированное сердце животного.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение ишемических изменений в динамике мембранного потенциала клетки ((McDonald, MacLeod, 1972) дало основание для заключения о выходе калия из кардиомиоцита. Поскольку поток выходящего из клетки калия был существенно выше, чем вход в нее натрия, было введено понятие "электрогенного натриевого" насоса, которое предполагало наличие других способов активного транспорта натрия из клетки помимо Na/K-АТФазы. С этого момента становится ясно, что при ишемии клетка переходит в функциональное состояние, при котором возможна активация мембранных механизмов, не свойственных для нормальных условий. В начале 80-х годов в экспериментах на изолированном сердце с изотопом 42«; (Shine, 1981) и на препарате папиллярной мышцы сердца с помощью калий селективных электродов (Kleber, 1983) было подтверждено, что ишемические изменения характеризуются выходом калия из ткани сердца в кровоток. К механизмам, реализующимся при ишемии, можно отнести активацию

АТФ зависимого (Кдуф) и натрий зависимого (К^) калиевых каналов, обмен

клеточного протона на внеклеточный натрий, электронейтральный симпорт лактата и калия из клетки и антипорт лактата и хлора. О существовании этих механизмов стало известно к середине 80-х годов.

В 90-х годах общепринятой становится гипотеза о последовательном изменении внутриклеточного элементного баланса при действии ишемии на мышечную клетку (Pierce, Czubryt, 1995). Согласно гипотезе ишемические нарушения функции миоцита развиваются на фоне изменения внутриклеточной концентрации элементов. Эти изменения начинаются с выхода калия из цитоплазмы в межклеточное пространство. Образование калиевого дефицита сопровождается накоплением в мышечной клетке натрия, что является началом необратимых изменений. Дефицит калия и аккумуляции в ткани сердца натрия при ишемии зарегистрированы методом атомно-абсорбционного анализа и ЯМР-спектроскопии, что косвенно свидетельствует о наличии внутриклеточных изменений концентрации калия и натрия.

Рассматриваемая гипотеза базируется на известных мембранных механизмах и весьма схематично описывает динамику ищемических нарушений в клетке без детальной картины того, что происходит в сложном клеточном синцитии, включающем кардиомиоцит и, тесно взаимодействующую с ним, эндотелиальную клетку капилляра. Отсутствие полной картины перестройки внутриклеточного ионного баланса при ишемии отражает ограниченность экспериментальных подходов и данных, полученных либо на препаратах ткани on mass, либо на уровне мембраны изолированной клетки. Другими словами, существовал пробел в знаниях о параметрах миоцита в ткани и роли его окружения в приспособительной реакции сердца к ишемическим условиям. Отсутствие данных на клеточном уровне обусловлено отсутствием адекватных методов анализа отдельной клетки in situ. Именно поэтому выпадал из рассмотрения ряд важных проблем фундаментальной и клинической кардиологии, требующий конкретных знаний об этапах ишемического изменения ионного гомеостаза мышечной клетки in vivo, в частности, о периоде, после которого развивается кальциевый парадокс, о механизме действия тройного раствора (глюкоза, инсулин, калий) и кардиоплегии, о состоянии "preconditioning", гибернации и гипотермии.

Для преодоления существующего пробела нами была разработана технология электронно-зондового микроанализа (ЕРМА) применительно к области исследования действия ишемии на гомеостаз кардиомиоцита in situ. Данная технология позволяет измерять концентрацию элементов в мышечной клетке сердца на биологических моделях разного уровня организации: целостном организме, изолированном сердце и первичной культуре клеток ткани сердца (Pogorelov, Allachverdov, 1984; Pogorelov, 1987; Pogorelov et al., 1991; Pogorelov et al., 1993; Pogorelov et al., 1994; Pogorelov et al., 1996; Pogorelov et al., 1998; Pogorelov et al., 1999; Pogorelov et al., 2000). В результате ЕРМА миоцита сердца животного впервые были экспериментально проверены и подтверждены на клеточном уровне основные предсказания гипотезы. Показано наличие калиевого дефицита и накопления натрия в мышечной клетке сердца при функциональной ишемии, вызываемой у животного действием длительной гипертермии.

Детальное изучение временной динамики изменений элементного состава мышечной клетки было выполнено на изолированном сердце при перфузии разной длительности в различных условиях массосбмена. Анализ данных ЕРМА миоцита изолированного сердца, полученных нами при полной ишемии, проточной аноксии, гипотермической перфузии и ишемии/реперфузии, позволил предложить модель, описывающую поэтапную активацию специфичных мембранных ион-транспортирующих систем и их взаимодействие во времени. На первом этапе внутриклеточный гипоксический ацидоз обуславливает увеличение

концентрации натрия в мышечной клетке посредством - Н+. обмена, что в свою очередь активирует выход калия из миоцита через канал. На втором этапе увеличение концентрации калия в межклеточном пространстве приводит к активации Ыа/К-АТФазы, что усиливает деэнергизацию и сопровождается усилением ацидоза. В результате происходит дополнительный выход калия из кардиомиоцита. На заключительном этапе ишемии увеличение внутриклеточной концентрации протонов, лактата и АМФ и уменьшение содержания АТФ способствует активации Кдуф канала, что вызывает интенсивный отток калия из

клетки. Все этапы ишемии протекают на фоне электронейтрального выхода лактата из кардиомиоцита, который сопровождается симпортом катиона калия и антипортом аниона хлора.

Полученные данные обусловили необходимость рассмотрения в рамках модели роли взаимодействия нескольких компартментов ткани сердца: внутриклеточного и внеклеточного пространств кардиомиоцита, а также эндотелиальной клетки капилляра, раннее не учитываемых при анализе приспособительно-компенсаторных реакций в процессе перестройки ионного баланса кардиомиоцита в условиях ишемии. Например, при полной ишемии, в отсутствии перфузии, изменения в структуре мембранного транспорта приводят к установлению нового стационарного состояния в распределении элементов на мембране миоцита. В этих условиях определяющим является буферный обьем внеклеточного пространства, когда значительное увеличение калия в нем ингибирует Ыа/К-АТФазу и ведущим механизмом становится диффузия электролитов. При аноксической перфузии все упомянутые выше механизмы, активируемые на мембране кардиомиоцита в условиях полной ишемии, сохраняются, но стационарное состояние не наступает. Изменение ситуации, по сравнению с полной ишемией, обусловлено тем, что при перфузии существует возможность поддержания градиента электролитов между внеклеточным пространством и цитоплазмой. Величина градиента на мембране кардиомиоцита зависит от скорости обмена электролитами между межклеточным пространством и просветом капилляра. При аноксической перфузии это зависит от состава перфузата, условий перфузии и состояния эндотелиальной клетки стенки капилляра.

В рамках предложенной модели стало возможным упорядочить и объяснить ран ее выявленные противоречивые литературные данные. Так в эксперименте на изолированном сердце нами было показано, что при аноксической перфузии в присутствии ингибитора (строфантиднн) или условий (гипотермия, калиевая блокада^ингибирующих Ма/К-АТФазу в миоците, вместо ожидаемого уменьшения концентрации калия и увеличения натрия, наблюдается

обратная тенденция, т.е. внутриклеточное содержание калия возрастает, а натрий уменьшается. Данный эффект следует рассматривать, как результат опосредованного действия, обусловленного тем, что основной мишенью действия ингибиторов в ткани оказывается Na/K-АТФаза мембраны эндотелиалыюй клетки. В результате чего прекращается активный перенос калия из межклеточного пространства через эндотелиальную клетку в просвет капилляра, и эндотелий представляет собой только морфологический барьер для пассивной диффузии электролитов. В такой ситуации элементный состав кардиомиоцита "консервируется", как это происходит при гипотермии или калиевой блокаде. В зависимости от схемы эксперимента под действием ингибитора Na/K-АТФазы, например, строфантидина миоцит может даже восстановить ишемические нарушения баланса калия и натрия, что вызывает активацию сократительной функции сердца.

Результаты, полученные нами в эксперименте с реперфузией изолированного сердца, показали, что реперфузионные нарушения баланса элементов в миоците обусловлены не столько длительностью ранней ишемии, но стадией, на которой она прерывается реперфузией. В рамках предложенной модели отсутствие или наличие реперфузионных повреждений миоцита определяется наличием активных специфичных механизмов на мембране миоцита, набор которых меняется по мере развития ишемии. Отсутствие действия реперфузии в начале ишемии обусловлено активацией Ыа/К-АТФазы на мембране миоцита. Значительные реперфузионные изменения в миоците, наблюдаемые в середине ишемии, объясняются интенсивным обменом внеклеточного натрия на внутриклеточный протон, который активируется на втором этапе ранней ишемии. Установление нового стационарного состояния в распределении элементов на мембране кардиомиоцита в конце ишемии, когда ингибируется Na/K-АТФаза и ведущим механизмом становится диффузия электролитов, смягчает действие реперфузии.

Предложенная нами модель, учитывающая взаимодействие миоцита с окружающими структурными компартментами ткани сердца, позволяет описать поэтапную реакцию мышечной клетки на ишемию, предсказать опосредованный эффект воздействия на систему миоцит-эндотелиальная клетка кардиоплегии и тройного раствора (глюкоза, инсулин, калий). В рамках предложенной модели нами постулирован механизм опосредованного действия ингибиторов Na/K-АТФазы, который объясняет имеющиеся экспериментальные данные и противоречивый литературный материал об активации сократительной функции сердца при действии сердечного гликозида. Полученные данные по ишемии/реперфузии изолированного сердца дают возможность представить достаточно развернутую картину элементного баланса в мышечной клетке сердца в состоянии "preconditioning" (стимуляция сердца кратковременной ишемией) и "stunning" (повреждающая реперфузия, развивающаяся после кратковременной ишемии).

Таким образом, в отличие от результатов, полученных ранее на ткани сердца, изолированных клетках или мембранных комплексах, экспериментальные данные электронно-зондового микроанализа внутриклеточного состава элементов (К, Na, С1) для объектов разного уровня организации дали основание для разработки модели, которая описывает динамику развития ишемии в сердце на

уровне кардиомиоцита с учетом роли межклеточного пространства и клетки

эндотелия капилляра.

ВЫВОДЫ

1. С помощью метода локального электронно-зондового микроанализа внутриклеточного содержания калия, натрия и хлора на объектах разной организации показано, что ранняя ишемия и аноксия сопровождаются последовательными изменениями градиента ионов К+, и С1 на мембране мышечной клетки сердца. Подтверждены основные положения гипотезы о поэтапном изменении элементного (К, Ыа, С1) состава кардиомиоцита при ишемии, заключающемся в первичном дефиците внутриклеточного калия, который сменяется увеличением в цитоплазме концентрации натрия.

2. В экспериментальных исследованиях на изолированном сердце и на уровне целостного организма выявлена ключевая роль эндотелиальных клеток капилляра и их взаимодействия с кардиомиоцитом в регуляции и адаптивном изменении элементного состава мышечной клетки при ишемии и аноксии.

3. Выявлен механизм, обеспечивающий повышение и стабилизацию содержания калия в кардиомиоцитах при действии ингибиторов Ыа/К-АТФазы. Согласно полученным данным, ингибиторы Иа/К-АТФазы влияют на мышечную клетку опосредованно через подавление активного транспорта калия на мембране эцдотелиальной клетки, что приводит к повышению уровня калия в межклеточном пространстве и активирует Иа/К-АТФазу кардиомиоцита в условиях ранней ишемии.

4. Обнаружено увеличение концентрации калия в мышечной клетке сердца в состоянии гибернации, подобное тому( которое наблюдалось при гипотермической перфузии изолированного сердца, что может свидетельствовать об общности калий сберегающих механизмов, включающихся при гибернации животного и гипотермической перфузии изолированного сердца.

Зрбобщение экспериментальных данных позволило предложить оригинальную модель последовательной активации ряда катион-анионых транспортных систем, специфичных для ранней ишемии. Гипоксический ацидоз, который сопровождает ишемию, обуславливает Ыа+ -Н+. обмен и выход калия из клетки через канал. Повышение концентрации калия во внеклеточном пространстве активирует Иа/К-АТФазу, что усиливает деэнергизацию клетки, внутриклеточный ацидоз и, как следствие, открытие Кд^ф канала. Дальнейшее увеличение уровня калия вне клетки ингибирует Ыа/К-АТФазу и устанавливает диффузное равновесие на мембране кардиомиоцита.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Грибакин Ф.Г., Погорелов А.Г., Буровина И.В., 1976. Исследование

содержания и распределения калия в фоторецепторах сложного глаза сверчка методом рентгеновского микроанализа. Цитология, 18(10): 1176-1179

2. Погорелов А.Г., Аллахвердов Б.Л., Буровина И.В., Кудинова И А., 1977. Рентгеновский микроанализ легкодиффундирующих элементов в биологических тканях, залитых в смолу. В сб. II Всесоюзного симпозиума "Криогенные методы в электронной микроскопии" (Пущино), 87-92.

3. Савельева Н.А., Аллахвердов Б.Л., Погорелов А.Г., 1977. Микрозондовые исследования водорастворимых элементов в криостатированных срезах биологической ткани. В сб. II Всесоюзного симпозиума "Криогенные методы в электронной микроскопии" (Пущино), 92-95.

4. Burovina I.V., Gribakin F.G., Petrosyan A.M., Pivovarova N.B., Pogorelov A.G., Polijanovsky A.D., 1978. Ultrastructural localization of potassium and calcium in an insekt ommatidium as demonstrated by X-ray microanalysis. J. of Comparative Physiology, 127: 245-253.

5. Буровина И.В., Пивоварова Н.Б., Погорелов А.Г., Сидоров А.Ф., Чмыхова Н.М., 1978. Рентгеновский микроанализ при исследовании биологических обьектов. Аппаратура и методы рентгеновского анализа, 21, "Машиностроение", Л.: 35-59.

6. Pivovarova N.B., Burovina I.V., Pogorelov A.G., Saveleva N.A., 1978. Quantitative microprobe analysis of K, Na, P in thin sections of biological tissue. In: Kurzfassungen der Vortrage (Dresden), 35

7. Allahverdov B.L., Saveljeva N.A., Burovina I.V., Pogorelov A.G., 1979. Quantitative microprobe analysis in the study of biological sample. In: 11th conference on electron microscopy and microanalysis (Szeged, Hungery), 216-217

8. Allahverdov B.L., Pogorelov A.G., Burovina I.V., Pivovarova N.B., Saveljeva N.A., 1979. Opportunities of qualitative X-ray microanalysis in Cell Biology. In:

11th conference on electron microscopy and microanalysis (Szeged, Hungery), 218219.

9. Буровина И.В., Иванова Т.И., Лычаков Д.В., Погорелов А.Г., 1980. Рентгеноспектральный локальный микроанализ в цитологии. IV Проверка адекватности методов электронной гистохимии таллия. Цитология, 22 (4): 415-419.

10. Allahverdov B.L., Burovina I.V., Pivovarova N.B., Pogorelov A.G., Saveljeva N.A., 1980. Investigations of the contents and distributions of potassium, sodium and phosphorous in cells by electron probe X-ray

microanalysis. In: IX international conference on X-ray optics and microanalysis (Amsterdam, Netherland), 76-77.

11. Sobota A., Pogorelov A., Burovina I., 1981. Heterogenous distribution of potassium and phosphorous in acanthameba castellanii. Cell Biology Int. Reports, 5: 221-227.

12. Погорелов А.Г., Аллахвердов Б.Л., 1982. Метод расчета обьемной концентрации элементов в срезах ткани по данным рентгеноспектрального микроанализа. Цитология, 24(7): 823-826.

13. Allakchverdov B.L., Burovina I.V., Pivovarova N.B., Pogorelov A.G., 1982. A biological tissue section microprobe quantitative procedure. In: X Int. congres on Electron Microscopy, 131-132.

14. Погорелов А.Г., Бурмистрова H.A., 1982. Исследованиеледянных срезов растительной и животной ткани в микроанализаторе JSM-U3. В сб. 8

Всесоюзной конференции "Локальные рентгеноспектральные исследования и их применение" (Черноголовка), 378-379.

15. Погорелов А.Г., Бурмистрова Н.А., 1982. Определение чувствительности метода РМА на срезах биологической ткани для Са, К, С1 и Na. В сб. 8 Всесоюзной конференции "Локальные рентгеноспектральные исследования и их применение" (Черноголовка), 380-382.

16. Pogorelov A.G., Allachverdov B.L., 1984. Microprobe quantitation procedure that calculates concentrations of chemical elenments in soft biological tissue sections. Micron and Microscópica Acta, 15: 177-180.

17. Sobota A., Burovina I.V., Pogorelov A.G., Solus A.A., 1984. Correlation between potassium and phosphorus content and their nonuniform distribution in Acanthamoeba castellanii.'Histochemistry, 81: 201-204

18. Погорелов А.Г.. Аллахвердов Б.Л., 1985. Криогенные методы в рентгеноспектральном микроанализе. В сб. III Всесоюзной конференции "Криогенные методы в электронной микроскопии" (Пущино), 53-56.

19. Погорелов А.Г., 1985. Элементный анализ толстых биологических лиофилизированных препаратов. В сб. III Всесоюзной конференции "Криогенные методы в электронной микроскопии" (Пущино), 68-70.

20. Burovina I.V., Pivovarova N.B., Pogorelov A.G., 1985. Ion compartmentalization in frog oocytes as demonstrated by X-ray microanalysis. Gen. Physiol. Biophys., 4: 309-319.

21. Аллахвердов Б.Л., Иванова Г.К.. Кузминых С.Б., Никонова Н.Л., Хуцян С.С., Погорелов А.Г., 1986. Аналитическая электронная микроскопия: новые приборы и методы. В сб. "Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии" (Пущино), 10-17.

22. Przelecka A., Allachverdov B.L., Pogorelov A.G., Glowacka S.K., 1986. Ultracytochemical localization and microprobe quantitation of calcium stores on the insect oocyte. Histochemistry, 85: 163-168.

23. Pogorelov A.G., 1987. Quantitation procedure for calculating the sensitivity of X-ray microanalysis on biological thin sections. Micron and Microscópica Acta 18: 159-163.

24. Przelecka A., Pogorelov A.G., 1988. Calcium content in the nucleus and nucleolus of vitellogenic oocyte of Gallería mellonella /Lepidoptera/. Cell Biol. Int. Reports, 12:221-224.

25. Pogorelov A., 1989. Cryotechniques in microanalysis. In: 12 Int. Congress on X-ray optics and microanalysis (Cracow, Poland), 240.

26. Погорелов А.Г., Мазай Г.Г., 1990. Исследование калиевого дефицита в кардиомиоците крысы после гипертермии всего организма. Цитология, 32:1130-1134.

27. Pogorelov A., Mazay. G., Pogorelova V., 1990. Comparative study of freeze-dried and freeze-cut cardiac muscle. In: 4th meeting on low temperature microscopy and microanalysis (Cambridge), G8.

28. Pogorelov A., Mazay G., Pogorelova V., 1990. Rat small intestine epithelinm mucus as a depot of potassium and chlorine. Proc. 12 ICXOM, 600-603.

29.

30.

31.

32.

33,

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

Pogorelov A.G., Allachverdov B.L., Burovina I.V., Mazay G.G., Pogorelova V.N., 1991. Study of potassium defficiency in cardiac muscle: cryotechniques and X-ray microanalysis. J.of Microscopy/Oxford, 12: 24-38.

Pogorelov A., Budantsev A., Pogorelova V., 1993. Quantitative electron probe microanalysis of AChE activity in rat brain section. J.of Histoche. Cytochem., 41: 1795-1800.

Pogorelov A., 1993. Cryopreparation methods for biological X-ray microanalysis. In: 12th Pfefferkorn Conference "The Science of Biological Microanalysis", (Cambrodge), 8.

Pogorelov A., Pogorelova V., Smirnova S., Spiridonov N., 1994. EPMA of dried biological substances. Mikrokimica Acta, 115/116: 405-411. Pogorelov A., Pogorelova V., Repin N., Mizin I., 1994. Quantitative Electron Probe Microanalysis with a wavelength dispersive spectrometer. Scanning Microscopy, Suppl. 8.: 101-108.

PogorelovA., Mizin I. and Pogorelova V., 1995. EPMA of oocyte from nematode Caenorhabditis Elegans. The Journal of Scanning Microscopies (Scanning 95, Calofomia, USA), 27.

Pogorelov A., Kokoz Yu., Dubrovkin M., Pogorelova V. 1996. The assay of elemental contents (K,Na) of cardiac myocyte in tissue and in suspension with EPMA. Royal Microscopical Society Journal/London, 31: 147. Pogorelov A., Pogorelova V., Dubrovkin M., 1996. The potassium excess in cardiomyocyte of hibernating ground squirrel. Royal Microscopical Society Journal/London, 31: 148.

Погорелов А.Г., Кокоз Ю.М., Корысгова А.Ф., Дубровкин М.И., 1996. Изучение элементного состава кардиомиоцитов IN VIVO и IN VITRO. В сб. Все российской конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино), 20.

Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Дубровкин М.И., 1996. Изучение калиевого баланса клетки сердца зимоспящего суслика В сб. Все российской конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино), 21.

Pogorelov A., Budantsev A., Pogorelova V., Mizin I., 1997. Assay of acetylcholinesterase activity and elemental composition in brain compartments by electronprobe microanalysis. Brain Research Protocols, 1: 44-48. Pogorelov A., Pogorelova V., Dubrovkin M. 1997. X-ray microanalysis of potassium deficite in cardiomyocyte induced by ischemia. Royal Microscopical Society Journal/London.

Pogorelov A., Pogorelova V., Dubrovkin M., 1997. Assay of anoxia-induced potassium depletion in cardiomyocyte with Electron Probe Microanalysis. The Journal of Scanning Microscopies 19: 213.

Погорелов А.Г., Кокоз Ю.М., Дубровкин М.И., Погорелова В.Н., Корыстова А.Ф, Кузмин B.C., 1997. Сравнительный анализ внутриклеточного содержания калия для кардиомиоцита в ткани папиллярной мышцы и первичной культуре сердца. Цитология, 39: 829-834.

Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Дубровкин М.И., Кузьмин С.В., 1997. Развитие гипокалиемии в мышечной клетке сердца при гипоксии. В сб. Гипоксия: механизмы, адаптация и коррекция (Москва), 96-97.

» >

44. Pogorelov A., Pogorelova V., Dubrovkin M., Demin I., 1998. Electron probe microanalysis of ischaemic changes in elemental contents of cardiomyicyte. In: Biological Motility: modern methods for studying (Puschcino), 120-122.

45. Pogorelov A., Pogorelova V., Dubrovkin M., Demin I., 1999. Potassium and sodium changes in cardiomyocyte during early aschemia. In: 1st int. congress on heart disease-new trends in research, diagnosis and treatment (Washington), 1886.

46. Погорелов А.Г., Погорелова B.H., Дубровкин М.И., Демин И.П., 2000. Анализ элементного состава (Na/K/Ca) мышечной клетки при ишемии на модели перфузированного сердца. Цитологи, 42: 62-65

47. Асланиди К.Б., Погорелов А.Г., Асланиди О.В., Морнев О.А., Саакян Г.Г., 2000. Транссинцитиальные градиенты калия в процессе поляризованного роста гифы N.crassa. Биологические мембраны, 17(4): 387-394

48. Асланиди К.Б., Погорелов А.Г., Асланиди О.В., Морнев О.А., Потапова Т.В., 2000. Распределение содержания калия в гифе Neurospora crassa. ДАН

49. Погорелов А.Г, Погорелова В.Н., Демин И.П., 2000. Анализ изменения ионного состава мышечной клетки сердца на стадии ранней ишемии. В сб. "Профилактическая кардиология" (Москва, 2000), 296-297.

50. Погорелов А.Г, Демин И.П., Погорелова В.Н., Зинченко В.П., 2000. Коррекция элементного состава (К, Na, С1) мышечной клетки сердца при ишемии тетрафенилфосфонием (ТРР+). В сб. "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), 219-222

51. Pogorelov A., Demin I., Pogorelova V., 2000. Effect of dimethyksukfoxide on intracellular potassium and sodium in cardiomyocyte. In: 4th EMAS Regional Workshop "Electron probe microanalysis today-practical aspects" (Czech, 2000), 211.

Научное издание Автореферат А.Г.ПОГОРЕЛОВА

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции ОК-СЮ5-93, том 2; 953000 - книги и брошюры.

Подписано в печать 03.10.2000 г. Заказ 8893Р. Тираж 100 экз. Усл..печ.л. 3,0.

Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Путинского научного центра РАН.

142290, г.Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ.