Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальный анализ процесса заражения инфузорий PARAMECIUM CAUDATUM внутриядерными эндобионтами HOLOSP0RA OBTUSA и Н.UNDULATA

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальный анализ процесса заражения инфузорий PARAMECIUM CAUDATUM внутриядерными эндобионтами HOLOSP0RA OBTUSA и Н.UNDULATA"

нв ид

/ ел р О

2 9 /и^

институт цитологии "

российской академии наук

На правах рукописи

СКОВОРОДКИН

Илья Николаевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОЦЕССА ЗАРАЖЕНИЯ ИНФУЗОРИЙ PARAMECIUM CAUDATUM ВНУТРИЯДЕРНЫМИ ЭНДОБИОНТАМИ HOLOSPORA OBTUSA И Н.UNDULATA

Специ юность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1993

Работа выполнена в Биологическом научно-исследовательском институте СПбГУ и в Институте цитологии РАН.

Научные руководители: член-корр. РАН проф. |[Ю. И. Полянский,| ст. п. е., кандидат биологических наук С. И. Фокин.

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, профессор Б. В. Громов; доктор биологических наук профессор И. В. Исси.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный педагогический университет им. А. И. Герцена.

Защита состоится «<-> » \XhCJbifV\X 1993 г. в /3 часов

па заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

<"■

Автореферат разослан » 5993 г

Ученый секретарь Специализированного совета,

доктор биологических наук Л. Н. Писарева

(£) Институт цитологии РАН, 1993

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В современной биологии суиествуют, как минимум,три крупных области, в разработку которых вносят вклад исследования, посвященные внутриклеточным бактериальным симбионтам. В первую очередь, это собственно проблема симбиоза различных организмов. Кроме того, исследования, посвященные прокариотичёским организма»), обитающим внутри эукариотических, могут представлять существенный интерес для разработки теории симбиотического происхождения клетки эукариот. Наконец, симбиотическая система подобного типа может служить моделью для изучения основ организации и функционирования клетки в соответствии с идеей симбиотического анализа (Осипов и др., 1976). .

Особенный интерес в этом плане представляют бактерии рода Holospora - облигатные эндонуклеобионты инфузорий рода Paramecium, имеющие сложный жизненный цикл. В жизненном цикле этих эндобионтов Об) выделяют два основных этапа: заражение парамеции и поддержание симбионтов в ряду бесполых поколений зараженных инфузорий.

Мы сосредоточили свое внимание на изучении этапа заражения клетки-хозяина - P.caudaitun эндонуклеобионтами H.obtusa и H.unduiata. До наших исследований изучение этого процесса ограничивалось в основном его описанием на светооптическом и электронно-микроскопическом уровне. Было выяснено, каким образом инфекционные формы бактерий проникают в макронуклеус (Ма) или микронуклеус (Ми) парамеций, а также был высказан ряд йрййположений о том, за счет каких процессов происходит транспорт Эб в ядро клетки-хозяина.

Стало очевидным, что следующим-этапом.изучения процесса заражения парамеций эндонуклеобионтами должен быть экспериментальный анализ который обеспечил бы необходимую базу для дальнейшего исследования симбионто-хозяинных взаимодействий в системе Рага-mecium-Holospora с применением биохимических и молекулярно-био-логических методов.

Цели и задачи исследования. Результаты морфологических исследований заражения P.caudatum эндонуклеобионтами H.obtusa и H.unduiata, выполненных отечественньми и зарубежными авторами, и; сответственно, взгляды на природу этого процесса в ряде отношений были противоречивы. В связи с этим устран^ие этих противоречий и уточнение схемы процесса ¡заражения парамеций указанными Эб на основании морфологических данных являлось первой цель» предлагав-

мой работы.

Второй, основной, целью было выявить в процессе заражения клетки-хозяина бактериями-эндобионтами звенья, в которых процесс может быть нарушен в результате различных экспериментальных воздействий. В частности, предполагалось выяснить, чем обусловлена свойственная н.obtusa и H.unduiata избирательность заражения Ма и Ми, соответственно, или на какой стадии заражения могут действовать механизмы, обеспечивающие подобную ядерную специфичность 36.

Для решения подобной задачи возможны два подхода. Во-первых, использование различных экспериментальных воздействий, в результате которых повреждаются те или иные компоненты симбионто-хозяинной системы и прерывается ее дальнейшее формирование. Во-вторых, генетическое расчленение исследуемого процесса путем подбора различных комбинаций штаммов 36 и клонов хозяина, в которых происходят нарушения процесса заражения*.

Мы использовали оба эти подхода. И в том, и в другом случае мы определяли критические звенья процесса заражения инфузорий P.caudatun эндонуклеобиоНтами Н.obtusa и H.undulata, чувствительные к тому или иному экспериментальному воздействие ' В соответствии с целями Исследования были поставлены следующие задачи:

,1. Провести на светоопуическом(а)иэлектронно-микроскопическом(6) уровне предварительное исследование процесса заражения клетки-хозяина н.obtusa{4)и H.unduiata@¿),происходящего без ' каких-либо экспериментальных вмешательств.

2. Изучить на. светооптическом уровне последствия экспериментально вызванных нарушений процесса заражения парамеций 36, в частности, выяснить: а) обусловлено ли избирательное проникновение бактерий в то или другое ядро размерами ядра-"мишени"; б) обусловлена ли такая избирательность различием вункциональноп активности ,Ма и Ми,- в) имеет ли какое-либо значение «ункциональная активность ядерного аппарата клетки-хозяйна для прохождения собственно процесса заражения éé Н.obtusa и H.undulata (без. учета направленности этого процесса); г) играет ли вункциональная ' активность бактерий какую-либо роль при заражении клетки-хозяина и если да, то на каких стадиях этого процесса.

3. Исследовать примеры естественного нарушения процесса заражения. Выяснить природу явления резистентности парамеции к зараже-

нию бактериями.

~ Научная новизна работы. Представленные в диссертации материалы позволили уточнить и дополнить описание процесса заражения инвузории P.caudatum эндонуклеобионтами Н.obtusa и H.undulata Это позволило разбить процесс на ряд стадия и экспериментальным путем выявить, на каких стадиях он может быть прерван в результате' тех или иных воздействия. Полученные данные служат необходимой основой для дальнейшего, более углубленного изучения данного процесса.

Научно-практическая ценность работы. Оказались полезными и наоли применение в исследовательской практике нескольких лабораторий некоторые методические разработки, выполненные нами. Так, было сконструировано приспособление, позволявшее обездвиживать объекты для их прижизненного изучения с помощь» светового микроскопа. С использованием этого приспособления была отработана методика периодического наблюдения под микроскопом одной и той же- инвузории, позволяющая проследить в динамике исследуемые процессы.

Усовершенствован Промышленный комплект микроманипуляторов КМ-2 для выполнения микрургических операций. •

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на двух заседаниях Ленинградского отделения всесоюзного обшества протозоологов (1989, 1990), на заседании С.-Петербургского отделения Общества протозоологов при РАН (1993 г.) -и на Y Всесоюзном, съезде протозоологов (Витебск, 1992).

Публикации.' По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, четьрех глав ("Обзор литературы, "Цели и задачи исследования", "Материал и методы", "Результаты'и обсуждение"), заключения, выводов и списка использованоп ли-^ературы, содержащего $Ъ названий. Работа иллюстрирована 21 рисунками и S таблицами.

. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал. Материалом для большинства экспериментов послужили парамеции p.caudatum клона МАП-ЗБ, полученного' в результате конъюгации. <з

Ряд клонов P.caudatum, не подвергавшихся каким-либо экспериментальным воздействиям, в том числе выделенные из природы ПК-36, 90-ЗГ-2 и М-571, были протестированы на проявление признака резис-

/

тентностн к заражении n.unduiata.

Для изучения природы явления резистентности инфузорий к заражению H.undulata были использованы клоны различного происхождения, проявляющие это свойство: МАП-ЗБн.и-16 (в дальнейшем тексте -Р-1), МАП-ЗБн.и~-30 (в дальнейшем тексте - Р-2), МАП-ЗБн.г~-40 (в дальнейшем тексте - Р-3). .

Инфекционные формы.36 Н. obtusa и н. undulata, служившие для заражения парамеций в различных экспериментах, получали, соответственно, из Клонов Р.caudatum Р20-16Н. 0. и Р21-5Н. и., выделенных в зараженном состоянии из природы.

Инфузорий, как зараженных, так и свободных от внутриядерных 36, культивировали по методике Соннеборна (sonneborn, 1970) - в пробирках на салатной среде, содержащей бактерии Aerobacter aerogenes, при комнатной температуре .(18-20^0. При субклонировании инфузорий культивировали в микроаквариумах из оргстекла (Заар, Лозина-Лозинский, 1964).

Методы.

Экспериментальное заражение парамеций эндонуклеобионтами. Для заражения парамеций в различных экспериментах использовали неочищенный гомогенат, приготовленный из инфузорий, содержащих инфекционные формы Н.obtusa или H.undulata (Preer) 1969). Количество инфекционных форм 36, содержащихся в 1 мл гомогената, определяли путем подсчета в камере Горяева. Эта величина в разлн'пшх вариантах экспериментов составляла от 2x10® до 2x10® 36 в 1 мл.

Заражение одиночных парамеций производили в микроаквариумах, содержащих равные объемы гомогената с инфекционными бактериями и культуральной среды. При массовом заражении парамеций в пробирку (10 мл) помещали 0.5 мл. среды, содержащей около 500 особей, и добавляли 0. 2-0. 3 мл гомогената.

Светооптические наблюдения. Светоонтические наблюдения, а также -микрофотосъемку производили под микроскопом Polyvar (Reichert) с использованием митода дифференциального интерференционного и Фазового контрастов при увеличениях lOOOx и 1250х.

При проведении ряда экспериментов.необходимо было исследовать процесс заражения парамеций .36 в динамике. Для этого требовалось неоднократно на протяжении определенного периода времени наблюдать под микроскопом одну и ту же особь. Для временного обездвиживания

наблюдаемых инфузорий мы разработали универсальное (устанавливаемое на любой тип микроскопа) приспособление (Сковородкин, 1990). ■

Зле к тронно-мнкроскопическое исследование. Лля электронно-микроскопического изучения процесса заражения парамеций Эб н. undulata инфузорий «иксировали при pH 7.4 2.57.-ным глутпровым альдегидом с добавлением йОУ.-ного паранорма в 0.1 М «ос$атном буфере с сахарозой в течение 1.5 ч и лоФиксировали 17.-ным oso4. Фиксацию производили при комнатной температуре. Ультратонкие срезы получали на упьтратоме lkd и просматривали на микроскопа* Tesia-5 и Jem-7.

Определение Фагоцитарной активности .пгфэм;:11нй._ Для тестирования Яагоцитлрной активности парамеции их ма -прзлрленныг. срок помещали в культуряльную среду, содержаиур елвесс .частиц туши, после чего их отмыпали в чистой среде и пол микроскопом подсчитывали число пшгевармтельных вакуолей, заполненных тушью.

Проведение микрургических операций. Удаление из парамеции цело^ го На или его части, удаление Ми и пересадку его из одной клетки в другую производили при помоши микроманипулятор? КМ-2 по методике, сходной с предложенной Ноулзом (Knowics, 1974). Парамеций оперировали в висячей капле на силиконизированных покровных стеклах, помешенных во влажную камеру. Операции выполняли под микроскопом Ergaval ( ßarl Zeiss Jona) при увеличениях 250х и 400х.

Лля проведения операций использовали два типа микроинструментов: "рабочую" микропипетку для удаления материала из клетки или его инъекции в клетку и вспомогательную микропипетку для регулирования объема висячей капли во время операции. При уменьшении объема висячей капли, инфузория придавливалась пленкой поверхностного натяжения к покровному стеклу, в результате чего обездвИжавалась.

Всасывание материала в микропипетку и выведение его из микропипетки производили с помощью либо пневматического устройства собственной конструкции, либо гидравлического устройства для • микроинъекции и микровсасывания, сходного по конструкции с предложенным Коизуми (Koizumi., 1974). Первое устройство применяли при удалении Ма или Ми из парамеции, второе - при пересадке № из одной клетки в другую.

Для удаления из парамеции Ма и Ми мьу1спользовали заточенные под углом 45® силиконизированные стеклянньк микропипетки диаметром G-7 мкм; для пересадки Ми из клетки в клетку - микропипетки диаметром 3.5-5 мкм. Все микроинструменты изготавливали на микрокуэ-

нице фирмы carl Zeiss Jena по методике Фонбрюна (1951).

Микрооблучение ядер парамеций УФ лучами. Микрооблучение парамеций УФ лучами проводили на установке Фирмы Carl Zeiss Jena, смонтированной на базе микроскопа NF (Carl Zeiss Jena) (Фокин, Осипов 1975).. Интенсивность УФ-облучения измеряли при помощи радиометра UVX Digital Radiometer (UVP, USA).

При облучении Ma использовали зонд площадью либо 750 мкм^

р

(примерно половина площади проекции Ma), либо 1500 мкм (практически вся площадь проекции Ma). Площадь зонда при облучении Ми

? '

составляла 100 мкм . Облучение парамеций . производили светом с длиной волны 240-280 нм. Экспозиционная доза облучения была равна 102 Дж: м^. При такой дозе облучения Ma парамеции выживали в течение 3-5 сут (Фокин, 1982).

Для того чтобы индуцировать фо'тореактивацию в контрольных экспериментах; использовали двухчасовое освещение видимым светом. В качестве теплового фипьтра применяли 10У.-ный раствор cuso4 с толщиной слоя 50 мм.

Воздействие высокой температурой на инфекционные Формы н.-obtus а и H.unduiata и УФ-облучение бактерий. Для того чтобы оказать повреждающее воздействие на инфекционные формы эндобионтов, производили УФ-облучение или нагревание до температуры 60-80®С бактерий, находящихся в гомогенате, приготовленном из зараженных парамеций.

Интенсивность теплового воздействия на н.obtusa (температура и длительность обработки) была определена, исходя из литературных данных (Fujishima, Nagahara,, 1985). Данные о воздействии высокой температуры на н. unduiata, а также, какие-либо _ данные о воздействии на 36'обоих видов УФ излучения в литературе отсутствовали. Поэтому интенсивность воздействия на инфекционные Формы 36 в этих случаях была определена на основании предварительных экспериментов. Инфекционные формы 36, находящиеся в неочищенном гомогенате зараженных парамеций, подвергали нагреванию или УФ-облучению и затем добавляли в культуры незарахенных инфузорий клона МАП-ЗБ. ' Тепловую обработку 36 производили, помещая на определенное время неочищенный гомогенат зараженных парамеций, содержащий инфекционные формы бактерий, в термостат при температуре 60°С (для н.obtusa и H. unduiata) или 80°С (только для Н.' obtusa), УФ-облучение инфекционных форм 36 производили в боксе, оборудованном тремя лампа-

ми БУВ-30, 85 "/. энергии которых приходится на свет с длиной волны 254 нм. Экспозиционная доза облучения составляла в этих экспериментах 420 и 840 Дж: м^ при 5- и 10-минутном облучении соответственно.

Результаты заражения парамеций Эб, подвергнутыми тепловой обработке или УФ-облучению, оценивали через 1.5-2 ч после добавления Эб в культуру парамвцил. При этом регистрировали наличие Эб в Фагосомах,' цитоплазме, Ма и Ми парамеций.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Транспорт н.obtusa и н■unduiata из пищеварительных_вакуолей

в Ма и ни парамеций.

Для изучения процесса заражения Р.' caudatum эндонуклеобионта-ми Н. obtusa и Н. undulata на светооптическом уровне и для того, чтобы выяснить, как зависит этот процесс от количества Эб, попавши* в инфузорию, парамеций клона МАП-ЗБ обрабатывали гомогенатом с различной концентрацией инфекционных форм бактерий: 1x10®, 5x10® и 2. 5x10^ Эб в 1 мл в случае н. obtusa и 1х105, 4х10Г) и 8х105 - в случае н. undulata. Результаты заражения учитывали через каждые 20 мин в течение 1-го ч и далее через 2, 3. 4 ч и через 1 сут после начала опыта. При микроскопировании инфузория отмечали присутствие Эб в их Фагосомах, цитоплазме, Мэ и Ми, а также учитывали число

н

попавиих в ядра бактерии. Кроме того, регистрировали морфологические изменения инфекционных Форм Эб, происходящие по мере перемещения их из пищеварительных вакуолЕй в ялра парамеций.

Для электронно-микроскопического исследования брали параме-. ций, зафиксированных через 2, 4, 12 ч и 2 сут после обработки гомогенатом, содержащим инфекционные Формы н. undulata. Поскольку инфекционные Формы Эб попадают в Фагосомы парамеций неоднократно в каждой отдельной клетке и неодновременно в разных особях, мы предполагали, что четырех вышеуказанных сроков Фиксации достаточно для * того, чтобы наблюдать все возможные стадии транспорта Эб в ядро клетки-хозяина.

Опираясь на литературный материал и собственные исследования, мы разбили процесс заражения парамеций' Лдобионтами и.obtusa и н.undulata на шесть стадий.

На 1-й стадии заражения инфекционные формы бактерий попадают

в Фагосому инфузории. Полученные нами данные о морфологии 36 и клетки-хозяина на этой стадии соответствуют описанным а литературе.

На 2-й стадии инфекционные Формы 36 превращаются в активированные. При этом мы наблюдали уменьшение периплазматической зоны бактери и уменьшение оптической и электронной плотности цитоплаз-матической зоны, вероятно связанное с декомпактизацией содержащегося в ней материала.' В противоположность тому, что предполагалось ранее для H.obtusa (Осипов, 1981), мы никогда не наблюдали сбрасывания наружной оболочки бактерии в пищеварительной вакуоли.

На 3-й стадии активированные формы H.obtusa и H.undulata выходят цитоплазму парамеций. Согласно нашим наблюдениям, активированные формы и того и другого вида бактерий, выходящие в цитоплазму инфузорий, окружены мембраной фагосомы. Ранее предполагалось, что H.undulata выходят в цитоплазму разрывая стенку пищеварительной вакуоли (Подлипаев, Осипов, 1979).

На 4-й стадии бактерии транспортируются в цитоплазме парамеции к Ма или Ми. Ранее было обнаружено, что вокруг активированных Форм H.obtusa образуется многослойный мембранный комплекс, в то время как H.undulata окружены только Фибриллярным слоем (Осипов, 1981). Мы обнаружили, что H.undulata в цитоплазме инфузорий также могут быть окружены мембранами. Светооптические наблюдения позволили нам высказать предположение о том, что активированные формы 36 обоих исследованных видов перемещаются к Ма или Ми парамеции в результате циклоза цитоплазмы последней и, что это перемещение происходит скорее случайно, чем направленно. Подобное предположение выдвигалось ранее a priori (Осипов, Подлипаев, 1981), а впоследствии было подтверждено для н.acuminata - _ эндобионта P.bursaria (Скобло и др., 1990).

На 5-й стадии заражения активированные Формы бактерий проникают в Ма или Ми парамеции. H.obtusa избирательно проникает в Ма, H.undulata - в Ми. Ранее (Подлипаев, Осипов, 1979) было показано, что при заражений парамеций H.undulata бактерии могут в редких случаях попадать в Ма, где, однако, затем погибают. Мы показали, что подобное нарушение ядерной специфичности возможно и для H.obtusa. '

На последней, 6-й стадии заражения, активированные Формы 36 фрагментируются (возможно многократно делятся), в результате чего

образуются "цепочки" бактерий, распадающиеся затем на отдельные вегетативные Формы, размножающиеся впоследствии простым делением надвое. Фрагментация активированных форм H.undulata, проникших в Ми, ранее не была описана.

На основании полученных результатов можно прийти к заключению, что в морфологическом отношении процесс заражения клвтки-хозяина протекает сходным образом у н.obtusa и H.undulata. Таким образом, в результате микроскопических исследований трудно обнаружить причину избирательного проникновения 36 в "свое" ядро. К такому же мнению пришли другие авторы (Gertz, wiemann, .1989), исследовавшие с помошью электронного микроскопа заражение p.caudatum эндобионтами н.obtusa и H.elegans (бактерии последнего вида, так же как и H.undulata, избирательно проникают в Ми парамеций).

Влияние микрургического удаления или инактивации УФ лучами вегетативного или генеративного ядра парамеций на прохождение npouecca заражения инфузорий 36 Н.obtusa или H.undulata.

При изучении заражения парамеций Н.obtusa и H.undulata мы считали необходимым выяснить, какую роль в этом процессе играет гетероморФный ядерный аппарат инфузорий. С этой целью мы либо инактивировали Ма или Ми путем их локального УФ-облучеНия, либо удаляли их из клетки. Затем к прооперированным парамециям добавляли инфекционные Формы н.obtusa или H.undulata и через 1.5-2 ч после этого наблюдали под микроскопом, как происходило заражение клеток.

В табл. 1 представлены результаты опытов по микрургическому удалению Ма или Ми из клетки инфузории с последующим заражением ее н.obtusa или H.undulata. Оказалось, что частота заражения эндо-нуклвобионтами парамеций с удаленными Ма или Ми снижалась, однако полного прекращения процесса проникновения H.obtusanflH H.undulata в оставшееся в клетке ядро не происходило.

Таблица 1.

Влияние' операции по удалению Ма или Ми парамеций на заражение эндонуклеобионтами ядра, оставшегося в клетке.

Вариант опыта Доля инфузорий, в Ма которых обнаружены н.obtusa,'/., *ís- Доля инфузорий, в Ми Которых обнаружены H.undulata, '/.,

Контроль 95-2 (628) 92-2 (169)

Удаление Ма - 68-8 (45)

Удаление Ми 86-7 (45) -

В скобках - число просмотренных парамеций.

Результаты опытов по заражению 36 н.obtusa и H.undulata парамеций с УФ-облученными № или Ми представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Влияние УФ-облучения Ма или Ми на заражение парамеций i 36 Н.obtusa и H.undulata.

Вариант опыта Доля инфузорий, в'Ма Доля инфузорий, в Ми которых обнаружены которых обнаружены Н. obtusa, X, x-S- H.undulata, '/., x-S-

Контроль SbÍE Í628) 92±2 (169)

УФ облучение Ма 34±7(32). 54-10 (39)

Уф облучение Ми_» ___66-10 ( §3)_

В скобках - число просмотренных парамеций.

»-опыты, в которых при УФ-облучении Ми регистрировали попадание н.obtusa в Ма, не проводили.

Согласно представленным в таблице результатам, после УФ-облучения Ма или Ми парамеций, инфузории могли заражаться (хотя и с меньшей частотой) эндобионтами Н.obtusa или H.undulata. При этом бактерии могли проникать и в необлученное, и в облученное ядро.

Последствия локального УФ-облучения ядер простейших достаточно хорошо изучены (см.: Самойлова, 1967; Фокин, Осипов, 1975). Они

сводятся прежде всего к резкому сокращению синтеза РНК и ДНК, обусловленному возникновением в последней пиримидиновых димеров. Поэтому, применяя метод локального ультрафиолетового облучения ядер парамеций, мы считали, что воздействуем в основном на транскрипционную активность облучаемого ядра.

Таким образом, функциональная активность ядерного аппарата парамеций непосредственно во время заражения их эндобионтами н.obtusa и n.unduiata, не имеет решающего значения для прохождения этого процесса. Иными словами, проникновение 36 в то или иное ядро парамеций не связано с "запуском" какого-либо процесса, отсутствовавши в организме клетки-хозяина до этого момента. Полученнье результаты позволили нам обсудить в работе предположение, о "маскировке" Эб в цитоплазме клетки-хозяина под какие-либо продукты ее метаболизма, постоянно транспортируемые в то или иное ядро.

Влияние уменьшения размеров или подавления Функциональной активности Ма на избирательность заражения вегетативного ядра иарамеций Эб H.obtusa и генеративного - Эб H.undulata.

Одной из поставленных нами задач было определить причину избирательности проникновения H.obtusa в Ма и H.undulata в Ми. Мы допускали, что ядерная специфичность 36 может быть обусловлена различием (Таких-то свойств генеративного и вегетативного ядер, таких, например, как размеры и Функциональная активность заражаемого ядра, по- некоторым литературным данным свойственная преимущественно макронуклеусу инфузорий (см. Борхсениус, 1975; Осипов, 1981).

Для проверки этих предположений производили микрургическое удаление или УФ-облучение части Ма, а также УФ-облучение целого Ма. При удалении части Ма размер его уменьшался и, соответственно, уменьшалось различие размеров Ма и Ми. При УФ-облучении части Ма • или всего Ма понижалась его метаболическая активность, что также уменьшало различия между вегетативным и генеративным ядрами парамеции.

К прооперированным тем или иным способом ццрамециям добавляли ^инфекционные Формы H.obtusa или H.undulata и через 1.5-2ч после этого просматривали инфузорий под микроскопом.

В табл. 3 представлены результаты опытов по изучению влияния размеров и активности ядра-"мишени" на избирательность его заражения тем или иным видом эндонуклеобионтов.

ТаблицаЗ,

Заражение эндонуклеобионтами Н.obtusa и H.undulata парамеций с частично удаленным или УФ-облученным Ма.

Вариант опыта Доля инфузорий, в Ма которых были

обнаружены эндобионты, '/., *-s-Н.obtusa H.undulata

Контроль 95-2 (628) Эг-г (169)

Удаление около 0. 3 Ма 82^7 (29)

Удаление около 0.9 Ма 57±2 (48) 0 (33)

УФ облучение около 0.5 Ма 49^3 (53) , 0 (20)

УФ облучение всего Ма 56^ (32) . О (34)

В скобках - число просмотренных парамеций.

»•-опыты, в которых регистрировали бы попадание H.undulata во Фрагмент ядра, оставшийся после удаления около 0. 3 Ма, не проводили.

Как показывают представленные в таблице результаты, после уменьшения размера и снижения активности Ма парамеций частота проникновения в него H.undulata, в норме попадающей в Ми, не возрастает. Кроме того было выяснено, что после частичного удаления или УФ-облучения МА не увеличивается также и частота попадания в Ми н.obtusa (макронуклеарного эндобионта). Соответственно, оба исследованных Фактора не определяют избирательность проникновения 36 в то или иное ядро инфузории. Это означает, что ядерная специфичность эндобионтов объясняется какими-то другими причинами. В диссертации обсуждается предположение о том, что избирательность проникновения Н.obtusa в Ма и H.undulata в Ми, обусловлена специфическим взаимодействием поверхностных мембран симбионта и наружной мембраны заражаемого ядра.

Влияние УФ-облучения и тепловой обр а бот к и н. оЪ t usa и _ н .jindu ; lata на процесс заражения ими парамеций.

Для того, чтобы изучить процесс заражения парамеций эндонуклеобионтами путем блокирования его различными повреждающими агентами, мы воздействовали экспериментальным путем не только на заражаемых инфузорий, но и на инфекционные Формы бактерий н.obtusa

II H.undulata.

В качестве «акторов, повреждающих жизнедеятельность зндобион-тов, мы выбрали воздействие высокой температурой и УФ-облучением.

Таблица

Влияние УФ-облучёния и тепловой обработки н.obtusa и H.undulata на вероятность попадания их в "свое" ядро.

Воздействие Длительность Доля инфузорий, в Доля инфузорий, в

на бактерий воздействия, которых наблюдали которых наблюдали

мин Н.obtusa в Ма, '/., H.undulata в Ми, 7.,

;ís- ' ' гос-

контроль

95^2 (628Í

92-2 (169)

Нагревание 5 100 (25) 23-5 (38)

при 60°С 10 100 (30) 0а (25)

15 100 (24)

То же при 5 61^10а (22)

80°С 10 0б (27) . ' -

УФ-облучение 5 10-5а (32) 100в С34)

10 0В (35) 9^5В (34)

15 - 0a. (45)

В скобках - число просмотренных парамеций. а В некоторых инфузориях бактерии оказывались неспособными проникать в "свое" ядро, но Могли выходить из пищеварительных вакуолей в цитоплазму парамеций.

6 Во всех парамециях бактерии, подвергавшиеся повреждающему воздействию, были неспособны выходить из пищеварительных вакуолей в цитоплазму инфузорий.

в во всех инфузориях все проникшие в Ми H.undulata лизирова-лись внутри ядер в течение 3-4 ч

В табл. 4 представлены результаты опытов по заражению парамеций эндобионтами н.obtusa и H.undulata, подвергавшимися воздействию высокой температурой и УФ-облучению. Полученные результаты позволяют прийти к следующим выводам: а) чувствительность н.obtusa

и H.undulata к использованным повреждающим воздействиям оказалась различной: инфекционность н.obtusa в результате УФ-облучения уменьшалась сильнее, чем в результате теплового воздействия, H.undulata, напротив, оказалась более чувствительна к действию высокой температуры; б) в зависимости от дозы повреждающего воздействия "процесс заражения парамеций эндобионтами блокировался на разных стадиях: на стадии выхода активированных форм 36 из пищеварительных вакуолей инфузорий, на стадии проникновения бактерий в ядро и на стадии фрагментации (множественного деления?) бактерий в ядре.

Изучение природы явления резистентности___некоторых к лонов

P.caudatum к заражению H.undulata.

Предварительные наблюдения, сделанные нами, показали, что парамеции, относящиеся к клонам Р-1, Р-Н, Р-3 в отличие от особей клона МАП-ЗБ не заражаются H.undulata. Для того чтобы выяснить, . чем обусловлено подобное явление, с резистентными и восприимчивыми к заражению H.undulata парамециями был выполнен ряд экспериментов.

В серим опытов парамеций резистентных и восприимчивых к заражению клонов обрабатывали гомогенатом, содержащим различное количество инфекционных форм H.undulata. Как показали результаты наблюдений, в парамециях клонов Р-1 и Р-Н инфекционные формы H.undulata попадают в пищеварительные вакуоли и выходят в цитоплазму так же, как и в особях восприимчивого к инфекции клона МАП-ЗБ. Однако вероятность проникновения Эб в Ми парамеций резистентных и восприимчивых к заражению клонов оказалась существенно различной (табл. 5). В резистентных парамециях активированные Формы H.undulata попадали в Ми значительно реже, чем в восприимчивых к заражению. Вместе с тем, при существенном увеличении концентрации инфекционных форм бактерий в гомогенате, используемом для заражения парамеций, вероятность проникновения Эй в Ми резистентных инфузорий возрастала."

Через 1-2 сут после добавления в культуры парамеций инфекционных форм H.undulata, независимо от концентрации бактерий в гомогенате, использованном для заражения, в резистентных парамециях Эб в Ми всегда отсутствовали, тогда как в восприимчивых инфузориях происходило дальнейшее развитие бактерий (табл. 5).

Таблица 5.

Заражение парамеций восприимчивого (МАП-ЗБ) и резистентных (Р-1, Р-2) к н.ипаигаъа клонов при различной концентрации инфекционных форм бактерий в гомогенате.

Клон Число инфекционных форм' Доля инфузорий, в Ми которых 36 в 1мл гомогената были Обнаружены Э(), '/., Х-в-

З-4-ч после 1-2 сут после начала опыта начала опыта

МАП- ЗБ 1х105-3х105 91^2 (147) 92-4 (38)

Р-1 1х105-3х105 12-4 (51) 0 (48)

8Х105-2Х106 80±г (35) 0 (30)

Р-2 1х105-3х105 14-3 (139) 0 (60)

8Х105-2ХЮ6 80-6 (40) 0 (31)

В скобках - ч>1сло просмотренных парамеций.

В результате светооптических и электронно-микроскопических исследований было установлено, что в Ми резистентных к инфекции парамеций в течение 3-4 ч после проникновения в ядро активированных H.undulata происходил их лизис.

Следовательно, нарушение процесса заражения парамеций, резистентных к инфекции H.undulata, может происходить на двух его стадиях: на стадии проникновения активированных форм эндобионтов в Ми и на стадии дальнейшего развития, бактерий в ядре, При этом на первой из этих стадий уменьшается лишь вероятность заражения, но оно не прекращается полностью;

Явление внутриядерного лизиса бактерий обнаружено также при исследовании Holospora acuminata - эндобионтов P.bursaria (Скобло и др., 1990). Морфологическое исследование э.того процесса, проведенное нами на светооптическом и электронно-микроскопическом уровне, показало принципиальное сходство.внутриядерного лизиса бактерий в этих двух симбионто-хозяинных системах. И в том и в другом случае поверхностная оболочка активированный ,Форм бактерий, оказавшихся в Ми резистентных инфузорий, в нескольких местах образовывала глубокие инвагинации. Затем в районах инвагинаций мембраны разрывались, свободные концы их при этом спирально закручивались.

Обнаружив и описав на светоптическом и электронно-

микроскопическом уровне явление внутриядерного лизиса н.шкьиаъа, мы предприняли попытку выяснить, какова причина лизиса н.ипаи1аЬа в Ми резистентных парамеций. Мы предположили, что лизис Эб в этом случае обусловлен какими-то мор#о-«изиологическими особенностями тех Ми, в которых он происходит.

Для проверки этого предположения была проведена серия опытов по пересадке Ми между резистентными и восприимчивыми к заражению н.undulata парамециями. Было выполнено 3 варианта опытов. В 1-м варианте Ми парамеций клона МАП-ЗБ,- восприимчивого к им«екции, .пересаживали в парамеций того же клона. Во 2-м варианте Ми ?лг.то1, восприимчивых к инйекции, пересаживали в резистентных пч>а""И' 1 клона Р-3. В 3-м варианте №1 резистентных парамеций кл Р-3 пересаживали в восприимчивых к заражению парамеций. Речупьгвгы экспериментов представлены в табл. 6.

Таблица 6

Заражение н.undulata парамеций, содержащих собственный и пересаженный Ми

Вариант Число. Число клеток, в ко- Число клеток Число клеток, трансплан- проопе- торых через 3-4 ч оставшихся в в которых был тации Миа рирован- после начала опыта живых через отмечен лизис ных кле- Эб были обнаружены 1-2сут после Эб в обоих Ми .ток в обоих Ми начала опыта через 1-2 сут

в в 13 12° 7 0

в р 15 10 15 14

р — в 11 " Э 7 0

В - восприимчивые к заражению парамеции; Р

резистентные

парамеции. ■ ■ .

® при повторном просмотре через 24 ч после начала опыта Эб были обнаружены в обоих ядрах всех 13 клеток.

а

- Результаты эксперимента по пересадке Ми между клетками одного и того же клона, вйсприимчивого к заражению Н.шк1и1аьа, показали, что Эб могли проникать как в собственный, так и в трансплантированный № (см. табл. 6). Таким образом, операция не вызывала тако-

го повреждения пересаживаемого Ми и клетки-реципиента, которое делало бы невозможным заражение инфузории н.ипаи1а1а. Результаты следующих двух вариантов опыта показали, что Ми резистентной парамеции, перенесенное .в восприимчивую к н.undulata клетку, заражалось точно так же, как и собственый Ми этой клетки. И наоборот, в Ми восприимчивой.к заражению особи, пересаженном в резистентную парамецию, происходил лизис активированных Форм н.undulata.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что Ми парамеций, резистентных к заражению н.ипаи1а(а, сами по себе не обладают какими-либо свойствами, обеспечваюаими разрушение попавших в них 36.

ВЫВОДЫ

В результате экспериментального анализа заражения ' инфузорий p.caudatum бактериями-эндонуклеобионтами н.obtusa и H.undulata было выяснено следующее:

1. Инфекционные Формы обоих изученных нами видов 36, попавшие в пищеварительные вакуоли парамеций, трансформируются в активированные Формы постепенно, а не скачкообразно. Этот процесс, начинающийся в Фагосоме, не заканчивается там, а продолжается в цитоплазме клетки-хозяина. . (

2. Перемещение активированных Форм н. obtusa и H.undulata по цитоплазме к Ма или Ми, соответственно, обусловлено циклозом цитоплазмы парамеций и происходит скорее случайно, чем целенаправлено.

3. После микрургического удаления или УФ-облучения Ма или Ми в прооперированной парамеции может происходить заражение зндобионта-ми н.obtusa или H.undulata оставшегося в клетке неповрежденного ядра. Проникновение Эб может происходить и в УФ-облученное ядро, по крайней мере в течение 1-го часа после операции.

4. Избирательность проникновения Н.obtusa в Ма и H.undulata в Ми не определяется размерами и функциональной активностью соответствующего ядра и, предположительно, обеспечивается индуктор-рецепторным взаимодействием активированной Формы Эб и ядерной оболочки.

5. Процесс заражения парамеций эндонуклеобионтами н.obtusa и H.undulata, подвергавшимися повреждающему воздействию УФ пучей и высокой температуры, может быть заблокирован, по. крайней мере, на трех стадиях: на стадии выхода активированных форм Эб из пииевари-

тельных вакуоле« в цитоплазму парамеции, на стадии проникновения в ядро и на стадии фрагментации (множественного деления?) активированных Яорм, проникйих в соответствующее ядро инфузории, в. Естественная резистентность некоторых клонов p.caudatum к заражению Н. undulata обусловлена блокированием процесса заражения, как минимум, на одной из двух стадий: на стадии проникновения активированной формы Эб из цитоплазмы в Ми парамеции или на стадии дальнейшего развития бактерии, прониквей в ядро. Если Эб проникают в. Ми резистентных парамеция, то в дальнеппем происходит их лизис в ядрах.

7. Резистентность P.caudatum к заражению н.undulata, обусловленная внутриядерным лизисом Эб в Ми, не зависит от каких-либо морфо-функциональнш особенностей самих Ми таких парамеций.

8. Совокупность полученных- нами данных показывает, что в процессе заражения парамеция Эб н.obtusa и н.undulata выявляется ряд чувствительных звеньев, в которых формирование системы хозяин-симбионт может быть заблокировано в результате различных воздействий на компоненты этой системы. Такими чувствительными звеньями процесса являются: а) трансформация инфекционных Формы Эб в акти вированные в пищеварительных вакуолях инфузории, б) выход активированных Форм Эб из фагосом в цитоплазму клетки-хозяина, в) проникновение бактерий в Ма или Ми парамеции, г) дальнейшее развитие активированных корм Эб, проникших в ядро.

Список, работ, опубликованных автором по материалам диссертации.

1. Сковородкин И. Н. Приспособление для обездвиживания мелких биологических объектов при их светооптическом изучении // Цитоло гия. 1990. Т. 32, N>3. С., 301-302.

2. Фокин С. П., Сковородкин И. Н. Holospora obtusa - эндо-нуклеобионт инфузории Pararaeciun caudatum в поисках макронуклеуса // Цитология. 1991. Т. 33. N»3. С. Ю1-И5.

3. Фокин С. И., Сковородкин И. Н. Holospora undulata - эндо-нуклеобионт инфузории Pararaeciun caudatum в поисках микронуклеуса // Цитология. 1991. Т. 33. N1 5. С. 64-75.

4. Сковородкин И. Н., Фокин С. И. Резистентность некоторых клонов инфузорий Paramecium caudatum к заражении бактериями Holospora undulata // Цитология. 1991. Т. 33. JP 6. С, 98-103.

5. Сковородкин И. Н., Фокин С. И. Внутриядерный лизис бактерий, инфицирующих Мйкронуклеус инфузории Paramecium caudatum // Цитология. 1992. Т. 34. If 4. С. 142. ' .