Экспрессия генов белков NS5B и NS5A вируса гепатита C, ингибиторный анализ и белок-белковое взаимодействие

Иванов, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия генов белков NS5B и NS5A вируса гепатита C, ингибиторный анализ и белок-белковое взаимодействие
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генов белков NS5B и NS5A вируса гепатита C, ингибиторный анализ и белок-белковое взаимодействие"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В, А. ЭНГЕЛЬГАРДГА

На правах рукописи

ИВАНОВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ БЕЛКОВ N856 И №5А ВИРУСА ГЕПАТИТА С, ИНГИБИТОРНЫЙ АНАЛИЗ И БЕЛОК-БЕЛКОВОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток и в Лаборатории энзимологии транскрипции Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук МК. {Суханова Научный консультант:

доктор химических наук, проф., ад.-корр. РАН С.Н. Кочетков

Официальные ощгонеиты:

доктор химических наук, профессор М.Б. Готтих

(НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова)

доктор биологических наук, профессор П.М, Рубцов (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН)

Ведущая организация:

НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ РАМН

Защита диссертации состоится 3 2006 года в час. на заседании

Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной бнолопга им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан 3 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат химических наук

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы. Гепатит С, вызываемый вирусом гепатита С (ВГС) относится к наиболее широко распространенным и опасным заболеванием человека. По оценке ВОЗ в настоящее время ВГС инфицировано более 170 млн, человек по всему миру. Терапия гепатита С, основанная на интерфероне а или его комбинации с нуклеозидным аналогом рибавирином, малоэффективна. Так, вирусологический ответ на нее вырабатывается всего у 40% пациентов, инфицированных наиболее распространенным в России вирусом генотипа Ib. Изучение молекулярно-биологических аспектов функционирования ВГС и поиск новых ингибиторов репликации был затруднен ввиду отсутствия до 2005 года клеточной вирус-реплицирующей культуры. Единственной клеточной культурой, моделирующей некоторые стадии жизненного цикла вируса, является искусственная система, называемая рештконом ВГС. Особый интерес представляет получение и исследование физико-химических и биологических свойств индивидуальных белков ВГС.

Геном ВГС представляет собой (+)-цепь РНК длиной около 9600 нуклеотндов, содержащую одну открытую рамку считывания, кодирующую полипротеин длиной 3011 аминокислотных остатков. Его процессинг под действием клеточных я вирусных протеиназ приводит к образованию четырех структурных и шести неструктурных белков. К первым относят белок нуклеокапсида (С-белок), гликопротеины вирусной ободочки (El и Е2) и полипептид р7. Три неструктурных белка обладают ферментативной активностью: автопро-теиназа NS2, функционирующая в составе NS2-3 полипротеина-предпхестветшка, NS3 - сернновая протенназа/хеликаза/ОТРаза и РНК-зависимая РНК-полимераза (Р-РНКП) NS5B. Последняя способна инициировать репликацию генома ВГС без участия праймера {(le novó). Три других неструктурных белка являются регуляторными. Так, NS4A является кофактором NS3 протеи-назы, NS4B и NS5A оказывают влияние на различные клеточные пути передачи сигнала. Последний также определяет вирусный ответ к интерферону и является ингибитором Р-РНКП ВГС. Все неструктурные белки, за исключением NS2, входят в состав репликазы ВГС.

С момента открытия ВГС в 1989 г. было опубликовано большое число работ, посвященных клонированию и экспрессии генов всех белков ВГС в E.coli и ряде эукариотических клеточных линий. Однако в большинстве литературных данных отсутствуют подробные характеристики этих систем и их эффективности, что в ряде случаев затрудняет воспроизводимость результатов. Данное замечание относится и к биохимическим характеристикам рекомбинантных вирусных белков, в частности Р-РНКП ВГС.

Первые ингибиторы РНК-полимеразной активности белка NS5B были предложены в 1999 г. К настоящему времени известно всего несколько типов низкомолекулярных ингибиторов. Так, среди аналогов NTP описано лишь пять оригинальных модификаций,

позволяющих им выступать в качестве термннаторных или мутагенных субстратов Р-РНКП и ингибировать репликацию вируса. Учитывая слабую развитость терапии гепатита С (см. выше), поиск новых потенциальных апти-ВГС агентов является весьма актуальным.

Открытым также остается вопрос о статусе и роли регуляторного вирусного белка NS5A. Помимо его роли в ответе на лечение интерфероном, его функции во многом остаются неясными. Так, в 2002 году было показано, что экспрессированный и выделенный из Ё,соН NS5A способен ингибировать Р-РНКП вируса. При этом в эукариотических клетках он присутствует в фосфорилированвом состоянии, однако влияние данной постгрансляционной модификации на ингибируюгцие свойства исследовано не было. Не показано, какие ферменты осуществляют его фосфорилироваиие NS5A в клетке, Неизвестно также общее количество фосфатных остатков в составе белка и их точная локализация. В то же время, учитывая основополагающую роль фосфорилирования в регуляции клеточной активности, такая информация является совершенной необходимой. Цели Ii задачи исследования.

1. Экспрессировать гены неструктурных белков вируса NSSA и NS5B в E.coli с высоким выходом и оптимизировать условия их выделения.

2. Оптимизировать условия определения ферментативной активности белка NS5B в праймер-зависнмых и праймер-пезависимых системах.

3. Исследовать влияние ряда соединений на Р-РНКП активность белка NS5B.

4. Идентифицировать протеинкиназы, способные фосфоршгаровать белок NS5A in vitro и картировать области фосфорилирования в его структуре.

5. Оценить влияние степени фосфорилирования неструктурного белка NS5A на ингибирование последним РНК-полимеразной активности белка NSSB.

Научная новизна и практическое значение работы. Сконструирована система экспрессии генов неструктурных белков NS5A и NS5B ВГС в E.coli, позволяющая выделять их с высоким выходом ( 5 мг/л клеточной культуры). Показано, что повышение уровня экспрессии данных белков в этой системе по сравнению с описанной в литературе обусловлено усилением инициации трансляции мРНК и практически не сопровождается интенсификацией транскрипции. Показана возможность применения данной системы для получения ряда мутантных форм Р-РНКП ВГС генотипа lb, не экспрессирующихся в описанных ранее системах. Представлена подробная методика выделения белков NS5A и NS5B. Доказано, что выделение белка NS5A в денатурирующих условиях с последующей ренатурацией позволяет получить препарат с описанными в литературе биологическими свойствами.

Продемонстрировано, что Р-РНКП ВГС проявляет наибольшую активность при 30°С в присутствии ионов магния или марганца, причем в случае Мл2* активность примерно в 3,5

раза выше, чем в присутствии ионов Mg* \ Показано, что для повышения эффективности ферментативной реакции при применении полиА-олигои праймер-матричного комплекса необходима достаточно длительная преинкубация фермента с РНК. Напротив, максимальная активность мутантной формы полимеразы NS5B-BLA8 в системе праймер-матричного комплекса достигается без или при достаточно короткой преинкубация. Оптимизированы условия определения РНК-полимеразной активности de novo.

Впервые показано, что пирогаллол и его производные могут являться обратимыми неконкурентными по отношению к NTP субстрату ингибиторами Р-РНКП ВГС. Их действие проявляется на стадии элонгации праймера н не затрагивает образование тройного комплекса фермент-праймер-матрица. Максимальной активностью обладают соединения, содержащие электрон оакцепторный заместитель в а-положении или электронодонорный заместитель в р-положении по отношению к полифенольной системе. При этом, в первом случае гидроксильная группа, находящаяся в пара-положении по отношению к заместителю не играет роли в активности вещества и может быть замещена на водород.

Продемонстрировало, что белок NS5A фосфорилируется in vitro казеинкиназами I и П человека, причем в последнем случае фосфоршшрование происходит в С-концевой области белка с включением четырех остатков фосфорной кислоты. Показано, что в фосфорилирова-кии NS5A в присутствия лизата гепатоцитов человека или частично очищенного гомогената печена кролика участвует помимо казеинкиназ по крайней мере еще одна протеинкиназа. Фосфоршшрование NS5A сопровождается снижением его активности как ингибитора Р-РНКПВГС.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции Московского центра медицинских исследований университета Осло «Advances in Molecular Cell Biology» (Москва, 2004), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, 2003), международной конференции «Химические н биологические проблемы протеомики» (Новосибирск, 2004), на международной конференции «Nucleic Acid Enzymes» (Таос, США, 2006) и Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах и 5 тезисов докладов в материалах конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на_страницах, содержит_рисунков

и_таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и

их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего _ источников.

Результаты и обсуждение

Работа состоит из трех разделов. Первый посвящен созданию системы эффективной экспрессии в E.coli генов неструктурных белков NS5A и NS5B ВГС и отработки методик их выделения. Второй посвящен изучению физико-химических свойств белка NS5B, оптимизации условий его праймер-зависимой и праймер-независимой РНК-полимеразной активности и изучению производных пирогаллола как ингибиторов данного фермента. Третий раздел посвящен идентификации протеинкиназ, осуществляющих фосфорилирование белка NS5A in vitro, и оценке влияния степени фосфорилирования белка на его способность ингибировать Р-РНКП ВГС,

Раздел I. Конструирование системы для эффективной экспрессии белков NS5A u NS5B, Экспрессия Р-РНКП ВГС при использовании коммерчески доступного вектора pET-21d. Основным объектом данной работы являлась Р-РНКП ВГС, представляющая собой белок с молекулярной массой 68 кДа. По литературным данным экспрессия полноразмерного белка в E.coli приводит к образованию телец включения, из которых невозможно выделить полимеразу с сохранением ее ферментативной активности. Экспрессия при температуре <, 30°С укороченной формы NS5BA21 белка с удаленным С-концевым гидрофобным доменом (21 аминокислотный остаток), напротив, позволяет получить растворимый активный белок. Клонирование гена белка NS5BA21 в векторе pET-21d под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 Rcoli (Рис, 1 А) и экспрессия в Exoli BL-21(DE3) при индукции и?£>пропил-р-0-тиогалактопиранозидом (ИПТТ) позволили получить целевой белок с крайне низким выходом (<0,1 мг/л клеточной культуры). Для повышения выхода, исходя из наличия А

Т7 promoter ttart

pET-21d-5BA55

—0-^-ACCgfGGCGATG.. Ш5В$55 тол».. .CTCGAG КАССАССАССАССАССАС

^ Ned Хш ' Н Н Н H Н К

pET-21d-5BA55-TATGA

77 promoter

, __Sep

—П-^-rACTlATG AATTCQ. ..NS5BAS5 gwa.. .CTCGAal-pACCACCACCACCACCACTM—

ЕсоЯ ХМ H H H H H H

С рЕТ-21 d-2c-58455

77 promoter «g^_SD »topi «arti_

^^TAlATOTATCGATTAMTMGGAGGMTAAk^TlATGAATTCG.. .NS5BL 55 CgffB...CTCGAGbCACCACCACCACCACCA(;TM— cfsinwii БЖЙ bsbw2 Xftol H H H H H H

Рис. 1. Схема векторов, экспрессирующих неструктурный белок NS5B. (А) - pET-21d-5B, (В) - pET-21d-5B-TATGA, (С) - рЕТ-21 d-2c-5B.

в гене Р-РНКП большого числа так называемых «редких кодонов», в качестве штамма хозяина нами были выбраны штаммы BL-21-CodonP]us (DE3)-RIL (Stratagene) и Rosetta(DE3) (Novagen), содержащие дополнительные копии генов некоторых редких тРНК. Кроме того, индукцию проводили при 22-25°С с использованием заменителя ИПТГ - лактозы. Целевой NS5BA21 белок был получен с выходом 0,6-0,8 мг/л клеточной культуры при ее культивировании в течение 18 часов. Наличие на С-конце полипептидной цепи белка шести остатков гистидина, кодированных вектором pET-21d, дает возможность выделять белок аффинной хроматографией на колонке с Ni-NTA агарозой. Следует отметить, что для полного извлечения белка из лизата клеток при выделении в соответствующем буфере необходимо присутствие не менее 0,5% (v/v) детергента (например, Triton Х-100). Кроме того, существенное уменьшение неспецифической сорбции белков Exoli на колонке с Ni-NTA агарозой достигается при наличии 0,5 М NaCI в буферах при лизисе клеток и хроматографии. Наконец, важным является поддержание в буфере во время выделения таких ингибиторов протенназ как PMSF и лейпептин. Роль последнего заключается в предотвращении ограниченного протеолиза целевого белка, происходящего в его N-концевой области с образованием неактивных укороченных форм полимеразы с молекулярной массой около 50-62 кДа.

Таблица 1. Экспрессия рекомбинантных белков, полученных в работе.

Белок Плазмида Выход (мг/л) Описание плазмиды KnJkcat

Белки ВГС

NS5BA55-His pET-21d-5BA55 0,12 исходная 458

рЕТ-2 ] d-5BA55-TATGA 1 шесть мутаций 512

рЕТ-2Ы-2с-5ВД55 3,5 двуцистронная 583

pTTQ18-5BA55 <0,04 tac-промотор

pLac-2c-5BA55 <0,04 /ас-промотор

NS5A-His pET-21d-2c-5A 4 двуцистронная

His-NS5A pET-15-5A 30 одноцистронная

pET-21 d-2c-His-5 А 30 двуцистронная

GST-NS5A pGEX-5X-l-5A 30 одноцистронная

Другие белки

His-CKI pET-2 ld-2c-His-CKI 28 двуцистронная

His-CKJl pET-21 d-2c-His-CKII 23 двуцистронная

Другая укороченная форма белка К35ВД55 (с удаленными 55 аминокислотными остатками с С-конца полипептидиой цепи) была получена в данной системе аналогично описанной выше с более низким выходом, чем Н35ВД21 (0,3 мг/л). Индукция этого белка

при использовании ИПТГ в течение четырех часов позволяла выделить всего 0,12 мг/л культуры (Табл. 1). Более того, метод оказался неприменим для получения другой мутантной формы белка, а именно NS5B-BLA8, отличающегося отсутствием в его структуре одной из {}-петель (8 аминокислотных остатков), расположенной вблизи активного центра. Так, выход NS5B-BLA8 белка не превышал 0,04 мкг/л культуры, причем данная форма полимеразы обладала высокой протеолитической лабильностью. Таким образом, необходимой задачей стала разработка новой системы экспрессии Р-РНКП ВГС, позволяющей получать различные мутаптные формы с высоким выходом.

Конструирование высокоэффективной системы экспрессии Р-РНКП ВГС. Одной из возможных причин низкой эффективности экспрессии гена белка NS5B с плаэмиды могла являться низкая эффективность инициации трансляции соответствующей мРНК, в большинстве случаев обусловленная устойчивой вторичной структурой в районе сайта связывания рибосом и 5'-концевой области гена (Makrides S.C., 1996). Компьютерное моделирование вторичной структуры мРНК показало, что последовательность Шайн-Дальгарна лежит в одноцепочечном участке, а другой элемент сайта связывания рибосом -ннициаторный AUG кодон и последующие несколько нуклеотидов, напротив, образуют дуплексы с комплементарными участками 5'-концевой области гена (Рис. 2А).

А В

'А^ ... SD

-aRjGGCG^ ^ ...5 nt.4

иттт

-AUG-

9 lit

9 nt

..5 rt.

J ц.4 nt-

~птт

| ...4 nt..

[)7n,

Рис. 2. Компьютерная модель вторичной структуры мРНК в районе сайта связывания рибосом н 5'-концевой области гена №5В белка (моделирование проводили с применением программы "СепеЬее"). мРНК соответствуют плазмндам рЕТ-Ш-5ВД55 (А), рЕТ-2 Ы-5ВД55 -ТАТвА и рЕТ-2Ы-2с-5ВД55 (В).

Такая структура может быть частично разрушена при замене одного нуклеотида, предшествующего AUG старт-кодону, и пяти следующих за ним на U и AAUUC, соответственно. Следует отметить, что по литературным данным нуклеотида U и А, фланкирующие старт-кодоп, усиливают взаимодействие с формилметионин-тРНК. По данным моделирования подобные замены приводят к тому, что в соответствующей мРНК весь сайт связывания рибосом находится в одноцепочечном участке и, может быть более доступен для связывания рибосом (Рис. 2В). Кроме того, дуплексы в данной мРНК состоят из четырех нуклеотидов каждый и менее стабильны, чем дуплексы длиной пять нуклеотидов исходной мРНК.

Замена данных шести нуклеотидов в плазмиде рЕТ-2Ы-5ВД55 (Рис. 1А) с образованием новой плазмиды рЕТ-21 d-5ВД55-TATGА (Рис. 1В) приводила к изменению двух аминокислотных остатков N-концевой области белка, но не отражалась на его ферментатив-ной активности. Эта модификация позволила повысить выход Р-РНКП в восемь раз (с 0,12 мг/л до 1 мг/л, Табл. 1) при индукции ИПТГ в течение четырех часов в штамме Rosetta(DE3) E.coli (Рис. ЗА). При этом по данным эксперимента по сравнению уровней соответствующих мРНК методом No them blot-гибридизации модификация плазмиды слабо отразилась на уровне транскрипции гена Р-РНКП (уровень возрос в 1,3 раза) (Рис. ЗВ). Таким образом, увеличение экспрессии целевого белка коррелировало с изменением вторичной структуры мРНК и, по-видимому, объяснялось повышением эффективности инициации трансляции.

выход белка,

win

3,51

~ □ Rosetta(DE3) ... «BL-21(DE3)

30 25 20 15 10

□ относительным выход белка

В относительный уровень мРНК

pET-21d- pET-21d- pET-21d-2c-5BD5S 6BD55- 5BDS5 TATGA

Рис. 3. (А). Сравнение выхода белка N5513,155 при его экспрессии в штаммах ЯскеКафЕЗ) и ВЬ-21 (БЕЗ) Е.соН. (В) Сравнение уровней экспрессии К55ВД55 белка и транскрипции его гена в штамме ЛмеНафЕЗ) Е.соН относительно исходного продуцента [плазмида рЕТ-21 <1-5В Д5 5, штамм НозеПа(ОЕЗ)].

Дополнительное увеличение выхода белка до 3,5 мг/л было достигнуто введением второй короткой АТ-богатой открытой рамки считывания (цистрона), расположенной на три нуклеотида выше целевого гена и содержащей дополнительную последовательность Шайн-Дальгарна, находящуюся на оптимальном расстоянии от старт-кодона другой рамки считывания для обеспечения реинициации трансляции (рис. 1 С). Изменение достаточно протяженного участка мРНК, предшествующего гену белка К35В, не привела к нарушению ее вторичной структуры (Рис. 2В). Увеличение выхода Р-РНКП может объясняться природным эффектом трансляционного сопряжения, увеличивающего эффективность инициации трансляции дистального цистрона и имеющего место, например, в случае /ас-оперона Е.соН. Кроме того, частичный вклад может вносить и 1,9-кратное повышение уровня соответствующей мРНК (Рис. ЗВ).

Исследование кинетики накопления белка показало, что максимальный выход достигается спустя 6,5-8,5 часов после его индукции ИПТГ и составляет 5 мг/л клеточной культуры. С помощью данной системы с близким выходом была экспрессирована другая мутантная форма Р-РНКП ВГС - NS5B-BLA8.

В работе была продемонстрирована необходимость использования при высокоэффективной экспрессии NS5BA55 белка штаммов E.coli, содержащих дополнительные копии редких тРНК. Так, замена штамма Rosetta(DE3) на BL-21 (DE3) приводила к понижению выхода NS5BA55 белка в 2,3 раза (Рис. ЗА). Таким образом, элонгация трансляции также определяет уровень экспрессии белка.

Обсуждаемый выше максимальный уровень экспрессии NS5BA55 составлял около 2% от общего количества белков E.coli. В то же время по литературным данным двуцистронная система позволяет повышать уровень экспрессии рекомбинантных белков до 30-40%. Одной из возможных причин столь сильного различия между уровнями экспрессии различных белков может быть нарушение природного сопряжения транскрипции (40 нуклеотидов в секунду) и трансляции (около 15 аминокислотных остатков в секунду). U.K. Mukhohfdhyay (2002) высказал предположение, согласно которому для максимального выхода белка необходимо помещать цистроны под контроль промоторов РНК полимеразы E.coli. Замена последних на промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 приводит к дисбалансу между трансляцией и транскрипцией и, как следствие, повышенной доступности образующейся мРНК для нуклеаз. Мы заменили Т7 промотор на более слабый lac промотор, однако данная модификация привела к резкому понижению выхода Р-РНКП ВГС (Табл. 1).

Экспрессия неструктурного белка ВГС - NS5A. Описанная выше двуцистронная система экспрессии позволила выделить другой неструктурный белок ВГС - NS5A с последовательностью из шести гистидинов на С-конце полипептидной цепи (NSSA-Hiss) из плазмиды на основе вектора рЕТ-21-2с-5А с выходом 4 мг/л клеточной культуры (Табл. 1). Его аналог с гексагистндиновой последовательностью на N-конце цепи (Hise-NS5A) был получен из плазмиды pET-2I-N-2c-5A с выходом около 30 мг/л. Следует отметить, что аналогичным уровнем экспрессии обладали продуценты His6-NS5A и GST-NS5A, созданные на основе одноцистронных векторов рЕТ-15Ъ и pGEX-5X-l. Исходя из этих данных, можно предположить, что двуцистронная система экспрессии эффективна для получения высокого выхода белков, гены которых слабо экспрессируются в одноцистронных векторах, и белков, N-концевую область которых нельзя изменять без потери их биологических свойств.

Белок NS5A выделяли методом аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой в денатурирующих условиях с последующей ренатурацией. Показано, что данный

белок не имеет сродства к таким слабым ионообменникам как ДЭАЭ-целлюлоза и карбоксиметялцеллюлоза.

Раздел II. Изучение физико-химических свойств белка NS5B, оптимизация условий определения РНК-полимеразной активности и изучение ингибпторных свойств производных пирогаллола.

Праймер-заеисимая РНК-nолимеразная активность NS5B белка. Следующим этапом работы было изучение функциональных свойств трех форм Р-РНКП ВГС: NS5BA21, NS5BA55 и NS5B-BLA8. Эти формы отличаются от белка дикого типа отсутствием в их структуре 21 (NS5BA2]) или 55 (55ВД55) аминокислотных остатков на С-конце полипептидной цепи, а также взаимодействующей с ними одной из Р-петель (NS5B-BLA8). У Р-РНКП дикого типа контакт этих элементов, расположенных вблизи активного центра, препятствует связыванию РНК-дуплекса с ферментом и в природе обеспечивает селективность фермента в пользу беспраймерной (de novo) инициации репликации вирусного генома. Как следствие, природная форма белка NS5B и ее производное NS5BA21 обладают гораздо более низкой (по сравнению с другими ДНК-и РНК-полимеразами) способностью утилизировать комплексы матрицы с праймером, содержащим более трех нуклеотидов (Zhong W. et al, 2000), что делает единственно возможным контроль за прохождением реакции на основе множественного включения [a-32P]NMP. Примерами таких систем являются поли(А)-олиго(и) и поли(С)-олиго(С) праймер-матричные комплексы. Литературные данные о физико-химических характеристиках фермента (оптимальная концентрация ионов металлов, температура реакции, необходимость преинкубашш для образования тройного комплекса)

350

300

^ 250

£ 200 о

в 150 ¡100 50

и А

I 1 —А— Мд2+

п| |_и_Нп2+

------

1 *—1-1- 1 1 ^

6 9 С, шМ

100,00

80,00

if 60,00

i 40,00

20,00

0,00

0 10 20 30 60 время преинкубации, мин

Рис. 4. (А) Зависимость активности №5ВД21 от концентрация М£** ( ) и Мп1* (■). За 100% принимали максимальную активность фермента в присутствии ионов М^*.(В) Зависимость активности фермента от времени преинкубации с полиА-матрицей и олигои-лраймером в присутствии ионов

существенно различаются. Мы показали, что представленные формы Р-РНКП ВГС проявляют наибольшую активность при 30°С в присутствии 3-5 мМ М^Ь или 0,75 мМ МпСЬ, причем в присутствии ионов Мп2+ она была примерно в 3,5 раза выше, чем в присутствии ионов (Рис. 4А). При определении активности с применением как поли(А)-олиго(Ц)-, так и поли(С)-олиго(С) праймер-матричного комплекса наибольший уровень включения соответствующего ЫМР наблюдался после 20 минутной преинкубации фермента с РНК (Рис.4В).

В данных условиях линейное накопление продукта реакции наблюдалось в течение первых 30-40 мин (Рис.5). При добавлении глицерина до концентрации 10% (у/у) протяженность линейного участка увеличивалась, но скорость реакции при этом снижалась вдвое. Напротив, детергенты (напр. Твин-20) и бычий сывороточный альбумин не влияли на активность Р-РНКП.

Рис. 5. Кинетические кривые накопления продукта реакции элонгации праймера, катализируемой К55ВД21 в отсутствие (1) иди в присутствии (2) бычьего сывороточного альбумина (БСА), глицерина (3) или детергента Твин-20 (4).

Описанные выше условия определения ферментативной активности были оптимальными для всех трех мутантных форм Р-РНКП {КЭ5ВД21, К85ВД55 и К55В-ВЬД8), однако активность двух последних примерно в 50 раз превышала таковую белка К55ВД21, что по литературным данным может объясняться повышенной доступностью активного центра для праймер-матричного РНК дуплекса. Эффективность элонгации длинных (больше 3 нуклео-тидов) праймеров в составе дуплексов была косвенно подтверждена на примере «беспетельной» формы К35В-ВЬД8. Так, данный белок при 30°С в результате инкубации с самокомплементарным праймером (5'-ОСАиССКЗССС) и соответствующими КТР включал нужное число звеньев. Следует отметить, что активность К35В-ВЬД8 в этой системе, в отличие от №5ВД21 в системе поли(А)-олиго(и) праймер-матричного комплекса, уменьшалась при длительной преинкубации белка с праймером. Данная система оказалась оптимальной для изучения субстратных свойств модифицированных <ИМТР. Так, из Рис. 6В можно видеть, что

0 25 50 75 100 125 время, мин

субстратом фермента может являться 4'-азидоуридин, но не бициклический трифосфат 3-(ß-1>рибофуранозш1)-6-гексил-2,3-дигндрофуро[2,3-д]пиримидин-2-она.

Рис. б. (А) Структура самокомштементарного праймера SSU. (В) Элонгация праймера SSU в присутствии АТР (1-3), АТР и UTP (4-6), АТР и 4'-N3-UTP (7-9), ATP и аналоге NTP (10-12), Концентрация субстратов составляла 20 (14,7,10), 50 (2,5,8,11) и 100 (3,6,9,12) мкМ, за исключением концентрации АТР в экспериментах 4-12 равной 100 мкМ. М - исходный олигонуклеотид.

Производные пирогаллола - эффективные ингибиторы Р-РНКП ВГС. В нашей работе было впервые показано, что пирогаллол (1,2,3-тригидроксибензол) и ряд его производных одинаково эффективно ингибировали реакцию, катализируемую NS5BA21 и NS5BA55 формами Р-РНКП ВГС. Наивысшую активность проявили соединения, содержащие электроно-

акцепторный заместитель в а-положении (Ib,k-u) или электронодонорный - в ß-положении (Ilf-j) по отношению к полифенольной системе (Табл. 2). При этом роль заместителя, по-видимому, сводится к созданию определенного электронного распределения в ароматической системе и, тем самым, нужных зарядов гидроксильных групп. Так, столь сильные отличия соединений с электроно-донорными (Ilf-j) и электороноакцелторными (Ib,k-u) заместителями можно объяснить их влиянием на рК» гидроксильных групп по (+)- и (-)-мезомерному механизму, соответственно. В последнем случае (-)-мезомериый эффект приводит к уменьшению значений рК, ряда гидроксильных групп в 2-м и 4-м положениях относительно заместителя.

В то же время сам заместитель, скорее всего, не участвует во взаимодействии ингибитора с ферментом. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что одинаковую активность проявляли соединения, в 4-положении кольца которых находился заряженный (IIh,i) или незаряженный (Ilg) атом азота, объемная бензильная (Hi) или маленькая метальная (IIb) группы, или атом кислорода (III), Отдельно следует упомянуть симметричные гидразоны (I*IIj). Их активность примерно в два раза превышала таковую для монозамещен-ных соединений (I,IIf-i), что может объясняться дублированием ароматической компоненты. Среди производных пирогаллола, содержащих электроноакцепгорные заместители, сходным было действие 2,3,4-тригидроксибензальдегида (lb) и его аддуктов с гидроксиламинами (IkJ) или с анилином (1р) и его производными (Iq-t). Все это косвенным образом свидетельствует об отсутствии контактов белка с заместителем при полифенольной системе. Наконец,

5'-GCAUGGGCCC-3*

3*-CCCGGGUACG-5'

12345678 9 10 11 12 М

Таблица 2. Производные три- и дигидроксибензолов - ингибиторы Р-РНКП ВГС

I II III IV V

Х- 1С;о, (ДМ

I | II III IV V

а: К = -Н (пирогаллол) 8-10 - -

Ь: Я » -СНО 2-3 1000 2,5-3 >1000 НА**

с: Я = -СООН - 200 100200 - -

(1: Я = -СООСНз - - >1000 - -

е:Я--С(0)СН3 30 - - - -

Я = -СН=К-Н<С4Н8>Х*** Г:Х = 0 3040 10 - >400 -

g:X = NCHз

Ь:Х = 1чГ(СН3)2

1:Х = *Г(СН3) (СН2С6Н5)

у. К - -СН=Ы-Ы<С4Н3Ж-К=СН- 1020 5 - 100200 -

к: Я - -СН-М-ОН 2 - - - -

1: Я = -СН=К-ОСНз 5 12 - - -

т: К = -СН=Ы-ЫН-С(0)СН3 11 90 - - -

п: К = -СН=К-Ш-С(0)СбН3(К02)2 3 - - - -

о: Я = -СН=К-Ш-302СК>НбК(СН3)г 30 90 - - -

К = -СН=Н-СбН4-Х р:Х = Н 2 500 1,5-2,5 НА НА

Ч: X = о,т,р-К02 2 - - - -

г; X = о,т,р-СООН 2-3 - - -

5: Х = о-С1 1.4 - - - -

ЪХ = о-Вг 2 - - - -

и: В. = -С(С) Нз)=К-СбН; 3 - - ■ -

* - не определялось ** - неактивно

***К<С4Нв>Х - 1,4- пиперидин (Х = К) или морфолин (Х = О)

t группы соединений (Ib,k-u) только гндроксилы в положениях 2 и 3 яшшотся функциональ-гыми, что подтверждается отсутствием значимой активности их аналогов (IVb,p) и (Vb,p), синтезированных на основе 3,4- и 2,4-дигидроксибензальдегида, и столь же высокой эффектностью производных (П1Ь,р). Отдельное место в ряду ингибиторов занимает сам пирогаллол. С одной стороны, его можно рассматривать как соединение ряда (I), содержащее »лектронодонорный атом водорода в ß-положении к полифенольной системе. С другой ггороны, любую из боковых гидроксильных групп можно считать электроноакцепторым [аместителем, что позволяет расположить вещество и в ряду (III). Действительно, значение Си для него близко к таковым для серии ингибиторов (Hf-j), и слегка уступало 1С50 для 2,3-дагидроксибензальдегида (Illb), что может объясняться меньшей силой (-)-мезомерного »ффекта, создаваемого гидроксилом, по сравнению с эффектом формильной группы.

Эффект ингибирования соединениями (ЫИ) полимеразной реакции объясняется их ззаимодействием с ферментом, а не с РНК. В пользу этого свидетельствует их сходная акти-шость в системах поли(А)-олнго(Ц) и поли(С)-олиго(С) праймер-матричных комплексов. 3 обсуждаемых экспериментах ингибиторы вносились в реакционную смесь после прсин-¡еубации фермента с РНК, т.е. после образования тройного комплекса фермент-матрица-траймер. При этом регистрируется влияние ингибитора как непосредственно на элонгацию голинуклеотидной цепи, так и на повторную реинициацию синтеза. Дня установления ;тадии ферментативной реакции, на которую действует ингибитор, нами был использован гепарин, добавление которого в реакционную смесь после преинкубации, как известно, приводит к связыванию не вошедшего в тройной комплекс фермента и препятствует рсини-зиации синтеза, что позволяет изучать исключительно стадию элонгации праймера. Из рис, 7А следует, что добавление гепарина до конечной концентрации >10 нг/мкл действительно

Рис. 7, Зависимость активности Р-РНКГТ ВГС от концентрации гепарина (А) и ингибитора Щ|) (В). Ингибитор добавлялся в реакционную смесь вместе С гепарином после преинкубации белка с праймер-матричиым комплексом (1) или до нее (2), или без гепарина до преинкубации (3).

приводило к подобному эффекту. В этих условиях активность фермента была в 5-6 раз ниже, чем активность фермента в отсутствие гепарина. На примере симметричного гидразона (II]) было установлено, что соединения практически одинаково ингибируют полимеразную реакцию как в присутствии, так и в отсутствие гепарина (рис. 7В), Таким образом, производные пирогаллола активны на стадии элонгации праймера. Возможность действия ингибиторов на процесс образования комплексов фермент-матрица-праймер была проверена следующим образом. В двух сериях экспериментов гидразон (11|) добавляли в реакционную смесь до илн после преинкубации Р-РНКП с поли(А) и (Цр)зи. На рис. 7В видно, что эффективность ингибитора не меняется при его введении одновременно с матрицей и праймером. Следовательно, ингибирующее действие соединения (11]) имеет место исключительно на стадии элонгации.

Действие соединений не является конкурентным по отношению к нуклеозид-5'-трифосфагам (Рис. 8А), иными словами связывание ингибитора возможно как с комплексом фермента с ЦТР, так и с ферментом без ЦТР, кроме того, связавшийся ингибитор не блокирует связывание нуклеозидтрифосфата.

Наконец, действие ингибиторов на Р-РНКП ВГС является обратимым, что было показано в следующем эксперименте. Водорастворимый гидразон (11Ь) инкубировали в течение 10 мин с ферментом в концентрации близкой к 1С$о (10 цМ), затем проводили преинкубацию с праймер-матричным комплексом с последующей элонгацией (1, Рис.8В). После разбавления смеси в 10 раз происходило восстановление активности фермента с 52% (1) до 85% (2). Как видно из сравнения 2 и 3, (Рис. 8В), активность фермента после разбавления смеси не достигает уровня контроля. Это, по-видимому, связано с высокой термолабильностью белка.

Рис. 8. (А). Зависимость активности Р-РНКП ВГС от концентрации ЦТР в отсутствие (1) или в присутствии ингибитора (ДО в концентрациях 5 (2) или 10 цМ (3). (В) Анализ обратимости связывания ингибитора с ферментом. Фермент инкубировали с соединением (ОД) в концентрации 10 цМ (1), или 10 цМ с последующим разбавлением до 1 рМ (2), в присутствии 1 >хМ ингибитора (3), а также без ингибитора (4).

'аздел III. Фосфорилирование белка NS5A in vitro и оценка влияния степени (»осфорнлировапия белка на его способность ншибированть Р-РНКП В ГС.

Влияние степени фосфорилирования белка NS5A на его способность шгибировать Р-РНКП. Мы показали, что фосфорилирование in vitro белка NS5A в присут-:твии лизата клеточной культуры гепатоцитов человека (Huh7) лишает его способности юдавлять полимеразную реакцию, катализируемую белком NS5B (Рис. 9). Из рисунка следует также, что ингибирование Р-РНКП нефосфорилнрованым белком NS5A, по-видимому.

Рис. 9. Влияние фосфорилировашюй (1,2) и нефосфорилированной (3,4) форм белка N35А на активность Р-РНКП ВГС при его добавлении к ферменту вместе с праймером н матрицей (2,4) или после прсинкубацин с ними (1,3).

происходит из-за блокирования инициации полнмеразной реакции. Так, белок NS5A оказывает влияние на ферментативную реакцию только при добавлении к Р-РНКП вместе с праймером и матрицей, тогда как при его внесении после преинкубации эффект исчезает (Рас. 9).

Фосфорилирование белка NSSA in vitro. В литературе было показано фосфорилирование белка NS5A in vitro казеинкиназой 2 (СКЛ) и протеинкиназой А (РКА), однако отсутствовали данные, касающиеся сайтов фосфорилирования и количества вводимых фосфатных групп в белок. Кроме того, неизвестно, существуют ли другие протеинкиназы, субстратом которых способен выступать NS5A.

В данной работе осуществлено компьютерное моделирование потенциальных сайтов фосфорилирования белка NS5A киназами CKI и СКЛ. В таблице 3 показаны лишь сайты первичного фосфорилирования, тогда как при введении фосфатных групп могут возникать новые сайты. Это связано со способностью данных киназ эффективно фосфорилировать остатки серина и треонина, в +3 (CKJI) или -3 (CKI) положениях к которым находятся фосфосерин или фосфотреонин. Как видно из таблицы 3, оба фермента теоретически способны осуществлять посттрансляционную модификацию вирусного белка. Следует, отметить, что разные компьютерные программы указывают разное число возможных сайтов что, по-видимому, объясняется различной вероятностью их фосфорилирования я относн-

Таблица 3. Компьютерное моделирование сайтов возможного фосфорилированяя белка И35А казеикиназами I и П, проведенное с использованием трех различный Интернет серверов. Жирным шрифтом показаны возможные сайты, предсказанные тремя серверами, курсивом представлены сайты, предсказанные другими двумя программами.

Сервер CKI CKII

PredPhos T242, T245, T274, T364, T367r S369, S370, S385, S390, S412, S414, S429, S432, S435 S151, T245, T270y S328, S386t T406, S408, T435

NetPhosK 1.0 T53, S222, S225, S228, S229, S230, S232, S235, S238, S297, T367, S382, S383, S3S5, S386, S369, S408, S412, S414, S429, S437, S441 S230, S237, S383, S385, S386, S396, S408, S429, S437, S441

GPS T53, S386, S412, S429, S432 T270, S369, S408, S412, S414, S426, S434, T435, S437, S441

тельно низкой специфичностью данных ферментов, что приводит к неоднозначности определения их теоретических сайтов. Другой факт, который необходимо упомянуть, заключается в том, что при расщеплении белка NS5A трипсином, полученного из культуры эукариотических клеток, модификации подвергаются практически только остатки серина, тогда как треонина - лишь в незначительной степени

Для подтверждения фосфорилировання белка NS5A in vitro под действием данных протеинкиназ, необходимо было иметь препараты соответствующих ферментов. С этой целью гены CKI и каталитической а-субъединицы CKII были отклонированы, используя библиотеки кДНК различных тканей человека, и помещены в pET-21-N-2c вектор, обсуждавшийся выше. Образующиеся химерные белки содержали последовательность из шести остатков гистидина, соединенную полилинкером (аналогично вектору рЕТ-15Ь) с N-концом полипептидной цепи. Экспрессия СКП при 22°С, индуцированная 1 мМ ИГГПГ, привела к целевому белку с выходом около 15-20 мг/л клеточной культуры. При этом около половины белка находилось в составе телец включения, однако вторая половина была успешно выделена в активном виде в нативных условиях на колонке с Ni-NTA-агарозой с дополнительной очисткой на колонке с гепарин-агарозой. CKI, напротив, количественно находилась в виде нерастворимой фракции, выделение которой в денатурирующих условиях с последующей ренатурацией не позволило получить активную протеинкиназу. Неудачными оказались попытки повысить растворимость образующейся в клетках E.coli CKI при ее экспрессии при пониженной температуре (18°С и 6°С), а также при ее индуцировании более низкой концентрацией ИПТГ (0,1-1 мМ). Аналогичный результат был получен и для CKI, ген которой был помещен в одноцистронный рЕТ-15Ь вектор. Поэтому в дальнейшей работе был использован коммерчески доступный препарат CKI из печени крысы.

Рис. 10. (А). Фосфорилирование казенна (1,2) и NS5A (3,4) кааеинкиназой I из печени крысы (1,3) и казеинкиназой II человека (2,4)

Проведенные эксперименты продемонстрировали, что белок NS5A может быть фос-форилирован in vitro казеинкиназами I и II (Рис. 10). Следует отметить, что эффективность фосфорилирования CKII была близка к таковой дня одного из ее природных субстратов -казеина.

- Свойства белка NS5A, фосфор ил ированного СКН. Белок NS5A не способен ингиби-ровать Р-РНКП ВГС не только при его фосфорилированин в присутствии лизата культуры эукарнотических клеток, но и при фосфорилированин рекомбинантной CKII. Это было продемонстрировано в эксперименте, в котором из реакции фосфорилирования NS5A под действием CKII отбирались аликвоты, которые после термоинактивации киназы вводились в

Рис. 11. (А) Кинетика фосфорилирования N55А белка казеинкиназой II (1). Аликвоты реакции были прогреты для инактивации фермента и добавлены в реакцию элонгации, катализируемую N35В (2). (В) Связывание додекаурндилата при различных концентрациях фосфорилированной (1) и нефосфорилированной (2) форм N55А. Концентрация белка, при которой происходит связывание половины ол игоку клеотида, соответствует константе диссоциации образующегося комплекса

полимеразную реакцию (Рис. 11 А). Этот результат может быть объяснен понижением или исчезновеиием сродства N35А белка или к N3513, или к РНК. Оценка РНК-связывающеЙ активности была проведена при инкубации белка N35А с радиоактивно-меченным двенадцатизвенным рибо(Ц) олигонуклеотидом с последующей фильтрацией реакционной смеси через нитроцеллюлозную и нейлоновую мембраны и визуализацией связавшейся с ними радиоактивности. Эти мембраны имеют сродство к РНК-белковому комплексу и свободной РНК, соответственно. Процент радиоактивности, связавшейся с нитроцеллюлозной мембраной, по отношению к таковой на обеих мембранах представляет собой процент РНК-олигонуклеотида, находящегося в составе РНК-Ы35В комплекса. На основании зависимости процента такого комплекса от концентрации фосфорилированной и нефосфорилированной форм Ы35А белка можно видеть, что константы диссоциации .данных комплексов близки в обоих случаях (1,24 и 1,84 нМ, соответственно, Рис. 11В). Таким образом, фосфорилирование Ж5А белка не влияет на его РНК-связывающую активность.

Картирование сайтов фосфорилирования N55А при катализе СКППо данным расчета четыре аминокислотных остатка белка И35А подвергаются фосфорилированию. Для определения фосфорилируемой области №5А белок инкубировали с СКП и [у-32Р]АТР, разделяли продукты в ЭОЗ-ПААГ и без выделения меченого белка проводили ограниченный протеолиз, катализируемый трипсином. После злюции из геля продукты анализировали методом МАНН масс-спектрометрии. Было показано, что один из образовавшихся пептидов соответствующий непосредственно С-концевой области белка, содержал четыре остатка фосфорной кислоты (Рис. 12). Этот факт был также подтвержден в независимом эксперименте. [32Р]-Меченый К35А-1Шб, содержащий шесть остатков гистидина на С-коице молекулы, подвергали органиченному трипсинолизу в растворе и проводили разделение продуктов на колонке с N¡-N1 А-агарозой. При этом вся радиоактивная метка содержалась в продукте, имеющем сродство к сорбенту, иными словами в его С-концевой части (Рис. 12).

ШТЗБ иг ньм>тл>л™1 СТУЬТО птчыгз КХЬ Р<3 СОНСУКСЧ/КШЗЬС! ТОТТСРСС А01 АйНУКЫС Р

МЫ УСРОТСЕЯЯТИНОТР Р ХЯАУТТСРСТР 5Р АРИУ$11А1Л11АГААЕЕ¥\ГЕ ТТКЛГОВРНУМТСМТПЗЫУККРСОУР АРВРРТЕУВа7^НЯУАРУСКРЬЬНЕОУТЕ0УСШ0^ЬУе30ЬРСЕРЕРВУАУЬТ5М1|Т£|РеН1ТАЕТАК1Ш1А ИОг Э РЗ ГАЭ ег А50Ь5АР5ЬКАТСТТЕНПЗ РОАСЬ! ЕАИЬЬЫКОЕМССНIТЕУЕ5ЕЫК1/У11ЛЭ РЕОРЬЙАЕЕОЕ ИЕУЗ УРАЕ ТЬККТЕКРР 3 АМРIКАЕРОУН РРЬЬЁЗНКОРБ У"УРР1Л/ШС РЬР РТКУРР!РР РЕЮНТТЛ/ЬТЕ ЁТ УЗгАЬАБЬАТКТГОЗЗВгЗАТБЗОТАААВРПОРЗОЮОТСгРУЕЗУЕЗМРРЬЕСВРССЗОЬговгпзТУЗВВАЗ

крууссишншш_

Рнс. 12. Первичная структура белка N85А, содержащего шесть остатков гистидина на С-конце цепи. Первые три остатка (жирный курсив) кодированы вектором. С-концевая область белка, которая подвергается фосфорили-рованию СКП, представлена жирным шрифтом, Подтвержденный сайт фосфорилирования выделен подчеркиванием.

Методом сайт-направлен ого мутагенеза была предпринята попытка картирования сайтов фосфорилирования CKII в структуре NS5A белка. Так, замена остатка Т435А не привела к снижению эффективности фосфорилирования белка. Напротив, мутагенез S408A подтвердил модификацию данного остатка серина (Рис. 12).

Анализ продуктов протеолиза фосфорилированного CKI и II NS5A белка методом ВЭЖХ показал наличие одного меченого продукта в каждом случае, причем они имели сходное время удерживания на колонке (Рис. 13). Отсюда можно предположить, что фосфорилирование в присутствии CKI также происходит в С-концевой области белка.

Для моделирования фосфорилирования NS5A белка в эукариотической клетке, наряду с индивидуальными казеинкиназами были также использованы лизат культуры гепатоцитов человека НиЬ7 и частично очищенный на сорбенте Affi-gel Blue Gel гомогенат печени кролика. Данная хроматография гомогената позволяла получить препарат, обогащенный АТР-связывающими ферментами (в том числе протеинкиназами) и лишенный, по крайней мере, части протеиназ и фосфатаз.

При переходе от рекомбинантых CKI н П к лизату гепатоцитов и описанному выше препарату печени кролика в процессе разделения меченых пептидов регистрировалось наличие двух меченых продуктов в случае NS5A-Hise и трех - в случае His6-NS5A форм белка (Рис. 13). Таким образом, наряду с казеинкиназами, в эукариотических клетках присутствует, по крайней мере, одна протеинкиназа, субстратом которой является NS5A белок. Кроме того, следует отметить, что третий продукт в случае His6-NS5A белка, скорее всего, объясняется возникновением дополнительного артефакгного сайта фосфорилирования при введении шести остатков гистидина, соединенных с NS5A линкером из 13 аминокислотных остатков, тогда как у NS5A-ffis$ формы линкер представляет собой лишь два остатка (Рис. 12).

1,0 0.8 0,6 0,4

0,2

СК) А

1.. .._. 1 1

5 10 15 20 25 30 35 40

Рис, 13. Профили разделения радиоактивно меченных продуктов протеолиза трипсином белка NS5A, фосфорилированного CKI, CKII и лшатом культуры гепатоцитов Huh7, (А) Белок NS5A, содержащий шесть остатков гистидина на С-конце полипептидной цепи. (В) Белок с шестью остатками гистидина на С- или N-конце.

выводы

1. Разработана эффективная система экспрессии генов неструктурных белков NS5B и NS5A вируса гепатита С (ВГС), Показана возможность ее использования для получения таких мутантных форм Р-РНКП вируса как NS5BA21, NS5BA55 и NS5B-BLA8 генотипа lb, не экспрессируемых в стандартной рЕТ-системе. Продемонстрировано, что повышение их выхода обусловливалось усилением инициации трансляции соответствующих мРНК и не сопровождалось изменением уровня последних.

2. Оптимизированы условия определения полимеразной активности белка NS5B в различных системах. Показана возможность использования данных систем для изучения ненуклеозидных ингибиторов, а также модифицированных нуклеозид-5'-трифосфосфатов как аналогов субстратов фермента.

3. Впервые обнаружено, что пирогаллол и ряд его производных являются обратимыми неконкурентными ингибиторами Р-РНКП ВГС. Данные соединения подавляют элонгацию РНК-праймера, но не влияют на связывание фермента с праймер-матричным комплексом. Максимальной активностью обладают вещества, содержащие электроноакцепторный заместитель в а-положении или электронодонорный заместитель в ^-положении по отношению к полифенольной системе.

4. Белок NS5A фосфорилируется in vitro под действием казеинкиназ I и II, а также лизата гепатоцитов. В случае казеинкиназы П модификации подвергаются четыре аминокислотных остатка, расположенные в С-концевой области белка, в том числе S408. При этом фосфорилирование не влияет на РНК-связывающую активность NS5A белка, но сопровождается снижением его ингибирующей активности по отношению к Р-РНКП ВГС.

Список печатныж работ» опубликованных по теме диссертации.

Статьи

1. Иванов А.В., Козлов М.В., Кузякин А.О., Косткж Д.А., Туницкая В Л., Кочетков СЛ. Новые ненуклеозидные ингибиторы РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С.// Биохимия 2004, Т. 69, № 7, С. 782-788.

2. Кочетков С.Н., Андреева О.И., Иванов А.В., Козлов М.В., Михайлов С.Н., Туницкая В,Л. Новые блокаторы вирусов иммунодефицита человека и гепатита СМ Молекулярная медицина, 2004, Т. 3, С. 41-48.

3. Ivanov А,V., Korovina A.N., Tunitskaya V.L., Kostyuk D.A., Rechinsky V.O., Kukhanova M.K., Kochetkov S.N. Development of the system ensuring a high-level expression of hepatitis С virus nonstructural NS5B and NS5A proteins.// Prot. Exp. Pur if., 2006, V. 48, ife 1, P, 14-23.

4. Козлов M.B., Поляков K.M., Иванов A.B., Филиппова С.Е., Кузякин А.О., Туницкая BJL, Кочетков С.Н. РНК-зависимая РНК-полимераза вируса гепатита С: исследование механизма ингибирования производными пирогаллола.// Биохимия, 2006, Т. 71, С. 12531259.

5. Иванов А.В., Кузякин А.О., Кочетков С.Н. Молекулярная биология вируса гепатита С Л

Успехи биологической химии, 2005, Т. 45, С. 37-86.

Тезисы

6. Ivanov A., Golubeva A., Kostyuk D., Tunitskaya V., Kukhanova М., Kochetkov S. "Cloning and expression of HCV RNA-dependent RNA polymerase", Conference for Students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, Kiev, Ukraine, September 2527,2003, Abstract, p. 153.

7. Ivanov A.V., Kozlov M.V, Kuzyakin A.O., Kostyuk D.A., Tunitskaya V.L., Kochetkov S.N. New inhibitors of hepatitis С virus RNA-dependent RNA-polymerase Adv. in Mol. Cell Biol. (Proc. of conf 10 ann, of Center for Med. Studies, Moscow, June 17-1$, 2004) p.25-34. •

8. Ivanov A., Kozlov M., Kuzyakin A., Tunitskaya V., Kostyuk D., Kukhanova M., Kochetkov S. "New non-nucleoside inhibitors of hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase", Chemical & biological problems of proteomics, Novosibirsk, Russia, July 5-9,2004, p.43,

9. Ivanov A., Tunitskaya V., Kozlov M„ Polyakov K., Kuzyakin A., Prassolov V., Kukhanova M., Kochetkov S. "The HCV nonstructural proteins: high-level expression and functional studies". Keystone Symposia "Nucleic Acid Enzymes", Taos, New Mexico, USA, Feb 11-16, 2006, p, 57.

Ю.Иванов A.B., Туницкая В.Л., Куханова M.K., Кочепсов С.Н. "Эффективная система экспрессии белков вируса гепатита С", Московская международная конференция "Биотехнология и медицина", Москва, Россия, 14-17 марта 2006, С. 54.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 13.09.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 608. Тел. 939-3890. Тел ./Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Иванов, Александр Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2.1. СТРУКТУРА ГЕНОМА ВГС.

2.2. БЕЛКИ ВГС.

2.2.1. БЕЛОК КАПСИДА.

2.2.2. ГЛИКОПРОТЕИНЫ ОБОЛОЧКИ Е1 И Е2.

2.2.3. БЕЛОК Р7.

2.2.4. БЕЛКИ NS2, NS3 И NS4A.

2.2.5. БЕЛОК NS4B.

2.2.6. БЕЛОК NS5A.

2.2.7. РНК-ЗАВИСИМАЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗА (NS5B).

2.2.7.1. Структура белка.

2.2.7.2. Биохимические свойства Р-РНКП.

2.2.7.3. Синтез вирусной РНК de novo.

2.2.7.4. Состав и функционирование репликационного комплекса ВГС. Белок-белковые взаимодействия.

2.2.7.5. Ингибиторы Р-РНКП ВГС.

2.3. ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ВГС.

2.3.1. ПРОНИКНОВЕНИЕ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ В КЛЕТКУ.

2.3.2. РЕПЛИКАЦИЯ ВГС.

2.3.3. ТРАНСЛЯЦИЯ РНК ВГС.

2.3.4. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЙ ПРОЦЕССИНГ И СБОРКА ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия генов белков NS5B и NS5A вируса гепатита C, ингибиторный анализ и белок-белковое взаимодействие"

Гепатит С представляет собой одно из опаснейших заболеваний человека. В настоящее время по оценкам ВОЗ около 3% мирового населения мира (170 млн) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС) [1]. У 3-10% инфицированных в течение примерно 20 лет развивается цирроз печени с возможным последующим развитием гепатоцеллюлярной карциномы [2]. Кроме того, с данным вирусом ассоциировано большое количество других заболеваний, непосредственно не связанных с печенью, затрагивающих кровь (например, криоглобулинемия), почки (например, гломерулонефрит) и.т.п. [3].

Терапия вируса в настоящее время весьма ограничена по своим возможностям и почти исключительно основана на использовании интерферона ос, а также его комбинации с нуклеозидным аналогом рибавирином (I) [2]. Следует отметить крайне низкую эффективность такой терапии, особенно в отношении вируса первого генотипа (к терапии чувствительно менее 30% пациентов). Поиск новых противовирусных препаратов затруднен из-за отсутствия доступных экспериментальных систем. Кроме того, последнее осложняет изучение молекулярно-биологических аспектов функционирования ВГС.

Основными задачами данной работы были разработка системы высокоэффективной экспрессии для получения двух неструктурных белков ВГС (РНК-зависимой РНК-полимеразы и ее регуляторного белка NS5A), являющихся основными компонентами репликационного комплекса вируса, поиск низкомолекулярных ингибиторов репликации ВГС, а также изучение некоторых аспектов посттрансляционной модификации белка NS5A.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Настоящий обзор посвящен молекулярной биологии ВГС. В нем рассматриваются структура вириона, проникновение вируса в клетку, репликация, трансляция и протеолитический процессинг, сборка новых вирусных частиц, а также известные к настоящему времени функции вирусных белков. Особое внимание уделено двум из них, а именно PHIC-зависимой РНК-полимеразе (Р-РНКП) и ее регулятору NS5A. Кроме того, проведен анализ известных низкомолекулярных ингибиторов активности Р-РНКП.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Иванов, Александр Владимирович

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана эффективная система экспрессии генов неструктурных белков NS5B и NS5A вируса гепатита С (ВГС). Показана возможность ее использования для получения таких мутантных форм Р-РНКП вируса, как NS5BA21, NS5BA55 и NS5B-BLA8 генотипа lb, не экспрессируемых в стандартной рЕТ-системе. Продемонстрировано, что повышение выхода белков обусловливлено усилением инициации трансляции соответствующих мРНК и не сопровождается изменением уровня последних.

4. Белок NS5A фосфорилируется in vitro под действием казеинкиназ I и II, а также лизата гепатоцитов. В случае казеинкиназы II модификации подвергаются четыре аминокислотных остатка, расположенные в С-концевой области белка, в том числе S408. При этом фосфорилирование не влияет на РНК-связывающую активность NS5A белка, но сопровождается снижением его ингибирующей активности по отношению к Р-РНКП ВГС.

2.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хотя с момента определения структуры генома ВГС прошло всего лишь немногим более десяти лет, за это время наши представления о функционировании этого вируса и вызываемого им опаснейшего заболевания существенно расширились. Тем не менее, многие детали протекающих процессов остаются по-прежнему невыясненными. Предстоят еще значительные усилия по определению структуры вириона, изучению ранних и, в особенности, поздних стадий жизненного цикла ВГС, установления механизма и регуляции репликации вирусного генома и процессинга полипептида-предшественника. Такого рода исследования, безусловно, приведут к принципиально новым стратегиям предотвращения инфекции и к усовершенствованию терапии гепатита С. Уже сейчас проходят испытания или активно обсуждаются новые потенциальные антивирусные агенты. Среди них блокаторы связывания вируса с рецептором, ингибиторы трансляции, направленные на связывание с IRES, ингибиторы протеиназной и хеликазной активностей белка NS3 и, пожалуй, в первую очередь, ингибиторы Р-РНКП. Продолжаются также попытки создания анти-ВГС вакцин разных типов. К сожалению, все эти исследования по-прежнему сдерживаются отсутствием адекватных систем тестирования. Не вызывает сомнений, что создание эффективной стратегии борьбы с гепатитом С зависит прежде всего от решения этих задач.

Целью данной диссертационной работы является разработка системы для получения неструктурных белков NS5A и NS5B ВГС в препаративных количествах, оптимизация условий определения Р-РНКП активности и поиск ее низкомолекулярных ингибиторов. Кроме того, были предприняты исследования по картированию некоторых сайтов фосфо-рилирования казеинкиназой II в составе белка NS5A, поиска других протеинкиназ, осуществляющих его посттрансляционную модификацию, и оценки влияния базального фосфорилирования на способность NS5A регулировать активность Р-РНКП ВГС.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В настоящей работе использовали следующие материалы: вектор pET-21d и Ni-NTA-агароза («Novagen», США), поли(и)-сефароза CL-6B («Amersham», Англия), вектор pTZ18R («Promega», США), бактотриптон, дрожжевой экстракт и бактоагар («Difco», США), Трис и 2-меркаптоэтанол («Мегск», Германия), глицерин, дитиотреитол, имидазол, тритон Х-100, нонидет Р-40, персульфат аммония, фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) и лейпептин («Sigma», США), акриламид и метилен-бис-акриламид («Roth», Германия), ЭДТА и пепстатин («Serva», Германия), твин-20 и кумасси бриллиантовый синий R-250 («Bio-Rad», США), тетраметилэтилендиамин и ИПТГ («Reanal», Венгрия). Остальные реактивы были производства «Реахим» (Россия) квалификации ос.ч. или х.ч. В генно-инженерных экспериментах использовали ферменты фирм «Promega» (США) и «Сибэнзим» (Россия). Трифосфаты 4'-азидоцитидина (XXII) и 3-(р-Б-рибофуранозил)-6-гексил-2,3-дигидрофуро[2,3^]пиримидин-2-она (XXIII) были любезно предоставлены Л.А. Александровой (ИМБ РАН). Производные ди- и тригидроксибензола (XXIV-XXVIII) были синтезированы М.В. Козловым (ИМБ РАН). Соответствующие казеинкиназе 1а и а-субъединице казеинкиназы II человека кДНК были любезно предоставлены Н.Г. Гурской (ИБХ РАН). Плазмиды pET-21d-5BA21 и pET-21d-5BA55-BLA8 были сконструированы Д.А. Костюком (ИМБ РАН).

Для наработки плазмидной ДНК и рекомбинантных белков использовали следующие штаммы Escherichia coli: XL-1 Blue (recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [F proAB lacIqZ.M15 TnlO (TetR)] («Promega», США), BL-21CodonPlus® (DE3)-RIL («Stratagene», США), BL-21 {F' ompT hsdSB (rb- mB-) gal dcm}, BL-21(DE3) {F' ompT hsdSB (rb- mB-) gal dcm (DE3)}, Rosetta {F' ompT hsdSB (rb- mB-) gal dcm lacYl pRARE6 (CmR)} and Rosetta(DE3) {F' ompT hsdSB (rb- mB-) gal dcm lacYl (DE3) pRARE6 (CmR)} («Novagen», США).

Олигонуклеотиды, использовавшиеся в работе, представлены в Таблице 5.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Иванов, Александр Владимирович, Москва

1. Global surveillance and control of hepatitis C. Report of a WHO Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium. // J. Viral. Hepat. 1999. V. 6. P. 35-47.

2. Rosen H.R., Gretch D.R. Hepatitis С virus: current understanding and prospects for future therapies. // Mol. Med. Today 1999. V. 5. P. 393-399.

3. Nocente R., Ceccanti M., Bertazzoni G., Cammarota G., Silveri N.G., Gasbcirrini G. HCV infection and extrahepatic manifestations. // Hepatogastroenterology 2003. V. 50. P. 11491154.

4. Lindenbach B.D., Rice C.M. Flaviviridae: the viruses and their replication. // In: Fundamental virology, Knipe D. M. and Howley P. M./SE Straus Lappincott Williams and Wilkins: Philadelphia. 2001. P. 589-639.

5. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. V. 89. P. 4942-4946.

6. Brown E.A., Zhang H., Ping L.H., Lemon S.M. Secondary structure of the 5' nontranslated regions of hepatitis С virus and pestivirus genomic RNAs. 11 Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5041-5045.

7. Pestova T.V., Kolupaeva KG., Lomakin I.В., Pilipenko E.V., Shatsky I.N., Agol V.I., Hellen C. U. Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98. P. 7029-7036.

8. Ito Т., Lai M.M. Determination of the secondary structure of and cellular protein binding to the 3'-untranslated region of the hepatitis С virus RNA genome. // J. Virol. 1997. V. 71. P. 8698-8706.

9. Fukushi S., Katayama K., Kurihara C., Ishiyama N., Hoshino F.B., Ando Т., Oya A. Complete 5' noncoding region is necessary for the efficient internal initiation of hepatitis С virus RNA. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 199. P. 425-432.

10. Kolykhalov A.A., Mihalik K., Feinstone S.M., Rice C.M. Hepatitis С virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo. II J. Virol. 2000. V. 74. P. 2046-2051.

11. Zein N.N. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes. // Clin. Microbiol. Rev. 2000. V. 13. P. 223-235.

12. Kalinina O., Norder H., Mukomolov S., Magnius L.O. A natural intergenotypic recombinant of hepatitis С virus identified in St. Petersburg. // J. Virol. 2002. V. 76. P. 4034-4043.

13. Choi J., Xu Z., Ou J.H. Triple decoding of hepatitis С virus RNA by programmed translation^ frameshifting. IIMol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 1489-1497.

14. Kunkel M., Lorinczi M., Rijnbrand R., Lemon S.M., Watowich S.J. Self-assembly of nucleocapsid-like particles from recombinant hepatitis С virus core protein. // J. Virol. 2001. V. 75. P.2119-2129.

15. Baumert T.F., Ito S., Wong D.T., Liang T.J. Hepatitis С virus structural proteins assemble into viruslike particles in insect cells. // J. Virol. 1998. V. 72. P. 3827-3836.

16. Lo S.Y., Selby M.J., Ou J.H. Interaction between hepatitis С virus core protein and El envelope protein. II J. Virol. 1996. V. 70. P. 5177-5182.

17. Uchida M., Hino N., Yamanaka Т., Fukushima LI., Imanishi Т., Uchiyama Y., Kodama Т., Doi T. Hepatitis С virus core protein binds to a C-terminal region of NS5B RNA polymerase. // Hepatol. Res. 2002. V. 22. P. 297-306.

18. Goh P.Y., Tan Y.J., Lim S.P., Lim S.G., Tan Y.H., Hong W.J. The hepatitis С virus core protein interacts with NS5A and activates its caspase-mediated proteolytic cleavage. // Virology 2001. V. 290. P. 224-236.

19. Mamiya N., Worman H.J. Hepatitis С virus core protein binds to a DEAD box RNA helicase. II J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 15751-15756.

20. Owsianka A.M., Palel A.H. Hepatitis С virus core protein interacts with a human DEAD box protein DDX3. // Virology 1999. V. 257. P. 330-340.

21. You L.R., Chen CM, Yeh T.S., Tsai T.Y., Mai R.T., Lin C.H., Lee Y.H Hepatitis С virus core protein interacts with cellular putative RNA helicase. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 28412853.

22. Hsieh T.Y., Matsumoto M., Chou H.C., Schneider R„ Hwang S.B., Lee A.S., Lai M.M. Hepatitis С virus core protein interacts with heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 17651-17659.

23. Alisi A., Giambartolomei S., Cupelli F., Merlo P., Fontemaggi G., Spaziani A., Balsano C. Physical and functional interaction between HCV core protein and the different p73 isoforms. // Oncogene 2003. V. 22. P. 2573-2580.

24. Kao C.F., Chen S.Y., Chen J.Y., Wu Lee Y.H. Modulation of p53 transcription regulatory activity and post-translational modification by hepatitis С virus core protein. // Oncogene 2004. V. 23. P. 2472-2483. •

25. Nguyen Ы, Mudryj M, Guadalupe M., Dandekar S. Hepatitis С virus core protein expression leads to biphasic regulation of the p21 cdk inhibitor and modulation of hepatocyte cell cycle. // Virology 2003. V. 312. P. 245-253.

26. Ruggieri A., Harada Т., Malsuura Y., Miyamura T. Sensitization to Fas-mediated apoptosis by hepatitis С virus core protein. // Virology 1997. V. 229. P. 68-76.

27. Marusawa Я, Hijikatci M., Chiba Т., Shimotohno К. Hepatitis С virus core protein inhibits Fas- and tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis via NF-kappaB activation. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 4713-4720.

28. Bergqvisl A., Rice C.M. Transcriptional activation of the interleukin-2 promoter by hepatitis С virus core protein. // J. Virol. 2001. V. 75. P. 772-781.

29. Dansako H., Naganuma A., Nakamura Т., Ikeda F., Nozaki A., Kato N. Differential activation of interferon-inducible genes by hepatitis С virus core protein mediated by the interferon stimulated response element. // Virus Res. 2003. V. 97. P. 17-30.

30. Kao C.F., Chen S.Y., Lee Y.H. Activation of RNA polymerase I transcription by hepatitis С virus core protein. // J. Biomed. Sci. 2004. V. 11. P. 72-94.

31. Dubuisson J., Rice C.M. Hepatitis С virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin. // J. Virol. 1996. V. 70. P. 778-786.

32. Voissel C., Dubuisson J. Functional hepatitis С virus envelope glycoproteins. // Biol. Cell 2004. V. 96. P. 413-420.

33. Ciccaglione A.R., Marcanlonio C., Tritarelli E., Equestre M., Magurano F., Coslanlino A., Nicoletti L., Rapicettci M. The transmembrane domain of hepatitis С virus El glycoprotein induces cell death. // Virus Res. 2004. V. 104. P. 1-9.

34. Liberman E., Fong Y.L., Selby M.J., Choo Q.L., Cousens L., Houghton M, Yen T.S. Activation of the grp78 and grp94 promoters by hepatitis С virus E2 envelope protein. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 3718-3722.

35. Taylor D.R., Shi S.T., Romano P.R., Barber G.N., Lai M.M. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein. // Science 1999. V. 285. P. 107-110.

36. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M., Rice C.M. Expression and identification of hepatitis С virus polyprotein cleavage products. // J. Virol. 1993. V. 67. P. 1385-1395.

37. Lin C., Lindenbach B.D., Pragai B.M., McCourt D.W., Rice C.M. Processing in the hepatitis С virus E2-NS2 region: identification of p7 and two distinct E2-specific products with different С termini. II J. Virol. 1994. V. 68. P. 5063-5073.

38. Carrere-Kremer S., Montpellier-Pala C., Cocquerel L., Wychowski C., Penin F., Dubuisson J. Subcellular localization and topology of the p7 polypeptide of hepatitis С virus. // J. Virol. 2002. V. 76. P. 3720-3730.

39. Griffin S.D., Beetles LP., Clarke D.S., Worsfold O., Evans S.D., Jaeger J., Harris M.P., Rowlands D.J. The p7'protein of hepatitis С virus forms an ion channel that is blocked by the antiviral drug, Amantadine. IIFEBSLett. 2003. V. 535. P. 34-38.

40. Thibeault D., Maurice R., Pilote L., Lamarre D., Pause A. In vitro characterization of a purified NS2/3 protease variant of hepatitis С virus. 11 J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 4667846684.

41. Liu Q., Bhal R.A., Prince A.M., Zhang P. The hepatitis С virus NS2 protein generated by NS2-3 autocleavage is required for NS5A phosphorylation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 254. P. 572-577.

42. Erdtmann L., Franck N., Lerat H., Le Seyec J., Gilot D., Cannie I., Gripon P., Hibner U., Guguen-Gidllouzo C. The hepatitis С virus NS2 protein is an inhibitor of CIDE-B-induced apoptosis. // /. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 18256-18264.

43. Franck N., Le Seyec J., Guguen-Guillouzo C., Erdtmann L. Hepatitis С virus NS2 protein is phosphorylated by the protein kinase CK2 and targeted for degradation to the proteasome. // J. Virol. 2005. V. 79. P. 2700-2708.

44. De Francesco R., Pessi A., Steinkuhler C. The hepatitis С virus NS3 proteinase: structure and function of a zinc-containing serine proteinase. // Antivir. Ther. 1998. V. 3. P. 99-109.

45. Han D.S., Hahm В., Rho H.M., Jang S.K. Identification of the protease domain in NS3 of hepatitis С virus. // J. Gen. Virol. 1995. V. 76 ( Pt 4). P. 985-993.

46. Kim S.Y., Park K.W., Lee Y.J., Back S.H., Goo J.H., Park O.K., Jang S.K., Park W.J. In vivo determination of substrate specificity of hepatitis С virus NS3 protease: genetic assay for site-specific proteolysis. II Anal. Biochem. 2000. V. 284. P. 42-48.

47. Failla C., Tomei L., De Francesco R. An amino-terminal domain of the hepatitis С virus NS3 protease is essential for interaction withNS4A. // J. Virol. 1995. V. 69. P. 1769-1777.

48. Neddermann P., Clementi A., De Francesco R. Hyperphosphorylation of the hepatitis С virus NS5A protein requires an active NS3 protease, NS4A, NS4B, and NS5A encoded on the same polyprotein. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 9984-9991.

49. Kim D. W., Kim J., Gy>ack Y., Han J.H., Choe J. Mutational analysis of the hepatitis С virus RNA helicase. II J. Virol. 1997. V. 71. P. 9400-9409.

50. Tai C.L., Chi W.K, Chen D.S., HwangL.H. The helicase activity associated with hepatitis С virus nonstructural protein 3 (NS3). // J. Virol. 1996. V. 70. P. 8477-8484.

51. Gwack Y., Kim D.W., Han J.H., Choe J. DNA helicase activity of the hepatitis С virus nonstructural protein 3. II Eur. J. Biochem. 1997. V. 250. P. 47-54.

52. Kucing W.F., Lin Y.C., Jean F„ Huang Y.W., Tai C.L., Chen D.S., Chen P.J., Hwang L.H. Hepatitis С virus NS3 RNA helicase activity is modulated by the two domains of NS3 and NS4A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 317. P. 211-217.

53. Heilek G.M., Peterson M.G. A point mutation abolishes the helicase but not the nucleoside triphosphatase activity of hepatitis С virus NS3 protein. П J. Virol. 1997. V. 71. P. 6264-6266.

54. Borowski P., Oehlmann K., Heiland M., Laufs R. Nonstructural protein 3 of hepatitis С virus blocks the distribution of the free catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase. II J. Virol. 1997. V. 71. P. 2838-2843.

55. Kwun H.J., Jung E.Y., Ahn J.Y., Lee M.N., Jang K.L. p53-dependent transcriptional repression ofp21(wafl) by hepatitis С virus NS3.// J. Gen. Virol. 2001. V. 82. P. 2235-2241.

56. Muramalsu S., Ishido S., Fujita Т., lloh M., Hotta H. Nuclear localization of the NS3 protein of hepatitis С virus and factors affecting the localization. // J. Virol. 1997. V. 71. P. 4954-4961.

57. Feng D., Cheng R., Ouyang X., Zheng LI., Tsutomu T. Hepatitis С virus nonstructural protein NS(3) and telomerase activity. // Chin. Med. J. (Engl.) 2002. V. 115. P. 597-602.

58. Prikhod'ko E.A., Prikhod'ko G.G., Siegel R.M., Thompson P., Major M.E., Cohen J.I. The NS3 protein of hepatitis С virus induces caspase-8-mediated apoptosis independent of its protease or helicase activities. // Virology 2004. V. 329. P. 53-67.

59. Khu Y.L., Tan Y.J., Lim S.G., Hong W., Goh P.Y. Hepatitis С virus non-structural protein NS3 interacts with LMP7, a component of the immunoproteasome, and affects its proteasome activity. IIBiochem. J. 2004. V. 384. P. 401-409.

60. Hugle Т., Fehrmann F., Bieck E., Kohara M., Krausslich H.G., Rice C.M., Blum H.E., Moradpour D. The hepatitis С virus nonstructural protein 4B is an integral endoplasmic reticulum membrane protein. // Virology 2001. V. 284. P. 70-81.

61. Lundin M, Monne М., Widell A., Von Heijne G., Persson M.A. Topology of the membrane-associated hepatitis С virus protein NS4B. // J. Virol. 2003. V. 77. P. 5428-5438.

62. Lin C., Wu J. W., Hsiao K., Su M.S. The hepatitis С virus NS4A protein: interactions with the NS4B and NS5A proteins. II J. Virol. 1997. V. 71. P. 6465-6471.

63. War is G., Sarker S., Siddiqui A. Two-step affinity purification of the hepatitis С virus ribonucleoprotein complex. I/RNA 2004. V. 10. P. 321-329.

64. Park J.S., Yang J.M., Min M.K. Hepatitis С virus nonstructural protein NS4B transforms NIH3T3 cells in cooperation with the Ha-ras oncogene. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 267. P. 581-587.

65. Florese R.H., Nagano-Fujii M., Iwanaga Y., Hidajat R., Hotta H. Inhibition of protein synthesis by the nonstructural proteins NS4A and NS4B of hepatitis С virus. // Virus Res. 2002. V. 90. P. 119-131.

66. Konan К. V., Giddings Т.Н., Jr., Ikeda M., Li K., Lemon S.M., Kirkegaard K. Nonstructural protein precursor NS4A/B from hepatitis С virus alters function and ultrastructure of host secretory apparatus. II J. Virol. 2003. V. 77. P. 7843-7855.

67. Tellinghuisen T.L., Marcotrigiano J., Gorbalenya A.E., Rice C.M. The NS5A protein of hepatitis С virus is a zinc metalloprotein. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 48576-48587.

68. Hirota M., Satoh S., Asabe S., Kohara M., Tsukiyama-Kohara K., Kato N., Hijikata M., Shimotohno K. Phosphorylation of nonstructural 5A protein of hepatitis С virus: HCV group-specific hyperphosphorylation. // Virology 1999. V. 257. P. 130-137.

69. Reed K.E., Xu J., Rice C.M. Phosphorylation of the hepatitis С virus NS5A protein in vitro and in vivo: properties of the NS5A-associated kinase. // J. Virol. 1997. V. 71. P. 7187-7197.

70. Tanji Y, Капеко Т., Satoh S., Shimotohno K. Phosphorylation of hepatitis С virus-encoded nonstructural protein NS5A. // J. Virol. 1995. V. 69. P. 3980-3986.

71. Reed K.E., Rice C.M. Identification of the major phosphorylation site of the hepatitis С virus H strain NS5A protein as serine 2321. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 28011-28018.

72. Katze M.G., Kwieciszewski В., Goodlett D.R., Blakely C.M., Neddermann P., Tan S.L., Aebersold R. Ser(2194) is a highly conserved major phosphorylation site of the hepatitis С virus nonstructural protein NS5A. // Virology 2000. V. 278. P. 501-513.

73. Kim J., Lee D., Choe J. Hepatitis С virus NS5A protein is phosphorylated by casein kinase II. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 257. P. 777-781.

74. Ide Y, Tanimolo A., Sasaguri Y, Padmanabhan R. Hepatitis С virus NS5A protein is phosphorylated in vitro by a stably bound protein kinase from HeLa cells and by cAMP-dependent protein kinase A-alpha catalytic subunit. // Gene 1997. V. 201. P. 151-158.

75. Huang L., Sineva E. V., Hargittai M.R., Sharma S.D., Suthar M., Raney K.D., Cameron C.E. Purification and characterization of hepatitis С virus non-structural protein 5A expressed in Escherichia coli. IIProtein. Expr. Purif. 2004. V. 37. P. 144-153.

76. Satoh S., Hirota M„ Noguchi Т., Hijikata M., Handa H., Shimotohno K. Cleavage of hepatitis С virus nonstructural protein 5A by a caspase-like protease(s) in mammalian cells. // Virology 2000. V. 270. P. 476-487.

77. Kalamvoki M., Mavromara P. Calcium-dependent calpain proteases are implicated in processing of the hepatitis С virus NS5A protein. // J. Virol. 2004. V. 78. P. 11865-11878.

78. Shirola Y, Luo H., Qin W„ Kaneko S., Yamashita Т., Kobayashi K, Murakami S. Hepatitis С virus (HCV) NS5A binds RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) NS5B and modulates RNA-dependent RNA polymerase activity. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 11149-11155.

79. Gao L., Aizaki H, He J. W., Lai M.M. Interactions between viral nonstructural proteins and host protein hVAP-33 mediate the formation of hepatitis С virus RNA replication complex on lipid raft. II J. Virol. 2004. V. 78. P. 3480-3488.

80. Evans M.J., Rice C.M., GoffS.P. Phosphorylation of hepatitis С virus nonstructural protein 5A modulates its protein interactions and viral RNA replication. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101. P. 13038-13043.

81. Macdonald A., Crowder K., Street A., McCormick C., Harris M. The hepatitis С virus NS5A protein binds to members of the Src family of tyrosine kinases and regulates kinase activity. II J. Gen. Virol. 2004. V. 85. P. 721-729.

82. Pawson T. Protein modules and signalling networks. //Nature 1995. V. 373. P. 573-580.

83. Macdonald A., Crowder K., Street A., McCormick C., Saksela K., Harris M. The hepatitis С virus non-structural NS5A protein inhibits activating protein-1 function by perturbing ras-ERK pathway signaling. II J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 17775-17784.

84. Samuel C.E. Antiviral actions of interferons. // Clin. Microbiol. Rev. 2001. V. 14. P. 778809, table of contents.

85. Clemens M.J., Elia A. The double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR: structure and function. II J. Interferon Cytokine Res. 1997. V. 17. P. 503-524.

86. Gale M., Jr., Kwieciszewski В., Dossett M., Nakao H, Katze M.G. Antiapoptotic and oncogenic potentials of hepatitis С virus are linked to interferon resistance by viral repression of the PKR protein kinase. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 6506-6516.

87. Majumder M., Ghosh A.K., Steele R., ZhouX.Y., Phillips N.J., Ray R„ Ray R.B. Hepatitis С virus NS5A protein impairs TNF-mediated hepatic apoptosis, but not by an anti-FAS antibody, in transgenic mice. // Virology 2002. V. 294. P. 94-105.

88. Street A., Macdonald A., Crowder K, Harris M. The Hepatitis С virus NS5A protein activates a phosphoinositide 3-kinase-dependent survival signaling cascade. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 12232-12241.

89. Park K.J., Choi S.H., Lee S.Y., Hwang S.B., Lai MM Nonstructural 5A protein of hepatitis С virus modulates tumor necrosis factor alpha-stimulated nuclear factor kappa В activation. II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 13122-13128.

90. Ghosh A.K., Majumder M, Steele R., Meyer K, Ray R„ Ray R.B. Hepatitis С virus NS5A protein protects against TNF-alpha mediated apoptotic cell death. // Virus Res. 2000. V. 67. P. 173-178.

91. Qadri I., Iwahashi M., Simon F. Hepatitis С virus NS5A protein binds TBP and p53, inhibiting their DNA binding and p53 interactions with TBP and ERCC3. // Biochim. Biophys. Acta 2002. V. 1592. P. 193-204.

92. Ghosh A.K., Steele R„ Meyer K, Ray R„ Ray R.B. Hepatitis С virus NS5A protein modulates cell cycle regulatory genes and promotes cell growth. // J. Gen. Virol. 1999. V. 80 ( Pt 5). P. 1179-1183.

93. Lcin K.H., Sheu M.L., HM'cing S.J., Yen S.H., Chen S.Y., Wu J.C., Wang Y.J., Kato N. Omata M., Chang F.Y., Lee S.D. HCV NS5A interacts with p53 and inhibits p53-mediated apoptosis. // Oncogene 2002. V. 21. P. 4801-4811.

94. Kato N. Lan КН., Ono-Nita S.K, Shiratori Y., Omata M. Hepatitis С virus nonstructural region 5A protein is a potent transcriptional activator. // J. Virol. 1997. V. 71. P. 8856-8859.

95. Ghosh A.K, Majumder M„ Steele R., YaciukP., Chrivia J., Ray R., Ray R.B. Hepatitis С virus NS5A protein modulates transcription through a novel cellular transcription factor SRCAP. II J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 7184-7188.

96. Chung KM., Lee J., Kim J.E., Song O.K., Cho S., Lim J., SeedorfM., Hahm В., Jang S.K. Nonstructural protein 5A of hepatitis С virus inhibits the function of karyopherin beta3. // J. Virol. 2000. V. 74. P. 5233-5241.

97. Fukuma Т., Enomoto N., Marumo F., Sato C. Mutations in the interferon-sensitivity determining region of hepatitis С virus and transcriptional activity of the nonstructural region 5A protein. // Hepatology 1998. V. 28. P. 1147-1153.

98. Gerotto M., Dal Pew F., Pontisso P., Noventa F., Gatta A., Alberti A. Two PKR inhibitor HCV proteins correlate with early but not sustained response to interferon. // Gastroenterology 2000. V. 119. P. 1649-1655.

99. Polyak S.J., Khabar K.S., Rezeiq M., Gretch D.R. Elevated levels of interleukin-8 in serum are associated with hepatitis С virus infection and resistance to interferon therapy. // J. Virol. 2001.V. 75.P. 6209-6211.

100. Bressanelli S., Tomei L., Roussel A., Incitti I., Vitale R.L., Mathieu M., De Francesco R., Rey F.A. Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. V. 96. P. 13034-13039.

101. Leveque V.J., Johnson R.B., Parsons S., Ren J., Xie C., Zhang F., Wang Q.M. Identification of a C-terminal regulatory motif in hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase: structural and biochemical analysis. // J. Virol. 2003. V. 77. P. 9020-9028.

102. Bressanelli S., Tomei L., Rey F.A., De Francesco R. Structural analysis of the hepatitis С virus RNA polymerase in complex with ribonucleotides. // J. Virol. 2002. V. 76. P. 3482-3492.

103. Ivashkina N. Wo Ik В., Lohmann V., Bartenschlager R., Blum HE., Penin F., Moradpour D. The hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase membrane insertion sequence is a transmembrane segment. II J. Virol. 2002. V. 76. P. 13088-13093.

104. OFarrell D., Trowbridge R., Rowlands D., Jager J. Substrate complexes of hepatitis С virus RNA polymerase (HC-J4): structural evidence for nucleotide import and de-novo initiation. // /. Mol. Biol. 2003. V. 326. P. 1025-1035.

105. Lohmann V., Roos A., Korner F., Koch J.O., Barlenschlager R. Biochemical and kinetic analyses of NS5B RNA-dependent RNA polymerase of the hepatitis С virus. // Virology 1998. V. 249. P. 108-118.

106. Cramer J., Jaeger J., Restle T. Biochemical and Pre-Steady-State Kinetic Characterization of the Hepatitis С Virus RNA Polymerase (NS5BDelta21, HC-J4). II Biochemistry 2006. V. 45. P. 3610-3619.

107. Maag D., Castro C., Hong Z., Cameron C.E. Hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) as a mediator of the antiviral activity of ribavirin. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 46094-46098.

108. Wang Q.M., Hockmcin M.A., Staschke K., Johnson R.B., Case K.A., Lu J., Parsons S., Zhang F., Rathnachalam R., Kirkegaard K., Colacino J.M. Oligomerization and cooperative

109. RNA synthesis activity of hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase. // J. Virol. 2002. V. 76. P.3865-3872.

110. Qin W., Luo H., Nomura THayashi N„ Yamashita Т., Murakami S. Oligomeric interaction of hepatitis С virus NS5B is critical for catalytic activity of RNA-dependent RNA polymerase. II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 2132-2137.

111. Choi H.B., Kim Y.G., Oh J.W. Biochemical properties of full-length hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase expressed in insect cells. // Exp. Mol. Med. 2003. V. 35. P. 475-485.

112. Kim M., Kim H, Cho S.P., Min M.K Template requirements for de novo RNA synthesis by hepatitis С virus nonstructural protein 5B polymerase on the viral X RNA. // J. Virol. 2002. V. 76. P. 6944-6956.

113. Oh J.W., Sheu G.T., Lai MM. Template requirement and initiation site selection by hepatitis С virus polymerase on a minimal viral RNA template. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 17710-17717.

114. Shim J.H., Larson G., Wu J.Z., Hong Z. Selection of З'-template bases and initiating nucleotides by hepatitis С virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase. // J. Virol. 2002. V. 76. P. 7030-7039.

115. Kao C.C., YangX., Kline A., Wang Q.M., Barket D., Heinz B.A. Template requirements for RNA synthesis by a recombinant hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase. // J. Virol. 2000. V. 74. P. 11121-11128.

116. Ranjith-Kumar C.T., Gutshall L., Sarisky R.T., Kao C.C. Multiple interactions within the hepatitis С virus RNA polymerase repress primer-dependent RNA synthesis. // J. Mol. Biol. 2003. V. 330. P. 675-685.

117. Luo G., Hamatake R.K., Mathis D.M., Racela J., Rigal K.L., Lemm J., Colonno R.J. De novo initiation of RNA synthesis by the RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) of hepatitis С virus. // Virol. 2000. V. 74. P. 851-863.

118. Kim S.J., Kim J.H., Kim Y.G., Lim H.S., Oh J.W. Protein kinase C-related kinase 2 regulates hepatitis С virus RNA polymerase function by phosphorylation. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 50031-50041.

119. Ishido S., Fujita Т., Holta H. Complex formation of NS5B with NS3 and NS4A proteins of hepatitis С virus. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 244. P. 35-40.

120. Kyono K, Miyashiro M., Taguchi I. Human eukaryotic initiation factor 4AII associates with hepatitis С virus NS5B protein in vitro. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 292. P. 659-666.

121. Llirano M., Kaneko S., Yamashita Т., Luo H., Qin W., Shirota Y., Nomura Т., Kobayashi K, Murakami S. Direct interaction between nucleolin and hepatitis С virus NS5B. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 5109-5115.

122. Shimakami Т., Honda M., Kuscikawa Т., Murata Т., Shimotohno K, Kaneko S., Murakami S. Effect of hepatitis С virus (HCV) NS5B-nucleolin interaction on HCV replication with HCV subgenomic replicon. II J. Virol. 2006. V. 80. P. 3332-3340.

123. Lan S., Wang H., Jiang H., Мао Д, Liu X., Zhang X., Ни Y., Xiang L., Yuan Z. Direct interaction between alpha-actinin and hepatitis С virus NS5B. // FEBS Lett. 2003. V. 554. P. 289-294.

124. Gcio L., Tu Я, Shi S.T., Lee K.J., Asanaka M., Hwang S.B., Lai M.M. Interaction with a ubiquitin-like protein enhances the ubiquitination and degradation of hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase. II J. Virol, 2003. V. 77. P. 4149-4159.

125. Johnston V.K., Maley D., Gagnon R.C., Grassmann C.W., Behrens S.E., Sarisky R.T. Kinetic profile of a heterocyclic HCV replicon RNA synthesis inhibitor. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 311. P. 672-677.

126. Nguyen T.T., Gates A.T., Gutshall L.L., Johnston V.K., Gu В., Duffy K.J., Sarisky R.T. Resistance profile of a hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase benzothiadiazine inhibitor. // Antimicrob. Agents Chemother. 2003. V. 47. P. 3525-3530.

127. Расе P., Nizi E., Pacini В., Pesci S., Matassa V., De Francesco R., Altamura S., Summa V. The monoethyl ester of meconic acid is an active site inhibitor of HCV NS5B RNA-dependent RNA polymerase. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. V. 14. P. 3257-3261.

128. Dixit N.M., Perelson A.S. The metabolism, pharmacokinetics and mechanisms of antiviral activity of ribavirin against hepatitis С virus. // Cell. Mol. Life Sci. 2006. V. 63. P. 832-842.

129. Shim J., Larson G., Lai V., Nairn S., Wu J.Z. Canonical З'-deoxyribonucleotides as a chain terminator for HCV NS5B RNA-dependent RNA polymerase. II Antiviral Res. 2003. V. 58. P. 243-251.

130. Olsen D.B., Eldrup A.B., Bartholomew L., Bhat В., Bosserman M.R., Ceccacci A., Colwell L.F., Fay J.F., Flores O.A., Getty K.L., Grobler J.A., LaFemina R.L., Markel E.J., Migliaccio

131. Koh Y.H., Shim J.H., Wu J.Z., Zhong W., Hong Z., Girardet J.L. Design, synthesis, and antiviral activity of adenosine 5'-phosphonate analogues as chain terminators against hepatitis С virus. // J. Med. Chem. 2005. V. 48. P. 2867-2875.

132. Bartenschlager R„ Lohmann V. Novel cell culture systems for the hepatitis С virus. // Antiviral Res. 2001. V. 52. P. 1-17.

133. Xie Z.C., Riezu-Boj J.I., Lasarte J.J., Guillen J., Su J.H., Civeira M.P., Prieto J. Transmission of hepatitis С virus infection to tree shrews. // Virology 1998. V. 244. P. 513-520.

134. Wunschmann S., MedhJ.D., Klinzmann D., Schmidt W.N., Stapleton J.T. Characterization of hepatitis С virus (HCV) and HCV E2 interactions with CD81 and the low-density lipoprotein receptor. II J. Virol. 2000. V. 74. P. 10055-10062.

135. Bartosch В., Dubuisson J., Cosset F.L. Infectious hepatitis С virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. // J. Exp. Med. 2003. V. 197. P. 633642.

136. Cormier E.G., Tsamis F., Kajumo F., Durso R.J., Gardner J.P., Dragic T. CD81 is an entry coreceptor for hepatitis С virus. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101. P. 72707274.

137. Germi R., Crance J.M., Garin D., Guimet J., Lortat-Jcicob H, Ruigrok R.W., Zarski J.P., Drouet E. Cellular glycosaminoglycans and low density lipoprotein receptor are involved in hepatitis С virus adsorption. II J. Med. Virol. 2002. V. 68. P. 206-215.

138. Wang Q.C., Feng Z.H., Nie Q.H., Zhou Y.X. DC-SIGN: binding receptors for hepatitis С virus. // Chin. Med. J. (Engl.) 2004. V. 117. P. 1395-1400.

139. Zuckerman E., Kessel A., Slobodin G., Sabo E., Yeshurun D., Toubi E. Antiviral treatment down-regulates peripheral B-cell CD81 expression and CD5 expansion in chronic hepatitis С virus infection. II J. Virol. 2003. V. 77. P. 10432-10436.

140. Kronenberger В., Ruster В., Elez R., Weber S., Piiper A., Lee J.H., Roth W.K., Zeuzem S. Interferon alfa down-regulates CD81 in patients with chronic hepatitis C. // Hepatology 2001. V, 33. P.1518-1526.

141. Kashiwagi Т., Нага К, Kohara M., Iwahashi J., Hamada N., Honda-Yoshino H., Toyoda T. Promoter/origin structure of the complementary strand of hepatitis С vims genome. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 28700-28705.

142. Domitrovich A.M., Diebel K.W., Ali N. Sarker S., Siddiqui A. Role of La autoantigen and polypyrimidine tract-binding protein in HCV replication. // Virology 2005. V. 335. P. 72-86.

143. Ivanyi-Nagy R., Kanevsky /., Gctbus C„ Lavergne J.P., Ficheux D., Penin F., Fosse P., Darlix J.L. Analysis of hepatitis С virus RNA dimerization and core-RNA interactions. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 2618-2633.

144. Barterjee R., Dasgupta A. Specific interaction of hepatitis С virus protease/helicase NS3 with the З'-terminal sequences of viral positive- and negative-strand RNA. // J. Virol. 2001. V. 75. P. 1708-1721.

145. Huang L., Hwang J., Sharma S.D., Hargittai M.R., Chen Y, Arnold J.J., Raney K.D., Cameron C.E. Hepatitis С virus nonstructural protein 5A (NS5A) is an RNA-binding protein. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 36417-36428.

146. Ji H., Fraser C.S., Yu Y, Leary J., Doudna J.A. Coordinated assembly of human translation initiation complexes by the hepatitis С virus internal ribosome entry site RNA, // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101. P. 16990-16995.

147. Ito Т., Lai MM An internal polypyrimidine-tract-binding protein-binding site in the hepatitis С virus RNA attenuates translation, which is relieved by the 3'-untranslated sequence. // Virology 1999. V. 254. P. 288-296.

148. Fukushi S., Okada M., Stahl J., Kageyamci Т., Hoshino F.B., Kalaycima K. Ribosomal protein S5 interacts with the internal ribosomal entry site of hepatitis С virus. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 20824-20826.

149. Izumi R.E., Valdez В., Banerjee R., Srivastava M, Dasgupta A. Nucleolin stimulates viral internal ribosome entry site-mediated translation. // Virus Res. 2001. V. 76. P. 17-29.

150. Murakami K, Abe M., Kageyamci Т., Kamoshitci N., Nomoto A. Down-regulation of translation driven by hepatitis С virus internal ribosomal entry site by the 3' untranslated region of RNA. II Arch. Virol. 2001. V. 146. P. 729-741.

151. Venkatesan A., Sharma R., Dasgupta A. Cell cycle regulation of hepatitis С and encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site-mediated translation in human embryonic kidney 293 cells. // Virus Res. 2003. V. 94. P. 85-95.

152. Liu Q., Tackney C., Bhat R.A., Prince A.M., Zhang P. Regulated processing of hepatitis С virus core protein is linked to subcellular localization. // J. Virol. 1997. V. 71. P. 657-662.

153. Lohmann V., Koch J.O., Bcirtenschlager R. Processing pathways of the hepatitis С virus proteins. // J. Hepatol. 1996. V. 24. P. 11-19.

154. Yang S.H., Lee C.G., Song M.K., Sung Y.C. Internal cleavage of hepatitis С virus NS3 protein is dependent on the activity of NS34A protease. // Virology 2000. V. 268. P. 132-140.

155. Brodsky L.I., Vasiliev A.V., Kalaidzidis Y.L., Osipov Y.S., Tatuzov R.L., Feranchuk S.I. GeneBee: the program package for biopolymer structure analysis. II Dimaks 1992. V. 8. P. 127139.

156. Kim J.H., Lee J., Oh В., Kimm K, Koh I. Prediction of phosphorylation sites using SVMs. // Bioinformatics 2004. V. 20. P. 3179-3184.

157. Blom N., Sicherilz-Ponten Т., Gupta R., Gammelloft S., Brunak S. Prediction of postradiational glycosylation and phosphorylation of proteins from the amino acid sequence. // Proteomics 2004. V. 4. P. 1633-1649.

158. Zhou F.F., Xue' Y., Chen G.L., Yao X. GPS: a novel group-based phosphorylation predicting and scoring method. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 325. P. 14431448.

159. Ferrari E., Wright-Minogue J., Fang J.W., Baroudy B.M., Lau J.Y., Hong Z. Characterization of soluble hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase expressed in Escherichia coli. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 1649-1654.

160. Oh J.W., Ito Т., Lai MM A recombinant hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase capable of copying the full-length viral RNA. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 76947702.

161. Adachi Т., Ago LI., Iiabuka N., Okuda K., Komcitsu M., Ikeda S., Yatsunami K. The essential role of C-terminal residues in regulating the activity of hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase. // Biochim. Biophys. Acta 2002. V. 1601. P. 38-48.

162. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. II Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 512-538.

163. Viitanen M.I., Vasala A., Neubauer P., Alatossava T. Cheese whey-induced high-cell-density production of recombinant proteins in Escherichia coli. // Microb. Cell. Fact. 2003. V. 2. P. 2.

164. Машко С.В. Оптимизация экспрессии гетерологичных генов в клетках Е. coli. II Биотехнология 1998. V. Р. 3-23.

165. Вапеух F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. V. 10. P. 411-421.

166. Uhlenbeck O.C., Bailer J., Doty P. Complementary oligonucleotide binding to the anticodon loop of fMet-transfer RNA. II Nature 1970. V. 225. P. 508-510.

167. Schoner B.E., Belagaje R.M., Schoner R.G. Translation of a synthetic two-cistron mRNA in Escherichia coli. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. V. 83. P. 8506-8510.

168. Oppenheim D.S., Yanofsky C. Translational coupling during expression of the tryptophan operon of Escherichia coli. // Genetics 1980. V. 95. P. 785-795.

169. Mukhopadhyay U.K., Sahni G. An insight into the possible mechanism of working of two-cistronic gene expression systems and rational designing of newer systems. // J. Biosci. 2002. V. 27. P.219-231.

170. Svensson J., Andersson C., Reseland J.E., Lyngsladcias P., Bulow L. Histidine tag fusion increases expression levels of active recombinant amelogenin in Escherichia coli. // Protein. Expr. Purif. 2006. V. 48. P. 134-141.

171. Pinna L.A. Casein kinase 2: an 'eminence grise' in cellular regulation? // Biochim. Biophys. Acta 1990. V. 1054. P. 267-284.

172. Bustos V.H., Marin O., Meggio F., Cesaro L., Allende C.C., Allende J.E., Pinna L.A. Generation of protein kinase Ckl alpha mutants which discriminate between canonical and non-canonical substrates. // Biochem. J. 2005. V. 391. P. 417-424.

173. Caizergues-Ferrer M., Belenguer P., Lcipeyre В., Amalric F., Wallace M.O., Olson M.O. Phosphorylation of nucleolin by a nucleolar type N11 protein kinase. // Biochemistry 1987. V. 26. P. 7876-7883.

174. Romero-Oliva F., Jacob G., Allende J.E. Dual effect of lysine-rich polypeptides on the activity of protein kinase CK2. // J. Cell. Biochem. 2003. V. 89. P. 348-355.

175. Rcimcidoss C.S., Steczko J., Uhlig J.W., Axelrod B. Effect of albumin on binding and recovery of enzymes in affinity chromatography on Cibacron Blue. II Anal. Biochem. 1983. V, 130. P. 481-484.1. БЛАГОДАРНОСТИ

176. Мне хотелось бы поблагодарить всех сотрудников Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток и Лаборатории этимологии транскрипции за неоценимую помощь при выполнении данной работы.

177. Выражаю благодарность сотрудникам Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Александровой Л.А. и Козлову М.В. за предоставленные для исследования соединения, и Костюку Д.А. за сконструированную плазмиду.

178. Выражаю благодарность сотруднице Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН за клонирование генов казеинкиназ человека.

179. Наконец, хочу поблагодарить своего научного руководителя Куханову М.К. и научного консультанта Кочеткова С.Н. за постоянное внимание и помощь в работе.

Информация о работе

Иванов, Александр Владимирович
кандидата химических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Экспрессия генов белков NS5B и NS5A вируса гепатита C, ингибиторный анализ и белок-белковое взаимодействие - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы