Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальная оценка функциональной пригодности и безопасности радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальная оценка функциональной пригодности и безопасности радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота"

ВОЛОЗНЕВ Лев Васильевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПРИГОДНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА шКе-ЗОЛЕДРОНОВАЯ КИСЛОТА

03.01.01 — Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ОКТ 1№

Москва 2013

005534820

Работа выполнена на кафедре радиобиологии и биофизики имени академика РЛСХН, профессора А.Д. Белова в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель:

Лысенко Николай Петрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой радиобиологии и биофизики имени академика РАСХН, профессора А.Д. Белова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ

Официальные оппоненты:

Тихонов Игорь Владимирович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биотехнологии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ

Осипов Андреян Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией радиационной биофизики ФГБУ ГНЦ ФМБЦ имени А.И. Бурназяна ФМБА России

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Медицинский радиологический научный центр» Министерства

здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «30» октября 2013 года в 14.30 на заседании диссертационного совета Д.220.042.04 при ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел.: 8 (495) 377-93-98).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. .

Автореферат разослан ¿¿с » сентября 2013 года и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.iW.

Ученый секретарь диссертационного совета

Фомина В.Д.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Одним из серьезных осложнений онкологических заболеваний различной локализации, несмотря на современную противоопухолевую терапию, является развитие костных метастазов. Метастатическое поражение скелета сопровождается ремоделированием пораженных участков кости вследствие стимуляции опухолевой клеткой костного обмена. Патологическое изменение в пораженных участках приводит к стойкому болевому синдрому, нарастающему по мере прогрессирования процесса; патологическому перелому и, как следствие, инвалидизации. Одним из перспективных методов паллиативной терапии при метастатическом поражении скелета является радионуклидная терапия (РНТ). Преимущества паллиативной терапии костных метастазов радиофармацевтическими препаратами (РФП) сегодня общеизвестны и не вызывают сомнения — это стойкое и длительное подавление болевого синдрома (до 6 месяцев и более), снижение потребления анальгетиков (или их полная отмена), улучшение качества жизни пациентов (Рыжков А.Д. и др., 2008; Крылов В.В. и др., 2005, 2006, 2007; Цыб А.Ф и др., 2006). Главное преимущество радионуклидной терапии заключается в том, что это системное лечение в равной мере воздействует как на манифестирующие, так и на субклинические метастатические очаги. Бисфосфонаты (в том числе золедроновая кислота) как таргетные носители для Р-эмиттеров обладают оптимальными характеристиками для доставки изотопа в патологический очаг, так как известна их высокоселективная тропность к костной ткани. Радионуклид |88Яе по своим ядерно-физическим характеристикам соответствует требованиям, предъявляемым к радионуклиду терапевтического назначения — высокая энергия излучения Е„иХ = 2,120 МэВ, короткий период полураспада (Т1/2 = 17,0 часов), способность образовывать комплексы с бисфосфонатами, которые избирательно накапливаются в очагах ремоделирования кости. Все эти факторы делают комплекс золедроновой кислоты и рения-188 перспективным для терапии метастатического поражения скелета. По сравнению с традиционно использующимися радиофармацевтическими препаратами, такими как |538ш-

EDTMP, 89SrCl2, свойства 18811е-золедроновой кислоты позволяют избежать излишней миелотоксичности и получить высокие поглощенные дозы непосредственно в метастатических очагах. При этом возможно использовать высокую терапевтическую активность, что предполагает более раннее наступление паллиативного эффекта (Liepe К., 2007; Silberstein Е.В., 2003; Lin W.Y., 1997). Необходимость проведения экспериментов по оценке безопасности и функциональной пригодности радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота обусловлена отсутствием исследований в мировой литературе, посвященных РФП на основе 188Re. Анализ состояния проблемы эффективности радионуклидной терапии в комплексном лечении метастатического поражения костной системы при злокачественных новообразованиях различной локализации подтверждает необходимость внедрения новых радиофармпрепаратов, обладающих высокой специфичностью -накопления в патологическом очаге.

Цель и задачи исследований. Цель настоящего исследования заключается в экспериментальной оценке функциональной пригодности и безопасности радиофармацевтического препарата 188Ле-золедроновая кислота.

Исходя из поставленной цели, необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить распределение радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота в организме крыс с моделью костной патологии.

2. Определить лучевые нагрузки и поглощенные дозы на органы и ткани при эквивалентном перерасчете на человека; определить соотношение «польза-риск» для применения в клинической практике.

3. Изучить безопасность препарата 188Ке-золедроновая кислота и компонентов для приготовления радиофармацевтического препарата 18811е-золедроновая кислота на экспериментальных животных.

4. Изучить аллергезирующие и иммунологические свойства лиофилизата для приготовления радиофармацевтического препарата 18811е-золедроновая кислота.

Научная новизна. Впервые определены поглощенные дозы 188Яе-золедроновой кислоты на органы и ткани у экспериментальных животных при эквивалентном пересчете на человека. Расчетные данные о лучевых нагрузках |8811е-золедроновой кислоты предполагают достижение высокой поглощенной дозы в патологическом очаге при низких лучевых нагрузках на интактные ткани. Впервые определен коэффициент соотношения «польза—риск» радиофармацевтического препарата для паллиативной терапии скелета для применения в практике. Исследован характер биораспределения, а также получены данные эффективного периода полувыведения 188Яе-золедроновой кислоты; показано специфическое накопление препарата в очагах ремоделирования кости на экспериментальной модели костной патологии. Впервые для оценки безопасности применения радиофармацевтического препарата |8811е-золедроновая кислота изучены радиотоксические свойства и токсичность его компонентов в виде раствора лиофилизата для приготовления РФП на экспериментальных животных. На основании результатов гематологических, биохимических, морфологических и гистологических исследований радиофармацевтический препарат 188Яе-золедроновая кислота охарактеризован как безопасный в терапевтической дозировке/активности, что позволяет рекомендовать препарат для проведения клинических исследований.

Теоретическая и практическая значимость исследований. Показана возможность применения радиофармацевтического препарата 18811е-золедроновая кислота для паллиативной терапии метастатического поражения скелета. Теоретически обосновано и экспериментально доказано остеотропное распределение препарата 18811е-золедроновая кислота в организме крыс, безопасность его применения. Результаты исследований 188Ке-золедроновой кислоты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, при производстве и проведении клинических исследований в фармацевтическом предприятии ЗАО «Фарм-Синтез» (г. Москва, Россия).

Положения, выносимые на защиту

1. Радиофармацевтический препарат 18811е-золедроновая кислота обладает выраженной остеотропностью, высокой скоростью выведения из организма и специфическим накоплением в очаге ремоделирования кости,

2. Лучевые нагрузки на органы и ткани не превышают предельно допустимых значений. Расчетные данные поглощенной дозы в экспериментальном патологическом очаге (7,8±5,3 мГр/МБк) предполагают достижение паллиативного эффекта при проведении радионуклидной терапии.

3. |8811е-золедроновая кислота с активностью 45,0 МБк/кг при внутривенном введении крысам оказывает относительную миелосупрессию обратимого характера.

4. Компоненты радиофармацевтического препарата в виде раствора лиофилизата при однократном введении до 6 мг/кг и многократном введении до 0,6 мг/кг по основному веществу (золедроновой кислоте) не вызывают токсических изменений в организме крыс.

5. Компоненты радиофармацевтического препарата в виде раствора лиофилизата стимулируют неспецифический иммунный ответ организма мышей за счет повышения фагоцитарной активности макрофагов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании секции радиобиологии отделения ветеринарной медицины РАСХН (г. Москва, 2012 г.); основные положения диссертации были представлены и обсуждены на следующих научных форумах: 7-я Международная конференция по радиофармацевтической терапии (г. Леви, Финляндия, 2012 г.), Международная научно-практическая конференция «Рений. Научные исследования, технологические разработки, промышленное применение» (г. Москва, 2013 г.).

Личный вклад автора. Разработка методов и экспериментальные исследования, представленные в диссертации, проводились либо лично автором, либо при непосредственном участии автора. Изучение биораспределения радиофармацевтического препарата было осуществлено совместно с канд. биол.

наук Клементьевой O.E., под руководством докт. мед. наук, профессора Корсунского В.Н.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, все в журналах, рекомендованных ВАК и 2 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 179 источников, из них 119 зарубежных авторов.

Материалы и методы собственных исследований. Работа выполнена на кафедре радиобиологии и биофизики имени академика РАСХН, профессора А.Д. Белова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ при сотрудничестве с лабораторией по доклиническому и клиническому исследованию радиофармацевтических препаратов ФГБУ ГНЦ ФМБЦ имени А.И. Бурназяна ФМБА России. Экспериментальные исследования были проведены с соблюдением общепринятых принципов, международных нормативных документов и инструкций МЗ РФ и РАМН по работе с лабораторными животными. Эксперименты проводились на 139 беспородных крысах, самцах и самках, массой 180-270 г, 30 морских свинках массой 250-300 г, 50 нелинейных мышах весом 2025 г, 30 мышах-гибридах (CBAXC57BL/6)Fi массой 20-25 г. Животных содержали при температуре 20-22°С, влажности не более 50%, в стандартных железных клетках с мелкой древесной стружкой. Содержание и кормление осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных».

В экспериментах на животных для оценки функциональной пригодности и радиотоксических свойств РФП 18811е-золедроновая кислота был использован в виде раствора для внутривенного введения с объемной активностью 35-200 МБ к/мл.

Таблица 1. Состав лиофилизата для приготовления радиофармацевтического препарата 18811е-золедроновая кислота

Активное вещество

Золедроновая кислота, таргетный носитель для изотопа (в пересчете на безводную субстанцию) (ЗАО «Фарм-Синтез», Россия) 4,0 мг

Вспомогательные вещества

Гентизиновая кислота (фирмы «АІсІгісЬ», кат. № 149357) 2,3 мг

Олова (II) хлорид безводный (фирмы «8І£ша»-«АМгісЬ», кат. № 452335) или Олова (II) хлорид двухводный (ГОСТ 36-78, ТУ 2623-032-00205067-2003, фирмы «Мегск» кат. № 1.07815, фирмы «АЫпсЬ» кат. № 208035) в пересчете на олова (II) хлорид 1,5 мг

Натрия перренат (ТУ 6-09-04-246-83, фирмы «АІсігісЬ», кат. № 380989) 0,045 мг

Изучение функциональной пригодности препарата '88Яе-золедроповая кислота проводилось на модели костной патологии ремоделирования кости (костная мозоль) и основывалось на определении динамики распределения |88Ке-золедроновой кислоты; расчете эффективных и биологических периодов полувыведения препарата из органов и тканей крыс. В эксперименте было использовано 15 крыс массой 180-230 г. Всем животным препарат 18811е-золедроновая кислота вводился в хвостовую вену с активностью 45 МБк/кг (золедроновая кислота 0,3 мг/кг, согласно эквивалентному перерасчету с человека на крысу). Через 1, 3, 5, 24 и 48 часов проводилась эвтаназия животных, после чего в органах и тканях определялось содержание РФП методом прямой радиометрии. Полученные результаты рассчитывали в процентах от введенного количества на орган и на 1 грамм ткани. Костная патология имитировалась переломом большеберцовой кости, манипуляции с животными проводились под хлоралгидратным наркозом (400 мг/кг, в/б). В течение последующих 14 дней после создания закрытого перелома формировалась костная мозоль, которая и служила моделью костной патологии.

Исследование радиотоксических свойств 18811е-золедроновой кислоты проводилось в соответствии с «Руководством по экспериментальному

(доклиническому) исследованию новых фармакологических веществ» (М., 2005, с. 729-741) на 30 самках беспородных крыс массой 190-210 г. Крысам экспериментальной группы в хвостовую вену ежедневно один раз в день в течение 3 суток вводился исследуемый препарат с активностью 15 МБк/кг/сут. (золедроновая кислота 0,3 мг/кг, согласно эквивалентному перерасчету с человека на крысу). Срок наблюдения 30 суток. Суммарная активность 45 МБк/кг была выбрана на основании клинических исследований безопасности 188Re-этидроновой кислоты (Palmedo Н. et al., 2000; Liepe К. et al., 2003), как приемлемая по соотношению «риск—польза».

Радиотоксичность оценивалась по общему состоянию, клиническому и биохимическому анализам крови в динамике до опыта, на 5, 10, 15, 20 и 30 сутки после введения препарата; патологоанатомическому исследованию с макро- и микроскопической оценкой состояния внутренних органов.

В экспериментах на животных для оценки токсических, аллергологических и иммунотоксических свойств компонентов РФП использовался 0,9% NaCl раствор лиофилизата.

Исследование токсичности лиофилизата для приготовления 188Re-золедроновой кислоты проводилось на 64 беспородных крысах-самцах массой 180-270 г при однократном и многократном внутрибрюшинном способе введения в различных дозировках и однократном внутривенном способе введения на 20 нелинейных мышах массой 20-25 г. Для изучения токсичности при однократном введении животные были распределены на группу контроля и экспериментальные группы с увеличением вводимой дозировки по основному веществу (золедроновая кислота): 3,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 9,0 мг/кг, 12,0 мг/кг и 15,0 мг/кг, по 4 крысы в каждой группе. Срок наблюдения составлял 14 суток. Токсичность оценивалась по выживаемости, общему состоянию и патоморфологической оценке внутренних органов. Для изучения токсичности при многократном введении животные были распределены на группу контроля и следующие экспериментальные группы (по 10 крыс в каждой группе): вводимая дозировка по основному веществу составляла 0,3 мг/кг, 0,6 мг/кг и 3,0 мг/кг. Препарат вводился

ежедневно в течение 5 суток. Срок наблюдения составлял 21 день. Токсичность оценивалась по выживаемости, общему состоянию, клиническому и биохимическому анализам крови, патологоанатомическому исследованию с макро- и микроскопической оценкой состояния внутренних органов до начала исследования и на 7 и 21-е сутки. Для изучения токсичности животные были распределены по группам: контрольная и экспериментальная (5,4 мг/кг по основному веществу является максимально вводимой дозировкой для мышей, ограниченная объемом вводимого раствора). Срок наблюдения составлял 14 суток. Токсичность оценивалась по выживаемости, общему состоянию и патоморфологической оценке внутренних органов.

Для клинического анализа кровь отбиралась в специальные пробирки «Юнивет» с антикоагулянтом ЭДТА. Анализы проводились на гематологическом анализаторе «Медоник» для ветеринарии (Швеция). Для биохимических анализов кровь отбиралась в специальные пробирки с гранулами для отделения сыворотки. Биохимические анализы проводились унифицированными методами на биохимических фотометрах «Стат факс 1904+» и «Стат факс 4500+» (США) с использованием стандартных наборов реагентов UTS фирмы «Юнимед». Морфометрическая оценка параметров органов животных осуществлялась с помощью весов «Vibra» (Shinko Denshi Co. Ltd, Япония). Для гистологических исследований органы и ткани фиксировали в забуферном 10%-ном растворе нейтрального формалина, дегитратировали в спиртовых растворах с возрастающей концентрацией и заливали в парафин по общепринятой методике, окраска гематоксилин-эозином. Аллергологические свойства оценивались при изучении активной кожной анафилаксии на морских свинках весом 250-300 г, реакции гиперчувствительности замедленного типа на 30 нелинейных мышах и исследовании реакции непрямой дегрануляции тучных клеток на 30 беспородных крысах-самцах в дозировке 0,3 мг/кг и 3,0 мг/кг по основному веществу (золедроновая кислота). Все реакции были выполнены по стандартным методикам в соответствии с «Методическими рекомендациями оценки аллергезирующих свойств фармакологических средств №98/300», одобренными

Фармакологическим государственным комитетом Минздрава России (протокол № 3 от 15 апреля 1999 г.). Иммунологические свойства оценивались при изучении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов на 30 мышах-гибридах (СВАХС57ВЬ/6)р! массой 20-25 г в дозировке 0,3 мг/кг и 3,0 мг/кг по основному веществу (золедроновая кислота) по общепринятой методике.

Лучевые нагрузки на органы и ткани были рассчитаны из данных распределения 188Яе-золедроновой кислоты в органах и тканях крыс с применением программы OLINDA/EXM версия 1.0 (Vanderbilt University, США), одобренной Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (Food and Drug Administration, FDA, USA) и Международным агентством по атомной энергии (International Atomic Energy Agency, IAEA). Лучевые нагрузки рассчитывали по методу, разработанному Stabin M.J. et al. (Stabin M.J., 2003, 2005) при эквивалентном перерасчете экспериментальных кинетических данных с животных на человека методом Kirschner А. et al. (Kirschner А. et al., 1975) по формуле:

D = N-DFt (1)

где D — лучевая нагрузка (удельная поглощенная доза) целевого органа или ткани, мЗв/МБк; N — число ядерных превращений в органе, наблюдавшееся в исходной области S, с; DF— конверсионный фактор дозы, мЗв/МБк-с, равный:

TV

DF = -i--(2)

т

где л, — количество излучений с энергией Et (МэВ), испускаемых за один ядерный переход в органе i с поглощенной фракцией (р,\ т — масса органа.

Все полученные данные были обработаны методами математической статистики с применением пакетов прикладных программ "OriginLab Pro 7.5" и "Microsoft Excel". Для каждого количественного признака определяли показатели среднего арифметического (М) ± стандартное отклонение. Достоверность полученных различий сопоставляемых величин оценивали с использованием t-

критерия Стьюдеита. Различия считались достоверными при уровне значимости, равном 5% (р=0,05), либо менее 5% (р<0,05).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Оценка функциональной пригодности 188Ке-золедроновой кислоты

Как показали результаты распределения препарата в организме крыс с моделью костной патологии, препарат обладает ярко выраженной остеотропностью и высокой скоростью выведения (таблица 2).

Таблица 2. Распределение препарата 18811е-золедроновая кислота в органах и тканях крыс-самок с моделью костной патологии после внутривенного введения (% от введенной активности на 1 грамм ткани)

Органы/ткани 1 ч Зч 5ч 24 ч 48 ч

Кровь, 1 мл 0,50 ± 0,03 0,20 ± 0,05 0,10 ±0,02 ** **

Желудок 0,30 ± 0,07 0,40 ± 0,04 0,40 ± 0,04 0,03 ±0,01 Не*

Печень 0,20 ± 0,02 0,10 ±0,05 0,09 ±0,01 0,02 ±0,01 Не*

Почки 2,4 ± 0,7 2,3 ± 0,8 2,4 ± 0,2 1,00 ±0,02 0,70 ± 0,02

Мышца 0,06 ±0,01 0,02 ±0,01 0,03 ±0,01 ** **

Скелет 25.70 ±2,43* 29,5±2,7* 31,8±5,4* 22,7±1,4* 20,10±0,81*

Мочевой пузырь (наполненный) 38,7 ±3,4* 51,4 ±5,8* - - -

* — (% от введенной активности на орган), * * — фоновое значение

Уже через 1 час после введения 18811е-золедроновой кислоты в скелете накапливается 25,7% от введенной активности. На протяжении последующих 4 часов содержание препарата в костной ткани остается достаточно высоким, составляя 29,5%, и к пятому часу достигает максимума — 31,8%. Через 24 часа наблюдения содержание препарата в костной ткани начинает незначительно снижаться и к 48 часу составляет 20,1%. Препарат быстро выводится из крови. Через 1 час после введения его концентрация не превышает 0,5 %/мл, через 5 часов — 0,1 %/мл, а через 24 часа после введения эта величина может считаться следовой. Экскреция 18811е-золедроновой кислоты происходит через мочевыделительную систему и отличается высокой скоростью выведения

(рисунок 2). Через 1 час после внутривенного введения в среднем 38,7% препарата выводится из организма с мочой, к третьему часу выводится до 51,4% от введенной активности. Из организма в целом за 3 часа введения экскретируется до 60,4% от введенной активности.

Накопление препарата в области костной патологии в среднем в 3,0 раза превышает уровень накопления в здоровой костной ткани (рисунок 1). Значения коэффициентов дифференциального накопления интактная кость/костная патология 2,5-3,6, говорят о специфическом накоплении комплекса 188Яе-золедроновая кислота в очагах ремоделирования кости и дают основание предполагать накопление в метастатических очагах скелета. Эффективный период полувыведения из организма в целом составляет (Тэф.) 7,86 ч. При определении Тэф для интактной кости и кости с переломом были получены сравнимые значения — 13,87 ч и 13,40 соответственно. Однако следует принять во внимание, что при сравнимом периоде эффективного полувыведения уровень накопления препарата в костной мозоли в 2,5-3,6 раза больше, чем в интактной костной ткани, что предполагает большую поглощенную дозу на моделируемый метастатический очаг.

Рисунок 1. Динамика накопления 18811е-золедроновой кислоты в очаге ремоделирования кости и интактной области

Рисунок 2. Функция выведения |8811е-золедроновой кислоты из организма крыс

Время, час

— — Интактная большеберцовая кость

Большеберцовая кость с переломом

Время, час

2.2. Исследование радиотоксических свойств 18811е-золедроновой кислоты с эквивалентной терапевтической активностью на крысах

На протяжении наблюдения в течение 30 суток после введения РФП гибели животных не зафиксировано. Разницы в поведении и состоянии животных экспериментальной группы в сравнении с животными контрольной группы не отмечено. Введение препарата 18811е-золедроновая кислота животным не привело к достоверному изменению показателей уровня гемоглобина, числа эритроцитов, тромбоцитов (таблица 3).

Содержание лейкоцитов и ретикулоцитов в крови животных в экспериментальной группе на 5—10-е сутки после окончания введения препарата (рисунки 3, 4) было достоверно ниже (р<0,05), чем у животных контрольной группы. В те же сроки отмечен достоверный (р<0,05) сдвиг влево в нейтрофильном профиле у животных опытной группы относительно контрольных. Все отмеченные выше изменения носили обратимый характер и к 30 суткам нивелировались.

Статистически достоверных различий в активности щелочной фосфатазы, ACT, AJIT, содержании альбумина, глюкозы, мочевины, общего белка, креатинина, калия, кальция по указанным показателям между группами не выявлено.

Таблица 3. Гематологические показатели крыс контрольной и экспериментальной групп

Показатель Срок после введения

До опыта 5 сут. 10 сут. 20 сут. 30 сут.

Гемоглобин, г/л контроль 125,0 ± 16,7 118,5 ± 15.0 124,2 ± 18,1 123,1 ± 16,4 119,5 ± 11,9

опыт 120.0 ± 22,4 115,3 ± 15.5 114,2 ±21,6 123,7 ± 12,4 117,5 ±5,7

Эритроциты, 10|2/л контроль 8,6 ± 0,6 7,5 ± 0.8 8,3 ± 2.9 8,0 ± 2,4 7,8 ± 0,8

опыт 8,0 ± 1,5 6,5 ± 1,2 7,3 ± 0,5 7,8 ± 0,6 8,1 ± 1,9

Ретикулоциты, %0 контроль 24,5 ± 4,6 23,2 ±3,6* 24,7 ±2,7* 23,9 ± 1,5 22,5 ± 1,9

опыт 23,3 ±3,6 13,1 ±2,2* 18,7 ±2,5* 23,9 ± 3,9 20,7 ± 5,5

Тромбоциты, 109/л контроль 355,3 ± 72,8 341,5 ±61,2 348,1 ±28,7 334,8 ±37,5 328,3 ±50,1

опыт 355,3 ± 72,8 271,5 ±79,2 307,8 ± 47,7 347,8 ±30,9 334,5 ± 33,0

Лейкоциты, 109/л контроль 12,0 ± 1,2 11,6 ± 1,9* 12,2 ± 1,0 12,4 ±1,9 11,3 ± 1,2

опыт 11,5 ± 3,1 8,2 ± 0,8* 10,6 ±4,4 11,2 ± 1,3 10,6 ± 1,9

* — различие в сравнении с контролем значимо по t-критерию Стьюдента (р<0,05)

Рисунок 3. Динамика изменения уровня лейкоцитов

экспериментальной и контрольной

Рисунок 4. Динамика изменения уровня ретикулоцитов

экспериментальной и контрольной

групп

5 15

О 10 20 30

— — — - Лейкоциты (контроль) Сутки Лейкоциты (опыт)

групп

130

10

0 10 20 30

— — — - Ретакулоциты (контроль) Сутки Ретикулоциты (опыт)

На гистологических срезах печени на 15 сутки было отмечено расширение сосудов, стаз крови и выраженная пролиферация клеток ретикулогистиоцитарной системы. В красном костном мозге на 5 сутки была отмечена высокая клеточность миелоидной ткани и большое содержание сегментоядерных нейтрофилов и форменных эритроцитов. На 15 сутки сохранилось высокое содержание форменных эритроцитов, при этом сегментоядерные нейтрофилы образовали очаговые скопления. К 30 суткам гистологическая картина экспериментальных образцов не отличалась от интактного контроля. Гистологические исследования костного мозга, почек и селезенки значимых изменений не показали.

2.3. Исследование токсичности компонентов для приготовления ш11е-золедроновой кислоты на крысах

Однократное внутривенное введение раствора лиофилизата (5,4 мг/кг по основному веществу) мышам не вызвало отрицательного воздействия на поведение, физиологическое состояние и внешний вид животных.

При однократном введении раствор лиофилизата в дозировке 15,0 мг/кг крысам вызывал гибель 50% животных на 7 сутки при в/б введении. При

патоморфологической оценке внутренних органов у экспериментальной группы почки были бледного цвета, рыхлые, на разрезе граница коркового и мозгового слоев практически не видна; печень была дряблая, светлая и имела мускатный рисунок. По данным патоморфологического вскрытия причиной смерти была острая почечная недостаточность. Снижение дозировки до 12,0 мг/кг и 9,0 мг/кг не вызывает гибели животных, но оказывает негативное действие на состояние печени и почек. Дозировки 6,0 мг/кг и 3,0 мг/кг, что эквивалентно двадцати- и десятикратной дозировке для человека, не вызывают токсического действия.

При многократном введении было показано, что в дозировке 0,3 мг/кг/сутки и 0,6 мг/кг/сутки препарат не вызывал клинически значимых изменений внутренних органов и не оказывал выраженного токсического действия на крыс по данным клинико-биохимического исследования животных. По результатам гистологических исследований в группе 0,6 мг/кг на протяжении всего эксперимента в альвеолярных ходах и в межальвеолярном пространстве легких были отмечены форменные элементы крови; сосуды сердца расширены, волокна Пуркинье увеличены, типические мышечные волокна и вставочные пластины разобщены. Селезенка имела уплотненную ткань красной пульпы, заполненной форменными элементами крови, венозные синусы расширены. Также было отмечено большое количество лимфоцитов в мозговом веществе тимуса.

Вводимая животным дозировка 3,0 мг/кг/сутки в течение 5 дней вызывала гибель 50% животных на 6-8 стуки. По данным патоморфологического вскрытия, клинико-биохимического анализа причиной смерти явилась острая почечная недостаточность. При патологоанатомическом вскрытии в брюшной полости находилось небольшое количество прозрачной жидкости. Почки на разрезе имели смазанный рисунок, корковый и мозговой слои плохо дифференцировались. Тимус имел неровные края и кровоизлияния. Морфометрический анализ показал увеличение относительной массы почек и селезенки, уменьшение органо-соматического показателя (ОСП) сердца. Остальные органы идентичны контрольным животным, значимых отличий отмечено не было. У выживших животных на 7 сутки в группе с дозировкой 3,0

мг/кг отмечалась относительная эритроцитопения (7,00±0,44х 1012/л, контроль 8,10±0,23ХЮ /л, р<0,05), незначительное снижение концентрации гемоглобина (130,70±7,54 г/л, контроль - 151,0±3,0 г/л, р<0,05) и уровня гематокрита (34,60±2,32%, контроль - 40,3±1,0%, р<0,05). По данным биохимического анализа сыворотки крови выживших животных отмечалось снижение активности ЛДГ (656,0±302,0 Е/Л, контроль - 1574,5±398,5, р<0,05), увеличение активности АЛТ (29,6±0,2 Е/Л, контроль - 27,00±1,71, р<0,05), ACT (149,7±2,02 Е/Л, контроль - 127,50±6,38 Е/Л, р<0,05), ЩФ (891,7±364,3 Е/Л, контроль -342,9±53,40, р<0,05), содержания мочевины (36,50±7,74 ммоль/л, контроль — 7,4±0,6 ммоль/л, р<0,05) и креатинина (91,6±13,3 ммоль/л, контроль - 75,3±5,8 ммоль/л, р<0,05). В группе с дозировкой 3,0 мг/кг были отмечены изменения со стороны сердца (рыхлая мышечная ткань, сосуды расширены, отслоенная сердечная капсула), селезенки (плотная красная и белая пульпа, насыщенная форменными элементами крови, плотные трабекулы и вены с утолщенными стенками и расширенными венозными синусами) и тимуса (дольки тимуса сжаты, междольковое вещество с большим количеством фибробластоподобных клеток). Наблюдалось токсическое влияние на почки, при этом было отмечено расширение дистального отдела коркового вещества с остатками форменных элементов крови. Полость капсулы Шумлянского расширена с неровными, искривленными листками Мальпигиева тельца. По всей толщине вещества (коркового и мозгового) наблюдалась отечность.

2.4. Исследования аллергизирующнх и иммунологических свойств

Результаты исследования активной кожной анафилаксии оценивались по размеру синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения у контрольной и экспериментальной групп морских свинок; положительной реакция считается при размере пятна выше 6,0 мм, не более 3,0 мм в контроле. Полученные данные в контрольной группе (2,70±0,33 мм <3,0 мм) и двух экспериментальных групп в дозировке 0,3 мг/кг (3,7±0,33 мм) и 3,0 мг/кг (6,30±0,67 мм) свидетельствуют об отсутствии положительной реакции у

морских свинок. Реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах была положительной при дозировке 3,0 мг/кг (разница в толщине обеих лапок мышей этой группы достоверно отличается от контрольной группы — 198±26,9 и 30±10,0 соответственно, р<0,05). При исследовании меньшей дозировки (0,3 мг/кг) статистически достоверной разницы отмечено не было.

При исследовании дегрануляции тучных клеток крыс предварительно сенсибилизировали, и оценивалась реакция на предварительную внутрикожную сенсибилизацию, реакция кожи на аппликационное воздействие и провокационная проба. При изучении предварительной внутрикожной сенсибилизации и реакции кожи на аппликационное воздействие ни у одного животного не возникло патологических изменений. Через двое суток на месте провокационной пробы была выявлена слабая реакция. Процент дегрануляции тучных клеток в контрольной (3,2±0,49%) и экспериментальных группах (0,3 мг/кг - 10,3±1,11%; 3,0 мг/кг - 16,0±1,23%) не превышал 20% (реакция отрицательная).

Исследование иммунологических свойств основывалось на определении оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Результаты фагоцитарной активности макрофагов оценивались в контрольной и в двух экспериментальных группах (0,3 мг/кг и 3,0 мг/кг). Согласно полученным данным, фагоцитарная активность макрофагов имеет статистически достоверное увеличение активности (р<0,05) с возрастанием дозировки в сравнении с контрольной группой (0,52±0,17 усл.ед.), активность при 0,3 мг/кг (2,72±0,16 усл.ед.) и 3,0 мг/кг (3,51±0,06 усл.ед.) больше в 5,2 и 6,7 раза соответственно.

2.5. Оценка лучевых нагрузок

Определение лучевых нагрузок производилось на основании экспериментальных данных, полученных на животных при экстраполяции на стандартизированную реалистическую модель взрослого мужчины (70,0 кг, модель основана на данных медицинских топографических изображений).

Были рассчитаны эквивалент эффективной дозы (Effective Dose Equivalent, EDE) и эффективная доза (Effective Dose, ED). Для 18811е-золедроновой кислоты эквивалент эффективной дозы (EDE) равен 0,093 мЗв/МБк, эффективная доза (ED) составляет 0,154 мЗв/МБк, и при вводимой терапевтической активности 45,0 МБк/кг составит в среднем 0,29 Зв и 0,48 Зв соответственно. Риск возникновения злокачественного новообразования при применении 188Ке-золедроновой кислоты равен 5-10"4-5Ю"3 в течение жизни, а средняя ожидаемая потеря жизни 0,1-1,0 месяца.

Высокие значения поглощенных доз (ПД) регистрируются в скелете (2,89 Гр), почках (1,65 Гр) и мочевом пузыре (4,33 Гр) в связи с остеотропным распределением препарата и его интенсивным выведением через мочевыделительную систему. Несмотря на высокую ПД на мочевой пузырь, значение не превышает толерантной дозы 10 Гр.

Поглощенная доза при введении 18811е-золедроновой кислоты в красном костном мозге (0,23 Гр) оказалась более чем в 10 раз меньше толерантной (2,5 Гр). Сравнивая поглощенные дозы на красный костный мозг известных терапевтических радиофармацевтических препаратов для паллиативной терапии скелета, можно видеть, что 18811е-золедроновая кислота обладает наименьшей нагрузкой в связи с коротким периодом полураспада 188Re и высокой скоростью полувыведения из организма. Таким образом, можно ожидать, что миелотоксичность при терапии 18811е-золедроновой кислотой не должна выходить за рамки установленной ВОЗ допустимой гематологической токсичности.

Для расчета поглощенной дозы на моделируемый патологический очаг был использован метод расчета дозы на сферу, разработанный Stabin M.G. Konijnenberg М. Согласно полученным результатам, наибольшие лучевые нагрузки получат метастатические очаги меньших размеров, что особенно актуально при диссеминированном мелкоочаговом поражении скелета. Если масса метастатических поражений варьирует от 14,0 до 70,0 г (по данным реконструкции КТ и ОФЭКТ; Liepe К., 2003), рассчитанная поглощенная доза

для 18811е-золедроновой кислоты при введении терапевтической активности 45,0 МБк/кг (и массе пациента 70 кг) для диапазона масс метастазов 14,0-70,0 г составляет 10,2-49,9 Гр (25,0±17,0 Гр). Средняя удельная поглощенная доза на патологический очаг (модель метастатического очага) равна 7,8±5,3 мГр/МБк. Значения поглощенных доз 10,2-49,9 Гр предполагают достижение стойкого паллиативного эффекта.

Масса, г

Рисунок 5. Функция поглощенной дозы относительно массы метастаза для 188Яе-золедроновой кислоты.

Для определения пользы от проводимой терапии и возможного риска был введен коэффициент, который косвенно прогнозирует показатель «польза—риск» в виде цифрового значения. В этом случае отношение поглощенной дозы на красный костный мозг к формируемой дозе на метастатический очаг определяет степень токсичности препарата к его терапевтическому эффекту:

А'-=ТГ (3)

URU

где КЫг — коэффициент «польза—риск» (benefit/risk), Dmet — средняя поглощенная доза на метастатический очаг, D,a, — средняя поглощенная доза на костный мозг (Red Marrow); КЫг справедливо, если Dmet > 4 Гр.

18811е-золедроновая кислота принимает значение коэффициента «польза-риск» равным 100 в связи с низкой дозовой нагрузкой на красный костный мозг

при высоком значении поглощенной дозы на метастатический очаг. Данная характеристика предполагает безопасное проведение системной радионуклидной терапии при ожидаемом стойком паллиативном эффекте.

ВЫВОДЫ

1 188п

1. Ке-золедроновая кислота имеет выраженное остеотропное распределение, специфическое накопление в области ремоделирования кости и высокую скорость выведения из организма. Значения накопления в очаге ремоделирования кости предполагают туморотропность в очагах метастатического поражения скелета.

2. Радиофармацевтический препарат 18811е-золедроновая кислота при внутривенном введении крысам с активностью 45 МБк/кг (терапевтическая активность) вызывает относительную транзиторную миелосупрессию.

3. Однократное введение раствора лиофилизата (компонентов для приготовления 188Ке-золедроновая кислота) до 6 мг/кг (двадцатикратно превышающая терапевтическая дозировка) и многократное введение до 0,6 мг/кг (двукратно превышающая терапевтическая дозировка) по основному веществу (золедроновой кислоте) не вызывают токсических изменений в организме крыс.

4. Компоненты для приготовления 18811е-золедроновой кислоты не обладают аллергизирующими свойствами и стимулируют неспецифический иммунный ответ организма мышей за счет повышения фагоцитарной активности макрофагов.

5. Лучевые нагрузки на органы и ткани не превышают предельно допустимых значений при проведении радионуклидной терапии, поглощенная доза на костный мозг (0,23 Гр) в 10 раз меньше толерантной дозы (2,5 Гр). Расчетная удельная поглощенная доза в экспериментальном патологическом очаге равна 7,8±5,3 мГр/МБк и предполагает достижение паллиативного эффекта при вводимой активности 45 МБк/кг.

Сведения о практическом использовании научных результатов

Полученные в результате выполненной работы данные о функциональной пригодности и безопасности 18811е-золедроновой кислоты используются при производстве, проведении клинических исследований и регистрации лекарственного радиофармацевтического препарата для паллиативной терапии метастатического поражения скелета. В настоящий момент проводится клиническое исследование (разрешение №238 на проведение клинических исследований от 08.04.2013 г. МЗ РФ), производство радиофармацевтического препарата налажено на фармацевтическом предприятии ЗАО «Фарм-Синтез» (г. Москва, Россия).

Рекомендации по результатам исследования

Исследуемый радиофармацевтический препарат 188Яе-золедроновая кислота в клиническом исследовании рекомендуется использовать в качестве средства паллиативной терапии при диссеминированном метастатическом поражении скелета и болевом синдроме при значении терапевтической активности, равном 45,0 МБк/кг, дозировке золедроновой кислоты 4,0 мг, при обязательном контроле функции кроветворения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. *Волознев JI.B. Механизмы развития метастатического поражения скелета и роль N-бисфосфонатов в терапии // Онкология. Журнал им. П.А.Герцена. — 2013. -№1.- С. 73-77.

2. *Волознев JI.B., Клементьева O.E., Корсунский В.Н., Лысенко Н.П. Экспериментальная оценка функциональной пригодности радиофармацевтического препарата |8811е-золедроновая кислота // Молекулярная медицина. - 2013. - №2. - С. 42-45.

3. *Волознев JI.В., Клементьева O.E., Корсунский В.Н., Лысенко Н.П. Доклиническая оценка токсичности радиофармацевтического препарата l88Re-золедроновая кислота // Ветеринарная медицина. — 2013. — №1-2. — С. 45-47.

4. *Волознев Л.В., Лунев A.C., Клементьева O.E., Корсунский В.Н. Дозиметрия и оценка безопасности радиофармацевтического препарата ,88Re-золедроновая кислота в эксперименте // Медицинская физика. — 2013. — №2. — С. 83-89.

5. *Волознев Л.В., Лунев A.C., Лысенко Н.П. Токсикологическая оценка лиофилизата для приготовления радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота в эксперименте на крысах // Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. - 2013. - №2. - С. 84-88.

6. Klementyeva О., Malysheva A., Kodina G., Korsunsky V., Rabinovich Е., Voloznev L., Krylov V. Preparation and biodistribution of 99mTc and 188Re labelled zoledronic acid // World Journal of Nuclear Medicine. - 2012. -V. 11(3). - P. 177.

7. Волознев Л.В., Клементьева O.E., Лунев A.C., Корсунский В.Н., Лысенко Н.П. Экспериментальная оценка функциональной пригодности и эффективности радиофармацевтического препарата 18^е-золедроновая кислота // Рений. Научные исследования, технологические разработки, промышленное применение: Сб. материалов международной научно-практич. конференции 21-22 марта 2013 г. — М.: ФГУП "Институт" Гинцветмет", 2013.

* публикации в ведущих рецензируемых журналах согласно перечню ВАК.

Подписано в печать 24.09.2013г. Формат А5 Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 9988 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волознев, Лев Васильевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ ИМЕНИ К.И.СКРЯБИНА»

04201362463

ВОЛОЗНЕВ Лев Васильевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПРИГОДНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА 188Ке-ЗОЛЕДРОНОВАЯ КИСЛОТА

03.01.01 - Радиобиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор

Лысенко Н.П.

Москва 2013 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5

1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................10

1.1 Метастатическое поражения скелета....................................................10

1.1.1 Механизмы развития метастатического поражения скелета.............10

1.1.2 Патогенетические основы возникновения «порочного круга» в метастатическом очаге....................................................................................16

1.1.3 Осложнения при метастатическом поражении скелета....................19

1.2 Радиофармацевтические препараты для паллиативной терапии скелета................................................................................................................21

1.2.1 Бисфосфонаты.........................................................................................21

1.2.2 Системная радионуклидная терапия при метастатическом поражении скелета..........................................................................................26

1.2.3 Механизм действия радиофармацевтических препаратов при

системной радионуклидной терапии метастатического поражения скелета

...........................................................................................................................32

1.3 Функциональная пригодность и безопасность радиофармацсвтических препаратов для паллиативной терапии метастазов в скелете........................................................................................37

Выводы по главе...............................................................................................42

2 МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................................43

2.1 Объект исследования.................................................................................43

2.1.1 Получение и основные ядерно-физические характеристики Ка188Яе04..........................................................................................................43

1 яя

2.1.2 Характеристика и синтез комплекса Яе-золедроновая кислота.... 45 2.1.3. Расчет используемой активности и дозировок для исследований... 47

2.2 Экспериментальные животные...............................................................48

2.3 Экспериментальные методы исследования на биологических системах..............................................................................................................49

1 ЯЯ

2.3.1 Изучение функциональной пригодности Яе-золедроновая кислота ...........................................................................................................................49

2.3.2 Изучение безопасности препарата18811е-30ледр0110вая кислота........51

2.3.3 Исследование аллергизирующих свойств...........................................55

2.3.4 Исследование иммунологических свойств..........................................58

2.4 Расчет лучевых нагрузок 188Ке-золедроновой кислоты.....................59

2.5 Методы статистической обработки результатов исследований.......62

3 ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПРИГОДНОСТИ ПРЕПАРАТА188Яе-ЗОЛЕНДРОНОВАЯ КИСЛОТА НА МОДЕЛИ КОСТНОЙ ПАТОЛОГИИ У

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ......................................................64

4 ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ188Re-ЗОЛЕДРОНОВАЯ КИСЛОТА..............................................................................................................73

1 ЙЙ

4.1 Изучение радиотоксичности Re-золедроновая кислота......................73

4.2 Исследование токсических свойств раствора лиофилизата для

188

приготовления Re-золедроновая кислота....................................................79

4.3 Исследования аллергизирующих и иммунологических свойств...........89

5 ЛУЧЕВЫЕ НАГРУЗКИ И ПОГЛОЩЕННЫЕ ДОЗЫ, РАСЧЕТ ПОКАЗА ТЕЛЯ «ПОЛЬЗА-РИСК».....................................................................93

ВЫВОДЫ............................................................................................................108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................110

ПРИЛОЖЕНИЕ №1

Список сокращений

AJIT - аланинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

БМЕ - базовая многоклеточная единица

КДН - коэффициент дифференциального накопления

ККМ - красный костный мозг

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

РДТК - реакция дегрануляции тучных клеток

РНТ - радионуклидная терапия

РФП - радиофармацевтический препарат

РХЧ - радиохимическая чистота

СОП - органо-соматичсский показатель

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

EDTMP - этилендиамин-тетраметиленфосфоновая кислота

EGF - эпидермальный фактор роста

ЕТ-1 -эндотелин-1

FPP - фарнезилпирофосфат

HEDP - гидроксиэтилидендифосфоновая кислота

IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста 1

IL - интерлейкин

OPG - остеопротегерин

PGE - простагландин

РТН - паратиреоидный гормон

РТНгР - паратиреоидный подобный пептид

RANK - фактор транскрипции каппа В

RANKL - рецептор-активатор ядерного фактора каппа В

TGF-p - трансформирующий фактор роста В

%ID - процент от введенной активности

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Одним из серьезных осложнений онкологических заболеваний различной локализации, несмотря на современную противоопухолевую терапию, является развитие костных метастазов. Метастатическое поражение скелета сопровождается ремоделированием пораженных участков кости вследствие стимуляции опухолевой клеткой костного обмена. Патологическое изменение в пораженных участках приводит к стойкому болевому синдрому, нарастающему по мере прогрессирования процесса; патологическому перелому и, как следствие, инвалидизации. Одним из перспективных методов паллиативной терапии при метастатическом поражении скелета является радионуклидная терапия (РНТ). Преимущества паллиативной терапии костных метастазов радиофармацевтическими препаратами (РФП) сегодня общеизвестны и не вызывают сомнения - это стойкое и длительное подавление болевого синдрома (до 6 месяцев и более), снижение потребления анальгетиков (или их полная отмена), улучшение качества жизни пациентов (Рыжков А.Д. и др., 2008; Крылов В.В. и др., 2005, 2006, 2007; Цыб А.Ф и др., 2006). Главное преимущество радионуклидной терапии заключается в том, что это системное лечение в равной мере воздействует как на манифестирующие, так и на субклинические метастатические очаги. Бисфосфонаты (в том числе золедроновая кислота) как таргетныс носители для Р-эмиттеров обладают оптимальными характеристиками для доставки изотопа в патологический очаг, так как известна их высокоселективная

1 SX

тропность к костной ткани. Радионуклид Re по своим ядерно-физическим характеристикам соответствует требованиям, предъявляемым к радионуклиду терапевтического назначения - высокая энергия излучения Ещах = 2,120 МэВ, короткий период полураспада (Т1/2 = 17,0 часов), способность образовывать комплексы с бисфосфонатами, которые избирательно накапливаются в очагах ремоделирования кости. Все эти факторы делают комплекс золедроновой кислоты и рения-188

перспективным для терапии метастатического поражения скелета. По сравнению с традиционно использующимися радиофармацевтическими препаратами, такими как 153Sm-EDTMP, 89SrCl2, свойства 18811е-золедро1ювой кислоты позволяют избежать излишней миелотоксичности и получить высокие поглощенные дозы непосредственно в метастатических очагах. При этом возможно использовать высокую терапевтическую активность, что предполагает более раннее наступление паллиативного эффекта (Liepe К., 2007; Silberstein Е.В., 2003; Lin W.Y., 1997). Необходимость проведения экспериментов по оценке безопасности и функциональной пригодности

1ПО

радиофармацевтического препарата Re-золедроновая кислота обусловлена отсутствием исследований в мировой литературе, посвященных РФП на

1 RR

основе Re. Анализ состояния проблемы эффективности радиопуклидной терапии в комплексном лечении метастатического поражения костной системы при злокачественных новообразованиях различной локализации подтверждает необходимость внедрения новых радиофармпрепаратов, обладающих высокой специфичностью накопления в патологическом очаге.

Цель и задачи исследований. Цель настоящего исследования заключается в экспериментальной оценке функциональной пригодности и

1 RR

безопасности радиофармацевтического препарата Re-золедроновая кислота.

Исходя из поставленной цели, необходимо решить следующие задачи:

I по

1. Изучить распределение радиофармацевтического препарата Re-золедроновая кислота в организме крыс с моделью костной патологии.

2. Определить лучевые нагрузки и поглощенные дозы на органы и ткани при эквивалентном перерасчете на человека; определить соотношение «польза-риск» для применения в клинической практике.

3. Изучить безопасность препарата 18!^е-золедроновая кислота и

1 88

компонентов для приготовления радиофармацевтического препарата Re-золсдроновая кислота на экспериментальных животных.

4. Изучить аллергезирующие и иммунологические свойства лиофилизата для приготовления радиофармацевтического препарата 188Яе-золедроновая кислота.

Научная новизна. Впервые определены поглощенные дозы I88Re-

золедроновой кислоты на органы и ткани у экспериментальных животных

при эквивалентном пересчете на человека. Расчетные данные о лучевых 188

нагрузках Re-золедроновой кислоты предполагают достижение высокой

поглощенной дозы в патологическом очаге при низких лучевых нагрузках на

интактные ткани. Впервые определен коэффициент соотношения «польза-

риск» радиофармацевтического препарата для паллиативной терапии скелета

для применения в практике. Исследован характер биораспределения, а также

получены данные эффективного периода полувыведения 188Яе-золедроновой

кислоты; показано специфическое накопление препарата в очагах

ремоделирования кости на экспериментальной модели костной патологии.

Впервые для оценки безопасности применения радиофармацевтического 1 88

препарата Re-золедроновая кислота изучены радиотоксические свойства и токсичность его компонентов в виде раствора лиофилизата для приготовления РФП на экспериментальных животных. На основании

результатов гематологических, биохимических, морфологических и

188

гистологических исследований радиофармацевтический препарат Re-золедроновая кислота охарактеризован как безопасный в терапевтической дозировке/активности, что позволяет рекомендовать препарат для проведения клинических исследований.

Теоретическая и практическая значимость исследований. Показана возможность применения радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота для паллиативной терапии метастатического поражения скелета. Теоретически обосновано и экспериментально доказано остеотропное распределение препарата 18^е-золедроновая кислота в организме крыс, безопасность его применения. Результаты исследований

188

Ле-золедроновой кислоты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, при производстве и проведении клинических исследований в фармацевтическом предприятии ЗАО «Фарм-Синтез» (г. Москва, Россия).

Положения, выносимые на защиту

1 8Я

1. Радиофармацевтический препарат Ле-золедроновая кислота обладает выраженной остеотропностыо, высокой скоростью выведения из организма и специфическим накоплением в очаге ремоделирования кости.

2. Лучевые нагрузки на органы и ткани не превышают предельно допустимых значений. Расчетные данные поглощенной дозы в экспериментальном патологическом очаге (7,8±5,3 мГр/МБк) предполагают достижение паллиативного эффекта при проведении радионуклидной терапии.

3. 188Ле-золедроновая кислота с активностью 45,0 МБк/кг при внутривенном введении крысам оказывает относительную миелосупрессию обратимого характера.

4. Компоненты радиофармацевтического препарата в виде раствора лиофшшзата при однократном введении до 6 мг/кг и многократном введении до 0,6 мг/кг по основному веществу (золедроновой кислоте) не вызывают токсических изменений в организме крыс.

5. Компоненты радиофармацевтического препарата в виде раствора лиофилизата стимулируют неспецифический иммунный ответ организма мышей за счет повышения фагоцитарной активности макрофагов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании секции радиобиологии отделения ветеринарной медицины РАСХН (г. Москва, 2012 г.); основные положения диссертации были представлены и обсуждены на следующих научных форумах: 7-я Международная конференция по радиофармацевтической терапии (г. Леви, Финляндия, 2012 г.), Международная научно-практическая конференция «Рений. Научные

исследования, технологические разработки, промышленное применение» (г. Москва, 2013 г.).

Личный вклад автора. Разработка методов и экспериментальные исследования, представленные в диссертации, проводились либо лично автором, либо при непосредственном участии автора. Изучение биораспределения радиофармацевтического препарата было осуществлено совместно с канд. биол. наук Клементьевой О.Е., под руководством докт. мед. наук, профессора Корсунского В.Н.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, все в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 179 источников, из них 119 зарубежных авторов.

1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Метастатическое поражения скелета

1.1.1 Механизмы развития метастатического поражения скелета

Метастатические поражения костей относятся к вторичным новообразованиям и в структуре костной патологии встречаются в 35-40 раз чаще, чем первичные опухоли и занимают третье место по частоте после метастазов в легких и печени. При этом частота развития опухолевого процесса варьируется в широких пределах в зависимости от нозологической формы основного заболевания. В 85 % случаев источником метастазов в кости являются злокачественные новообразования молочной железы, легкого и простаты. Так, частота метастазирования при раке молочной железы в кости составляет 65-75%, рака предстательной железы 65-75%, легкого 3040% (таблица 1) (Карпенко В.Ю, 2005; Павленко Н.Н. и др., 2011; 1лркт А., 2004; ZЫ-YQ & а!., 2010).

Таблица 1. Частота метастатического поражения костей в зависимости от морфологии первичной опухоли.

Опухоль Частота метастазирования

Миелома 70-90 %

Почки 20-25 %

Меланома 14-45 %

Щитовидная железа 60%

Легкие 30-40 %

Молочная железа 65-75 %

Предстательная железа 65-75 %

Примерно у 80% больных костные метастазы локализуются в позвоночнике, костях таза, ребрах, грудине и черепе (Моисеенко В.М., 2001; Паша С.П., 2008; Тепляков В.В. и др., 2007). American Joint Committee on Cancer за 2009 год приводит данные частоты метастатического поражения костей с учетом локализации (таблица 2)

Таблица 2. Частота метастатического поражения костей с учетом локализации.

Локализация метастазов Частота поражения (%)

Позвоночный столб 59

Кости таза 49

Ребра 30

Бедренная кость 24

Кости черепа 20

Плечевая кость 13

Другие 3

Числовое различие в частоте метастатического поражения костей в зависимости от локализации может быть объяснено особенностями распределения красного костного мозга в скелете, в котором могут присутствовать специфические рецепторы способствующие «прицельной» инвазии опухолевых клеток. В работе R.E. Coleman было показано, что у взрослого человека до 65 % красного костного мозга локализуется в плоских костях, и этот факт вероятнее всего, по его мнению, и обуславливает высокий процент преимущественного распространения метастазов по оси скелета (Coleman R.E. et al., 1994).

Механизмы, лежащие в основе поражения костной ткани, сложные и являются результатом взаимодействия, как опухоли, так и костной системы. Сегодня понимание этих взаимодействий существенно улучшилось, однако окончательных специфических путей развития метастатического поражения не выявлено.

По мнению исследователя Онкологического института им. П.А.Герцена Карпенко В.Ю. опухолевые клетки метастазируют в костную систему преимущественно гематогенным путем в связи с отсутствием в ней лимфатического дренажа, при этом главным коллектором транспорта опухолевых клеток в кости является венозная система (Карпенко В.Ю., 2005; Nelson J.B., 1995).

В 1940 г C.Batson впервые описал комплексную сеть позвоночных,

эпидуральных и околопозвоночных вен. Это соединение параллелей и коммуникантных путей создает «особую» венозную систему, как один из вариантов транспорта опухолевых клеток в кости. Отсутствие клапанного аппарата позволяет крови перетекать в различных направлениях, что связано с внешним давлением, создаваемым физической активностью. Эти факты частично могут объяснить высокую частоту распределения метастазов вдоль позвоночног