Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрофизиологические и фармакологические характеристики различных типов кальциевых каналов пирамидных нейронов гиппокампа и клеток Пуркинье крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электрофизиологические и фармакологические характеристики различных типов кальциевых каналов пирамидных нейронов гиппокампа и клеток Пуркинье крысы"

РГ6 од

8 0 НТ 1996 ^ац’ональна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

На правах рукопису

Панченко Віктор Анатолійович

Електрофізіологічні та фармакологічні характеристики різних типів кальцієвих каналів пірамідних нейронів гіпокампу та клітин

Пуркіньс щурів.

03.00.05 - Біофізика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1996

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі фізикохімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: член-кореспондеігг НАН України Олег Олександрович Кришталь Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім.

О.О.Богомольця НАН України за адресою м. Київ вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім.

О.О.Богомольця НАН України.

Валентин Леонідович Зима, доктор фізико-математичних наук Віктор Іванович Тесленко.

Провідна установа: Інститут біохімії їм. А.В. Паладіна.

Захист відбудеться

Автореферат розісланий «

* > 199£р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця

доктор біологічних наук

Зоя Олександрівна Сорокіна-Маріна.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ ,

Актуальність проблеми. Кальцієві канали, що керуються потенціалом плазматичної мембрани збудливих клітин, утворюють один з основних шляхів надходження іонів кальцію із зовнішнього середовища у клітину. Відкривання цих каналів у відповідь на деполярізацію та генерація вхідного струму обумовлює регулювання мембранного потенціалу та у значній ступені визначає характеристики потенціала дії, що генерується клітиною. Крім сигнальної функції, кальцієві канали грають важливу роль у сполученні електричної активності плазматичної мембрани із різними рецепторними механізмами та внутриклітинними процесами. Це обумовлюється участю іонів кальцію у багатьох біохімічних реакціях, які визначають специфічну клітинну активність. В останні роки з'явилися нові дані про роль взаємозв'язку надходження іонів кальцію у клітину та активації різних регуляторних каскадів, що керуються внугриклітинним АТФ та іншими нуклеотидами. Кальцієві канали є важливим елементом у сполученні електричного збудження із різноманітними процесами усередені клітини, вони контролюються не тільки потенціалом, але й цілим рядом мембранних рецепторів. Цей допоміжний контроль дозволяє більш тонко керувати надходженням кальцію у клітину за рахунок модулюючого або регулюючого впливу на канал певних гормонів або нейротрансміттерів через системи внутриклітинних посередників.

На сучасному етапі встановлено, що диаденозин-поліфосфати, що містяться поряд із АТФ у секреторних гранулах, а також їх спільний кальцій-залежний викід після стимулюючої дії, впливають на сигнальні процеси міжклітинної взаємодії. Більшість з цих питань до початку нашої роботи були явно недостатньо досліджені, саме через це застосування метода "patch clamp" дозволило отримати нові важливі результати, які здатні суттєво розсунути наші знання про функціонування кальцієвих каналів збудливих клітин.

Поряд із дослідженнями процесів модуляції кальцієвих каналів, важливим є пошук та дослідження нових блокаторів цих каналів. Відомо, що кальцій, який потрапляє у клітину із зовнішнього середовища через кальцієві канали, грає важливу роль у підтриманні та керуванні багатьох внутриклітинних процесів.

Іони кальція виконують регуляторну роль у таких процесах як іонна проникливість мембрани, виділення медіаторів у хімічних синапсах, м’язеве скорочення, у процессах клітинної диференціровки та інш.

Порушення регуляції, що відбувається завдяки надлишкового входу кальція у клітину, досить часто є причиною таких явищ, як ішемічне порушення та кальцієва смерть клітин. На рівні цілого організму у багатьох випадках це спричиняє різні захворювання нервової та серцево-судинної систем. Зараз існує ряд антагоністів кальцієвих каналів, що здатні селективно блокувати той чи інший тип каналів, таким чином впливаючи на певні внутриклітинні процеси. Застосування цих нейропротекторних засобів сприяє запобіганню перевантаження клітин зовнішнім кальцієм. Але властивості відомих антагоністів кальцієвих каналів не завжди задовольняють вимогам сучасної медицини, у зв'язку з чим пошук та вивчення нових антагоністів, що мають певні властивості, є актуальною задачо», яка розв'язується у межах електрофізіологічного дослідження мембран збудливих клітин.

Вивчення можливих ендогених модуляторів кальцієвих каналів, таких як аденозин та диаденозин-поліфосфати, визначення взаємозв'язку між їх впливом на ізольовані нейрони та фізіологічними функціями ЦНС також становить безперечний науковий інтерес.

Мета та задачі дослідження. Основна мета роботи - провести комплексне дослідження властивостей кальцієвих каналів, що керуються потенціалом плазматичної мембрани декількох типів клітин ЦНС щура. Вивчити їх основні електрофізіологічні та фармакологічні характеристики, а також з'ясувати механізми регуляції цих каналів за допомогою модулюючого впливу диаденозин-поліфосфатів на аденозинові рецептори.

1. Застосувати метод фіксації потенціала у конфігурації "whole cell" для вивчення властивостей кальцієвих каналів пірамідних нейронів гіпокампа та нейронів Пуркіньє щура.

2. Ідентифікувати типи потенціалзалежних каналів, що становлять основу кальцієвої провідності пірамідних клітин гіпокампа та клітин Пуркіньє мозочка.

3. З'ясувати особливості потенціалзалежності, кінетики та фармакології іонних струмів крізь кальцієві канали високопорогових та низькопорогових типів.

4. Вивчити дію нового блокатора кальцієвих каналів 1156865 у порівнянні із дією відомих блокаторів німодипіна та флунарізина на високопорогові та низькопорогові кальцієві струми.

5. Визначити вплив аденозина, диаденозин-поліфосфатів, аналогів АТФ, що не гідролізуються, на кальцієві струми та з'ясувати чи має місце прямий регуляторний вплив родини аденозинових рецепторів на кальцієві канали. У випадку виявлення такої дії оцінити її внесок у сумарний регуляторний ефект, що викликається природними агоністаюі через відповідні мембранні рецептори. Наукова новина роботи.

1. Визначені загальні та відмінні властивості високо- та низькопорогових кальцієвих струмів у нейронах Пуркіньє мозочка та у нейронах гіпокампа.

2. Проаналізовані електрофізіологічні та фармакологічні характеристики іонних струмів через кальцієві канали різних типів. Досліджено їх взаємозв'язок

із аденозиновими рецепторами.

3. Виявлено характер впливу нового блокатора 1156865 на основні електрофізіологічні характеристики високо- та низькопорогових струмів через кальцієві канали нейронів мозочка. Проведено порівняльний аналіз фармакологічної дії 1*56865 із дією німодипіна та флунаризина.

4. Вивчені особливості явища модуляції високопорогових струмів через кальцієві канали нейронів гіпокампа диаденозин-поліфосфатами. Проведено порівнянім модулюючого ефекга аденозина, АТФ та диаденозин-поліфосфатів на кальцієві канали.

5. Проведено фармакологічний аналіз ефекга потенціації струмів крізь кальцієві канали диаденозин-поліфосфатами за допомогою сучасних селективних антагоністів аденозинових рецепторів. Виявлена участь рецепторів Р4 типа у модуляції кальцієвих каналів нейронів гіпокампа.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Отримані результати мають, поперед всього, фундаментальний інтерес, оскільки дозволяють суттєво розвинути уяву про загальні та відмінні властивості кальцієвих потендіалзалежних каналів різних типів та пов'язаних із ними рецепторів у нейронах ЦНС ссавців. Стосовно цього питання нові дані є важливими при формуванні більш повної уяви про фізіологічну роль високопорогових кальцієвих каналів, а також при пошуках нових засобів скерованного фармакологічного впливу на них. Вивчення модуляції кальцієвих каналів відчиняє можливість об'єднання у рамках загального підходу даних по модуляції кальцієвих струмів та даних по регуляції рецепторних механізмів, що пов'язані із кальцієвими каналами.

Дослідженій впливу ко-медіаторів на синаптичні процеси на сучасному етапі перебувають у початковому стані. Важливим кроком уперед є аналіз модуляції кальцієвих каналів за допомогою специфічних рецепторів диаденозин-поліфосфатів у гіпокампі. Це дозволяє розсунути сучасні знання про родину аденозинових рецепторів у ЦНС ссавців.

Результати досліджень про прямий вплив R56865 на кальцієві струми та його відмінність від флунарізина дозволяють оцінювати доцільність застосування цього препарату у медицині поряд із традиційним використанням флунарізину. Знання впливу різних типів блокаторів кальцієвих каналів дозволяє розробляти оптимізовані з точки зору ефективності фармакологічні засоби захисту від перевантаження нервових та інших клітин позаклітинним кальцієм. Досліджений препарат R56865 представляє новий клас сполук, що запобігають ішемії та кальцієвій смерті. Зміна електрофізіологічних характеристик кальцієвих струмів під впливом R56865, німодипіна та флунаризину є одним з визначальних факторів, на який зважають при цілеспрямованому пошуку нових нейропротекторних препаратів.

Апробація роботи. Основні положення роботи були викладені на міжнародних симпозіумах Biophysical Society Annual Meeting (San-Francisco 1995), Physiological Society (Oxford, 1995), а також на семінарах секції біофізики і засіданні вченої ради Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця (Київ 1996).

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень та екпериментальної частини, обговорення результатів, 7 висновків та списку літератури з 283 найменувань. Роботу викладено на 120 сторінках друкованного тексту та ілюстровано 16 рисунками. За тематикою роботи опубліковано 6 робіт.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводилися на ізольованих нейронах гіпокампу та клітинах Пуркіньє мозочка щура. Нейрони, що відносяться до різних зон гіпокампу морфологічно легко ідентифікувалися. Експерименти проводилися на щурах 12-

14 денного віку. До цього періоду у них завершується диференціровка пірамідних нейронів [Гамбарян, Коваль, 1977], а розвиток елементів сполучної тканини ще не заважає ферментативній ізоляції нейронів. У випадку дослідження клітин Пуркіньє вік щура був менший (8-12 діб). Після декапітації тварини гипокамп швидко виділювали та переносили у розчин складу (у гпМ): NaCl 150, КС1 5, NaHC03 26, глюкоза 20, КН2РО4 1.25, СаСІ2 2, MgCl2 2, pH 7.4 (розчин А), де тонким лезом під мікроскопічним контролем готували зрізи гіпокампу товщиною 300-400 цм. Зрізи переносили у розчин ферменту, що містить (у шМ): NaCl 150, КС1 5, NaHCOj 26, СаСІ2 0,5, EGTA 1, глюкозу 10 (розчин Б) та насичений карбогеном (95% О2 и 5% СО2 ), pH 7.4. Ферментативная обробка (Aspergillus oryzae, Sigma, США) проводилася при 33 °С на протязі 30 хвилин при постійному перепусканні крізь розчин карбогену. Потім проводили тривалу відмивку зрізів від ферменту, спочатку у розчині Б на протязі 20 хвилин, а потім у розчині А. Такі зрізи використовувалися для отримання ізольованих нейронів на протязі 8-10 годин. Таким чином отримували ізольовані пірамідні нейрони (зон СА1 та САЗ), які ідентифікували за їх характерною формою. Ізольовані нейрони зберігали невелиху частину апікальних та базальних дендритів, мали діаметр 15-20 цм та довжину тіла клітини 30-50 рм. Процедура виділення клітин Пуркіньє мозочка та розчини для обробки були ті ж. Час обробки у розчині Б становив 20 хвилин.

Для реєстрації іонних струмів крізь мембрану дослідних нейронів був застосован метод внутриклітинної перфузії [Kostyuk et al., 1984] у модифікації із

використанням скляних мікропіпеток. Піпетки заповнювалися розчином, що містить (у юМ) Трис-РС>4 70, Трис-С1 20, EGTA 5, MgCl^ 5, Трис-С1 20, АТФ 5, ГТФ 0.5 (рН=7.3), опір піпетки не був більш, ніж 5 МОм. Склад позаклітинного розчину (у шМ): NaCl 150, СаСІ2 2, MgCl2 2, HEPES-NaOH-20 (рН=7.4).

При дослідженні струмів крізь Са2+ канали застосовували розчин, що містить (у тМ): ВаСІ2 20, холін-хчорид 70, ТЭА-С1 40, Трис-С1 20, рН=7.4. Експерименти проводилися при кімнатній температурі 20-23 С°. Зміна

позаклітинних розчинів проводилася за методом фіксації концентрації за допомогою установки "Jumping Table" (Chizhmakov et al. 1992, Parsons, Panchenko et al. 1996).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

R56865 як блокатор Са2+ каналів нейронів Пуркіньє щура. Порівняння із

німодипіном та флунарізином.

Практично всі дослідні нейрони демонстрували наявність низькопорогових Са2+ струмів. Початок активації цих струмів при зсуві мембраною потенціалу на 200-300 мс від підтримуючого потенціалу (ПП) -100 mV реєструвався при тестовому потенціалі (ТП) від -60 до -50 mV. Час досягнення піку даного струму при ТП -10 mV становив 8-12 мс, стала часу падіння дорівнювала 40-50 мс. Реєстрацію низькопорогових Са2+ струмів (НПС) у "чистому вигляді” проводили із використанням фтор-вмісного внутриклітинного розчину. Високопорогові Са2+ канали (ВПК) інгибувалися за рахунок впливу іонів F' на протязі 5-10-ти хвилин. Про повне інгибування свідчило поступове зникнення характерної сталої складової ("плато") реєстрованого струму. В експериментах на клітинах Пуркіньє концентрація Са2+ у позаклітинному середовищі була 10 піМ, що дозволяло знизити струми витіку та збільшити амплітуду струму. Час природного половинного зменшення струму (природний run-down) становив 15-25 хвилин, а максимум вольт-амперної характеристики спостерігався на потенциалах від -30 до -10 mV.

У концентраційних границях від 0.01 до 10 цМ Я56865 блокував НПС при різних ТП. Досягнення стаціонарного рівня блокування спостерігалося після 2 хвилин прикладання антагоністу. Вольт-амперні характеристики (ВАХ), які були зафіксовані у контролі та під дією 0.1 цМ 1156865 демонструють відсутність потенціал-залежності ефекту блокування (Рис. 1). Враховуючи процес піп-(1о\уіі, повне відновнення струму після прикладання 1-10 цМ 1*56865 проходило через 4-7 хвилин (при стимулюючій частоті 1 раз на хвилину), тобто ефект блокування є зворотнім.

Вимірення стаціонарної інактивації (Н^) НПС проводилося при попередньому 30-ти секундном зсуві мембраного потенціалу із наступним вимірюванням струму, який активується на максимумі ВАХ (Рис. 2). При ПП від -40 до -140 тУ до та під час прикладання 0.1 |дМ 1156865, амплітуди струмів нормувалися на амплітуду максимального струму, що реєструвався при -140 тУ. Експериментальні дані достатньо добре апроксимувалися рівнянням Больцмана:

Рис. 2А демонструє, що під дією 0.1 цМ 1156865 відбувається зсув кривої стаціонарної інактивації на 20+3 тУ у бік більш від’ємних мембранних

І/Ішах=1/(1+ЄХР(У- Уо)Д).

Рис.1. Блокуюча дія 1156865, флунарізину (Пи) та А

V (тУ)

німодипіну (Міт) иа НПС у нейронах Пуркіньє.

Праворуч: ВАХ у контролі (•) та під дісю антагоністу (о), ПП -100 тУ, міжімпульсовий інтервал 30 с. Ліворуч: записи струмів у тих самих клітинах при ТІЇ -20 тУ. Час інкубації у розчинах, що містять антагоністи становив: 1 хв. для 1*56865, 2 хв. для

флунарізину та 3 хв. для німодипіну.

В

-60-40 -20 0 20

V (т'/)

І <РА)

■300

100 те

1 (рА)

С

V (тУ)

І (рА)

100 тз

потенціалів. Тут та далі величина зсуву кривої 1^ обчислювалася як різниця параметрів У0 у контролі та під дією антагонисту ± систематична похибка вимірювань.

Флунарізин блокував Са2+ струми у більш високих концентраціях, ніж Я56865. Його блокуюча здатність є також оборотньою. Час повного відновлення струму, враховуючи гип-(1ошп становив 4-9 хвилин та зростав за мірою збільшення прикладеної концентрації блокатора. Вимірена для 5-ти нейронів крива 1іж для НПС зсувалася на 10+3 іпУ у бік більш від’ємних потенціалів під

дією 0.5 цМ флунарізину (Рис. 2В).

Німодипін практично повністю блокував НПС у нейронах Пуркіньє мозочка у концентрації 10 иМ, а у концентрації 0.2 (іМ майже не впливав на їх амплітуду. ВАХ зсувалася під дією цього антагоністу на 10±2 пі\; (середнє для чотирьох вимірювань) у бік більш позитивних потенціалів. Блокуюча дія підсилювалася при більш від’ємних потенціалах, що свідчило про потенціал-залежність ефекту блокування НПС (Рис. 1С). Стаціонарна інактивація, вимірена у контролі та в присутності 5 (іМ німодипіна зсувалася незначно (6±2 тУ, середне для п’яти вимірювань), у порівнянні з 13.56865 та флунарізином, хоча дослідження

А

В

і ....

0.8

0.6

0.4

0.2

0

0.1 ми ¡06815

V (тУ)

Ь.

1г-

V Соаігоі

•ч 0.8

0

■-о \ 0.6

\ > 0.4

\0 \

Ч°Ч 0.2

. ;--9. Л - - ЮО -60 -60 -40 0

V (тУ)

Ь.

1г-

0.8

0.6

¥ 0.4

ч

. \ Ъ ♦ 0.2

д

*60 -60 -40

-гЖ.

-140 -120 -100 -80 -60 -40 V (тУ)

С

Рис.2. Вплив антагоністів Са^+ каналів на стаціонарну інактивацію НПС у нейронах Пуркіньє у контролі (•) та під дією антагоніста (о). Амплітуди струмів, вимірені при різних ПП нормувалися на амплітуду струму при потенціалі -140 ітіУ. Кожна пара кривих є апроксимацією даних рівнянням: І/Ітах=!/'(1 +е\р(У'-\'0)Д) методом найменших квадратів (для 15-ти клітин у контролі та 5-ти клітин у кожному антагоністі). Параметри у контролі та під дією сполук: У0=-84 тУ, к=8 шУ (контроль); Уо=-104 тУ, к=8 тУ (1156865); У0=-94 тУ, к=8 тУ (флунарізин); Уо=-90 тУ, к=8 тУ (німодипін).

для німодипіну проводили при концентрації на порядок більшої, ніж для 1156865 та флунарізину (Рис. 2С).

Крім ВАХ та стаціонарної інактивації важливим аспектом є визначення характеру блокування від частоти стимулюючого імпульсу (ше-сіерепсіепсе). Ступінь блокування Са2+ струмів флунарізином залежить від частоти та тривалості деполяризуючого імпульсу (ДІ). У наших експериментах ДІ подавався на клітини серією імпульсів. Зсув потенціала проводили від -100 тУ до -20 тУ, тривалість імпульсу становила 200мс. Частота стимуляції у серіях імпульсів становила 1 імпульс на 5 секунд (часта стимуляция) та 1 імпульс на 60 секунд (рідка стимуляція). Аналіз характеру блокування проводили за допомогою реєстрації залежності амплітуди струму від часу (часового ходу), яка наведена на Рис.З. У контрольному розчині проводили записи амплітуд струмів при частій, а потім при рідкій стимуляції після чого клітину переносили у розчин, що містив флунарізин та повторювали вимірювання, продовжуючи стимулювати клітину із частотою 1 раз на хвилину. Коли минуло чотири хвилини частота стимуляції збільшувалася, потім флунарізин відмивали, продовжуючи записи та спостерігаючи відновнення амплітуди до її первинного значення. В розчині, шо містив флунаризин після першого імпульсу блокуючий був несильний, але

Рис.З. Блокуючий ефект R56865 та флуиарізину на НПС при рідкій (1/60 с) та частій (1/5 с) стимуляції. Клітини деполяризувялися від ПП -100 mV до -20 mV, тривалість імпульсу 200 мс.

розвивався по мірі продовження рідкої стимуляції (Рис. 30). У розчині, що містив 1156865, блокуючий ефект розвивався відразу після першого імпульсу та незначно зростав на протязі всього часу аплікації. Додаткова часта стимуляція в кінці прикладання Я56865 не викликала додаткового блокування. У випадку з

І , пА

в

І « пА

флунарізином часта стимуляція навпроти, приводила до розвитку додаткової блокуючої дії. Величина зростання ефекту блокування при частій стимуляції була

порівненою з величиною ефекту при рідкій стимуляції. Порівнюючи часовий хід

при дослідженні ефектів флунарізину та R56865 можна зробити висновок, що

блокування НПС флунарізином йде, на відміну від R56865 із залучанням

механизму use-dependence, а блокуючий ефект R56865 практично позбавлен цієї

властивості.

Криві доза-ефект для блокуючої дії кожного антагоніста були отримані при виміренні амплітуд Са2+ струмів при потенціалах, що відповідають максимуму ВАХ при ПП -100 mV та тривалості ДІ 200-300 мс. Блокуюча дія кожної сполуки вимірювалася після 3-х хвилин прикладання із частотою стимуляції 1 раз на 30 секунд. Теоретичні криві, побудовані за методом найменших квадратів, є апроксимацією експериментальних даних, що описуються рівнянням Хіпла: I/lmax=((Kdln/(fAln + [К^|г])), де Ітах та І- амплітуди струмів, вимірені у контролі та під дією антагоніста; [А] та [К^]- концентрація вільного антагоністу та рівноважна константа дисоціації (концентрація половинної дії), відповідно, п-коефіцієнт Хілла. Останні були однаковими для всіх сполук (п=1), досліджених на НПС, відповідні величини K<j становили 0.1 цМ для R56865, 0.9 цМ для флунарізину та 3.5 цМ для німодипіну (Рис. 5, лівий графік). Оскільки використання фтор-вмісного внутриклітинного розчину не дозволяло реєструвати високопорогові Са2+ струми (ВПС) через інгибуючу дію F", то для вивчення цих струмів був використован фосфатний внутриклітинний розчин. Робота з таким розчином потребує, як правило, використання пзтч-піпеток із більш тонким діаметром кінчика. У більшості випадків ВПС активувалися при ПП -60 mV починаючи з -ЗО mV та досягаючи максимума амплітуди при -10- 0 mV. Як було встановлено у експериментах по дослідженню НПС (Рис. 2) при ПП -60 mV НПС були повністю інактивовані, таким чином досліджувалися тільки ВПС. Час зростання струму збігався із часом до піку у випадку НПС, однак кінетика спаду була повільнішою. Струм лише частково інактивувався при деполяризації до -10 mV та тривалості імпульсу 1 с (Рис. 4). Час природного половиного run-down становив 35-45 хвилин. Для отримання ВАХ ВПС реєструвалися із 30 с

міжімпульсовими інтервалами та тривалості деполяризуючого імпульсу 100-200 мс. Для усунення впливу НПС при потенціалі -60 шУ, амплітуда ВПС вимірювалася в кінці імпульсу (усереднювалося значення по 10-ти останнім точкам). ВАХ, отримані для 1156865, флунарізину та німодипіну не зсувалися під дією антагоністів.

Для дослідження характеру блокування застосовувалися два типи імпульсації:

короткі імпульси (з тривалістю 200 мс) та довгі (з тривалістю 1 с). ГТП був

однаковим в обох випадках -60 шУ, ДІ відповідав максимуму ВАХ.

Експерименти з короткими імпульсами проводили із використанням протоколу

аналогичному тому, який застосовувався для дослідження НПС. В даних умовах

1156865 на відміну від флунарізину також не виявляв властивостей ше-

сіерепсіепсе. Для того щоб перевірити чи блокує флунарізин ВПК переважно у

иыдкритоиу станы для ВПС був застосован протокол із стимуляцією довгими (1

с) імпульсами та міжімпульсовим інтервалом 60 с.

Рис.4. Порівняння

блокуючої дії 1156865 та підтвердження иге-

<!ерепс)епсе для флунарізину на ВПС. Клітини деполяризувалися від ПП -60 тУ до -10 тУ, тривалість імпульсу 1 с, частота стимуляції 1/60 с. Час інкубації для кожного іапису вказан на рисунку.

500 те 500 та

В таких умовах інкубація у 5 цМ 1156865 після першої хвилини прикладання приводила до блокування Са2+ струму у значньїй мірі (Рис. 4А), на протязі подальшого часу ступінь блокувашія зростала лише частково, досягаючи насичення під кінець третьої хвилини витримки в антагоністі. На відміну від Я56865, флунарізин у тій ж самої концентрації навіть після 3 хвилин аплікації без стимулювання незначно зменшував пікове значення струму (16±5%), але зміна кінетики спаду була досить вагома (Рис. 4В). Таким чином пролонгована

А В

активація ВПС підтвердила відсутність властивості ше-сіерепсіепсе для 1156865 та наявність пієї властивості для флунарізину. За даних умова німодипін блокував ВПС значно менш ефективно, ніж флунарізин та 1156865.

Antagonist concentration (/-¿М) Antagonist concentration (/jM)

Рис. 5. Залежність доза-ефекту блокуючої дії R56865, флунарізину та німодипіну на НПС та ВПС. Точки надають середне значення для 4-S клітин ± систематична похибка вимірювань. Криві е апроксимацією даних ізотермою Ленгмюра із Kj=0.1 цМ дня R56865, ^=0.9 цМ дія флунарізину та К,)=3.5 и\1 для німодипіну (для НПС ліворуч), та рівнянням Хілла із K,j=3.1 цМ. п=1.5 для R56865, K,j=9.5 цМ п=1.5 для флунарізину та Кд=38 р.М, п=1 для німодипіну (дія ВПС праворуч).

Дані по блокуванню БПС були проаналізовані та наведені у вигляді доза-ефект (Рис. 5, правий графік). Умови стимуляції клітин та протоколи експериментів, на основі яких отримані точки графіку доза-эффект були такими

ж, як у випадку дослідження НПС. Величини Kj та коефіцієнти Хілла становили для R56865, флунарізину та німодипіну З.ІцМ п=1.5, 9.5цМ 11=1.5 та 38цМ п=1, відповідно.

Вплив диаденозин-поліфосфатів на високопорогові кальцієві канали у

нейронах гіпокампу.

Максимальний ВПС реєструвався після деполяризації мембрани перфузованого нейрону від ПП -100 mV до ТП -10- 0 mV. Час деїтоляризуючого зсуву становив 50 мс, інтервал між стимулюючими імпульсами 5- 15 с. Ці параметри дозволяли проводити реєстрацію ВПС в оптимальних умовах,

уникаючи впливу повільної інактивації на вимірену амплітуду струмів. Типова амплітуда ВПС у цих умовах становила 500 - 1000 рА. Час зростання струму для ТП -10 mV становив 10-15мс, стала спаду струму 500- 600 мс. Час природного половипого зменшення струму на протязі експерименту (half rundown) становив 35-45 хвилин. Для отримання ВАХ реєструвалися струми, ідо викликаються ДІ різної амплітуди із міжімпульсовим інтервалом 15 с. Як правило ВАХ не зсувалися під дією прикладаних сполук. Прикладання 5 цМ ApjA приводило до швидкого та оборотнього збільшення вхідного струму через Са2+ канали. Таке зростання струму виявило властивості потенціал-залежності та було більш значним при більш від’ємних потенціалах (Рис. 6). З 52-х досліджених нейронів

37 демонстрували значне зростання струму через Са2+ канали. Ефект вважався значним, коли він не перебільшував умовно прийнятий мінімальний рівень величиною 5% від вихідної величини струму.

Щоб ідентифікувати, який з типів Са2+ каналів бере участь у зростанні вхідного Са2+ струму, в ролі селективних та необоротних блокаторів каналів Р- і

Vm (taV)

RECOVERY. П

600 рА

100 me

Рис. 6. Потенціація ВПС через Саг+ канали, яка була викликана прикладанням АР5А у нейронах гіпокампу. ВАХ наведена для піковьіх значень струмів у контролі, після 1 хвилини інкубації у АР5Л та після "відмивки" сполуки. Г1П -100 тУ, м'їжіипульсовий інтервал 15 с.

IV- тішу були обрані відповідно ш-Aga-IVA та c)-CgTx. У розвитку експеримента із

даними блокаторами після 5 хвилин інкубації у розчині, який містить 200 пМ со-

А§а-ІУА, зростання Са2+ струму зберігалося. У контрольних експериментах були

перевірені необоротність та насиченість дії обох токсинів після 5-ти хвилинної

інкубації клітин у кожному з них у концентрації 200 пМ со-Ага-ІУА та 5 цМ со-

С§Тх. Інкубація у цих, умовах є достатньою для отримання необоротньої та насиченої дії. Для проведення цих експериментів використовувався наступний експериментальний протокол. Після реєстрації ВАХ у контрольному розчині, вимірення повторювали у присутності 5 (іМ АР5А. Після відмивки АР5А ВАХ реєструвалася знову у контрольному розчині. Після чого клітину витримували в одному з токсинів на протязі 5-ти хвилин та, по вихіду цього часу, знову знімали ВАХ, та переносили клітину у контрольній розчин. Завдяки необоротності дії токсинів реєстровані знову значення ВАХ співпадали або були трохи менше тих, що були отримані під дією токсину. Оброблену таким чином клітину знову переносили у розчин, що містить 5 цМ АР5А. Потенціююча здібність останнього повністю зберігалася після інкубації у 200 пМ о-А^а-ІУА. В середньому для 6 клітин оброблених даним токсином наступне прикладання АР5А викликало збільшення пікового значення струму максимуму ВАХ на 14±5%. Селективний блокатор К-каналів о-С£Тх, який був прикладаний на 5 хвилин у концентрації 5 |іМ блокував струми в середньому на 34±7% від контрольного значення. Клітини, які спочатку демонстрували збільшення вхідного струму під дією 5 цМ АР5А, інкубувалися у розчині, що містить 5 цМ са-С^Гх. Після відмивки токсину фракція струму, що залишилася, не модулювалася прикладанням АР5А (Рис. 7). АР5А не впливав на вхідні струми активовані при ПП -40 тУ. Відомо, що при цьому потенціалі Са2+ канали ІЧ-типу практично повністю інактивовані. Залишені функціонуючи Ь-канали були нечутливі до прикладання АР5А, в той час як на тих самих клітинах, при зсуві ПП у бік гіперполяризації (як правило до -100 шУ) контрольне прикладання АР5А викликало зростання струму через кальцієві канали. Добре відомий селективний блокатор Са2+ каналів Ь-типу ніфедипін не блокував ефекти збільшення Са2+ струму під впливом АР5А. Прикладання 5 цМ АР5А на фоні ніфедипіну у концентрації 50 цМ викликало потенціацію струму по власним параметрам, яка була схожою із тою, яка спостерігалася на тих самих клітинах у відсутності ніфедипіну. З метою виявлення типу рецептору, що сполучений з каналами, які активуються АР5А, були досліджені антагоністи аденозинових рецепторів А] та А2 типов 8-циклопентил-1,3-диметилксантін (СРТ) та 3,7-диметил-пропаргілксантін

(ОМРХ) відповідно. Було знайдено, шо у даних експериментальних умовах жоден і них антаїуністів не впливав на потенціацію струмів через Са2~ канали. Умови проведення експериментів з СРТ та БМРХ були тіж самі, що у випадку застосування ніфедигііну. Інкубація, як у 500 пМ СРТ, так і в 5 цМ ОМРХ (насичені концентрації для А| та А2 рецепторів, відповідно) на протязі 2 хвилин не викликало будь-якої дії на збудливі Са2+ струми.

Рис. 7. Дія АР5А на ВПС до та після інкубації пірамідного нейрону гіпокампу у ra-CgTx.

Потенціація викликана ЛР5А (ліворуч), повністю зникала після 5 хвилин інкубації у а-CgTx (праворуч).

ОСООТЛОЬ • 5 АрвА ОКЕСО'УЕЯЇ

У той час прикладання на фоні цих антагоністів розчинів із 5 цМ АР5А викликало потенціюючий ефект, близький до вихідного.

Дані що стосуються АР5Л -індукованого збільшення сумарного струму через Са2+ канапи та виливу на це збільшення різних сполук надані на Рис. 8. Усі досліджені клітини були чутливі до аденозину (п=51), тобто прикладання цієї сполуки у концентрації 50 цМ викликало часткове швидке та оборотне блокування струму крізь Са2+ канали, але цей ефект не завжди корелював із чутливістю до АР5А. Так наприклад, коли аденозин блокував струми в усіх 52-х

Ар,А 5 ЦМ 6 ^ ц.СеТі

■ІООиУ -ЗОої .ІООвУ-ЗОаУ •

Шва

Уга (гаУ) Ут (шУ)

клітинах, 15 з них виявилися не чутливі до АР5А (ефект потенціації був менший 5% або відсутній).

Ефекти впливу прикладання позаклітинного розчину, що містить 5 та 100 цМ АТФ не були виявлені при дослідженні 14-ти нейронів, у яких спостерігалися, як ефекти блокування аденозином, так й ефекти потенціації під дією АР5А. Це дозволило виключити з розгляду декілька типів пурінергічних рецепторів при вивченні явища потенціації.

Рис. 8. Середні значення величин потенційованого під АР5А компоненту Са2+ струму на фоні різних антагоністів в нейронах гіпокамоу. Ефект вимірювався як (І-Іо)/Іо, де Іо- струм у розчині, ЩО містить антагоніст, І- струм у розчині, що містить 5 |іМ Ар;А на фоні антагоністу. Кількість досліджених нейронів надано зверху.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

В цьому дослідженні було встановлено, що, як R56865, так і флунарізин не зсувати ВАХ при блокуванні НПС. Аналогічні дані для флунарізину були отримані раніш на клітинах нейробластоми [Wang et al; 1990]. Під дією німодипіну ВАХ зсувалася у бік позитивних потенціалів на 10±2%. Цей факт засвідчує про потенціал-незалежність дії R56865 та флунарізину на НПС та про

41/1 (»)

6 8 4 5 4 1

1

tt-Agi-NA tt-Cfli ОТ Vh=-40 mV СРТ DM?X Ccatroî 250 sM 5|*4 MjiM 5(10 oM 5)iM

наявність залежності блокуючої дії німодипіну від мембранного потенціалу. Зсув ВАХ при аплікації мімодипіну дозволяє припустити, що німодипін викликає перерозподіл заряду поверхні мембрани поблизу місць, де розташовані канали й таким чином впливає на функціонування цих каналів [Hodgkin, Keynes 1957]. Відомо, що флунарізин зсуває криву стаціонарної інактивації Са2+ каналів у бік від'ємних потенціалів [Wang et al. 1990], в цьому дослідженні було отримано підтвердження цього явища в клітинах Пуркіньє. Дослідження стаціонарної інактивації для R56865, флунарізину та німодипіну виявило, що всі три антагоністи зсувають криві Ь^, але величина зсуву різна для кожного з них. Встаношіено, що для R56865 величина зсуву кривої 1ьх у бік від'ємних

потенціалів є максимальною, флунарізин займає проміжну позицію, а для німодипіна зсув 1і.с є несуттєвим та може не братися до уваги за методикою, яка

не вимагає точністі фіксації потенціалу до 5 mV. Сильний ефект R56865 по зсуву іігх може бути пояснений його припустимо більш високою афінністю у

порівнянні з флунарізином та німодипіном до Са2+ каналів в інактивованому стані. Більш того ця сполука, видимо, здатна підтримувати й продовжувати інактивований стан каналу. Цей механізм, певно є аналогічним відомому механізму зсуву кривої стаціонарної інактивації для натрієвих каналів, коли зв'язування речовини з інактивованим каналом призводило до зсуву кривої Іі.^

[Khodorov et al. 1976]. Таким чином, оскільки усі речовини прикладалися у концентраціях, що викликали однаковий блокуючий ефект струму на піку ВАХ (див. Рис. 5), можливо припустити, що коли НПС блокуються R56865, то у мембрані клітини Пуркіньє більша доля каналів знаходиться в інактивованому стані, ніж у випадку блокування струмів флунарізином та німодипіном. Але блокуючий ефект кожного з блокаторів не може бути пояснений тільки за рахунок зсуву h^,.

Раніше було показано, що флунарізин блокує як ВПС так й НПС, показано також, що це блокування має властивість use-dependence в різних біологічних об'єктах[Акаіке et al. 1989, Pauwels et al. 1991, Regan 1991]. У нашому дослідженні ми перевірили цю властивість флунарізину для клітин Пуркіньє мозочка щура. На відмінність від флунарізину, при блокуванні ВПС речовиною

R56865 use-dependence дія цього антагоністу була відсутня. Відсутність independence у випадку аплікації R56865 підтверджується фактом швидкого блокування Са2+ струмів за відсутністю стимуляції. Якщо порівняти часовий хід блокування для R56865 та флунарізину на НПС та ВПС, можливо помітити, що при рідкій стимуляції флунарізин призводив до неповного блокування, яке ставалр сильнішим при збільшенні частоти стимуляції. Дія R56865 не залежала від частоти стимуляції і ефект R56865 досягав насичення набагато скоріше, ніж ефект флунарізину. Зміна кінетики струму під дією флунарізину та відсутність будь-яких змін у випадку прикладати R56865 свідчать про те, що флунарізин взаємодіє переважно із відчиненими Са2+ канапами, в той час як R56865 діє на закриті та відкриті канали у рівному ступені (Рис. 4).

Криві доза-ефекг, отримані для флунарізину та німодипіну для НПС у клітинах Пуркіньє виявилися аналогічними для дії цих антагоністів в ізольованих нейронах гіпоталамуса щура [Akaike et al. 1989]. Таким чином можливо припустити відсутність специфічності ефектів в різних регіонах мозоку для флунарізину та .німодипіну. Із аналізу результатів, що приведені на Рис. 5 випливає такий порядок афінності досліджених антагоністів для канал-рецепторного комплексу НПК: R56865 > флунарізин > німодипін. Для ВПС афінність всіх антагоністів була нижче, ніж для НПС. Різні нахили кривих доза-ефект для R56865 та флунарізину у порівнянні із німодипіном дозволяють припустити різні механізми дії цих блокаторів на ВПС. Коефіцієнти Хілла для R56865 та флунарізину (п=1.5), відмінні від німодипіну (п=1), можливо, свідчать про більш ніж один центр зв'язування для молекул R56865 та флунарізину у комплексі рецептор-канал ВПК. Для німодипіну є лише один центр зв'язування з канал-утворюючим комплексом Са2+ каналів обох типів.

Відомо, що дигідропіридіни здатні частково блокувати ВПС у клітинах Пуркіньє [Regan 1991]. В цьому дослідженні показано, що німодипін у концентрації 10 цМ блокує ВПС клітин Пуркіньє на 20%, в той час як R56865 та флунарізин у цій же концентрації блокує ВПС майже повністю (Рис. 5). Цей факт корелює із сучасним положенням про те, що ВПС в клітинах Пуркіньє мозочку представлені в основному каналами P-типу. Як відомо P-канали не

чутливі до дигідропірвдинів, тому блокування їх за допомогою R56865 та флунарізину дозволяє припустити можливість фармакологічного впливу на даний тип каналів. Вплив R56865 на P-канали за попередніми даними, що викладені в цій прані, є сильнішим ніж вплив флунарізину (Рис. 5), хоча докладне дослідження цього питання, вивчення вибірковості дії R56865 на той чи інший тип каналів потребує, безумовно, застосування ю-Aga-IVA та інших токсинів, для коректного фармакологічного підходу.

Представлені результати свідчать про те, що R56865 блокує Са2+ струми в нейронах Пуркіньє більш ефективно, ніж флунарізин та німодипін. Таю характеристики даного блокатору, як а) відсутність use-dependence при блокуванні Са2+ струмів та б) зменшення необхідного рівню деполяризації для інактивації Са2+ каналів дозволяє припустити використання R56865 як ефективний нейропротектор, що запобігає кальцієвому перевантаженню клітини.

В дослідженні модуляції Са2+ струмів диаденозин-поліфосфатами було виявлено, що AP5A призводить до збільшення co-CgTx -чутливого компоненту струму через ВПК на 18+5%. Висока специфічність o-CgTx дозволяє стверджувати, що АР5А селективно потенціює N-типСЬ 2+ каналів у нейронах гіпокампу. Ефект фасилітації Са2+ струмів пірамідних нейронів гіпокампу добре корегує із збільшенням входу Са2+ в синаптосомах середнього мозоку [Panchenko et al. 1996J.

Експерименти з ніфедипіном, як на ізольованих нейронах (Рис. 8), так й на синаптосомах, виключають участь дигідропіридин-чутливих Са2+ каналів (L-тип) в процесі потенціації. Експерименти, у яких показана потенціал-залежність потєнціації, її наявність при ПП -100 mV та відсутність при -40 mV, підтверджують участь Са2+ канатів N-типу та відсутність участі Са2+ каналів L-типу в цьому процесі.

В попередніх дослідженнях на зрізах гіпокампу[К1і5Іііп et al. 1994] було показано, що диаденозтгн-поліфосфати складним чином впливають на синаптичну передачу: під дією АР5А синаптична передача інгибується з наступним транзієнтним овершутом постсинаптичного популяційного потенціалу після видалення розчину, що містить AP5A. Наші результати можуть частково

пояснити цей феномен. Транзієнтно зростаюча зфективність синаптичної передачі, викликана дією Ар5А може бути пов'язана із збільшенням рівню Са2+ в пресинаптичних терміналях.

Наші дані показують, що різноманітність пурінергічних рецепторів, що регулюють синаптичну передачу в ЦНС дещо ширша, ніж вважалося до сих пір. Так, наприклад, постульоване раніше положення про наявність тільки Aj и А2 типу рецепторів в гіпокампі, не може пояснити описане явище потенціації Са2+ струмів [Bruns et al. 1987]. Як показано на Рис. 8 специфічні антагоністи A¡ и А2 рецепторів СРТ та DMPX не впливали на здатність диаденозин-поліфосфатів збільшувати струм через Са2+ канали. Блокуюча дія аденозину припустимо пов'язана з А] рецептором[Mogul et al. 1993] не коррегувала з ефектами, викликаними АР5А. Що також дає змогу говорити про відсутність участі цього типу рецептору в процесі потенціації. Совокупність цих даних дозволяє припустити, що ефект фасилітації Са2+ каналів забезпечується специфічними рецепторами [Pintor et al. 1995]. З іншого боку пригнічення синаптичної передачі під диаденозин-поліфосфатами у зрізах гіпокампу запобігалося антагоністом А] рецепторів СРТ [Klishin et al. 1994]. Цю суперечність можуть пояснити дані, отримані рядом авторів [Scanziani et al. 1992,Scholz, Miller 1992], коли інгибування всіх типів Са2+ каналів не було необхідним для інгибування мініатюрних збуджуючих постсинаптичних струмів аденозином в нейронах гіпокампу.

Різна дія АТФ на синаптосомах та ізольованих нейронах також є свідченням наявності різних типів рецептор-ефекторних механизмів для диаденозин-поліфосфатів та АТФ в різних ділянках мозоку[Panchenko et al. 1996]. Враховуючи те, що ніфедипін блокував ефекти збільшення входу Са2+ в синаптосомах, припустима наявність пурінорецептору, що регулює Са2+ канали L-типу, які керуються АТФ, як N-канали - диаденозин-поліфосфатами. В останній час було запропоновано класифікувати два типу даних рецепторів як P2d и Р4 [Pintor et al. 1995].

Ca2+ канали N-типу модулюються багатьма основними нейротрансмітерами та нейромодуляторними речовинами: глутамат, ГАМК, аденозин и т.д.[СагЬопе et

al 1989,Swartz, Bean 1992]. Модулююча дія диаденозин-поліфосфатів на Са2+ канати N-типу є ще одним підтвердженням важливості звя'зку цього типу каналів з широким спектром речовин, що приймають участь у функціонуванні ЦНС. Здатність диаденозин-поліфосфатів впливати на процеси в нейронах мозку є свідченням важливості подальшого вивченім даного класу речовин.

Дія фармакологічних речовин, дослідженні« в даній роботі на Са2+ канали носить різнобічний характер, викликаючи або блокаду, або потенціювання різних компонентів Са2+ провідності. Особливо важливими для фармакології є такі можливості: (а) потеїшіал-керовалий блок; (б) "use-dependent’’-блок та (в) потенціація активності N-каналів, що приймають активну участь у синаптичній передачі.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою методу фіксації потенціалу "patch-clamp" в конфігурації ”whole-cell" визначені основні злектрофізіологічні характеристики Са2+ струмів пірамідних нейронів гиппокампу та нейронів Пуркіньє мозочка щура. В нейронах Пуркіньє ізольовані та вивчені ВПС та НПС. Визначені характерні параметри часу активації та інактивації, потенціалзалежності, стаціонарної інактивації для цих струмів.

2. Вивчено дію нового блокатору R.56865 на Са2+ струми нейронів Пуркіньє щура у порівнянні з флунарізином і німодипіном. Встановлена така послідовність здатності трьох антагоністів Са2+ каналів блокувати Са2+ струми в клітинах Пуркіньє: Я56865>флунарізин>німодипін. Відповідні концентрації половинної дії (Kj) становлять 0.1, 0.9, 3.5 |іМ для НПС і 3.1, 9.5, 38 цМ для ВПС.

3. При дослідженні стаціонарної інактивації НПС прикладання R56865, флунарізина і німодипіна в концентраціях блокуючих 50-60% струму призводило до зсуву кривої 1)ж в бік від'ємних мембранних потенціалів. Для R56865 такий

зсув був максимальним та становив 20±3 mV (п=5), однак блокуюча дія даної речовини не зводилась лише до зсуву h^; максимальна кальцієва провідність

також зменшувалась.

4. При дослідженні пірамидних нейронів гіпокампа показано, що аденозин в концентрації 10 цМ здатен блокувати ВПС, однак прикладання АТФ, негідролізованих аналогів АТФ і диаденозин-поліфосфатів на тих же клітинах не викликало блокування Са2+ струмів.

5. Прикладання диаденозин-пентафосфата в концентрації 5 цМ приводило до зворотнього збільшення ВПС в середньому на 18±3% (при величині пороту певності реєстрації потенціації 5%) в більшості дослідженних нейронів (36 із 51).

6. Високопороговий компонент Са2+ струму потенційований прикладанням 5 цМ АР5А неовборотньо блокувався селективним блокатором каналів N-типу а-CgTx (5 цМ) і не виявляв чутливості до o-Aga-lVA (200 пМ) і ніфедипіну (50 цМ). Ефект потенціації оборотно усувався зміщенням ПП до -40 mV. Таким чином показано, що канали, які потенціюються під АР5А, е каналами N-типу.

7. Потенціація Са2+ каналів N-типу під АР5А не усувалася при застосуванні селективних антагоністів аденозинових рецепторів Aj та Aj типу, СРТ (5 рМ) и DMPX (500 пМ). Рецептори, що, не відносяться до загальноприйнятих підтипів Aj та Аз, а є, напевно, новим підтипом рецепторів (нещодавно класифікованим як Р4), вивчення якого вимагає подальших досліджень.

Перелік робіт, оиубікованих за матеріалами дисертації.

А) Статті в журналах та збірниках:

1.R56865 AS Са++ -CHANNEL BLOCKER IN PURKINJE NEURONS OF RAT: COMPARISON WITH FLUNARIZINE AND NIMODIPINE.

V.A.Panchenko, O.A.Krishtal, F.Tegtmeier and A.Ya.Tsyndrenko Neuroscience Vol.54, No.3, pp.587-594, 1993 :

2.DIADENOSINE POLYPHOSPHATES SELECTIVELY POTENTIATE N-TYPE OF Ca++ CHANNELS IN THE RAT CENTRAL NEURONES.

V.APanchenko, J.Pintor, AYa.Tsyndrenko, M.T.Miras-Portugal and O.A.Krishtal. Neuroscience, Vol.70, No.2, pp.353-360, 1996

3.MODULATORY EFFECTS OF DIADENOSINE POLYPHOSPHATES ON DIFFERENT TYPES OF CALCIUM CHANNELS IN THE RAT CENTRAL NEURONES.

V.APanchenko, J.Pintor, A.Ya.Tsyndrenko, M.T.Miras-Portugal and O.AKrishtal. Neurophysiology, 26 (6), 409-416,1994.

4.COMPARATIVE PATCH CLAMP STUDIES WITH FRESHLY DISSOCIATED RAT HIPPOCAMPAL AND STRIATAL NEURONES ON THE NMDA RECEPTOR ANTAGONISTIC EFFECTS OF AMANTADINE AND MEMANTINE.

C.G. Parsons, V.A. Panchenko, V.O. Pinchenko, A.Y. Tsyndrenko and O.A. Krishtal. European Journal of Neuroscience: Vol.8,446-454, 1996.

5.THE POTENTIATION OF N-TYPE Ca++ CHANNELS BY DIADENOSINE POLYPHOSPHATES IN THE RAT CENTRAL NEURONES.

V.A.Panchenko, J.Pintor, A.Ya.Tsyndrenko, M.T.Miras-Portugal and O.A.Krishtal. J.Physiol. 487, 199, 1995.

Б) Тези і реферати доповідей:

6. D1ADENOS1NE POLYPHOSPHATES SELECTIVELY POTENTIATE N-TYPE OF Ca+^ CHANNELS IN THE RAT CENTRAL NEURONES.

V.A.Panchenko, J.Pintor, A.Ya.Tsyndrenko, M.T.Miras-Portugal and O.A.Krishtal. Biophysical Society Annual Meeting (San-Francisco 1995).

Victor A. Panchenko. Electrophysiological and pharmacological characteristics of different types of calcium channels in the rat hippocampal pyramidal neurones and Purkinje cells.

The dissertation (manuscript) is presented in accordance with requiemients foe the degree of candidate (PhD) of biological sciences in the speciality 03.00.05 biophysics.

A.A. Bogomoletz Institute of Physiology, Ukrainian National Academy of Sciences, Kiev, 1996.

The blocking action of recently synthesized benzothiazolamine derivative R56865 was compared with that of dihydropyridine (nimodipine) and diphenylalkylamine (flunarizine) on low-voltage-activated and non-inactivating high-voltage-activated Ca++ currents. The experiments were carried out on freshly isolated Purkinje neurons of rat cerebellum using patch-clamp technique in the whole-cell configuration. Among the substances tested R56S65 was found to be the most effective blocker of the Ca++ current. In the sequence R56865, flunarizine and nimodipine, apparent Kj values for LVA current are 0.1 цМ, 0.9 цМ and 3.5 цМ, and for HVA current 3.1 цМ, 9.5 ¡.iM,

38 [iM, respectively. The current-voltage relationships for both types of currents displayed little or no shift under either flunarizine or R56865 but showed a 10 mV shift in the positive direction under the action of nimodipine. The steady-state inactivation curves for LVA calcium currents were shifted under the action of R56865, flunarizine and nimodipine (in concentrations which blocked 50-60% of the current) to more negative membrane potentials for 20 mV, 10 mV and 6 mV, respectively. In contrast to R56865, flunarizine blocked both types of Ca++ channels in a use- dependent manner. It is concluded that the order of potency of Ca++ antagonist for both types of channels studied is R56865 > flunarizine >nimodipine. Strong shift of steady-state inactivation relationship by R56865 can further facilitate its blocking action in in vivo conditions. Calcium ions play a key role in the regulation of many cellular functions. Recent electrophysiological studies indicate the existence of at least three types of voltage-operated Ca++ channels. They have different electrophysiological characteristics and pharmacological properties. Numerous organic and inorganic Ca++ channel antagonists have been developed with specificities varying in respect to different calcium currents. The class of dihydropyridines is the most well studied among Ca++ channel blockers. One of them, nimodipine was taken as reference substance to compare its blocking action on Ca++ channels with action of two other drugs. According to classification of Ca++ antagonists by the World Health Organization, flunarizine is classified as a class IV Ca++ antagonist, non-selective for slow Ca++ channels. Flu protects the brain against functional and/or structural neuronal damage in various animal model of cerebral ischemia. In addition of its cerebrovascular effect, Flu has also direct

neuropiotective action. Flu blocks both low-voltage-activated (LVA) and noninactivating high-voltage-activated (HVA) channels . Clinically, it has been used to treat a number of diseases: vertigo, migraine, epilepsy and some heart diseases. Recently synthesized substance N-[l-[(4-fluorophenoxy) butyl]-4-piperidinyl]-N-methyl-2-benzothiazolamine (R56865) is a prototype of a promising new class of substances that protect cells from the consequences of ischemia. R56865 is known to inliibit the cardiac glycoside-induced gain in sodium and calcium in myocytes and to prevent ouabain-induced Ca++ overload of cardiac muscle. These phenomena seem to correlate with the blockade of LVA and HVA currents in myocytes and cardiac muscles. But the action of R56865 on Ca++ charnels in central neurons remains unknown. One of the aims of this study was to compare the blocking action of three antagonists, R56865, Flu and Nim on two types of Ca++ channels in the membrane of the Purkinje neurons of rat.

The action of diadenosine polyphosphates on high voltage activated Ca++ channels were studied in freshly isolated hippocampal neurones using whole-cell patch-clamp technique. Current-voltage relationships were measured in control and after incubation in 5 uM Ap4A or Ap5A. The latter procedure led to the 15%+-3 of reversible increase of current through Ca++ channels when measured at the holding potential of -100 mV but not at -40 mV. Nifedipine failed to block this effect. In isolated neurones nifedipine-sensitive current trough L-type Ca++ channels didn't demonstrate the increase under diadenosine polyphosphates. The potentiation of current trough Ca++ channels in hippocampal neurones were irreversibly blocked by 5 цМ ш-Conotoxin, but not by 200 nM o-Aga-lVA. These data indicate that diadenosine polyphosphates enhance activity of N-type Ca++ channels in the central neurones of rat. .

B.A. Панченко Электрофизиологические и фармакологические характеристики различных типов кальциевых каналов пирамидных нейронов гиппокампа и клеток Пуркинье крысы.

Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.05 - биофизика. Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев 1996.

Целью представленной работы было провести комплексное исследование свойств потенциалуправляемых кальциевых каналов плазматической мембраны нескольких типов клеток ЦНС крысы. Изучить их основные электрофизиологические и фармакологические характеристики, а также выяснить механизмы регуляции этих каналов с помощью модулирующего воздействия диаденозин-полифосфатов на аденозиновые рецепторы.

Изучено действие нового блокатора R56865 на кальциевые токи нейронов Пуркинье крысы в сравнении с флунаризином и нимодипином. Установлена следующая последовательность для способности трех антагонистов кальциевых каналов блокировать кальциевые токи в клетках Пуркинье: R56865^nyHapH3HH>miMOflimHH. Соответствующие концентрации половинного действия (K<j) равны 0.1, 0.9, 3.5 цМ для низкопороговых токов и 3.1, 9.5, 38 цМ для высокопороговых токов. При исследовании стационарной инактивации низкопороговых кальциевых токов приложение R56865, флунаризина и нимодипина в концентрациях блокирующих 50-60% тока приводило к сдвигу кривых h^ в сторону более отрицательных мембранных потенциалов. Для R56865 такой сдвиг был максимальным и составлял 20±3 mV (п=5), однако блокирующее действие данного вещества не сводилось только к сдвигу h^: максимальная кальциевая проводимость также уменьшалась. При исследовании пирамидных нейронов гиппокампа показано, что аденозин в концентрации 10 цМ способен блокировать высокопороговые кальциевые токи, однако приложение АТФ, негидролизуемых аналогов АТФ и диаденозин-полифосфатов

на тех же клетках не вызывало блокирования кальциевых токов. Приложение диаденозин-пентафосфата в концентрации 5 ц,М приводило к обратимому увеличению высокопороговых кальциевых токов в среднем на 18±3% (при величине порога достоверной регистрации потенциации 5%) в большинстве исследованных нейронов (36 из 51). Высокопороговый компонент кальциевого тока, потенциированный приложением 5 цМ АР5А, необратимо блокировался селективным блокатором каналов Т^-типа а-СдТх (5 цМ) и не проявлял чувствительности к ю^а-ГУА (200 пМ) и нифедипину (50 цМ). Эффект потенциации обратимо устранялся смещением поддерживаемого мембранного потенциала до -40 тУ. Таким образом, показано, что каналы, потенциируемые под АР5А, являются каналами ІМ-типа. Потенциация кальциевых каналов \т-типа под АР5А не устранялась при применении селективных антагонистов аденозиновых рецепторов Ах и А2 типа, СРТ (5 цМ) и ОМРХ (500 пМ). Рецепторы, отвечающие за этот эффект, не относятся к общепринятым подтипам Л1 и А2 рецепторов аденозина, а представляют собой, по-видимому, новый подтип рецепторов (недавно классифицированный как Р4), изучение которого требует дальнейших исследований.

Ключові слова: кальцієвий струм, кальцієві канали, 1156865, флунарізин, диаденозин-поліфосфати, аденозинові рецептори.

Подписано а печать 10.07.96г.Формат 60x84/Іб Усл.пвч.л. 1,4 Учетно-изд.л. 1,5 Іїіраж 100 Бум.офс.М Зак. 68 Издательство "ЛОГОС" г.Киев, ул. Б.Хмельницкого.19