Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия генов теплового шока и адаптация организмов к гипертермии

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генов теплового шока и адаптация организмов к гипертермии"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР.

' институт биологии -развития иы.Н.К.кольцова ---

На правах рукописи

ТИТАРЕНКО Елена Александровна

удк:577.217.5

экспрессия генов теплового шока и

адаптация организмов к шергерши 03.00.15 - генетика

А в. тореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических "наук

Москва - 1589

Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова АН СССР, г.Москва.

Научные руководители:

- д.б.н. Ы.Б.Евгеньев г - д.б.н. Е.В.Ананьев

Официальные оппонента:

- доктор медицинских наук, профессор Л.И.Корочкин

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР, Москва;

- кандидат .биологических наук, Л.I"1.Николаев

ВНИИ "Биотехнология", Москва.

Ведущее учреждение; кафедра генетики биологического факультета Ленинградского государственного университета им. А.А.Жданова.

Защита диссертации состоится -<23" мол- 1990 г. на заседании специализированного совета К 002.85.01 по защите диссертаций на соискание'ученой степени кандидата биологических наук при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР по адресуг 117334, г.Москва, ул. Вавилова, 26. 1

, С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им.Н.К.Кольцова АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.М.Протопопова

общая характеристика

Актуальность проблемы. Синтез небольшого чмсла полипептидов в ответ на повышение' температуры выше оптимального для данного организма уровня - универсальная реакция,характерная для всех изученных организмов от Е.поИ до человека ( ИпсЦ^зъ , 1986). При тепловом шоке (ТШ) происходит перестройка всех уровней активности генома - от транскрипции и созревания РНК, до трансляции и сборки белков (Лозовская, Евгеньев, 1984). Белки теплового шока (БТ№ синтезируются не только в ответ на повшение внешней температуры за пределы, характерные для обычных условий обитания организма, но и на действие ряда других стрессовых факторов (например окисляющих агентов, веществ, нарушающих энергетический метаболизм, веществ, вызывающих осмотический стресс, некоторых вирусов и г.д.) 4 Коуег , 1984; Lindquiзt , 1986). Интересно и то, что гены, кодирующие ЕГШ, отличаются высоким консерватизмом своей структуры, что харахтерю для тех генов, которые играют ваднув роль в жизнедеятельности клетки (пример - гистоновые гены).

Т.к. экспрессия генов ПИ может индуцироваться различными стрессовыми факторами, то естественно было бы предположить, что одной из основных функций этой системы генов является защита клетки йт повреждающего действия стресса и повышение ее устойчивости - иными словами, адаптация клетки к неблагоприятным воздействиям. Несмотря на то, что количество работ, посвященных изучению этого вопроса, стремительно расте' , молекулярные механизмы функционирования системы теплового шока и функции БГШ в клетке в настоящее время до конца не ясны. Получен ряд данных, убедительно свидетельствующих в пользу участия БГШ в формировании термотолерантности и их возможной рдчи в защите клетки от неблагоприятных условий среды ( Талеиау , 1983; ВозоЬ et а1 , 198Н).

К настоящему времени в литературе имеется сравнительно мало данных ио г-учению экспрессии генов ТШ у организмов, резко отличающихся по температуре спеды обитания. В связи с этим представлялось интересным выяснить характер экспрессии ггнов, кодирующих БТШ, у организмов, приспособленных в процессе эволюции к различны! температурным режимам. Отличаются ли более теплолюбивые организмы по способности экспрессировать ВГШ при экстремально высоких температурах от тех, яоторые приспособлены к обитанию в более уме-

ренном климате, и можно ли определенно говорить о положительной корреляции между способностью организма к высокотемпературной экспрессии генов Uli и его термоустойчивостью? Имеет ли эта способность синтезировать БГШ при повышении температуры адаптивное значение? Ответы на эти вопрсла, а также изучение молекулярно-биоло-гических механизмов функционирования системы ответа на ТШ представляют не только теоретический интерес в плане изучения многосторонних взаимодействий организма и окружающей среды, но имеют и практически ценность при разработке способов и режимов адаптации к различным стрессам и создании новых форм с повышенной термоустойчивостью. Кроме того, в последнее время проблема реакции организмов на повышение температуры окружающей среды рассматривается в плане воздействия гипертермии на раковые клетки, которые, как и все активно делящееся клетки, оказались чувствительными, к высокой температуре. Поэтому проблемы, связанные с выяснением механизмов воздействия гипертермии на рост ракоЕ х оцухолей, сейчас очень актуальны.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось сравнение экспрессии генов ТШ у организмов, отличающихся по температуре среды обитания, и установление возможных корреляций между синтезом БПП и термоустойчивостью организмов, приспособленных в процессе эволюции к различным температурным режимам внешней среды. Работа включала следующие задачи: I) изучить синтез БГШ как на трансляционном уровне, так и на уровне синтеза мРНК в модельных системах; 2) сравнить характер экспрессии генов ТШ при разных температурах у организмов, отличающихся по термоустойчивости; 3) проанализировать первичную структуру гена, кодирующего главный белок теплового шока у организма, приспособленного к обитанию в среде с жарким климатом - тутового шелкопряда.

Научная новизна р&бсты. В результате проведенных исследований показано существование положительной корреляции между экспрессией генов ТШ и термоустойчивостьго у трех линий D.melanogaster, реагирующих по-разному на температурный стресс: контрольной Ore -gon R , термоустойчивой линии Т и мутантной линии l (i)ts -403, характеризующейся высокой термочувствительностью.

Показана авторегуляция синтеза БТШ, т.е. способность этих белков ингибирозать собственный синтез по принципу обратной связи.

При изучении характера синтеза БТ1Д у трех видов шелкопряда, отличающихся по температуре среды обитания, обнаружено, что куль-

тур" клеток тутового и дубового шелкопрядов, видов, обитающих на юге, способны были синтезировать ьГШ при исключительно высоких температурах (до 50°С) и отличались высокой термоусгойчивостыо. В клетках тутового шелкопряда (в.тога ) наблюдалось нарастание синтеза мРНК, кодирующего БТШ70, при повышении температуры вплоть до 45°С. Показано, что повышенная тер»орезистентность характерна и для гусениц тутового шелкопряда. С другой стороны, культура клеток вида, обитающего в умеренной полосе (непарный шелкопряд), характеризовалась гораздо меньшей теплоустойчивостью и способна была экспрессировать БГШ при температурах не выше 40°С.

Показано, что инфецированна" вирусом ядерного полиэдроза (оЯП) культура в.тог! теряла способность синтезировать ЕЛИ, что,по-ви-димому, явилось причиной ее повышенной чувствительности к высокой температуре.

Из геномной библиотеки З.тог! получен клон Втлзр 70, содержащий термоиндуцибельный ген ЬГШ70. Построена реотрйктная карта этого клона и определена нуклеотидная последовательность гена.Сте-пень гомологии его, последовательности аминокислот с БЖ70 дрозофилы составляет 83%. В 5'-регуляторной области клонированного гена обнаружены типичные регуляторные элементы ТШ (14-нуклеотидные про-иоторные НБЕ -элементы) с высокой степенью гомологии (не более 3-х замен) аналогичным регуляторным элементам дрозофилы.

Практическая ценность работы. Полученные данные могут быть использованы в экспериментах по разработке спсзобов и режимов адаптации организмов к различным экстремальным факторам. Результаты наших исследований можно использовать в работах по генетической инженерии» имеющих целью создание фор* с повышенной термоустойчивостыо. Клон из генома в.тог1 , содержащий ген Ш170, можно использовать при создании генных конструкций, активность экспрессии которых регулируется температурным фактором. Тутовый шелкопряд - важны" в народнохозяйственном плане объект, полученные в работе результаты по индукции БШ в зараженных клетках могут быть хспользованы в разработках по борьбе с распространенн й болезнью з.тог! , вызываемой ВЯЛ. Кроме того, в последнее время растет число работ по использованию вируса ядерного полиэдроза в качестве эукариотического вектора для наработки в гусеницах шелкопряда ценных биотехнологических продуктов (интерферона, интерлекша и т.д.) и нами данные по действию ТШ на зараженные клетки следует учитывать в подобных исследованиях.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, одна находится в печати. Результата, изложенные в диссертации, обсуждались на рабочем совещании "Белки ■теплового шока" (Ленинград, 1987 г.), а также на межлабораторном научном проблемном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен им. Н.И.Вавилова АН СССР.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, 4-х глав (литературный обзор, материалы и методы, результаты исследований и обсуждение результатов), выводов и списка литературы, состоящего из 166 наименований, содержит 106 страниц текста, J8 рисунков и одну таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. Материалом исследования служили три линии Dro-sophila melanogasíer, отличающиеся по способности переносить повышенную температуру: контрольная Oregon я , мутантная линия 1(1) ts -403, полученная из лаборатории проф. Р.Аркинга (Мичиган, США), которая характеризуется повышенной чувствительностью к температурному стрессу, а также терыорезистентная линия Т полученная из Ленинградского университета (кафедра генетики), которая отличается тем, что" остается фертильной при 32°С.

Еыди использованы гусеницы У-го возраста тутового шелкопряда ВотЪух mori 1 , а также культур! клеток 3-х видов шелкопряда;, тутувого (В.morí ), дубового ( Antberaca регаух Guer. ) и непарного ( Lymantrla dispar X. ). Все культуры клеток, а также культура клеток в.mori, инфецированная ВШ, были получены от Т.Я.Брауде-Золотаревой (ИОГен АН СССР, Москва). •

Методы исследований. Введение радиоактивной метки в белки in vivo и в ¡о'льтуре клеток проводили, как описано в работе Evgen*-ev et al. (1979).

Введение радиоактивной метки в ДНК проводили гак с помощью ДНК-полимеразы E.coli (Манииатис с сс-шт., 1984), так и используя систему достройки второй цепи экзогенной ДНК, помещенной в полилинкер фага MI3 (тр 19) с помощью фрагмента Кленова ДНК-полчме-разы I ( Hu, Messing , 1982).

Электрофорез белков в полиакриламадном геле проводили по методу 'Laemmli (1970), двумерный электрофорез белков проводили'по методу OTarrell. (1975). Флюорографию гелей вз акрилаа'вда прово-

дили согласно Bonner, Ьазкеу (1974).

Выделение ДНК и РНК из пух и из кулыуры клеток, плазмидной ДНК и ДНК бактериофага Д , обработку ДНК ферментами, фракционирование ДНК и РНК в плоских агарозных гелях, перенос из гелей на нитроцеллюлозные фильтры, эксперименты по гибридизации ДНК и РНК, иммобилизованных на фильтрах с мечеными радиоактивными зондами проводили согласно руководству Манниатиса с соавт. (1984).

Конструирование геномной библиотеки тутового шелкопряда, включающее приготовление векторной ДНК (был использован бактериофаг ^ - разновцинос-ть EMBL 3 ( Hendrik et al. , 1983), приготовление фрагментов эукариотической ДНК длиной 20 т.п.н, лигирование, упаковку рекомбинантной ДНК в частицы фага ^ , а также скрининг полученной библиотеки методом гибридизации in situ бляшек фага % со специфические зондом, меченым 32р и содержащим ген, кодирующий БТШ70 D.melanogaater , проводили, как описано в руководстве Манниатиса с соазт. (1934).

Молекулярный анализ выделенного из библиотеки генов B.mori фрагмента ДНК ВшЬзр 70, включающий построение его рестриктной карта и определение нуклеотидной т.-¡ледовательности по модифицированному методу Maxam, Gilbert (1980) проводили совместно с Н.Г.Холодиловым и В.М.Блиновым (Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск). Эксперименты по 31 -картированию проводили согласно руководству Манниатиса с соавт. (1984).

результаты шслвдований и их обсдцеющ ,

Предполагается, что способность к синтезу БПП организмами при повышении температуры окружающей среды имеет адаптивное значение, т.е. существует корреляция между способностью синтезировать БТШ клеткой и термоустойчивостью организма.

БТШ выполняют, по-видимому, спасающую функцию, т.е. предохраняют метцу от негативного действия высоких температур. Следовательно, те клетки и организмы, которые способны синтезировать БТШ в экстремальных условиях, будут устойчивыми к такому стрессу.

' Способность синтезировать БТШ при перенесении организма или клетки в условия повышенной температуры явилась таким критерием, нрторый мы использовали для характеристики тех событий, которые происходят в кдетг" в ответ на тепловой стресс. Причем, было проведено сравнительное изучение этой'способности у 'организмов, при-

способленных в процессе эволюции к различным температурным режимам среды обитания.

I. Сравнение ответа на тепловой шок у разных ЛКН"й Drosophila melanocaster

При анализе синтеза БТШ в ответ на повышение температуры у трех различ..лх линий c.nelanogaa-oer : контрольной Oregon R , термоустойчивой линии Т и термочувствительной мутантной линии l(I)ts-403 было обнаружено, что способность синтезировать БГШ в отврт на повышенную температуру коррелирует с устойчивостью организма к гипертермии. Ыутантнад линия неспособна синтезировать полный спектр B'iul при 37°С (он у нее редуцирован) (рис.1,б),и ото коррелирует с ее крайне высокой чувствительностью к повышенной температуре: личинки 1(тНо -403 плохо переносят нагревание более 30 минут при 37°С и быстро погибают. Термоустойчивая линия Т, особенностью кс-орой является ее фертильность при 32°С, проявляет тенденцию к более высокому включению радиоактивной метки при сублетальной для дрозофилы температуре (39-40°С) по сравнению с контролем (рис.1,а\ в клетках слюнных желез личинок этой линии при 37°С синтез БТШ поотекает на фоне непрекращающегося синтеза некоторых клеточных белков, в то время, как у линии Oregon R синтез нормальных белков при 37°С практически полностью подавлен (рисЛ,а).

Ранее многими исследователями было показано ( Taneuay , 1983), что существует корреляция между развитием термотолерантности и синтезом БТШ. Было показано ( 3oscii et al. , 1988), что только те виды гидры, к .'орые способны были синтезировать БТШ при повышении температуры, выживали при достаточно сильном нагреванчи и приобретали термотолерантность. При исследовании мутантаЕ.coli .чувствительного к повышению температуры (Yamonori, Yura , 1982) выяснилось, что у него нарушена система синтеза БГШ. Аналогичную картину наблюдали у Dlctycstalium discoideum ( Tanguay , 1983), где было показано, что мутант, неспособный экспрессировать БТШ, неспособен таьже развивать термотолерантноеть. Наши результаты согласуются с имеющимися в литературе данными и позволяют заключить, что способность к синтезу БТШ при повышении температуры четко коррелирует с термоустойчивостью организма. По-видимому, терыо-реоистентность исследованной линии Т, кроме этого, связана еще с

а

i 23^5678

S i 2

$370-

-

- ta

«I

¿53739W 253733WX

2726-

CSTC3-

37 37

Рис Л .а.Флюорограмма синтеза белков в клетках слюнных желез линии Oregon Н (5, 6, 7, 8 - дорожки) и линии Т (I, 2, 3, 4-дорожки)

б.Флюорогракма синтеза оелков в клетках слюнных желез линии Oregon к (1-я дорожка) и линии l(Dts -403 (2-я дорожка)

какими-то неизвестными физиологическими и молекулярными механизмами, которые дают ей возможность сохранять нормальную жизнедеятельность при температурах, выпе пороговых ;ля дрозофилы.

П. Авторегуляция синтеза БТ13 линдквист с соавт. ( Lindr;ui3t , I98X; bindquist et EÜJ982) и Боннер ( Bonner, IS62) показали, что Б1Ш участвуют в регуляции собственного синтеза по принципу обратной связи, т.е. они по пере накопления оказывают ингибирующее влияние на собственный с.гнт^э,

однако в своих исследованиях они использовали различные ингибиторы синтеза РНК и белка, имеющие побочный эффект. В опытах, проведенных нами на ыугантной линии l(I)ts -403, у которой нарушена система ответа на ТШ, было доказано, что у нее через 2 часа пос-. ле прекращения действия ТШ пуфы теплового шока достигали гигантских размеров, особенно цуф 63ВС, который кодирует БГШ83. В то же время у контрольной линии Oregon н эти пуфы практически полностью исчезали уже через I час после прекращения действия высокой температуры (таблица).

Таблица

Размеры пуфа 63ВС:63А у личинок Oregon R и мутантной линии l(I)ts -403 в процессе восстановления после ТШ

время восстановления (мин)

30

!

60

!

120

Oregon R l(I)ts-403

1.62 1.95

Х.26 2.1

1.05 2.03

Синтез БТШ у мутантной линии продолжался более 4-х часов после снятия ТШ (рис.2), д у Oregon R через 2 часа после помещения личинок в нормальные условия синтез всех НШ практически полностью прекращался и восстанавливался синтез нормальных белков (рис.2, дорожка 7).

3Ol&t&tp 23G0G&

—: —. Я—*а» С» «а

ООО б» /¿34

**

Рис.2. Флюорограмма восстановления синтеза белков после ТШ в клетках слюнных желез личинок линии Oregon R (5-7 дорожки) и ыттантной линии 1(1 )ts -403 (1-4 дорожки)

S й ?

Для объяснения наблюдаемых явлений мы предлагаем следующую гипотезу. Повышение температуры до 37°С в клетках 1(1)ts -403 приводит к нарушении функции какого-то регулятора, необходимого для нормального функционирования всей системы ответа на ТШ. Поэтому, мы наблюдаем крайне низкий уровень синтеза BTÏÎI, которые из-за недостаточного количества не могут выполнять свои функции и не поступают в ядро, и,т.о.»здесь и после снятия Ш сохраняются все условия для индукции генов системы Ш, выполняющих "ses" - функцию. Иными словами, БТШ в клетках мутанта неспособны ингибировать собственный синтез по принципу обратной связи. Поэтому-то мы и наблюдаем у мутанта сохранение гигантских пуфов ТШ и синтез БТШ долгое время после прекращения действия повышенной температуры. Аналогичная картина наблюдается, если подвергнуть нормальные клетки дрозофилы действию слитом высокой температуры (39-40°С), во время которого БТШ практически не синтезируются, зато после прекращения шока при 2.5°С начинается их активный синтез. Что касается появления у мутанта нормальной картины синтеза БТШ через 2 часа после прекращения ТВ, это можно объяснить или синтезом соответстг вующего регулягорного вещества ¿G novo , или восстановлением его свойств (например, сборкой субъединиц).

Ш. Ответ на тепловой шок трех видов шелкопряда, отличающихся по температуре среды обитания

В результате изучения синтеза БГШ у трех различных видов шелкопряда - тутового, дубового и непарного-мы получили новые доказательства в пользу корреляции между экспрессией генов ТШ при экстремально высоких температурах и устойчивостью организмов к ним. Впервые нами было показано, что. синтез БТШ у такого вида насекомого, как Я;, no ri , наблюдается при температурах до 50°С (рис. 3, б). Причем идет ке только активная трансляция мРНК, кодирующих БТШ В.п. гу , ко и нарастание синтеза мРНК, кодирующих БГ11Г70, вплоть до 45°С (рис,4). Если в клетках дрозофилы при 37°С происходит индукция БГ!1 на фоне резкого уменьшения синтеза нормальных белкоз (рис. 3, а), то в клетках 3<,moi-i лишь при 40°С и вьше заветна индукция в области 70 кДа г.ри сохранении активного синтеза белков с Мг = 83, 68, 40 (по-видимому, актина), 23 кДа и ряда минерных белкоз (рис. 3,. б). Т.е., в клетках гто-вого шелкопряда при повшекии теготературы происходит экспрессия

"Ч

«3 70 68

= й = а.

55 3739Ч0'С

ТУ-— i ■■ 4

а=ч 1

£5-— —-

в гт

Рис.3. Флюорограмма белков, синтезируемых при различных температурах в клетках дрозофилы (а) и В.тог! (б)

р т---

12

Рис.4. Гибридизация суммарной РНК из клеток культуры дрозофилы (1,2 дорокки) и в.топ (3_б дорожки), ищурированных при разной температуре с ДШГ клона 229.1 В.пе1агю£азЪег

1, 3 - при 25°С

2, 4 - при 37°С

5 - при 40°С

6 - при 45 С

ЕШ с сохранением и усыением смтеэа некоторых белков, синтезирующихся и при нормальной температуре. Аналогичная картина синтеза белков при температурах до 49°С наблюдается и в культуре клеток дубового шелкопряда (рис.5), клетки которого также хщштеризуют-

с? исключительно высокой термоустойчивостыо.

Исследование синтеза белков B.mori с помощью двумерного электрофореза позволили заключить, что v него при 25°С конститутивно синтезируются по крайней мере три формы БГШ-70-подобных белков. Ранее на дрож£ах было показано ( Jidu, Yahara , 1984), что у штамма Hsr I, являющегося терлоуптойчивым, конститутивно синтезируются некоторые ВГШ при нормальной температуре. По-видимому, если одной из функции БТШ является защита клеток от повреждающего действие ТШ, то при повышении температуры синтез этих конститутивно экспрессирующихся форм БТШ может значительно возрастать. Это предположение также подтверждаемся полученными недавно результатами экспрессии разных генов семейства БТШ70 дрожжей ( Lindquiat , 1986). Некоторые члены этого семейства конститутивно экспрессирую-тся в норме и повышают уровень экспрессии при ТШ, другие экспрес-сируются только в ответ на повышение температуры.

Способность клетог изученных видов шелкопряда синтезировать ЕТШ при экстремально высоких температурах может объясняться, по крайней ыере, двумя причинами. Во-первых, т.к. это виды, обитающие на юге, то термоустойчивость может являться эволю-ционно выработанной способностью; во-вто-вых, наблюдаемое явление может быть свойственно липь к; ьтивируемым клетаам шелкопряда и объясняться, например, присутствием в "ультуральнсй среде каких-либо агентов, обуславливающих частичную индукцию генов ТШ при нормальной температуре. Например, было показано (Compton, Мс Cnrthy,

. - - 1973), что среда, применяемая для культи-

белков, синтезирующих- г «

ся в клетках культур вирования клеток дрозофилы, по мере хране-

дубового (1-4 дорожки) ния приобретает способность индуцировать и непарного (5-8 доро- r е г

яки) шелкопрядо: при °ДИН иэ главных цуфов ТШ. разной температуре

Для проверки первого предположения мы проанализировали синтез белков при повышении температуры в клетках жирового тела гусениц У возраста B.mori . Было обнаружено, что тепловая обработка при 40°С не сказывается знач1 лелыаи образом на интенсивность

i Z 3 5 <5 78

Г'-'^'МТ?"-^»

„ !;__'

О- --- I

70— -

С** а'гач

л» - —* '

25— <

2S J7W92ST7WW,

.. ?___I

Рис.5. Флюорограмма

синтеза нормальных белков в клетках жирового тела, хотя в клетках дрозофилы при этой температуре практически пре"ращается синтез любых белко-. Нужно отметит; что жировое тело гусениц, подвергнутых ТЫ in vivo , по-видимому, все же менее термоустойчиво, чем культивируемые клетки, т.к. индукция БТШ в нем (в отличие от ку~ь-туры) была обнаружена уже при 37°С, а при температурах выше 45°С включение ыегки падало до фонового уровня.

Для проверки второго предположения нами был проанализирован спектр БТШ в культуре клеток непарного шелкопряда - вида, обитающего в средней полосе. Оказалось, что в его клетка* синтез БТШ при температурах 40°С и выше резко падает (рис.5), напоминая в этом отношении ситуацию в клетка дрозофилы (рис.3,а). Т.о. -ь. dispar четко отличается от двух других впов,. обитающих в теплом климате. Замечатель. о, что если культуры клеток B.mori и A.parnyi были способны переживать три пассажа - ср~к наблюдения - при 37°С (Т.Я.Брауде-оОлотарева, неопубликованные данные), то клетки непарного шелкопряда не выдерживали длительного действия этой температуры.

Ij. Комбинированное действие ТШ и вирусной инфекции на тутс.ый шелкопряд

Было замечено (Т.Я.Брауде-Золотарева, неопубликованные данные), что клетки B.mori /зараженные вирусом ядерного полиэдроза (ВЯЛ), становились чувствительными к высокой температуре, в отличие от незаряженных клеток кулм^ы, которые выдерживали нагревание до Ó0°C мг"ли сохранять жизнеспособность и переживать несколько пассажей при 37°С. Нами было показано, что при инфекции клеток тутового шелкопряда ВЯЛ они не способны синтезировать никаких белков, кроме полиэдрина - белка оболочки этого вируса с Hr ~ 33 кДа ( Uiller et al. , 1983) (рис.6,а).

Подобная картина наблюдалась и при заражении B.mori in vivo (рис.5,6). Здесь также прекращался всякий белковый синтез и синтезировался только полиздрин. Результаты гибридизаций суммарной РНК из клеток тутового шелкопряда, зараженных и незараженньсс ВШ1 с зондом, содержащим ген БГШ70 дрозофилы, позволили заключить,что ингибирсвание белкового синтеза про*'входит на посттранскрипционном уровне, вероятнее всего на уровне трансляции. Высокая чувстви-тел ность клеток B.mori ,инфециров&нных вирусом, к высокой тем-

а. —

з

SS

! I

О -!

i Z 3 ч

i г

Рис.б.а. Флюорогреша белков, син-тезирующк"ся при 25°С и 42°С в не-зараженных (I и 3 дорожки) и зараженных ВШ (2 и 4 дорожки) культу-

§ах клеток 1.2пдорожки - 25°С; 3-допожки - 42 С.

б. Флпорограмка белков, синтезирующихся в жировом теле незасаженных (2 дорожка) и зараженных ВЯЛ (I дорожка) гусениц В.тог! после ТШ. Полиэдрин отмечен стрелкой.

пературе объясняется, по-видимому, тец, что они неспособны синтезировать ВШ в ответ на температурный стресс.

Т.о., можно отметить четкую корреляцию между синтезом клеткой БПП и термоустойчивостью. Несомненно то, что БШ выполняют в клетке " SOS"-функции, что может включать в себя: I) препятствие к формированию внутриклеточных нерастворимых агрегатов белков, денатурированных в усл^зиях высоких температур, и участие в рена-турации поврежденных белков, согласно ( Pelham,1986); 2) стабилизация клеточных структур и предохранение гас от повреяделщего действия температурного стресса С Pelham , 1984); 3) сохранение системы сплайсинга ( Yoat, Lindquiat , 1986) i. трансляции ( Moyrand, Pederaon, 1983) в кнтактном состоянии.

У. Анализ клон? Bmhsp 70, содержащего ген, кодирующий ЬГШ70 тутового шелкопряда

Нами была отмечена поразительная способность клеток в.mor! транслировать БПП при экстремально высоких температурах 'ю 50°С) и транскрибировать в этих условиях мРНК, кодирующую НШ70. Ш попытались выяснить, не связана ли отпеченная штивность этого гена с некоторыми особенностями структуры его 5'-регуляторной области. Ранее многкш исследователями оыло показано (Bienz ,1985; Pelhan, Bienz , 1982), что прсмотсрный район генов, кодирующих БГШ70, отличается рядом особенностей, характерных только для этих генов. В этой района были обнаружены так называете элементы ТШ-

HSE -элементы, которые имеют высокую степень гомологии даже у организмов, эволюционно удаленных друг от друга. В опытах по использованию с итетических оли. :>нукл£стидов, имеющих последовательность hse -элемента, и дупликации консенсусов в 5'-районе гена, кодирующего БГШ70, было показано ( '.Vei et al. , 1986; Amin et al.. 1987; Sorger, Pelham , 1987; Baumami e+ al. , 1987), что усиление транскрипции этого гена наблюдается пропорционально числу НЗЕ-элементов. Причем необходимым условием является перекрывание 2-х консансусных последовательностей, и расстояние между таким:' дуплетами не должно превышать 80 п.н. (Biens , 1985; Cohen, biesel-son , 1988).

Из геномной библиотеки Б.moi. нами был клонирован фрагмент ДНК, длиной 4.5 т.п.н. - Bmhsp 70 (рис.7) построена его грубая рестриктная карта и установлено, что клон Bmhsp 70 содержит тер-моиндуцибельный ген, о чем свидетельствуют результаты гибридизации суммарной РНК, выделенной из клеток, инкубированных при 25 и 42°С, с зондом, содержащим клон Вш'пзр 70 (рис.8).

i г

ы

0

о LU

1

■s< -о

1=4=1 •=•

—, о у сп £

ZC

I I Г I

3

Рис.7. Рестриктная карта клони-ованного фрагмента ДНК пЬзр70. Отмечены основ-нь_> сайты рестрикции.-Структурная часть гена, кодирующею ВГШ70 зашт-рихозана. Стрелка пока-• зывает направление транскрипции.

Рис.8. Гибридизация РНК ' из клеток В.топ. При 25°С (1-я дорожка) и клеток. подвергнутых ТШ при 42°С (2-я дорожка). В качестве зонда использовали ДНК клона чтйзр 70, меченую 32р •

Рма определена нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента Д4К. Оказалось, что клон Bmhsp 70 содеркит 5'-ре-гуляторную область и 1380 п.н. структурной части гена, кодирующего ЕПП70В.тог1 (рис.7). Степень гомологии между вычисленной последовательностью аминокислот и аминокислотной последовательностью гена, кодирующего аналогичный белок дрозофилы, составляет 83% (по меньшей мере для полученного нами фрагмента структурной части).

При анализе 5*-области ранее секвенирозанных генов, кодирующих БПП70, было обнаружено, что основные регуляторные элементы расположены в основном в пределах 250-300 п.н. выше сайта инициа- ■ ции транскрипции ( Bienz , 1985). Результаты SI-картирования позволили идентифицировать сайт инициации транскрипции, располагающийся на расстоянии 99 п.н. от кодона инициации трансляции ATG (рис.9). Ранее было показано (Amin et al.1987), что активная трансляция мРНК ТШ происходит только в том случае если длина лидерной последовательности составляет не менее 95 п.н. Как считают многие авторы ( Klementz et al. , 1985; Me Garry, Liadquiat , 1985)," такая длинная лидерная последовательность играет важную роль в избирательной трансляции мРНК ТШ при повышении температуры.

В 5'-регуляторной области нами были обнаружены последовательности, сводные с ТАТА-боксом, ранее описанным для дрозофилы ( То-rofc et ol. „ 1980), которые расположены на расстояниях: от - 245 до -239; от -226 до -220 и от -49 до -43 выше точки инициации транскрипции (рис.9). Вии обнаружены типичные промоторные элементы транскрипции -14-нуклеотидные HSE -элементы, впервые идентифицированные в генах, кодирующих БТШ70 дрозофилы ( Bienz,1985): • две пары перекрывающихся элементов в положениях от -139 до -116 и от -89 до -66 п.н. (рис.9). Они гомологичны- не более 3-х замен -аналогичным элементам, описанным для дрозофилы и других организмов ( Shi эу, Parker , 1986). Установлено, что расстояние между 2-мя парами перекрывающихся HS™ -элементов равно 26 п.н.

Анализ регулятсрной зоны клонированного гена B.mori не выявил принципиальных отличий между ним и аналогичными районами соответствующих генов, выделенных из других грганизмов (например . дрозофила, Xenopus человек). Однако, для того, чтобы однозначно ответить на вопрос: зависит ли способность гена, кодирующего БГШ70 B.nori работать з экстремальных условиях от цук. эот:<дной

-эгэ аАААТзкАГТАААттесАИААИААААТАоаттяастАТАотт

-270 а1лмитааогггаци1дтгтста1^та1с11^т1аттт1т^

-220 ЗТЗЯАА'ЛС^/таАЛЛО^ОЗЖЛАТажСАЖТХЗТТгЗКСЗЛКГСТИ

-120 техАМхжоосангстадпаасаитАССАОСАААв

-70 тстсаютадда! цод! ЦТАТЛТААОСДАНАСТПАОаАаСИСАТТ

-20 ТСАЗААтТГТаАААТАСААЗСаААЗЗАЗАСЗАЗСЗАГТТСПТЗАЗАА

31 АС: ; АЗ ААЗГА:ААЛЗ ПАА^'^итАтлиг ААЗ1З:ЗС АН ;АЛА? ;а

81 ТаТЗЛГЛАЛ.'А.МААГЛ ■ 'ЕЭ^13СААТАЗЗА_«13А!СТМ31АгАА тг ра101в10т

131 сггаттсзтзсзтсзс-тотттзосааса чюаазаю0ааа1са1(?ао5 181 /асзасгаочосаассззассайасокс-асзгооозпсасзоасао

а ¡3 з п ^ х- р з х т а р 7 .1) I

Р.»с.9. Фрагмент последовательности цуклеотидов клона ВкЪэр 70> включающий 3£0 п.н. 5'-регуляторной области и 230 п.н. структурной части гена, кодирующего Б1Ш70 з.шога . Сайт инициации транскрипции (АаС) обозначен стрелкой и волнистой линией. Сайт инициации трансляции (АТС) взят в тэаыку. ТАТА-подобныэ последовательности подчеркнуты тонкой чертой. Точками отмечены последовате; .ности, гомологичные Н5Б -элементам ТШ. Под пос.1 эдовательнос-тью нуклеотидоз приведена последовательность аминокисл т.

последов ател ности его б'-регуляторного района или ке определяется особыми физиологическими свойствами (гомеостазом) клеток Е.тог! необходимо в дальнейпем провести эксперименты по введению этого гена в менее термоустойчивые организмы (например, с помощью Р-элемент-эависпмой трансформации & геном дрозофилы) и изучить его экспрессию р трансгенноц организме.

'ВЫВОДЫ'

I. При изучении синтеза ЕГШ у трех линий В.те1апоеа£^ег , отличающихся по чувствительности к повышенной температуре, обнаружена положительная корреляция между способностью синтезировать БГ1Д при экстремальных температурах и терыоустойчивостью.

Результаты сравнения реакции на' ТШ линий дрозофилы 1 (I)ts -403 и Oregon R позволили сделать вывод о способности FIU1 к авторегуляции собственного синтеза по принцицу обратной связи. $

3. Показано, что виды, обитающие на юге (B.mori и А.рез>-nyi ) способны синтезировать БГШ при исключительно высоких температурах (до 50°С), в то время как вид, обитающий в умеренной зоне ( L.dispar ) ведет себя в этом отношении сходно с дрозофилой и способен синтезировать БГШ при температурах не выше 40°С.

4. Показано, что в клетках B.:nori , зараженных ВШ, наблюдался интенсивный синтез только белка оболочки вируса - полиэд-рина. Такие клетки оказались неспособными синтезировать БШ и проявляли высокую термочувствительность.

5. Выделен и охарактеризован геномный клон Bmhsp 70, содержащий 5* - регуляторцую область и 1380 п.н. структурной части тер^оиндуцибельного гена, кодирующего БГ1П70 B.mori.

6. Степень гомологии между аминокислотной последовательностью клонированного гена и последовательностью аминокислот аналогичного гена дрозофилы равна 83?.

7. В 5*- регуляторной области клона Bmhnp 70 были идентифицированы характерные элементы транскрипции, свойственные генам теплового пока.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛВДУЩИХ РАБОТАХ:

1.r..3.Evgen'ev, О.G.Zatsopina, ïl.îitarenîco. Autoregulation of heat-shock systenj in Drosophila melanogagter. Analysis oí heat-3hock response in a temperature-3ensitive cell-lethal mutant //PE3S Lett.-1985, v.180.- P.286-290.

2. М.Б.Евгеньев, В.Ш.Шейияер, А.В.Левин, Т.Я.Броуде-Золота-рева, Е.А.Титаре.чко, Н.Г.Щупге, К.К.Караез, ХЛ.Ульмасов. Молекулярные механизмы адалтеции и г пертерлш у висшсс организмов. I. Синтез белков теплового пока в клетк&х культу pu различных видов иелкопряда и в гусеище'х.// Иолек. биол. - 1937, т.21. -

С.484-494.

3. Т.Я.Ерауде-Золотарева, Е.А.Титаренко, О.Н.Денисеиго,

К.К.Караев, Х.А.Ульмасов, А.В.Левин, М.^.Езгенъез. Полег^.чпркые

.механизмы адаптации к гипертермии у высших организмов. Ш. Действие теплового шока на клетки тутового шелкопрада вомЬух mori , зараженные вирусом ядерного полиэдроза !} Молек. биол. - 19Ш, . т.22. - C.II2B-II3I.

4.1.l.B.Evgen'ev, 'i.I.Braude-Zolotareva, Е.А.Тйагепко, А.V.Levin, O.li.Denisenko, K.Ulnasov, K.Karaev. Heat-shock reaponoe in Bombyx mori cells infected by nuclear poly' edrosis virus (3IPV) // Mol.Gen.Genet.-19S9, v.215.- P.322-325.

5. Е.А.Титаренко, А.В.Левин, H.Г.Холодилов, В.М.Блинов, Ы.Б.Евгеньев. Клонирование и определение последовательности цу;<-леотидов гена, кодирующего главный белок теплового шока (БТШ70) тутового шелкопряда /7 Докл. АН СССР (в печати).