Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эктацитометрическая характеристика деформабильности эритроцитов в условиях нормального и напряженного эритропоэза

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эктацитометрическая характеристика деформабильности эритроцитов в условиях нормального и напряженного эритропоэза"

РГ8 ОД

? 7

На правах рукописи

БЕЛКИН АЛЕКСЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

ЭКТАЦИТОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕФОРМАБИЛЬНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ НОРМАЛЬНОГО И НАПРЯЖЕННОГО ЭРИТРОПОЭЗА

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Челябинск, 1996

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинской академии

Hay иные «руководители:

академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор ЗАХАРОВ Ю..]

кандидат медицинских наук, доцент СТОРОЖОК С. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ПОПОВ Г.К.

доктор физико-математических наук, профессор БАЙТИНГЕР Е.

кандидат биологических наук, доцент ОКИШОР A.B.

Ведущее учреждение: Екатеринбургская медицинская академия

Защита состоится " 18 " июня 1996г. в " " часов, на заседав

диссертационного совета К. 113. 13. 04. в Челябинском государствен« педагогическом университете (454080, Челябинск, пр. Ленина, 69).

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотек] университета.

Автореферат разослан " 17 " мая 1996г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д.З. ШИБКОВА

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Эритроциты обладают уникальной способностью к упругим изменениям размеров и формы, что обеспечивает их возможность свободно проходить через микроциркуляторное русло. Свойства мембран эритроцитов при деформациях, по аналогии с гиперупругим твёрдым телом, определяются молекулярной организацией мембраны и физико-химическими свойствами образующих её молекул. Особая роль в обеспечении упругих способностей при сдвиговой деформации и поддержании формы дискоцита приписывается белковому цитоскелету мембран эритроцитов, формирование которого должно быть завершено к моменту выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь /С.А. Сторожок, 1995/.

Исследования последних лет позволяют говорить о наличии регуляторного контроля за функциональным состоянием белкового цитоскелета и, соответственно, способности эритроцитов к деформации /Bennet, 1990/. Особое внимание уделяется изучению генетических аномалий белков цитоскелета мембран эритроцитов, наличие которых ставится в причинную связь с повышенным разрушением эритроцитов и развитием анемии у человека /Palek, Sahr, 1992/. Показана также роль дефектов цитоскелета эритроцитов в патогенезе гипертонической болезни, проявляющаяся в снижении деформабильности эритроцитов вследствие увеличения кальмодулинзависимого связывания Са2+ с цитоскелетом /Bennett, е.а., 1988; Gardner, Bennett, 1988/, поэтому исследования молекулярной структуры белкового цитоскелета эритроцитов и особенностей его формирования на различных этапах дифференцирования эритроидных клеток, несомненно имеет важное теоретическое и прикладное значение.

Особо значимо при проведении исследований подобного рода объективно оценить способность эритроцитов к упругой деформации. Одним из методов, отвечающих этому требованию, является компьютерная эктацитометрия /Bessis, е.а., 1981/. Использование эктацитометрии в гематологической практике создало новые возможности для успешной дифференциальной диагностики анемий, вызванных нарушениями мембран или цитоскелета эритроцитов /Bessis, 1981; Mohandas е.а., 1981./.

Однако, в настоящее время в России отсутствует отечественная серийная модель эктацитометра, что в значительной мере ограничивает возможность проведения Российскими учёными исследований по изучению вязко-упругих свойств цитоскелета эритроцитов и их влияние на реологические свойства клеток крови. Разработка и создание отечественной модели эктацитометра с компьютерной обработкой полученной информации, отработка технологии эктацитометрических исследований вязко-эластических свойств эритроцитов при физиологическом и стимулированном эритропоэзе, внедрение эктацитометрии в практику научно-исследовательских и клинических лабораторий России, безусловно является актуальной проблемой как для практической, так и теоретической медицины.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - разработка и создание лабораторной эктацитометрической установки для количественной оценки деформабильности эритроцитов. Исследование способности эритроцитов к деформации в условиях нормального и напряжённого эритропоэза.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Разработка и создание лабораторной эктацитометрической установки;

2. Написание и отладка программного обеспечения для компьютерной обработки результатов эктацитометрического анализа деформабильности эритроцитов;

3. Отработка технологии проведения эктацитометрических исследований;

4. Исследование деформабильности эритроцитов "молодой" и "старой" популяций эктацитометрическим методом в условиях нормального эритропоэза;

5. Исследование деформабильности эритроцитов "молодой" и "старой" популяций эктацитометрическим методом в условиях напряжённого эритропоэза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые в России создана лабораторная установка позволяющая исследовать

деформабильность эритроцитов методом лазерной дифрактометрии (эктацитометрии) с непосредственным вводом информации в компьютер.

Создано оригинальное программное обеспечение для обработки результатов эктацитометрических исследований.

Разработана технология эктацитометрических измерений.

Исследование вязкоэластических свойств мембран эритроцитов при помощи эктацитометра позволило выявить отличия в деформабильности эритроцитов различных возрастных популяций в условиях нормального и напряжённого эритропоэза.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты данной работы могут служить теоретической основой при разработке серийного промышленного образца эктацитометра. Отработанная технология иследования деформабильности

эритроцитов с помощью эктацитометра может быть использована

для разработки методических рекомендаций по исследованию реологических свойств крови методом эктацитометрии. Выявленные различия в деформабильности эритроцитов в условиях нормального и напряженного эритропоэза могут быть использованы для теоретического обоснования механизмов выхода зрелых эритроидных клеток из костного мозга в кровь.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения диссертации доложены на конференциях: "Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области", Тюмень, 1993; "Актуальные проблемы фармации", Тюмень, 1994; "Медицина и охрана здоровья", Тюмень, 1995.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Компьютерная эктацитометрия является объективным методом исследования деформабильности эритроцитов, обеспечивающая высокую степень автоматизации измерений;

2. Деформабильность эритроцитов является одним из важных критериев их функциональной зрелости.

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано

5 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 128 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 288 работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на беспородных белых крысах-самцах, массой 180-200 гр (800 особей). Животные содержались в условиях вивария на полноценной диете (овёс, овощи, минеральные добавки). Кровь для исследований обычно забиралась из надреза кончика хвоста крысы в гепаринизированные капилляры ( фирма Radiometer Copenhagen, Дания ), для этого животное помещалось в специально сконструированный, стандартный домик из органического стекла. В ряде экспериментов кровь требовалось забирать из сердца или яремной вены, в этом случае животное находилось под эфирным наркозом. Кровь стабилизировали 3% раствором цитрата натрия

( 0,1 мл раствора цитрата натрия на 1 мл крови).

Подсчёт количества эритроцитов, ретикулоцитов, цитометрию эритроцитов, расчёт таких показателей, как средний объём эритроцитов, сферический индекс, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах проводили по общепринятым методам и формулам /И. Тодоров, 1963; П.А.Коржуев, 1964; М.И.Стенко, 1975/.

Гематокрит определяли на гематокритной микроцентрифуге ( АВ LARS LJUNGBERG & СО Stockholm, Швеция, 15000g, 2 мин).

Обработка и статистический анализ результатов, включающий в себя методы вариационной статистики, регрессионный анализ, дисперсионный и корреляционный анализ, осуществлялись при помощи компьютера.

Раствор FICOLL-400 для эктацитометрических исследований готовили на фосфатном буфере по прописи (0,30М NaCl, 0,020М Na2HP04, 0,005М КН2Р04; рН 7,4).

Вязкость 20% раствора FICOLL-400 оценивалась по стандартной методике при помощи капиллярного стеклянного вискозиметра отечественного производства ВПЖ-1, которая

контролировалась и поддерживалась при температуре 37° С на уровне «20сП. Плотность раствора измерялась пикнометром.

Для выделения клеток крови различной степени зрелости, использовали метод центрифугирования по Murphy /1973/. Кровь помещалась в пластиковые пробирки и раскручивалась на центрифуге ( 40000g, 30') или в микрокапиллярах на гематокритной центрифуге ( 15000g, 60')-модифицированный метод Murphy.

При центрифугировании крови, эритроциты "молодой" популяции концентрировались в верхнем слое капилляра, а "старые" клетки - в нижнем. Острая кровопотеря, как фактор, стимулирующий эритропоэз, проводилась по стандартной методике: кровь забиралась из яремной вены животного (2% от массы тела), находящегося под эфирным наркозом.

Особое место в нашей работе отведено исследованию деформационных свойств эритроцитов в зависимости от осмоляльности среды /Clark е.а., 1983/. Моделирование сред различной осмоляльности осуществлялось по следующей технологии

- раствор FICOLL-400 готовили на 0,02М фосфатном буфере, pH 7,4, не содержащем NaCl, измеряли его вязкость, а затем в пробы добавляли различную, но фиксированную массу NaCl и тщательно перемешивали при помощи магнитной мешалки.

Осмоляльность сред измеряли с помощью осмометра 1Ц-01. Используя полученный набор растворов различной осмоляльности исследовали способность эритроцитов к упругим деформациям для "молодой" и "старой" популяции клеток до и после кровопотери.

Конструктивные особенности эктацитометра. созданного в нашей лаборатории. Для исследования способности эритроцитов к деформациям использовали метод эктацитометрии. Эктацитометрия

- метод, в основе которого лежит явление дифракции лучей гелий-неонового лазера на тонком слое эритроцитов, деформируемых потоком вязкой жидкости, что приводит к изменению дифракционной

картины, по которым судят о деформабильности эритроцитов (рис. 2,3) /ВеБЯБ, е.а., 1980; Сгопег, е.а., 1980 /.

Нами создана и апробирована эктацитомегрическая установка для изучения реологических свойств эритроцитов в потоке, в качестве конструктивного прототипа которой мы использовали конструкцию прибора, представленную в работах /Везз1з, е.а., 1980; йгопег, е.а., 1980/.

Основанием установки служит массивная металлическая плита, установленная горизонтально. Привод наружного цилиндра обеспечивает серводвигатель (НБМ 150, Чехословакия) и высокостабилизированный блок питания с кварцевой стабилизацией. Скорость вращения может меняться в пределах от 0 до 400 об/мин. и контролируется специальным электронным индикатором, датчиком которого служит оптронная пара. В качестве когерентного источника света используется гелий-неоновый лазер ЛНГ-208Б (мощность Р=1.9х10~3 Вт, длина волны ^=632.8 нм). Оба стакана выполнены из прозрачного для видимого света материала (оргстекло) и термостабилизированы. Термостабилизация внутреннего, покоящегося стакана, конструктивно была нами обеспечена пропуском внутри него змеевика. Для наружного стакана нами сконструирована специальная "рубашка" с отверстием для света и с очень малым зазором между этой "рубашкой" и вращающимся наружным стаканом. Наружный диаметр внутреннего цилиндра составляет 49 мм, внутренний диаметр наружного - 50 мм, так что ширина щели между стаканами равна 0,5 мм. Исследуемые эритроциты, суспензированные в растворе Е1СОЬЬ-400, вносились в зазор между этими цилиндрами, где подвергались деформирующему воздействию при вращении наружного стакана. Формула для расчёта скорости

Я-£2 N

сдвига имеет следующий вид: у =-= (—)-(2к—), где £2 - частота

1 1 60

вращения, И - радиус вращающегося стакана, 1 - зазор между стака-

нами, N - скорость вращения ( N/60 - число оборотов в минуту), приобретает вид: у = ——— = 314.16 ■ (—) ' 0.5 60

При фиксированных значениях радиусов внутреннего и наружного стаканов, скорость сдвига зависит только от скорости вращения наружного стакана, а при постоянном значении динамической вязкости г)> усилие сдвига т, также определяется только скоростью

вращения т = у- т|

Информация об основных константах нашей установки была "зашита" в программу компьютера и различные усилия сдвига достигались изменением скорости вращения. В качестве регистрирующего устройства мы использовали твёрдотельную видеокамеру, видеосигнал с которой поступал на аналого-цифровой преобразователь, что обеспечивало непосредственный ввод информации в персональный компьютер 1ВМ РС/АТ (рис. 1).

Видеокамера была изготовлена по нашему заказу в НПО "Ромпа" г. Барнаул.

Блок-схема эктацигометра

Прозрачные | [ ципщцры

Ф Рис 1.

Для количественной оценки выявляемого среднеклеточного удлинения при сдвиге используется эктацитометрический показатель, или индекс удлинения 1]э=(А-В)/(А+В), где А и В -большая и малая полуоси дифракционного эллипса.

Степень вынуждающего воздействия оценивается по

напряжению (усилию) сдвига т = т|-у; (Н/м2), где т) - динамическая

вязкость суспензионной среды, Пахе; у - скорость сдвига, 1/с. В свою

очередь скорость сдвига зависит от скорости вращения N наружного цилиндра относительно покоящегося внутреннего- и соотношения их

Б N

диаметров В и с1 : у = 2 к -

Ю - (I

Действительное изображение дифракционной картины выводится на монитор компьютера (рис. 2.), программно анализируется и может быть записано в память машины вместе с интересующими нас параметрами, такими как значения радиусов и индекс деформабильности, как величина, определяемая особым отношением радиусов эллипса по формуле, 1]}=(А-В)/(А+В) и являющаяся функцией от усилия сдвига. Для сравнения изображения выводимого на монитор компьютера и реальной дифракционной картины, получаемой на нашей установке, на рис. 3 представлены фотографии, полученные контактным способом с фотопластинок, на которые проецировались лучи лазера, прошедшие через суспензию эритроцитов.

Рис. 2. Реальное изображение дифракционной картины, получаемое при прохождении луча от лазера через слой эритроцитов и выводимое на монитор. Справа-для покоящихся эритроцитов; слева-для эритроцитов в сдвиговом потоке.

Рис. 3. Фотографии дифракционных картин, полученных при прохождении луча лазера через суспензию эритроцитов. 1- для покоящихся эритроцитов; 2, 3- для эритроцитов в сдвиговом потоке.

В процессе исследования деформабильности эритроцитов с помощью эктацитометра регистрируют зависимость 1ц от х (рис. 4). Программа, позволяющая анализировать изображение, написана на языке Turbo Paskal и получила название "Scan".

А-В

Рис.4. График зависимости индекса деформабильности от усилия сдвига, приложенного к эритроцитам.

Технология проведения эктацитометрических исследований. Решая задачу по тестированию прибора, мы провели серию из 10 экспериментов. Проба крови вносилась в 20% раствор ПС(ЭЫ,-400, (в пропорции 100 мкл цельной крови на 3 мл раствора) приготовленного на фосфатном буфере. В результате разбавления, концентрация эритроцитов составляла «15><107 клеток/мл. Дальнейший контроль за концентрацией эритроцитов в растворе не носил принципиального характера, так как данный параметр определял лишь интенсивность дифракционной картины (по аналогии с дифракционной решёткой) и лимитировался чувствительностью видеокамеры.

По количественным показателям индекса деформабильности 1е>, при различных усилиях сдвига, изменяющихся в диапазоне от 0 до 35 Н/м2 , используя компьютер, строилась эмпирическая кривая, иллюстрирующая функциональную связь между изменениями в

форме взвешенных в вязкой среде эритроцитов и приложенным к ним напряжением сдвига (рис. 4). В результате компьютерной обработки полученных результатов, включающей весь алгоритм математико-статистического анализа, а также преобразование графического образа функции индекса деформабильности (10) от усилия сдвига (т), приложенного к эритроцитам, в адекватную аналитическую форму, с оценкой степени достоверности соответствия этому виду уравнения и учётом погрешностей, неизбежно возникающих в подобного рода исследованиях, были получены следующие значения (табл. 1)

Таблица 1.

Результаты регрессионного и корреляционного анализов зависимости индекса 1с деформабильности от усилия сдвига т НОМЕР РЕГРЕССИИ ."СТЕПЕНЬ ПОЛИНОМА :4 ВИД ПОЛИНОМА: У=А0+А1Х+А2Х2+АзХ3+А4Х4

1 коэффициент значение лев. граница прав.граница

степени X коэффициента уровень 0.95 уровень 0.95

0 3.86006х10~4 -1.73923х10-2 1.81643х10-2

1 7.98527х10"2 6.97506х10"2 8.99547х10-2

2 -5.67924х10"3 -7.23902х10"3 -4.11946х10"3

3 1.98004х10"4 1.16666х10-4 2.79342х10-4

4 -2.58114x10"® -3.92702x10-® -1.23527x10"®

МНОЖЕСТВЕННАЯ КОРРЕЛЯЦИЯ: 0.9998., ЗНАЧЕНИЕ ФИШЕРА: З.21952х103, ТАБЛИЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ФИШЕРА: 19.2467, УРАВНЕНИЕ ЗНАЧИМО.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Процессы газообмена между кровью и тканями осуществляются в микроциркуляторном русле во время прохождения эритроцитов через кровеносные капилляры. Средний диаметр эритроцитов («7,55 мкм) вдвое превышает диаметр самых мелких капилляров («3 мкм), поэтому при прохождении через кровеносные капилляры происходит деформация эритроцитов, при которой меняются линейные размеры и форма клеток. Таким образом, способность эритроцитов к деформации является непременным условием их прохождения через микроциркуляторное русло, а это во многом определяет выполнение кровью одной из основных ее функций - газотранспортной.

Деформация эритроцитов осуществляется за счет сил напряжения сдвига со стороны смещающихся слоев плазмы крови. После прекращения воздействия деформирующей силы эритроциты восстанавливают прежние размеры и форму, то есть им присущи свойства упругого твердого тела. Способность эритроцитов к деформации получила название деформабильность (deformability). Следует различать понятия деформабильность эритроцита в целом и деформабильность мембраны эритроцита. Мембрана эритроцита также обладает свойствами упругого твердого тела Поведение мембраны эритроцита при действии деформирующей силы как упругого твердого тела определяется ее молекулярной организацией и физико-химическими свойствами структурных молекул.

Анализ доступной нам литературы свидетельствуют о том, что метод эктацитометрии является в настоящее время одним из основных, используемых в ведущих зарубежных гематологических центрах для оценки деформабильности эритроцитов /Chasis, Mohandas, 1986; Chasis е.а., 1988; Reid е.а., 1987; Nash е.а., 1990; Kuypers е.а., 1990/.

Отсутствие эктацитометров в гематологических лабораториях России обусловлено тем, что выпуск этих приборов не освоен нашей отечественной промышленностью, а приобретение импортных приборов лимитируется их высокой стоимостью. Один из обязательных этапов на пути разработки промышленного образца экта-цитометра является создание лабораторной эктацитометрической установки и отработка технологии проведения экспериментов по оценке деформабильности эритроцитов методом лазерной дифрактометрии, что и являлось одной из задач настоящей работы.

Рис. 5. Графики зависимости индекса деформабильности 10 мембран эритроцитов крысы, обработанных раствором глютарового диальдегида, различных концентраций, от приложенного к ним напряжений (т). 1-"норма"; 2- концентрация глютарового диаль-дегида-0.01%; 3- концентрация глютарового диальдегида -0.02%; 4-концентрация глютарового диальдегида -0.03%.

Используя эктацитометр мы выявили достоверное снижение деформабильности эритроцитов, мембраны которых были модифицированы в результате обработки глютаровым диальдегидом, также были найдены различия в деформабильности молодых и старых эритроцитов (рис. 5).

Другая, используемая нами, модельная ситуация, модифицирующая мембрану эритроцита, а следовательно, и её вязкоэластические свойства - блокада спектрина антителами к нему.

Липосомы, загруженные антителами к спектрину, вводились крысам внутрибрюшинно, попадая в кровь они сливались с мембраной эритроцитов, так что антитела к спектрину взаимодействовали со спектрином. Блокада спектрина антителами приводила к изменению структурной организации цитоскелета мембраны эритроцита, что в свою очередь негативно отражалось на реологических свойствах эритроцитов. Изменения в способности эритроцитов к упругим деформациям, вызванные структурной модификацией цитоскелета мембраны антителами к спектрину, хорошо прослеживались по результатам эктацитометрических исследований (рис. 6).

А-В

Рис. 6. Графики зависимости индекса деформабильности мембран эритроцитов, загруженных антителами к спектрину, от приложенного к эритроцитам напряжения (т). 1-эритроциты интактных крыс; 2- эритроциты крыс, которым вводились липосомы, содержащие антитела к спектрину. Точки на графике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п—10).

Способность эритроцитов к деформации определяют следующие основные факторы:

1. Вязкоэластические свойства мембранного материала;

2. Форма клеток ( отношение площадь поверхности / объём);

3. Вязкость внутриклеточного содержимого относительно вязкости внеклеточного раствора / Mohandas, 1981/.

В том случае, когда нет изменений вязкоэластических свойств мембранного материала, максимальной деформабильностью клетки обладают в изоосмолярной среде, поскольку при этих условиях обеспечивается наибольшая величина отношения площадь поверхности / объём. Величина этого отношения зависит от осмо-ляльности суспензионного раствора. С увеличением концентрации гемоглобина в эритроцитах и, соответственно, увеличением вязкости внутриклеточного содержимого, изменяется отношение площадь поверхности / объём клеток, и как следствие этого снижается деформабильность эритроцитов, что достигается путём помещения последних в гиперосмолярную среду. В гипоосмолярной среде также снижается деформабильность эритроцитов, и тоже по причине изменения отношения площадь поверхности / объём клеток /С1агк, 1983/. Кривая зависимости индекса деформабильности 1ц эритроцитов от осмоляльности суспензионного раствора при условии постоянства усилия сдвига (т=сопз1;), получила название профиля осмотической деформабильности (рис. 7).

На профиле осмотической деформабильности выделяют следующие точки: максимальное значение индекса деформабильности 1ртах> 1ртщ- минимальное значение в гипоосмолярной области, в гиперосмо-лярной области - значение осмоляльности для 10=1/2 1втах-Анализируя значения осмоляльностей для и 10=1/2 1втах на

профиле осмотической деформабильности можно получить информацию о вязкоэластических свойствах мембран эритроцитов, о форме клеток, о соотношении площадь поверхности / объём и вязкости внутриклеточного содержимого /МоЪапс1аз, 1981; 11етЬаг1;, е.а., 1989/.

А-В

kg

Рис. 7. Профиль осмотической деформабильности эритроцитов интактных крыс. Точки на графике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п=10).

В ходе процессов дифференциации эритроидных клеток, протекающих в костном мозге, происходит формирование специализированных мембранных структур, необходимых зрелым эритроцитам для их функционирования в циркулирующей крови. Такой специализированной мембранной структурой является белковый цитоскелет. Синтез белков - структурных компонентов цитоскелета начинается на уровне проэритробластов /Hanspal е.а, 1992/. Есть все основания предполагать, что ретикулоциты, поступающие из костного мозга в кровоток в условиях нормального кроветворения, представленны в основном ретикулоцитами IV, и, в меньшей степени, III степени зрелости /P.A. Дымшиц, Ю.М. Захаров, 1966/, которые имеют завершённую структуру цитоскелета. Выход в циркулирующую кровь ретикулоцитов ранней степени зрелости (О, I и II классов зрелости) возможен в экстремальных ситуациях (например, после острой кровопотери).

Возможно, что деформационные свойства этих ретикулоцитов имеют отличия от зрелых эритроцитов, поскольку у них не завершён процесс самосборки белкового цитоскелета. Для проверки этого предположения, мы исследовали деформабильность

ретикулоцитов, выделенных из крови интактных крыс, а также и ретикулоцитов, полученных от крыс после острой кровопотери.

Для разделения эритроцитов, мы использовали метод центрифугирования по Murphy /1973/. Выделенные с помощью этого метода фракции молодых и старых эритроцитов достоверно различались относительным содержанием ретикулоцитов (рис.8), концентрацией гемоглобина, диаметром и отношением площадь поверхности/объём (табл. 2).

Рис. 8. Относительное количество ретикулоцитов, выявленное в цельной крови и среди клеток верхнего и нижнего слоев, после центрифугирования по

Murphy /1973/ (п=12).

до кровопотери

после фоеопогсри

Таблица 2.

Результаты цитометрических исследований и концентрация гемоглобина в эритроцитах молодой и старой популяций до и после кровопотери (п=10). *Р<0.05 относительно данных для верхнего слоя до кровопотери

Исследуемый образец эритроцитов Средний диаметр эритроцитов (0) Х±т (мкм) Средняя площадь эритроцитов (S) Х±т (мкм2) Сферический индекс S/V Х±т Концентрация Hb X±m (г/л)

1 Клетки верхнего слоя до кровопотери 7.32+0.13 104.62+1.11 2.72±0.05 298±8

2 Клетки нижнего слоя до кровопотери *6.21±0.09 *75.22±0.65 *2.58±0.08 *316±5

3 Клетки верхнего слоя после кровопотери 7.97+0.12 123.81+1.12 2.82±0.07 278±8

4 Клетки нижнего слоя после кровопотери *6.26±0.17 *76.99±1.24 *2.48±0.09 •326+7

Исследуя с помощью эктацитометрической техники деформабильность эритроцитов молодой и старой популяций, выделенных из крови интактных крыс, мы выявили достоверно более низкую способность к деформации старых эритроцитов в отличие от молодых клеток (рис. 9).

А-В

0.45 1

Рис. 9. Графики зависимости индекса деформабильности от усилий сдвига, приложенных к эритроцитам различной степени зрелости. 1-"молодые" клетки, 2-"старые" эритроциты после острой кровопотери, 3-"старые" эритроциты, полученные при физиологическом эритропоэза, 4-"молодые" клетки после острой кровопотери. Точки на графике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п= 10).

Достоверные отличия наблюдались и между профилями осмотической деформабильности эритроцитов до и после кровопотери. На профиле осмотической деформабильности эритроцитов старой популяции в отличие от профиля осмотической деформабильности для молодых клеток (рис. 10) наблюдалось достоверное снижение величины 1ртах и смещение 1стт в гипертоническую область, а также уменьшение ширины интервала значений осмоляльности суспензионной среды 0Ш1П- О'.

Низкая деформабильность - в гиперосмолярной среде является следствием увеличения концентрации гемоглобина и роста вязкости внутриклеточного содержимого в результате потери эритроцитами воды. В гипотоническом растворе, напротив, происходит поступление воды в эритроциты и вследствие этого увеличение их сферичности и уменьшение величины отношения площади поверхности к объёму, что также приводит к снижению деформабильности /Mohandas е.а., 1981/.

AJ

Рис. 10. Профили осмотической деформабильности для "молодой"(1) и "старой"(2) популяций клеток до кровопотери при фиксированном усилии сдвига ( т=30 Н/м2 , г|=18,64x10" 3 Па-с, Т=310°К ). Точки на графике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п=10).

Величина Iomax уменьшается при снижении отношения площадь поверхности/объем и увеличении величины модуля поверхностного сдвига мембран эритроцитов /Chasis е.а., 1988; Reinhart е.а., 1989/. Положение 1отах на профиле осмотической деформабильности Iümax эритроцитов обычно соответствует изоосмолярному значению среды, но может смещаться в гипотоническую область при увеличении концентрации гемоглобина, или - в гипертоническую область при снижении концентрации гемоглобина в эритроцитах.

Значение осмоляльности суспензионной среды (Omin) при которой величина деформабильности эритроцитов минимальна (Iomin) также варьирует в зависимости от концентрации гемоглобина в эритроцитах. Минимальная величина деформабильности эритроцитов при Omin обусловлена достижением эритроцитами максимального возможного объема, когда отношение площадь поверхности объем имеет наименьшее значение, и при этой осмоляльности раствора гемолизируется до 50% клеток /Mohandas е.а., 1981/.

Увеличение деформабильности эритроцитов при снижении осмоляльности суспензионной среды ниже величины Omin объясняют уменьшением объема клеток вследствие потери ионов и воды в результате увеличения проницаемости мембран /Clark е.а., 1983/.

Таким образом, выявленные нами характерные отличия профиля осмотической деформабильности старых эритроцитов в отличие от молодых клеток были обусловлены увеличением концентрации гемоглобина в цитоплазме и уменьшением отношения площадь поверхности/объём.

Действительно, для популяции старых клеток, в отличие от молодых эритроцитов, нами было выявлено достоверное увеличение концентрации гемоглобина и уменьшение отношения площадь поверхности/объём (табл. 2). Уменьшение величины Inmax Для старых эритроцитов можно объяснить как снижением соотношения площадь поверхности/объём, так и изменениями вязко-эластических свойств материала мембраны. Об этом свидетельствует и более высокие значения модуля поверхностного сдвига для мембран старых эритроцитов в отличие от молодых клеток, выявленные с помощью микроаспирационной техники /La Celle е.а., 1976/.

Одной из задач настоящего исследования являлось изучение деформабильности эритроцитов молодой и старой популяций в условиях стимулированного эритропоэза после острой кровопотери. Для нормального эритропоэза характерно наличие эритроцитарного

баланса, или соответствия между количеством эритроцитов поступающих из костного мозга в кровь и элиминируемых из кровеносного русла вследствие их разрушения. В результате количество эритроцитов в единице объема крови остается относительно постоянным /Е.И. Мосягина и др. 1976 /. Интенсивность процессов эритропоэза в костном мозге определяется уровнем эритропоэтина в плазме крови /М.Г. Кахетелидзе, 1964/.

Увеличение ретикулоцитов в периферической крови после острой кровопотери, обусловленное их выходом из костного мозга, или так называемый распределительный ретикулоцитоз, наблюдается уже через 4-6 часов после острой кровопотери. В циркуляцию поступают ретикулоциты 0, 1, 2 степени зрелости, которые при нормальном эритропоэзе завершают процесс созревания в костном мозге.

Действительно, через четыре часа после острой кровопотери мы выявили достоверные изменения в ретикулоцитарной формуле - увеличение относительного количества менее зрелых форм ретикулоцитов (табл. 3).

За время нахождения в костном мозге в ретикулоцитах завершаются процессы формирования белкового цитоскелета, определяющего способность клеток к деформации, что является непременным условием для их прохождения через микроциркуляторное русло. Выявленная в наших экспериментах низкая способность к деформации молодых эритроцитов, выделенных из крови крыс через четыре часа после острой кровопотери (рис. 11), в сравнении с деформабильностью молодых эритроцитов из крови нормальных животных , была обусловлена появлением в цирку-ляторном русле незрелых ретикулоцитов.

Таблица 3.

Относительное распределение ретикулоцитов крови по степени зрелости до и после кровопотери.

Сроки исследования 1 класс 2 класс 3 класс 4 класс

До кровопотери 3.3110.82 5.5810.84 7.6510.76 83.4414.36

После кровопотери *5.30±0.64 »8.5110.83 "12.0110.93 *74.1613.29

*Р<0.05 относительно данных, полученных до кровопотери.

А-В

Рис. 11. Профили осмотической деформабильности для "молодой'популяции эритроцитов; 1 - интактные крысы;

2- спустя четыре часа после острой кровопотери ( фиксирован-ное усилие сдвига т=30 Н/м2 , Г|=18,64х10-3 Па-с, Т=310°К ). Точки на графике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п^Ю).

Таким образом результаты данной работы позволяют говорить о том, что в условиях нормального эритропоэза из костного мозга в кровь поступают ретикулоциты имеющие высокую способность к деформации, и напротив, незрелые ретикулоциты, обладающие

низкой деформабильностью, не могут пройти через поры стенок венозных синусов костного мозга. После острой кровопотери, в результате действия эритропоэтина на стенки венозных синусов костного мозга, этот механизм отбора ретикулоцитов по степени зрелости блокируется, что позволяет выбросить в циркуляцию костномозговой резерв ретикулоцитов и обеспечить экстренное восполнение дефицита эритроцитов в крови.

ВЫВОДЫ

1. Эктацитометрия является объективным методом оценки способности эритроцитов к деформации;

2. Преимуществами эктацитометрического метода оценки деформа-бильности эритроцитов являются быстрота проведения исследований и их высокая степень автоматизации ;

3. Эритроциты старой популяции, выделенные из крови нормальных крыс, имеют достоверно более низкую деформабильность в сравнении с молодыми эритроцитами.

4. Снижение деформабильности эритроцитов при старении обусловлено уменьшением отношения площадь поверхности объем, увеличением концентрации гемоглобина в цитозоле и изменениями механических свойств материала мембраны.

5. Через четыре часа после острой кровопотери эритроциты молодой популяции обладают достоверно более низкой деформабильностью в сравнении с молодыми эритроцитами, выделенными из крови нормальных животных.

6. Снижение деформабильности эритроцитов молодой популяции через четыре часа после острой кровопотери обусловлено поступлением в циркуляцию из костного мозга ретикулоцитов ранней степени зрелости, в которых не завершены процессы формирования структуры белкового цитоскелета.

СПИСОК

НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

L. Эктацитометрия-объективный метод оценки способности эритроцитов к деформации /Белкин A.B.., Сторожок С.А., Катюхин Л.Н..// Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова., 1991, №1, - С. 133-138.

I. Уровень АТФ в эритроцитах при механических деформациях и изменении осмолярности среды/ Сторожок С.А., Санников А.Г., Белкин А.В.//Обмен веществ в норме и патологии: Сб. науч. работ. -Тюмень. 1992. - С. 95. 5. Завершенность процессов самосборки цитоскелета мембран эритроцитов как один из факторов их функциональной зрелости /Сторожок С.А., Белкин A.B., Василевский В.В., Санников А.Г.//Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области: Сб. науч. работ. -Тюмень.

1993. - С. 50-52.

L Использование эктацитометра при исследовании деформационных свойств клеток эритроидного ряда/Белкин A.B., Сторожок С.А.//Актуальные проблемы фармации: Сб. науч. работ. -Тюмень.

1994. - С. 170.

). Роль мембранного цитоскелета в обеспечении стабильности и деформабильности эритроцитов/ Сторожок С.А., Санников А.Г., Белкин A.B.// Медицина и охрана здоровья: Тез. докл. международной науч. конф.- Тюмень, 1995. - С. 50.