Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронно-микроскопическое исследование сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Электронно-микроскопическое исследование сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий"

На правах рукописи

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СБОРКИ ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКИ И ЯДЕРНЫХ ПОРОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В РАСТУЩИХ ООЦИТАХ АМФИБИЙ

Гистология, цитология, клеточная биология - 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2006

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных

структур, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Киселева Елена Владимировна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Высоцкая Людмила Васильевна, Новосибирский государственный университет, г, Новосибирск

доктор биологических наук Семешин Валерий Федорович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

I

I <

Ведущее учреждение: Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии «Вектор» Кольцово, Новосибирская область

Защита диссертации состоится «1» ноября 2006 г, на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д- 003.011,01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: dissovtffibi onet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

—=

А.Д. Груздев

Актуальность проблемы. Отличительной особенностью эукариот является наличие ядра и ядерной оболочки, обеспечивающей отделение генетического аппарата клетки. Ядерная оболочка является не просто структурным барьером, но и важной функциональной органеллой, дефекты организации которой приводят к серьезным заболеваниям человека (Worman, Courvalin, 2000; Somech et al., 2005). Поэтому исследование структуры, функции ядерной оболочки и ее динамики в ходе клеточного развития является одной из актуальных задач современной биологии.

Расположенные в ядерной оболочке ядерные поровые комплексы выполняют ключевую роль в обеспечении активного и пассивного транспорта различных молекул между ядром и цитоплазмой (Smythe et ai., 2000; Adam, 2001; Fahrenkrog, Aebi, 2003). Процессы сборки-разборки ядерной оболочки и ядерных пор в делящихся клетках достаточно хорошо исследованы в условиях in vitro и in vivo в митозе (Zatsepina et al1977; Marshal, Wilson, 1997; Goldberg et al., 1997; Burke, Ellenberg, 2002). Однако вопрос о том, каким образом формируются новые участки ядерной оболочки с ядерными порами на стадии интерфазы, когда в ней уже присутствуют зрелые поры и ламина, практически не исследован. Выяснение механизмов этого процесса требует детального анализа структурной организации, функции и динамики ядерной оболочки и ее составных компонентов с использованием комплекса различных методов. Одной из наиболее удобных моделей для исследования этого вопроса являются ооциты амфибий. Ядро развивающегося ооцита существенно увеличивается в размере, не претерпевая' деления, соответственно, растет и ядерная оболочка. Эта особенность, в сочетании с крупными размерами клетки, определяет преимущество ооцита как подходящего объекта для изучения механизмов формирования ядерной оболочки.

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы исследовать механизмы сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий и определить возможное участие внутриклеточных структур в этом процессе.

Для осуществления заданной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить ультраструктурную организацию ооцитов амфибий на разных стадиях их развития.

2. Провести морфологический и морфометрический анализ динамики мембран эндоплазматического ретикулума в растущем ооците.

3. Оценить возможное участие пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, в процессе формирования ядерной оболочки.

4. Проанализировать ультраструктурную динамику ядерной оболочки и ядерных пор в процессе роста ядра ооцита, в частности, определить, изменяется ли плотность распределения пор в ядерной оболочке на разных стадиях оогенеза.

5. Исследовать влияние инъекции антител к нуклеопорину р62, входящему в состав центрального отдела ядерного порового комплекса, на формирование ядерной оболочки и ядерных пор в ооцитах амфибий.

6, Сравнить механизм сборки ядерной оболочки в растущих ооцитах амфибий и в итоги чески делящихся клетках синцитиальных эмбрионов дрозофилы на стадии интерфазы. На основании полученных данных создать модель формирования ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.

7. Определить локализацию внутриядерного актина и его взаимодействие с ядерной оболочкой.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе проведен сравнительных анализ ультраструктурной организации растущих ооцитов амфибий на разных стадиях оогенеза. Установлено, что в процессе развития ооцита наблюдается перераспределение внутриклеточных органелл по цитоплазме клетки и меняется равномерность распределения пор в ядерной оболочке.

Впервые в цитоплазме ранних ооцитов обнаружены компактные миелиноподобные структуры, способные разворачиваться в мембраны гладкого эндоплазматического ретикулума. На Ш-ГУ стадиях оогенеза зарегистрировано множественное слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и появление фрагментов ядерной оболочки, не имеющих пор, вблизи мест слияния. Гладкие мембранные пузырьки также обнаружены вблизи внутренней ядерной мембраны таких ооцитов, что позволяет предположить возможность перемещения части мембраны пузырька через мембранный компонент ядерной поры внутрь ядра и, во многом, доказывает участие ЭПР в сборке наружной и внутренней ядерных мембран. Впервые в ооцитах амфибий зарегистрировано слияние пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, с наружной ядерной мембраной, что доказывает причастность этих органелл к формированию новых участков ядерной оболочки в этих клетках. На уровне электронной микроскопии установлено, что сборка ядерных поровых комплексов в растущем ядре ооцита ксенопуса происходит через формирование промежуточных структур, и выявлены последовательные этапы этого процесса. Сочетание методов флуоресцентной и электронной микроскопии позволило выявить внутри ядра ооцитов актин- с од ержащи е филаменты, которые могут быть вовлечены во внутриядерный транспорт и, возможно, в сборку ядерной оболочки. Комплексный подход позволил продемонстрировать, что формирование ядерной оболочки — это сложный процесс, в который вовлечены многие внутриклеточные структуры. Результаты проведенного исследования демонстрируют новые аспекты происходящих в ооците процессов, предшествующих оплодотворению, которые могут быть использованы в работах по изучению организации созревающих и оплодотворенных яйцеклеток, а также эмбриональных клеток.

Материалы диссертационной работы, опубликованные в обзорной статье (Морозова и др., 2005), используются при чтении лекций на Кафедре генетики и селекции в Санкт-Петербургском государственном университете и могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов других университетов.

Апробация работы. Результаты, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на отчетной сессии Института цитологии и генетики (2005 г.), а ткаже на российских и международных конференциях и симпозиумах: XLI МНСК (Новосибирск, 2003); 3-я Международная научная конференция «Актуальные проблемы современной биологии и биотехнологии» (Астана, Казахстан, 2003); 7-я Путинская школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Россия, Пущино, 2003); Международный Симпозиум по проблемам Мейоза (Санкт-Петербург, 2003); Российско-китайский Симпозиум «Наука о жизни» (Пущино, 2004); 8-я Азиатско-Тихоокеанская Конференция по Электронной Микроскопии (Канадзава, Япония, 2004); III съезд ВОГиС (Москва, 2004); Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, Беларусь, 2004); 7-й Межнациональный Микроскопический Конгресс (Портороз, Словения, 2005); Конференция Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Структура и динамика клеточного ядра» (Гран-Мохте, Франция, 2005); XV Всероссийское Совещание «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005); Школа-Семинар Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Молекулярный Транспорт. Каналы и Транспортеры» (Эриче, Сицилия, Италия, 2005) и «Клеточные мембраны: организация и динамика» (Бильбао, Испания, 2006); 16-й Международный Микроскопический Конгресс (Саппоро, Япония, 2006).

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 12 тезисов в сборниках конференций и симпозиумов, 2'статьи приняты в печать.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 149 страницах печатного текста, содержит одну таблицу и иллюстрирована 55 рисунками. В списке литературы приведено 270 источников,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объекты исследования. В качестве объекта исследования использовали ооциты шпорцевых лягушек Xenopus laevis и травяных лягушек Rana temporaria. Ооциты на разных стадиях оогенеза идентифицировали по размерам и пигментированносги, согласно классификации Дьгори (Duryee, 1950).

Микроинъекцни в ооциты осуществляли при помощи микроиньектора (Drummond, Англия) стерильными стеклянными капиллярами. Первичные антитела для инъекции разводили в соотношении 1:50 в растворе фосфатного буфера (PBS, Sigma). Инъецированные ооциты инкубировали 3 часа в растворе Рингера. Для микроинъекций использовали моноклональные мышиные антитела к нуклеопорину р62 (Amersham, Англия) и к ламину ВЗ (предоставлены доктором Krohne, Германия).

Флуоресцентная микроскопия. Ооциты фиксировали в растворе PBS, содержащем 4 %-ный параформальдегид и 0.1 %-ный Triton-XlOO;

окрашивали флуоресцентно меченым фаллоидином, отмывали в PBS и переносили на предметное стекло в 50 %-ный раствор глицерина в PBS (Guild et ai,, 1997; Gard, 1999). Анализ FITC-флуоресценции осуществляли на микроскопах Axioskop-2 Plus и LSM 510 (Zeiss, ФРГ)-

Электронно-микроскопический анализ. Ооциты фиксировали 2.5 %-ным раствором глутарового альдегида в 0.1 M Хепес-буфере, дофиксировали в 1 %-ном растворе тетроксида осмия, дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и в ацетоне, после чего заключали в эпоксидную смолу Агар-100 и полимеризовали в течение 2-х суток при 60 °С (Уикли, 1975). Ультратонкие срезы толщиной 50-70 нм получали с помощью алмазного ножа на ультратоме Ultracut (Австрия), контрастировали растворами уранилацетата и цитрата свинца и исследовали в электронном микроскопе LEO 910 (Zeiss, Германия).

Для визуализации внутриядерных актиновых филаментов в просвечивающем электронном микроскопе использовали метод фиксации ооцитов по Парфенову (Parfenov et al., 1995).

Инкубация ооцитов с латрункулином. Для деполимеризации актиновых филаментов ооциты инкубировали с латрункулином (Calbiochem, США) в концентрации 1 ng/ml; 3 pg/ml; 5 ng/ml в растворе Рингера в течение ночи при +4 °С. В качестве контроля использовался раствор диметилсульфоксида в растворе Рингера, Затем образцы отмывали раствором Рингера и фиксировали по стандартному протоколу для электронно-микроскопического анализа.

Морфометрнческий анализ проводился в электронном микроскопе на срезах с использованием статистической программы AnalySIS (версия 2.11, Soft Imaging System).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Особенности ультраструктурной организации ооиитов амфибий на разных стадиях оогенеза, Сравнительный электронно-микроскопический анализ ооцитов показал, что в процессе оогенеза их структурная организация существенно усложняется, что сопровождается перераспределением органелл по цитоплазме клетки. В ооцитах на I-IH стадиях развития нами впервые обнаружены компактные миелиноподобные структуры (МПС), состоящие из концентрически упакованных мембранных слоев (рис. 1, а, 6). На Ш стадии мы наблюдали разворачивание компактных МПС в двухслойные мембраны, напоминающие мембраны гладкого ЭПР (рис, 1, в). МПС выявлялись также в фолликулярных клетках и в межклеточном пространстве между ооцитом и фолликулярными клетками, и часто контактировали с плазматической мембраной ооцита. При этом в участках цитоплазмы ооцита, прилежащих к районам контактов с МПС, обнаруживались многочисленные мембраны ЭПР. На основании этого было высказано предположение, что МПС могут представлять запас мембранных компонентов для ЭПР, необходимых на этой стадии активного роста ооцита.

Рис. 1. Компактные миелиноподобные структуры (МПС), разворачивающиеся в двухслойные мембраны, напоминающие мембраны гладкого ЭПР. а - компактная МПС в цитоплазме раннего ооцита (стадия II оогенеза); б - фрагмент разворачивающейся МПС (стадия III оогенеза); в - декомпактизованная МПС кольцевой формы в цитоплазме ооцита на III стадии оогенеза.

Характерной чертой ооцитов амфибий, так же как опухолевых и эмбриональных клеток, является наличие в цитоплазме пористых пластинок -специфического компонента ЭПР» содержащего цитоплазматические поры. Наши исследования показали, что пористые пластинки присутствуют в цитоплазме ооцита на всех стадиях оогенеза в большом количестве и могут содержать от 1 до 20 и более мембран в стопке (рис. 2, а, б). Пористые пластинки состоят из гладких мембран ЭПР, пронизанных многочисленными пороподобными комплексами. При сравнении морфологии пороподобных и ядерных поровых комплексов мы установили, что периферические отделы пороподобных комплексов симметричны и состоят из двух компонентов, сходных с цитоплазматическим отделом ядерных пор (рис. 2, б). Типичная для ядерных пор баскет-струкгура в них отсутствует, что согласуется с данными биохимических исследований.

Анализируя ооциты амфибий, нам удалось впервые зарегистрировать непосредственное слияние пористых пластинок с наружной ядерной мембраной (рис. 2, в, г). Слияние мембран пористых пластинок с ядерной оболочкой происходит локально, в участках, не содержащих ядерных или цитоплазматических пор, и в месте слияния формируется, вероятно, новый участок ядерной оболочки. Поскольку предположение о возможной функции пористых пластинок в качестве запаса структурных компонентов для ядерных пор уже высказывалось ранее в литературе (Cordes et а/,, 1995; Burke, Ellenberg, 2002; Harel et a!,, 2003), и было установлено, что в процессе роста ооцита ксенопуса, одновременно с ростом ядерной оболочки и формированием ядерных пор, уменьшается количество цитоплазматических пор (Cordes et а!., 1995), наши данные могут свидетельствовать о непосредственном использовании пористых пластинок для формирования новых фрагментов ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов.

Рис. 2. Электронно-микроскопические фотографии пористых пластинок в ооцитах амфибий, а, 6 - стопки упорядочение расположенных пористых пластинок с пороподобными комплексами в цитоплазме ооцитов (стрелками отмечены пороподобные комплексы; на вставке представлен пороподобный комплекс на большем увеличении); в, г — слияние пористых пластинок с ядерной оболочкой (длинные стрелки указывают на место слияния) пп - пористые пластинки; я - ядро.

На основании наших исследований можно предположить два варианта использования пороподобных комплексов: они могут разбираться на отдельные нуклеопорины, которые переходят в перинуклеарное пространство и используются для формирования ядерных поровых комплексов во вновь сформированнных фрагментах ядерной оболочки, либо, поскольку пороподобные комплексы симметричны, они могут разделяться на две равные части, каждая из которых содержит центральный и цитоплазматический отдел будущей ядерной поры. Достройка внутриядерного отдела происходит позднее. Первый вариант может иметь место при делении ядер в растущих эмбрионах дрозофилы, для которых была продемонстрирована способность нуклеопоринов в пороподобных комплексах переходить из растворимого состояния, в составе цитоплазматического пула белков, в структурные комплексы (От$сЬепко е/ о/., 2004). Второй вариант больше подходит для таких активно растущих клеток как ооциты, а также для опухолевых клеток, которым в короткие сроки требуется сформировать большое количество новых ядерных пор.

Линамика ядерной оболочки в процессе развития ооиитов.

На рисунке 3 представлен фрагмент ядерной оболочки ооцита ксенопуса. Можно различить составные компоненты ядерной оболочки: наружную и внутреннюю ядерные мембраны и ядерные поровые комплексы. Ядерные поровые комплексы легко определить по характерной баскет-структуре их внутриядерного отдела (рис. 3, а, 6). На поперечном срезе со стороны цитоплазмы видны составные компоненты ядерного порового комплекса: гранулы цитоплазматического кольца, радиально расположенные спицы и центральный транспортер (рис. 3, в).

Рис. 3. Вид ядерной оболочки и ядерных пор в ооцитах амфибий, а, 6 - фрагменты ядерной оболочки целых ооцитов на поперечном срезе (ням — наружная ядерная мембрана; вям - внутренняя ядерная мембрана; пунктиром отмечены баскет-структуры ядерных поровых комплексов); в - фрагмент ядерной оболочки на продольном срезе (вид со стороны цитоплазмы; одинарными стрелками отмечены цитоплазматические гранулы ядерной лоры; двойными стрелками - спицы центрального отдела поры; тройной стрелкой — центральный транспортер

Исследование морфологии ядерной оболочки растущих ооцитов амфибий показало, что плотность распределения пор в ней меняется в процессе оогенеза. На ранних стадиях встречаются протяженные участки ядерной оболочки без ядерных пор, в то время как в зрелых ооцитах поры расположены регулярно и с высокой плотностью. Сравнительный морфометрический анализ плотности распределения ядерных пор на единицу

длины ядерной оболочки в зрелых (стадии V-VI) и растущих ооцитах (стадии II-III) показал, что в первом случае ядерные поры расположены в среднем в 3 раза плотнее по сравнению с растущим ядром. Эти данные, а также увеличение размера ядра в ходе оогенеза, свидетельствуют об активной достройке ядерной оболочки и сборке новых ядерных пор в ранних ооцитах амфибий.

Наши исследования показали, что на III стадии оогенеза вблизи ядерной оболочки появляются многочисленные пузырьки ЭПР диаметром от 150 до 300 нм, многие из которых контактируют и сливаются с наружной ядерной мембраной. Мы предположили, что эти пузырьки могут быть вовлечены в сборку ядерной оболочки, поскольку подобный процесс наблюдался ранее при формировании ядерной оболочки в митотически делящихся ядрах. Поэтому была поставлена задача исследовать динамику ЭПР на разных стадиях оогенеза.

Динамика э и доплазмат и чес кого ретикулума в процессе развития ооиитов.

Морфометрический анализ динамики ЭПР на разных стадиях оогенеза показал, что наиболее заметное увеличение общей площади поверхности мембран ЭПР происходит на III-IV стадиях оогенеза (рис. 4, а). Мы полагаем, что это может быть обусловлено, наряду с другими процессами, такими как вителлогенез, перераспределение ионов кальция, и запасание белков и липидов, необходимых для обеспечения развития будущего эмбриона, участием мембран ЭПР в сборке ядерной оболочки. Для более детального анализа реорганизации ЭПР был проведен сравнительный анализ относительной площади поверхности мембран ЭПР и его относительного объема в разных участках цитоплазмы (рис, 4, б). Совокупность морфометрических и электронно-микроскопических данных показала, что элементы ЭПР, включающие пузырьки и цистерны гладкого и шероховатого ретикулума, распределены неравномерно между различными областями цитоплазмы ооцита, и их локализация в клетке меняется в процессе оогенеза (рис. 4, б, в). На I-II стадиях оогенеза наибольший относительный объем цистерн и пузырьков ЭПР наблюдаются в периферической области цитоплазмы, в то время как остальные области цитоплазмы обеднены этими мембранами. На III-IV стадиях развития происходит перемещение мембран ЭПР с периферии в среднюю и околоядерную области. На последующих стадиях оогенеза ЭПР более менее равномерно распределен по цитоплазме ооцита. Таким образом, наши исследования показали, что на III-IV стадиях оогенеза происходит перемещение компонентов ЭПР в околоядерную область цитоплазмы, где они, вероятно, используются .для формирования новых фрагментов ядерной оболочки.

ст.mi ct.iii-iv стадии оогемем

ct.V-VI

б 60000

70000 •

60000

50000

40000

X

S 30000

% ю 20000

о

1 10000 •

0

периф

!

—■— среди I | -А— ОКОЛОЯД;

ст. 1-11 ст.Ш-IV ct.V-VI стадами оогенеза

стадий Ш

стадия HMV

стадия V-VI

Рис. 4. Динамика эндоплазматического ретикулума в растущих ооцитах амфибий, а — изменение общей площади поверхности мембран ЭПР в ооците на разных стадиях оогенеза; б - изменение относительного объема цистерн и пузырьков ЭПР в оогеиезе в различных областях цитоплазмы; в — схема, демонстрирующая распределение мембран ЭПР в цитоплазме ооцитов на 1-УХ стадиях развития (1 — периферическая область; 2 — средняя область; 3 — околоядерная область; я — ядро).

Новый механизм сборки ядерной оболочки в растущих неделяшихся клетках. Электронно-микроскопические исследования показали, что на III стадии оогенеза вблизи наружной мембраны ядра наблюдаются многочисленные пузырьки ЭПР, которые часто сливаются с ней (рис. 5, а, б). Следует отметить, что в области слияния пузырьков ЭПР с ядерной мембраной обнаруживаются участки ядерной оболочки, свободные от ядерных пор, и содержащие незрелые поровые комплексы.

Наши исследования также выявили присутствие мембранных пузырьков внутри ядра, вблизи внутренней ядерной мембраны (рис. 5, в). Эти данные позволяют предположить, что наблюдаемые структуры возникают в результате перетекания части мембраны пузырька, слившегося с наружной ядерной мембраной, внутрь ядра через мембранный компонент ядерной поры.

Рис, 5. Контакт пузырьков ЭПР с ядерной оболочкой ооцита. а - массовое слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и фрагменты ядерной оболочки без ядерных пор вблизи участков слияния; б - пузырьки ЭПР, сливающиеся с наружной мембраной изолированного ядра ооцита; в, г - гладкие мембранные пузырьки вблизи внутренней мембраны ядра. Белые стрелки указывают на мембранные пузырьки, черные стрелки — на ядерные поры.

Основываясь на этих данных, мы предложили модель формирования новых участков ядерной оболочки (рис. 6). Согласно этой модели, новые фрагменты ядерной оболочки образуются за счет слияния пузырьков ЭПР с наружной мембраной ядра и перетекания части пузырька внутрь ядра через мембранный компонент ядерной поры. Далее оба фрагмента уплощаются, приближаются друг к другу, и в них начинается формирование новых

ядерных поровых комплексов. Подобные внутриядерные пузырьки были нами выявлены и при анализе срезов интерфазных ядер синцитиальных эмбрионов дрозофилы (предоставлены Губановой Н.В.), на основании чего мы предполагаем, что в растущих интерфазных ядрах соматических клеток сборка ядерной оболочки может идти по аналогичному механизму.

ПуЗЫ]

Рис. 6. Модель последовательных стадий формирования ядерной оболочки с участием пузырьков ЗПР. / - пузырек ЭПР вблизи ядерной оболочки; 2 - слияние пузырька ЭПР с наружной мембраной ядра; 3 — перемещение части мембраны пузырька внутрь ядра через мембранный компонент ядерной поры; 4, 5 — формирование двухслойной мембраны; 5 - сборка ядерных поровых комплексов в новом фрагменте ядерной оболочки.

Как было показано в опытах in vitro, сборка ядерных поровых комплексов идет через промежуточные структуры (Kiseleva et al., 2001). Мы выявили сходные последовательные стадии формирования ядерных пор in vivo в ядерной оболочке целых ооцитов (рис. 7): сначала новый фрагмент ядерной оболочки состоит из двух мембран и не содержит пор. Затем наружная и внутренняя мембраны изгибаются по направлению друг к другу, сближаются и сливаются. В участках слияния начинается формирование компонентов ядерных поровых комплексов, причем сначала формируется центральный, а затем периферические отделы поры.

1

формирование новых ЯПК'

а

б

—^—

Рис. 7. Последовательные этапы сборки ядерных, поровых комплексов в растущей ядерной оболочке ооцитов ксенопуса. а - стадии формирования ядерного порового комплекса через промежуточные структуры, выявленные с использованием просвечивающей электронной микроскопии; б - схематическое изображение последовательных стадий сборки ядерных поровых комплексов. Стрелка указывает направление процесса формирования ядерного порового комплекса.

Такая последовательность сборки ядерных поровых комплексов подтвердилась в наших дальнейших исследованиях. При инъекции в ооцит антител к нуклеопорину р62, входящему в состав центрального компонента порового комплекса, наблюдались протяженные участки ядерной оболочки, не содержащие ядерных пор. Морфометрический анализ также показал, что плотность пор в ядерной оболочке после инъекции р62 в ранние ооциты существенно снижается по сравнению с ядерной оболочкой нативных ооцитов. Можно предположить, что недостаток этого белка блокирует процесс сборки ядерного порового комплекса на стадии формирования его центрального отдела и препятствует дальнейшему встраиванию нуклеопоринов в собирающуюся пору. Полученные данные показали, что нуклеопорин р62 необходим на начальном этапе формирования ядерной поры, когда происходит контакт и слияние двух мембран и собирается центральный компонент поры.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что ядерная оболочка в растущих ядрах ооцитов амфибий формируется с участием мембранных компонентов ЭПР и пористых пластинок (рис. 8), а пороподобные комплексы пористых пластинок могут служить источником нуклеопоринов для собирающихся ядерных поровых комплексов.

Рис. 8. Модели сборки новых фрагментов ядерной оболочки в ооцитах амфибий с участием цитоплазматических органелл. а — сборка ядерной оболочки с участием мембран ЭПР; б - сборка ядерной оболочки с участием пористых пластинок.

Механизм сборки ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках отличается от процесса сборки ядерной оболочки в митозе. В митозе оболочка собирается из сливающихся пузырьков ЭПР, затем в ней собираются поры и ламина. В растущих неделящихся клетках, содержащих уже сформированную ядерную оболочку, зрелые ядерные поровые комплексы и ламину, для достройки ядерной оболочки необходимо слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной, перетекание части их мембраны через мембранный компонент ядерной поры внутрь ядра, деполимеризация ламины, формирование нового фрагмента ядерной оболочки, сборка в нем ядерных поровых комплексов, и, затем, сборка ламины.

Внутриядерный актин и его взаимосвязь с ядерной оболочкой.

Используя электронно-микроскопические методы, мы выяснили, какие структуры принимают участие в формировании ядерной оболочки растущих неделящихся ядер со стороны цитоплазмы, однако, оставалось неясным, какие внутриядерные компоненты участвуют в этом процессе. Недавние исследования на уровне сканирующей электронной микроскопии выявили в изолированных ядрах ооцитов ксенопуса актин-содержащие филаменты, контактирующие с баскет-структурами ядерных пор (Кдзе1еуа е1 а/., 2004).

С использованием флуоресцентной микроскопии мы показали, что ядра ооцитов ксенопуса интенсивно окрашиваются конъюгированным с Р1ТС фаллоидином, специфически связывающимся с филаментным актином, что свидетельствует о присутствии в ядрах значительного количества актина. Актин равномерно заполняет всю нуклеоплазму, окружая многочисленные внутриядерные включения сферической формы (рис. 9, а, 6). Размер этих включений и их многочисленность позволяют предполагать, что они относятся к ядрышкам, присутствующим в ооцитах в большом количестве.

Поскольку флуоресцентный анализ не позволил исследовать организацию актина в ядре, нами был проведен детальный ультраструктурный анализ с использованием фиксации, специфически выявляющей актиновые микрофиламенты (РагЯгпоу е* а/., 1995). Электронно-микроскопический анализ показал, что актин в ядре ооцитов ксенопуса присутствует в виде филаментов, представляющих собой скрученные нити толщиной около 0,1 мкм и длиной до нескольких микрон (рис. 9, в), которые образуют сеть, пронизывающую все внутриядерное пространство, Актин-содержащие филаменты часто располагаются вблизи ядерной оболочки и контактируют с ядрышками и баскет-структурами ядерных пор (рис. 9, г). При инкубации

ооцитов с латрун кули ном, деполимеризующим актин, мы отмечали нарушения морфологии ядра и строения ядерной оболочки. Наши результаты, в совокупности с биохимическими данными, позволяют предполагать, что актин-содержащие филаменты, соединяя внутриядерные структуры напрямую с ядерными порами, могут обеспечивать путь для направленного транспорта молекул внутри ядра и между ядром и цитоплазмой. Недавно в составе ядерной оболочки были выявлены белки-несприны, которые могут связываться с актином как внутри ядра, так и в цитоплазме (Warren et at., 2005; Worman, Gundersen, 2006)1 He исключено, что ядерная оболочка опосредует связь между ядерным матриксом и цитоскелегом, обеспечивая согласованное функционирование клетки как единого целого.

Рис. 9. Актин-содержащие филаменты в ядрах ооцитов ксенопуса. а. б- целый ооцит и изолированное ядро ооцита ксенопуса, окрашенные на актин флуоресцентно меченым фаллоидином (интенсивная окраска наблюдается в ядре ооцита; неокрашенные включения сферической формы внутри ядра соответствуют ядрышкам; ц — цитоплазма; я - ядро); в, г - ультраструктура актин -содержащих филаментов в ядрах ооцитов амфибий и их контакт с баскет-структурами ядерных пор (стрелки отмечают актин-содержащие филаменты; я — ядро).

выводы.

1. Увеличение площади поверхности и объема мембран эндоплазматического ретикулума в околоядерной области ооцита на 3-й стадии оогенеза может быть обусловлено сборкой новых фрагментов растущей ядерной оболочки.

2. Пористые пластинки, входящие в состав ЭПР и содержащие цитоплазматические поры, могут сливаться с наружной мембраной ядра и служить источником мембран и иуклеопоринов для собирающейся ядерной оболочки и ядерных пор.

3. В цитоплазме ранних ооцитов амфибий впервые выявлены миелиноподобные структуры, которые могут выполнять роль депо мембран для ЭПР на стадиях интенсивного роста и развития ооцита.

4. Сборка ядерных поровых комплексов происходит через формирование промежуточных структур. Блокирование встраивания нуклеопорина р62 в ядерную пору нарушает начальные этапы ее сборки в растущих ооцитах.

5. Предложена модель сборки ядерной оболочки в растущих ооцитах амфибий за счет слияния пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и перемещения части мембраны пузырька через мембранный компонент ядерной поры внутрь ядра. Далее два фрагмента мембраны пузырька сближаются и формируют новый участок ядерной оболочки, в котором инициируется сборка новых ядерных пор.

6. Электронно-микроскопический анализ выявил в ядрах ооцитов актин-содержащие филаменты, контактирующие с ядрышками и ядерными поровыми комплексами. Деполимеризация этих филаментов нарушает морфологию ядра. Предполагается, что данные филаменты вовлечены во внутриядерный и ядерно-цитоплазматический транспорт, а также в сборку новых фрагментов ядерной оболочки.

Список основных публикаций по теме диссертации.

1. Семакова К.Н., Киселева Е.В, Миелино-подобные структуры как возможный источник гладкого эндоплазматического ретикулума в ранних ооцитах амфибий. Цитология. 2003.45(8) : 246-257.

2. Morozova К., Kiseleva Е. New model of nuclear envelope assembly using endoplasmic reticulum vesicles. 8th Asia-Pacific Conference on Electron Microscopy (8APEM). Kanazawa, Japan, 2004. P. 76.

3. Morozova K., Kiseleva E. Cytoplasmic annulate lamellae are specific organelles of actively growing and rapidly dividing cells. Materials of Russian-Chinese Symposium "Life Science", Puschino, Russia, 2004. P. 122.

4. Морозова КЛ., Аллен Т.Д., Киселева E.B. Исследование механизмов формирования внутренней ядерной мембраны в растущих ооцитах амфибий. III съезд ВОГиС Генетика в XXI: современное состояние и перспективы развития. Москва, 2004. Т.Н С. 263.

5. Morozova K.N., Kiseleva E.V. Striking myelin-like structures unwrapping in Xenopus oocytes: a source of membranes or the store of their excess? 7th Multinational Congress on Microscopy. Portoroi, Slovenia, 2005. Abstract book, P, 27.

6. Kiseleva, E, Morozova, K., Goldberg, M.W., Rutherford, S., Allen, T.D, New mechanism of nuclear envelope and nuclear pore assembly in growing nuclei. Abstract Book of the EMBO/FEBS Conference on Nuclear Structure and Dynamics. La Grande Motte, France, 2005. P. 81.

7. Морозова K.H., Губанова H.B., Киселева E.B. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры. Цитология, 2005.47(8) : 667-678.

8. Morozova К1Ч., Kiseleva E.V. Defects in nucleo-cytoplasmic transport and nuclear pore complexes assembly caused by immunodepletion of p62 nucleoporin. Materials of 16th International Microscopy Congress. Sapporo, Japan, 2006. P. 369.

9. Губанова H.B., Морозова K.H., Киселева E,B. Структурная организация, функция и динамика ядерных пор. Цитология. 2006. 48(11) (принята в печать),

Ю.Морозова К.Н., Киселева Е.В. Морфометрический анализ динамики эндоплазматического ретикулума в растущих ооцитах амфибий. Цитология. 2006. 48(12) (принята в печать).

Подписано к печати 25 сентября 2006 г. Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд, л. 0,7. Тираж 100 экз. Заказ 102.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Морозова, Ксения Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Яд ерн ая обол очка.

1.1.1. Строение и функция ядерной оболочки.

1.1.2. Ядерная оболочка и генетические заболевания человека.

1.2 Ядерные поровые комплексы.

1.2.1. Ультраструктура ядерных поровых комплексов.

1.2.2. Биохимический состав ядерных пор.

1.2.3. Механизмы транспорта молекул через ядерную пору.

1.3. Эндоплазматический ретикулум и его связь с ядерной оболочкой.

1.3.1. Структурная организация и функциональная роль эндоплазматического ретикулума в клетке.

1.3.2. Формирование эндоплазматического ретикулума и его реорганизация при различных условиях.

1.3.3. Миелиноподобные структуры.

1.3.4. Пористые пластинки - компонент эндоплазматического ретикулума, содержащий цитоплазматические поры.

1.3.4.1. Пористые пластинки - специфические органеллы высоко активных клеток.

1.3.4.2. Взаимодействие пористых пластинок с внутриклеточными органеллами.

1.3.4.3. Сравнительный анализ структурной организации и белкового состава пористых пластинок и ядерной оболочки.

1.3.4.4. Возможные механизмы формирования цитоплазматических пор.

1.3.4.5. Возможная функциональная роль пористых пластинок в клетке.

1.4. Механизмы сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в митозе.

1.4.1. Характеристика основных событий клеточного цикла.

1.4.2. Динамика ядерной оболочки в процессе митоза.

1.4.3. Реорганизация ядерных и цитоплазматических пор в клеточном цикле.

1.5. Ооциты амфибий как удобная модель для изучения сборки ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.

1.5.1. Особенности организации ооцитов амфибий и их отличие от других клеток.

1.5.2. Характеристика различных стадий оогенезау амфибий.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования и условия их содержания.

2.2. Метод выделения ооцитов и микроинъекции в ооциты.

2.3. Инкубация ооцитов с латрункулином.

2.4. Фиксация и окраска ооцитов для флуоресцентной и конфокальной микроскопии.

2.5. Фиксация и заливка ооцитов для электронно-микроскопического анализа.

2.6. Модификация метода фиксации и заливки ооцитов для выявления внутриядерных актиновых филаментов на ультраструктурном уровне.

2.7. Получение, окрашивание и исследование полутонких и ультратонких срезов.

2.8. Морфометрический анализ электронно-микроскопических изображений.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Особенности ультраструктурной организации ооцитов амфибий на разных стадиях оогенеза.

3.1.1. Сравнительный анализ ультраструктурной организации ооцитов на разных стадиях оогенеза.

3.1.2. Динамика эндоплазматического ретикулума в развивающихся ооцитах амфибий: электронно-микроскопический и морфометрический анализ.

3.1.3. Структурная организация и локализация миелиноподобных структур в цитоплазме ооцитов. Последовательные стадии декомпактизации миелиноподобных структур в мембраны гладкого эндоплазматического ретикулума.

3.1.4. Морфология и динамика пористых пластинок в цитоплазме ооцитов амфибий.

3.2. Динамика ядерной оболочки в процессе развития ооцитов.

3.2.1. Структурная организация ядерной оболочки в растущих ооцитах амфибий.

3.2.2. Сборка ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в процессе роста ооцитов амфибий.

3.2.2.1. Ультраструктурная характеристика процесса сборки ядерной оболочки со стороны цитоплазмы.

3.2.2.2. Ультраструктурная характеристика процесса сборки ядерной оболочки со стороны ядра.

3.2.2.3. Нарушение сборки ядерной оболочки при инъекции в ооциты антител к нуклеопорину р62.

3.3. Взаимосвязь ядерной оболочки ооцитов ксенопуса с актин-содержащими компонентами ядерного матрикса.

3.3.1. Выявление внутриядерных актин-содержащих филаментов с помощью флуоресцентной и просвечивающей электронной микроскопии.

3.3.2. Исследование влияния латрункулина, разрушающего актиновые филаменты, на улътраструктуру ооцита.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Участие мембранных компонентов цитоплазмы ооцита амфибий в сборке ядерной оболочки.

4.1.1. Реорганизация и функциональная роль эндоплазматического ретикулума в развивающемся ооците.

4.1.2. Миелиноподобные структуры как возможный источник мембран в ранних ооцитах амфибий.

4.1.3. Возможная роль пористых пластинок в формировании ядерной оболочки и модель взаимодействия этих внутриклеточных органелл.

4.2. Новый механизм сборки ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.

4.2.1. Сходство и различия сборки ядерной оболочки в митотически делящихся и растущих неделящихся клетках.

4.2.2. Сборка ядерной оболочки в ооцитах амфибий как модель формирования ее компонентов в интерфазных ядрах соматических клеток.

4.3. Внутриядерный актин и его взаимосвязь с ядерной оболочкой.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электронно-микроскопическое исследование сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий"

Отличительной особенностью эукариотических клеток является наличие ядра и ядерной оболочки (ЯдО), обеспечивающей разделение процессов репликации и транскрипции от трансляции. Стремительное развитие молекулярно-биологических и генетических методов значительно расширило современные представления о ЯдО. Она является не просто структурным барьером, но и важной функциональной органеллой, дефекты белков которой приводят к серьезным заболеваниям человека (Worman, Courvalin, 2000; Somech et al., 2005). Поэтому исследование структуры, функции и динамики ЯдО является одной из приоритетных задач не только для фундаментальной биологии, но и для практической медицины.

Расположенные в ЯдО ядерные поровые комплексы (ЯПК) выполняют ключевую роль в обеспечении активного и пассивного транспорта различных молекул между ядром и цитоплазмой (Smythe et al., 2000; Adam, 2001; Fahrenkrog, Aebi, 2003). Процессы сборки-разборки ЯдО и ядерных пор в делящихся клетках достаточно хорошо исследованы в условиях in vitro и in vivo в митозе (Zatsepina et al., 1977; Marshal, Wilson, 1997; Burke, Ellenberg, 2002; Мамон, 2005). Однако вопрос о том, каким образом формируются новые .участки ЯдО с ядерными порами на стадии интерфазы, когда в ЯдО уже присутствуют зрелые поры и ламина, практически не исследован.

Выяснение механизмов этого процесса требует детального анализа структурной организации, функции и динамики ЯдО и ее составных компонентов, выполненных на адекватной модели с использованием комплекса различных методов. Одной из наиболее удобных моделей для исследования сборки ЯдО в ядрах растущих неделящихся клеток являются ооциты амфибий. Ядро развивающегося ооцита существенно увеличивается в размере, не претерпевая деления, соответственно, растет и ЯдО. Эта особенность, в сочетании с крупными размерами клетки, определяет преимущество ооцита как подходящего объекта для изучения механизмов формирования ЯдО. Цели и задачи работы

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы выяснить механизм сборки ядерной оболчки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий и определить возможное участие внутриклеточных структур в этом процессе. Для осуществления заданной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Сравнить ультраструктурную организацию ооцитов амфибий на разных стадиях их развития.

2. Провести морфологический и морфометрический анализ динамики мембран ЭПР в растущем ооците.

3. Оценить возможное участие пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, в процессе формирования ядерной оболочки.

4. Проанализировать ультраструктурную динамику ядерной оболочки и ядерных пор в процессе роста ядра ооцита, в частности, определить, изменяется ли плотность распределения пор в ядерной оболочке на разных стадиях оогенеза.

5. Исследовать влияние инъекции антител к нуклеопорину р62, входящему в состав центрального отдела ядерного порового комплекса, на формирование ядерной оболочки и ядерных пор в ооцитах амфибий.

6. Сравнить механизм сборки ядерной оболочки в ооцитах амфибий и в митотически делящихся клетках синцитиальных эмбрионов дрозофилы на стадии интерфазы. На основании полученных данных создать модель формирования ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.

7. Определить локализацию внутриядерного актина и его взаимодействие с ядерной оболочкой.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе проведен сравнительных анализ ультраструктурной организации растущих ооцитов амфибий на разных стадиях оогенеза. Установлено, что в процессе развития, одновременно с ростом ооцита и его ядра, меняется равномерность распределения пор в ЯдО. Параллельно наблюдается перераспределение внутриклеточных органелл в цитоплазме ооцита.

Впервые в цитоплазме ранних ооцитов обнаружены компактные миелиноподобные структуры, способные разворачиваться в мембраны ЭПР. Продемонстрирована четкая корреляция между стадией развития ооцита и распределением мембран ЭПР в определенной области цитоплазмы. На ИНУ стадиях оогенеза зарегистрировано множественное слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и появление вблизи мест слияния фрагментов ЯдО, не имеющих пор. Гладкие мембранные пузырьки также обнаружены вблизи внутренней ядерной мембраны, что позволяет предположить возможность перемещения части мембраны пузырька через мембранный компонент ядерной поры внутрь ядра и во многом доказывает участие ЭПР в сборке наружной и внутренней ядерной мембран.

Впервые в ооцитах амфибий зарегистрировано слияние пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, с наружной мембраной ЯдО, что доказывает причастность этих органелл к формированию новых участков ЯдО в этих клетках.

На уровне электронной микроскопии установлено, что сборка ЯПК в растущей ЯдО ооцита происходит через формирование промежуточных структур, и выявлены последовательные этапы этого процесса. Обнаружено, что блокирование нуклеопорина р62, одного из белков центрального отдела ЯПК, приводит к нарушению формирования поровых комплексов в растущей ЯдО.

Сочетание методов флуоресцентной и электронной микроскопии позволило выявить внутри ядра ооцитов актин-содержащие филаменты. Установлено, что при инкубации ооцитов с агентом, деполимеризующим филаментный актин, существенно изменяется морфология цитоплазмы и ядра, нарушается строение ЯдО. Обнаружение актин-содержащих филаментов в ядре ооцита открывает новые возможности для изучения функций внутриядерного актина, его роли в динамике внутрядерных структур и взаимодействии с актиновым цитоскелетом.

Проведенное детальное ультраструктурное исследование развивающихся ооцитов демонстрирует единство и тесную взаимосвязь мембранных компонентов клетки. С помощью методов флуоресцентной и электронной микроскопии удалось убедительно продемонстрировать, что формирование ЯдО - это сложный процесс, в который вовлечены различные внутриклеточные структуры. Данная работа подтверждает необходимость комплексного подхода, подразумевающего анализ динамики всех взаимосвязанных клеточных органелл с использованием различных методов, при проведении аналогичных исследований на других объектах.

Результаты проведенного исследования имеют существенное значение для понимания процессов, происходящих на самых ранних этапах оогенеза, и могут быть использованы в работах по изучению организации созревающих и оплодотворенных яйцеклеток, а также эмбриональных клеток. Результаты проведенных исследований имеют фундаментальное значение, поскольку демонстрируют новые аспекты происходящих в ооците процессов, предшествующих оплодотворению.

Полученные в работе данные представляют также определенный теоретический интерес, поскольку рост ооцита напоминает, в определенной степени, рост соматической клетки на стадии интерфазы, и формирование новых участков ЯдО ооцита происходит, как и в интерфазных ядрах, в уже существующей ЯдО, содержащей зрелые ЯПК и ламину. Можно предположить, что формирование ЯдО может проходить в интерфазных ядрах по аналогичному механизму.

Материалы диссертационной работы, опубликованные в обзорной статье в журнале «Цитология» (Морозова и др., 2005), используются при чтении лекций на Кафедре генетики и селекции в Санкт-Петербургском государственном университете и могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов других университетов. Апробация работы

Результаты, представленные в диссертации, докладывались на отчетной сессии Института цитологии и генетики в 2005 г. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались также на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: XLI Международная научная студенческая конференция (Новосибирск, 2003); 3-я Международная научная конференция «Актуальные проблемы современной биологии и биотехнологии» (Астана, Казахстан, 2003); 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Россия, Пущино, 2003); Международный Симпозиум по проблемам Мейоза (Санкт-Петербург, 2003); Российско-Китайский Симпозиум «Наука о жизни» (Пущино, 2004); 8-я Азиатско-Тихоокеанская Конференция по Электронной Микроскопии (Канадзава, Япония, 2004); III съезд ВОГиС (Москва, 2004); Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, Беларусь, 2004); Школа-Семинар Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Молекулярный Транспорт. Каналы и Транспортеры» (Эриче, Сицилия, Италия, 2005); 7-й Межнациональный Микроскопический Конгресс (Портороз, Словения, 2005); Конференция Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Структура и динамика клеточного ядра» (Гран-Мотте, Франция, 2005); XV Всероссийское Совещание «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург. 2005); Школа-Семинар

Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Клеточные мембраны: организация и динамика» (Бильбао, Испания, 2006); 16-й Международный

Микроскопический Конгресс (Саппоро, Япония, 2006).

Список публикаций по теме диссертации

По теме диссертационного исследования опубликованы 3 статьи и 12 тезисов в сборниках конференций и симпозиумов, 2 статьи приняты в печать.

1. Семакова К.Н., Киселева Е.В. Структурная динамика и взаимосвязь ядерной оболочки и эндоплазматического ретикулума в растущих ооцитах амфибий. Материалы XLI Международной научной студенческой конференции. Новосибирск, 2003. С. 37.

2. Semakova К., Kiseleva Е. A new source of membranes in amphibian oocytes, The Third International scientific conference "Actual problems of contemporary biology and biotechnology" Astana, Kazakhstan. 2003. Abstract book. P. 190-191.

3. Семакова K.H., Киселева Е.В. Миелиноподобные структуры - возможный источник мембран в растущих ооцитах амфибий. Сборник тезисов 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Россия, Пущино. 2003. С. 41-42.

4. Киселева Е.В., Семакова К.Н. Тайны внутриклеточного зодчества. Химия и жизнь. 2003. № 10 : 14-15.

5. Семакова К.Н., Киселева Е.В. Динамика эндоплазматического ретикулума и ядерной оболочки в мейозе у амфибий. Международный Симпозиум по проблемам Мейоза. Санкт-Петербург, 2003. Цитология. 2003. 45(9): 923.

6. Семакова К.Н., Киселева Е.В. Миелино-подобные структуры как возможный источник гладкого эндоплазматического ретикулума в ранних ооцитах амфибий. Цитология. 2003. 45(8): 246-257.

7. Morozova К., Kiseleva Е. Cytoplasmic annulate lamellae are specific organelles of actively growing and rapidly dividing cells. Materials of Russian-Chinese Symposium "Life Science". Puschino, Russia, 2004. P. 122.

8. Morozova K., Kiseleva E. New model of nuclear envelope assembly using endoplasmic reticulum vesicles. 8th Asia-Pacific Conference on Electron Microscopy (8APEM) Kanazawa, Japan. 2004. P. lb.

9. Морозова К.Н., Аллен Т.Д., Киселева Е.В. Исследование механизмов формирования внутренней ядерной мембраны в растущих ооцитах амфибий. III съезд ВОГиС Генетика в XXI: современное состояние и перспективы развития. 2004. Т.И С. 263.

Ю.Морозова К.Н., Киселева Е.В. Возможная функция окончатых мембран в опухолевых и активно делящихся клетках. Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск, Беларусь, 2004. С. 92-93.

11.Morozova K.N., Kiseleva E.V. Striking myelin-like structures unwrapping in Xenopus oocytes: a source of membranes or the store of their excess? 7th Multinational Congress on Microscopy. Portoroz, Slovenia, 2005. Abstract book. P. 27.

12. Kiseleva, E, Morozova, K., Goldberg, M.W., Rutherford, S., Allen, T.D. New mechanism of nuclear envelope ancl nuclear pore assembly in growing nuclei. Abstract Book of the EMBO/FEBS Conference on Nuclear Structure and Dynamics. La Grande Motte, France, 2005. P-081

13. Морозова K.H., Губанова H.B., Киселева Е.В. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры. Цитология. 2005. 47(8): 667-678.

14. Киселева Е.В., Морозова К.Н., Голдберг М.В., Разерфорд С., Аллен Т.Д. Новый механизм сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих неделящихся ядрах. Материалы XV Всероссийского Совещания «Структура и функции клеточного ядра». Санкт-Петербург. Цитология. 2005. 47(9): 814.

15. Morozova K.N., Kiseleva E.V. Defects in nucleo-cytoplasmic transport ancl nuclear pore complexes assembly caused by immunodepletion of p62 nucleoporin. Matherials th of 16 International Microscopy Congress. Sapporo, Japan, 2006. P. 369.

16. Губанова H.B., Морозова K.H., Киселева Е.В. Структурная организация, функция и динамика ядерных пор. Цитология. 2006. 48(11) (принята в печать).

17. Морозова К.Н., Киселева Е.В. Морфометрический анализ динамики эндоплазматического ретикулума в растущих ооцитах амфибий. Цитология. 2006. 48(12) (принята в печать).

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Киселевой Елене Владимировне за чуткое и внимательное руководство работой, за всестороннюю поддержку, идейное вдохновление, неисчерпаемый энтузиазм и проявленное терпение. Особые слова благодарности автор выражает заведующему лабораторией Рубцову Н.Б. за помощь в освоении методик работы на конфокальном микроскопе, а также за ценные советы на разных этапах подготовки диссертационной работы, плодотворное обсуждение результатов и ценную критику. Автор признателен Губановой Н.В. за предоставленные образцы эмбрионов дрозофилы. Отдельно хотелось бы поблагодарить Байбородина С.И. за неоценимую помощь в освоении методов электронно-микроскопического анализа и Мельникова В.А. за техническую поддержку, без которой было бы невозможно получение результатов. Автор выражает искреннюю признательность Алешиной Т.Е. за помощь в освоении флуоресцентной микроскопии. Также хотелось бы выразить слова благодарности всему коллективу Лаборатории морфологии и функции клеточных структур за искреннюю помощь и советы по выполнению работы и за постоянную моральную поддержку.

Список использованных сокращений;

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота ГДФ - гуанозиндифосфорная кислота ГТФ - гуанозинтрифосфорная кислота МПС - миелиноподобные структуры ПП - пористые пластинки ППК - пороподобный комплекс ЭПР - эндоплазматический ретикулум ЯдО - ядерная оболочка ЯПК - ядерный поровый комплекс

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Морозова, Ксения Николаевна

Глава 5. ВЫВОДЫ

1. Увеличение площади поверхности и объема мембран ЭПР в околоядерной области ооцита на 3-й стадии оогенеза может быть обусловлено сборкой новых фрагментов растущей ядерной оболочки.

2. Пористые пластинки, входящие в состав ЭПР и содержащие цитоплазматические поры, могут сливаться с наружной мембраной ядра и служить источником мембран и нуклеопоринов для собирающейся ядерной оболочки и ядерных пор.

3. В цитоплазме ранних ооцитов амфибий впервые выявлены миелиноподобные структуры, которые могут выполнять роль депо мембран для эндоплазматического ретикулума на стадиях интенсивного роста и развития ооцита.

4. Сборка ядерных поровых комплексов происходит через формирование промежуточных структур. Блокирование встраивания нуклеопорина р62 в ядерную пору нарушает начальные этапы ее сборки в растущих ооцитах амфибий.

5. Предложена модель сборки ядерной оболочки в растущих ооцитах амфибий за счет слияния пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и перемещения части мембраны пузырька внутрь ядра. Сближение двух фрагментов мембраны пузырька формирует новый участок ядерной оболочки, в котором инициируется сборка новых ядерных пор.

6. Электронно-микроскопический анализ выявил в ядрах ооцитов актин-содержащие филаменты, контактирующие с ядрышками и ядерными поровыми комплексами. Деполимеризация этих филаментов нарушает морфологию ядра. Предполагается, что данные филаменты вовлечены во внутриядерный и ядерно-цитоплазматический транспорт, а также в сборку новых фрагментов ядерной оболочки.

Заключение.

В настоящей работе проведено сравнительное исследование ультраструктурной организации ооцитов амфибий на разных стадиях их развития. Сочетание морфологического и морфометрического анализа позволило установить, что в процессе оогенеза происходит существенная реорганизация внутриклеточных органелл. Так например, в ходе развития ооцита отмечается перемещение мембран ЭПР с периферии клетки в центр, к ядру. На ПНУ стадиях роста ооцита, сопровождающихся активацией транскрипции, происходит увеличение относительной протяженности и площади мембран ЭПР в средней и околоядерной областях цитоплазмы и уменьшение этих параметров в периферическом отделе клетки. Одновременно наблюдается множественное слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной, что может свидетельствовать об активном использовании компонентов ЭПР для формирования новых фрагментов растущей ЯдО. В целом, в ходе развития ооцита, увеличивается общий объем и площадь поверхности мембран ЭПР. Предполагается, что выявленная реорганизация ЭПР в растущих ооцитах амфибий обусловлена процессами накопления желтка -виттелогенеза, перераспределением ионов Са2+, синтезом и запасанием белков и липидов, необходимых для обеспечения развития будущего эмбриона, а также сборкой новых фрагментов растущей ЯдО.

При ультраструктурном исследовании цитоплазмы ранних ооцитов амфибий (1-П стадии развития) нами впервые были обнаружены миелиноподобные структуры (МПС), способные декомпактизоваться в мембраны гладкого ЭПР. МПС встречались также и в межклеточном пространстве между ооцитом и фолликулярной клеткой, причем при контакте МПС с плазматической мембраной ооцита в прилежащих участках цитоплазмы ооцита появлялись многочисленные мембраны ЭПР. Таким образом, присутствие МПС в ранних ооцитах может быть обусловлено активизацией процесса синтеза и сборки новых мембранных компонентов, в частности, ЭПР и ЯдО в клетке.

На уровне электронной микроскопии мы исследовали организацию пористых пластинок (ПП) в цитоплазме ооцитов амфибий и установили сходство и различие встроенных в них пороподобных комплексов с ядерными порами. Впервые было продемонстрировано прямое слияние ПП с наружной ядерной мембраной, что подтвердило существующее ранее предположение о возможной функции ПП в качестве депо мембран и нуклеопоринов для ЯдО и ЯПК. Предложено несколько моделей использования ПП для формирования новых ЯПК в растущей ЯдО.

Используя различные методы электронной микроскопии, мы воссоздали последовательные этапы формирования новых фрагментов ЯдО и сборки ЯПК. Согласно предложенным моделям этих процессов, рост ЯдО в ядре ооцита происходит при непосредственном участии пузырьков ЭПР, а формирование новых ЯПК инициируется вблизи участков слияния пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной. Выяснилось, что сборка зрелой ядерной поры осуществляется через промежуточные структуры, в которых сначала собираются центральные компоненты ЯПК, а затем периферические.

Поскольку рост ядра ооцита в какой-то степени аналогичен росту ядра соматической клетки на стадии интерфазы, было высказано предположение о том, что формирование новых фрагментов ЯдО и сборка новых ЯПК в интерфазных ядрах будет протекать по сходному сценарию. Исследования, проведенные на ранних эмбрионах дрозофилы, свидетельствуют в пользу этой гипотезы.

В настоящей работе с использованием конфокальной и электронной микроскопии продемонстрировано наличие актин-содержащих филаментов в ядрах ооцитов амфибий. Показано, что воздействие агента, разрушающего актиновые филаменты, приводит к значительным нарушениям как в цитоплазме, так и в ядре. Выявленный в ходе электронно-микроскопического анализа тесный контакт внутриядерных актин-содержащих филаментов с ядрышковым материалом и с ядерными порами, в совокупности с литературными биохимическими данными, позволяет предполагать существование внутриядерного актинового каркаса, динамически взаимодействующего с компонентами ядра и участвующего во внутриядерном, а также, возможно, в ядерно-цитоплазматическом транспорте молекул. Соединяя внутриядерные структуры напрямую с ядерными порами, актин-содержащие филаменты могут, вероятно, обеспечивать путь для направленного транспорта материала внутри ядра и его быстрого экспорта в цитоплазму. Полученные данные свидетельствуют также о возможном участии актин-содержащих филаментов в формировании ЯдО.

Таким образом, выполненная диссертационная работа может рассматриваться как новый важный шаг в изучении механизмов сборки ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Морозова, Ксения Николаевна, Новосибирск

1. Авакян A.A., Кац JI.H., Минеева JI.A., Ратнер E.H., Гусев М.Б. Электронно-микроскопические данные о мезосомоподобных и миелиноподобных структурах у синезеленых водорослей // Микробиология. 1978. Т. 47. №. 4. С. 739-744.

2. Айзенштадт Т.Б. Цитология оогенеза // Москва: Наука, 1984.

3. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки // Москва: Мир. 1987. Т. 4.

4. Груздев А.Д. Применение стереологических методов в цитологии // Новосибирск: Наука, 1974.

5. Губанова Н.В., Киселева Е.В. Структурная организация, функция и динамика ядерных пор // Цитология. 2006. Т. 48. № 11. (принята в печать).

6. Дэвидсон Э. Действие генов в раннем развитии // Москва: Мир, 1972.

7. Лебкова Н.П., Смольянников A.B. О механизмах обратимости жировой дистрофии // Арх. Патол. 1983. Т. 45. №. 7. С. 41-47.

8. Мамон Л. А. Взаимоотношения между ядерно-цитоплазматическим транспортом и расхождением хромосом // Цитология. 2005. Т. 47. № 3. С. 263280.

9. Морозова К.Н., Губанова Е.В., Киселева Е.В. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры // Цитология. 2005. Т. 47. № 8: 667-678.

10. Парфенов В.Н., Галактионов К.И. Внутриядерные актиновые микрофиламенты в ооцитах травяной лягушки // Цитология. 1987. Т. 29. № 2. С. 142-149.

11. Семакова К.Н., Киселева Е.В. Миелиноподобные структуры как возможный источник гладкого эндоплазматического ретикулума в растущих ооцитах амфибий // Цитология. 2003. Т. 45 N. 8. С. 746-757.

12. Семченко В.В., Хижняк A.C. Ультраструктурные изменения астроцитов собаки в пост-ишемический период (морфометрический анализ) // Морфология. 2001. Т. 119 №.2. С. 15-19.

13. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих // Москва: Мир, 1975.

14. Христолюбова Н.Б. Функциональная морфология цитоплазматических органелл // Новосибирск: Наука, 1972.15.