Эколого-биохимические закономерности функционирования активных илов и грунтов водохранилищ

Шаталаев, Иван Федорович

Бесплатный автореферат и диссертация по географии на тему
Эколого-биохимические закономерности функционирования активных илов и грунтов водохранилищ
ВАК РФ 11.00.11, Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биохимические закономерности функционирования активных илов и грунтов водохранилищ"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577, 472 (28)+628.35

ШАТАЛАЕВ Иван Федорович

ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ ИЛОВ И ГРУНТОВ ВОДОХРАНИЛИЩ

11.00.31 - охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-1995

Работа выполнена на кафедре органической, биологической и физколлоидной химии Самарского Государственного медицинского университета, на Самарской городской станции аэрации, на сооружениях биологической очистки сточных вод ПО "Самаранефтеор-гсинтеа".

Научный консультант: действительный член Российской Экологической Академии, Заслуженный деятель науки га, доктор биологических наук.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И.С. Дзержинская доктор технических наук Н.В. Скирдов доктор биологических наук Г.В. Кудрявцева

Ведущее^чреждение: Институт гидробиологии Академии наук

на заседании Специализированного совета N Д.053.05.91 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119889, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"______ 1995 г.

Ученый секретарь совета N Д.053.05.91

профессор М-И. ТЕДГГЧЕНКО

Украины

Защита состоится "

1995 г в

кандидат

Л.И, Степанова

Актуальность темы. Принято считать, что устойчивость гидроэкосистем обеспечивается видовым разнообразием входящих в них сообществ гидробиснтов. особенно, микроорганизмов. Одним из главных призйа-ков стабилизированной экосистемы является наличие максимальной биомассы на единицу проходящей через систему энергии и максимальное количество сшбистических связей /период климакса/'. Однако показано. что именно в этот период развития водных экосистем видовое разнообразие в них уменьшается, отмечается выравненность слагающих его видов и их стратификация. Особенно это характерно для замкнутых гидроэкосистем. Трудно, однако, допустить, что устойчивость экосистема в этом случае зависит только от пространственной ориентации слагающих ее видов - стратификации последних. Многолетние наблюдения за природными и модельными гидрозкосистемами показали, что в результате кратковременного мощного антропогенного воздействия, приводящего к метаболическому шоку, гидроэкосистемы в течение 24-48 ч по многим параметрам достигают исходного функционального состояния и при этом увеличения видового разнообразия не происходит. Несостоятельность представлений об обязательном увеличении разнообразия микроорганизмов в климаксной экосистеме подтверждена экспериментами на орбитальных станциях в гермосистемах.

Все эти данные приводили исследователей к мысли о том. что в период климакса устойчивость экосистем достигается каким-то иным путем, ь частности, увеличением разнообразия эндо- и эквометаболи-тов и. как следствие, структурной организацией ключевых олигомер-ных ферментов метаболизма. Первое предположение уже находит экспериментальное подтверждение. Рядом авторов показано существование прямой зависимости между темпами прироста биомассы водорослей и

концентрацией внеклеточных органических соединений. Телитчен-ко М.М., Остроумов С.А. и др. весьма много внимания уделяли роли экзометаболитов в кизни морских и пресноводных сообществ. Ыаргалеф свидетельствует об увеличении разнообразия растительных пигментов вдоль сукцессионного градиента водной экосистемы. Установлено, что выделяемые гидробионтами токоферолы, способны активно регулировать интенсивность процессов свободнорадикального и ферментативного переокисления растворенных органических веществ - энергетической основы гомеостаза водных экосистем.

Второе же предположение остается совершенно неизученным и открытым. Бесспорно, что взаимодействие многочисленных факторов при формировании гидроэкосистем связано с огромным числом биохимических метаболических реакций, во "многом более сложных и разнообразных, чем внутриклеточный метаболизм. На каком-то этапе дальнейший прогресс биохимической экологии будет лимитирован уровнем знания данного вопроса.

В связи с этим особое значение приобретают исследования, направленные на изучение структурной организации ключевых ферментов метаболизма в гидрозкосистемах и их роль в стабилизации и реанимации последних при техногенных, особенно экстремальных воздействиях. Неизвестны субмолекулярные механизмы, ограничивающие влияние мощного антропогенного пресса на водные экосистемы. До сих пор остается "тайной", какими путями гидроэкосистемы в короткие сроки "выбираются" из глубочайших стрессовых ситуаций. Достигается ли ими при этом исходный функциональный статус или экосистемам наносится какой-то "биохимический ущерб". Нам представляется, что на это можно ответить только при условии более тонкого методического подхода.

Цель и задачи. Наши исследования были направлены на определение динамики молекулярных форм /МФ/ некоторых ключевых ферментов мета-

болизма микросообществ в техногенных и природных гидроэкосистемах с целью определения способности последних к адаптации, реанимации, стабилизация после антропогенного воздействия и роли в этих процессах МФ ферментов окислительного метаболиама. Результаты исследований возводят пересмотреть существующие^представления о путях стабилизации гидроэкосистем и показать, что наряду с известными существует альтернативный путь достижения устойчивости, заключающийся в индукции низкомолекулярных форм ключевых оксидоредуктаз в ответ на увеличение разнообразия эндо- и экзометаболитов в микросообществах развивающихся гидрозкосистем. Расшифровка субмолекулярных механизмов реанимации, адаптации и стабилизации откроет новью возможности в области биомониторинга гидроэкосистем, поиска путей выхода последних из крайне неблагоприятной ситуации, сложившейся в последние годы. В связи с поставленной задачей решали следующее конкретные вопросы:

- исследовали динамику активности и гетерогенность МФ некоторых ферментов в моделях экосистемы активного ила по фазам развития, а именно: одного из ключевых ферментов гликолиза - ЛИГ, связующего липидний ч углеводный обмены а-ГФД, пускового фермента пен-тозофосфатного цикла - Гл-6-ФД, одного из ключевых, ферментов цикла трикарбоновых кислот - М£Г, ключевого фермента белкового и аминокислотного обмена - ГДГ, а также каталазы - детоксиканта пероксида водорода - одного из метаболитов живых систем;

- устанавливали наличие !<№ вышеназванных ферментов в водной среде модельных экосистем активного ила, их структурные особенности на разных фазах развивавшихся экосистем и роль их в стабилизации последних:

- разрабатывали способы технологического контроля процессов биологической очистки промышленных и бытовых сточных вод по динамике активности и гетерогенности № исследуемых ферментов активных

илов;

- исследовали влияние залповых сбросов промышленных сточных вод и их компонентов на активность и структурную организацию К© ферментов активных илов в моделях и на действующих сооружениях биологической ОЧИСТКИ;

- выясняли роль МФ ферментов окислительного метаболизма в реанимации и стабилизации экосистем, подвергшихся антропогенному влиянию;

- определяли фракционный состав белков в сообществах воднш экосистем в процессе их развития, выявляли изменения в структурной организации белка под влиянием сточных вод и их компонентов, разрабатывали способы биотестирования токсичности промышленных выбросов по изменению структурной организации упомянутых белков;

- исследовали гетерогенность МФ ферментов и фракционный состав белков-в микросообществах в грунтах водохранилищ Волжского каскада и малых рек Самарской области; устанавливали наличие зависимости между гетерогенностью Ш> и белков и техногенными нагрузками на водоемы, поступающими от городов Самары и Саратова, выясняли роль МФ ферментов в поддержании экологического равновесия в гидроэкосистемах;

- разработали систему способов биомониторинга водных экосистем на основе изменения активности и структурной организации ключевых ферментов окислительного метаболизма активных илов, микросообществ грунтов водохранилищ и малых рек.

Научная новизна. Результаты исследований позволили значительно дополнить общепринятую систему биохимической адаптации водных экосистем, предложенную Хочачкой и Сомеро. Получены ранее неизвестные данные о составе, динамике активности и структурной организации МФ ферментов энергетического метаболизма ценозов активного ила и мяк-

росообществ грунтов водохранилищ и малых рек. Определены некоторые механивмы стабилизации гидроэкосистем и роль зндо- и экзоферментов в механизмах поддержания экологического равновесия в них. Установлено ранее неизвестное ЯЕление индукции низкомолекулярных форм де-гидрогеназ в клетках ила при переходе в стабильное состояние. Открыто ранее неизвестное явление индукции и экспресс-биосинтеза множества низкомолекулярных форм оксидоредуктаз - "реаниматоров" при выходе гидроэкосистем из состояния метабол>гческого шока, их реанимации и стабилизации. Обнаружено увеличение гетерогенности низкомолекулярных форм ферментов окислительного обмена микросообществ грунтов водохранилищ и малых рек с неблагоприятным гидрохимическим статусом.

Практическая значимость. Разработаны способы биотестирования токсичности сточных вод и их компонентов, а также способ технологического ¡сонтроля за работой сооружений биологической очистки, которые могут Сыть использованы в практике лабораторий охраны окружающей среды, служб биомониторинга Госкомприроды и отраслевых НИИ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной /Одесса, 1989 г./, республиканских /Одесса, 1990 г., Саратов, 1992 г., Самара, 1993 г./, региональных /Саратов,1989 г., Самара, 1991 г./ и других конференциях, посвященных проблемам охраны поверхностных вод.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, получено 3 авторских свидетельства /Ы 1622400. N 1684664, N 1751570, на 2 из них получены патенты/, патент РФ N2014596,4 рационализаторских предложения /Самарский медицинский институт. N 98/83, N 61/89, N 62/89, N 53/89/.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Содержит 317 страниц машинописного текста, в том числе 70 рисунков, 41 таблицу, список литературы из 537 наименований /из них 333 иностранные/ и приложения.

1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В лабораторных исследованиях моделей экосистем активного ила использовали регенерированный ил сооружений биологической очистки сточных вод ПО "Нефтеоргсинтез". Фоновые загрязнения удаляли трехкратным отмыванием ила дистиллированной водой. Отмытый ил помещали в аэратор периодического действия объемом 10 л, исходная концентрация ила составляла 0,8-1,0 г/л. В синтетической среде единственным источником углерода служила глюкоза в конечной концентрации 1 г/л. Ил постоянно перемешивали, продували воздухом, температуру поддерживали в пределах 23-25° С. Фазы развития активного ила контролировали по показателям оптической плотности на Фо-тоэлектроколоримегре КФК-2 и по сухому остатку биомассы ила. Концентрацию глюкозы в иловой жидкости определяли орто-толуидияовым методом. Общую дегидрогеназную активность устанавливали по разработанному нами методу. Количество микроорганизмов в активном иле определяли путем прямого подсчета по Разумову.

На разных фазах развития экосистем активного ила имитировали залповые сбросы сточных вод различных цехов и производств ПО "Нефтеоргсинтез", а также некоторых отдельных компонентов сточных вод и двухкомпонентных смесей. К сточным водам и их компонентам активный ил был адаптирован. Контакт ила со сточными водами и их компонентами проводили в течение 1 ч при 37° С.

В экспериментах на действуювдх сооружениях биологической очистки образцы ила отбирали в регенераторе, в первой, второй.

третьей секциях аэротенков и на выходе из аэротенков городской станции аэрации; на входе, в центре, на выходе из аэротенков и во вторичных отстойниках первой ступени, а также в центре аэротенка и во вторичных отстойниках второй ступени биологической очистки сточных вод ПО "Нефтеоргсинтез". Действие на активный ил залповых сбросов сточных зод отдельных производств и общезаводских сточных вод контролировали сразу после контакта сточных вод с активным илом первой ступени и далее в течение 24-72 ч. Залповые сбросы отслеживали по оперативным данным дежурного технолога. Время между отбором образцов ила и анализом составляло не более 30-50 мин.

Образцу грунтов водохранилищ и малых рек отобраны в экспедициях 1989-91 гг.

Дезинтеграция клеток активного ила и микросообществ грунтов природных гидроэкосистем включала следующие процедуры: суспензию биомассы трехкратно отмывали 0,1 М фосфатным буфером рН 7,2, центрифугировали при 5000 % 5 мин. Осадок дезинтегрировали в механическом дезинтеграторе в течение 5 мин при 4° С. Дезинтеграт переносили в колбу, добавляли 5 мл фосфатного буфера и тритона Х-100 в конечной концентрации 20 ыг/мл. Колбу помещали на магнитную мешалку на 2 ч при 37° С для солюбилизации белка. Далее гомогенат центрифугировали при 8000 ё 10 мин.

Сулернатант подвергали электрофорезу в плоских блоках полиак-риламидного геля. В работе использовали материалы и реактивы для диск-электрофореза /"КеапаГ', Венгрия/. Анализируемые образцы в объеме 50 мкл в смеси с 40%-ным раствором сахарозы наносили на линию старта. В качестве электродного буфера использовали 1 М трис-ЭДТД-боратный буфер рН 9,2. Электрофорез проводили при силе тока 5,0 мА/см в первые 30 мин, затем 10 мА/см до его окончания. Выявление К® исследуемых дегидрогеназ проводили феназинметасуль-фат-тетразолиезой реакцией в инкубационных средах," оптимизирован-

ных применительно к ферментам микросообществ гидроэкосистем. Оптимизацию осуществляли с применением планирования многофакторного эксперимента по Боксу - Уилссну. Установлены следующие оптимальные составы инкубационных сред.

Для MS ЛДГ: водкыа растворы NAD 1 мг/мл - 25 мл,' нитросиний тетрадеаиевый 1мг/+м-~. 30 ua,,_ фенавинметаоульфат 1 мг/мл - 2 мл. лактат лития кристаллический - 360 мг, 0,1 М фосфатный буфер рН 7,4 - до 100 мл. Инкубацию проводили 3 ч при 37° С. В местах локализации Ш> ДДГ развивается темно-синее окрашивание.

Для МФ а-ГФД: водные растворы NAD 1 мг/мл - 40 мл, нитрос.иний тетразодиевый 1 мг/мл- 30 мл, феназинметасульфат 1 мг/мл - 2 щ, 1 М раствор й-глицерофосфата натрия рН 7,0 - 10 мл, 0,2 М трис-HCl буферный раствор рН 7,1 - до 100 мл. Инкубацию проводили 3 ч при 37° С. В местах локализации МФ фермента развивается темно-синее окрашивание.

Для МФ ЩР: водные растворы NAD 1 мг/мл - 40 мл, нитросиний тетразолиевый 1 мг/мл - 25 мл, феназинметасульфат 1 мг/мл - 4 мл, 1 М раствор малата натрия рН 7,0 - 10 мл,0,2 М трис-HCl буфер рН 7,1- до 100 мл. Инкубировали 2 ч при 37° С. В местах локализации МФ фермента развивается темно-синее окрашивание.

Для МФ ГДГ: водные растворы NAD 1 мг/мл - 40 мл, нитросиний тетразолиевый 1 мг/мл - 30 мл, феназинметасульфат 1 мг/мл - 2 мл, 1 М раствор L-глутамата натрия рН 7,0 - 5 мл, 0,1 М фосфатный буфер рН 7,0 - до 100 мл. Инкубировали 3 ч при 37° С. В местах локализации МФ фермента развивается темно-синее окрашивание.

Для Ш Гл-6-ФД: водные растворы NADP 1 мг/мл - 30 мл, нитросиний тетразолиевый 1 мг/мл - 25 мл, феназинметасульфат 1 мг/мл - 2,5 мл, глюкозо-6-фосфат натрия кристаллический - 150 мг. 0,2 М трис-HCl буфер рН 7,1 - до 100 мл. Инкубировали 3 ч при 37° С. В местах локализации Ш фермента развивается темно-синее окрашивание.

Для выявления № каталазы блоки геля выдерживали 10 мин в дистиллированной воде, затем погружали на 10 мин в 0,03%-нъш раствор пероксида водорода, промывали водой и помещали на 8 мин в смесь, состоящую из разных количеств 10%-ного раствора железа хлорида и 10%-ного раствора'феррицианида калия. Зоны, содержащие ка-тапаву,-имадш-вид-.желтых полоо-яа «змно»зел&ном фоие^-берлинской~»«» лазури. Хранили гели в темноте и извлекали на свет только для просматривания.

Для выявления фракций неферментного белка гелевые пластинки погружали в 1%-ный раствор амидочерного в 7%-ной уксусной кислоте на 10 мин. Избыток красителя удаляли вымачиванием гелевых пластинок Е 7%-ной уксусной кислоте. Молекулярную массу фракций белка определяли в градиенте геля. В качестве маркеров использовали альбумин лиофилизмрозанный из сыворотки человека с молекулярной массой 66000-69000 Д / "Reanal", Венгрия /, пепсин 85000 Д и инсу-лонг SP / Югославия / 6500 Д.

Сканирование эяектрофореграмм проводили путем прямой денсито-метрии на автоматическом интегрирующем денситометре ERI-65 m фирмы "Carl Zeiss" / lena, Германия / и на анализаторе фореграмм АФ-1 ПО "Львовприбор".

Общее содержание белка в образцах активного ила и донных осадков устанавливали с помощью биуретовой реакции. Общую активность некоторых специфических дегидрогепаз определяли по Асатиани. Общую активность каталазы устанавливали модифицированным методом Баха. Результаты экспериментов подвергали статистической обработке. Расчет коэффициентов уравнений регрессии проводили на ПЭВМ.

2. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ АКТИВНЫХ ИЛОВ, ШКРОСООБЩЕСТВ ГРУНТОВ ВОДОХРАНИЛИЩ И МАЛЫХ РЕК ПО ИЗМЕНЕНИЮ АКТИВНОСТИ И ГЕТЕРОГЕННОСТИ К® ЛДГ Лактатдегвдрогеназа - /Ь-лагаат-.ЫАО-оксидоредуктаза, 1.1.1.2?, ЛДГ/ катализирует обратимое превращение пирувата в молочную кислоту, один иэ ключевых,ферментов гликодиаа.

В моделях экосистем активного ила в зависимости от фаз развития ЛДГ' характеризуется пятью активными зонами, включающими от шести до девяти МФ. Максимальная гетерогенность фермента приходится на фазу лог-роста и стационарную фазу. Основная масса фермента локализуется в области ЛДГ-5, что отражено на рис.1 айв табл.1.

Таблица 1

Относительная активность № ЛДГ ила по фазам развития

Фазы развития экосистемы Зоны активности, изменения в ■з/у /о/а

1 2 3 4 5

адаптации •10,0 2,0 13,5 18,5 56,0

лог-роста -15,0 5,5 17,0 22,0 40,5

стационарная 24,5 2,0 •16,5 19,5 37,5

ДЦГ-5 несет основную функциональную нагрузку по дегидрированию лагсгата, что вполне согласуется с дачными, указывающими на окисление молочной кислоты мембраносвязаншй ДЦГ-5. Полученные данные свидетельствуют об интенсификации процессов дегидрирования лактата в тазе лог-роста и стационарной фазе, причем, в большей мере активируются низкомолекулярные формы фермента. Увеличение гетерогенности фермента за счет кизкомолекулярных форм может быть объяснено диссоциацией олигомеров на субъединицы с сохранением каталитической активности. Логичным может быть предположение индукции адаптивных форм, модулятором которых является увеличение раз-

нообразия зндо- и экзометаболитов в развивающейся экосистеме.

В иловой жидкости в начале фазы лог-роста в области ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ДДГ-3 выявлено до пяти активных зон по электрофоретической подвижности соответствующие таковым зндоферментов /рис.1 б/. До центра стационарной фазы число экзогенных МФ ЛДГ не меняется, в фазах адаптации и во второй половина.-стационарной фазы указанные. Ш> не выявлены. Ни на одной из фаз не обнаружены экзоферменты в области ЛДГ-4 и ЛЯГ-Б.

В аэротенках городской станции аэрации ЛДГ представлена также пятью зона»«!, причем, гетерогенность фермента увеличивается от регенератора к выходу из аэротенка. Изменение соотношения активности Ш> ЛДГ ила в процессе очистки сточных вод показано в табл.2.

Таблица 2

Относительная активность Ш> ЛДГ ила в процессе очистки сточных вод на городской станции аэрации

Секции аэротенка Зоны активности, изменения в 7.7.

1 2 3 4 5

регенератор 7,5 5,0 11,0 16,5 60,0

первая секция 10,0 9,0 17,5 19,0 44,5

вторая секция 13,0 10,5 19,0 22,5 35,0

третья секция 11,5 10,0 17,0 22,0 39,5

выход из аэротенка 11.0 10,0 17,5 19,5 42,0

Из данных видно, что в регенераторе в условиях лимита кислорода преобладает активность ЛДГ-5. По мере прохождения ила по секциям аэротенка при интенсивной аэрации отмечено достоверное увеличение активности низксмолекулярных форм ЛДГ и падение таковой у ЛДГ-5. Такая >:е динамика активности Ш> ЛДГ ила установлена при очистке сточных вод НПЗ: во вторичных отстойниках и на входе- в аэ-ротенки в условиях относительного лимита кислорода выражена активность мембраносвязанкой ДДГ-5, а переход биомассы ила в аэрируемые

участки аэротенков сопровождается увеличением относительной активности низкомолекулярных цитоплазматических форм и снижение таковой у ЛДГ-5. Установленная закономерность согласуется с предположениями о том, что скорость синтеза ЛДГ-5 регулируется концентрацией кислорода.

Залповые сбросы сточных вод НТВ и их компонентов в зависимости от вида производства и концентрации в той или иной мере ин-гибировали МФ ЛДГ. Установлена резко выраженная токсичность сточных вод производства CMC "Прогресс" и карбамида, практически полностью блокирующих гликолиз на фрагменте лактат-пируват. Залповый' сброс сточных вод заводского коллектора, содержащих до 140 мг/г ила аммиака, приводил к полному ингибировани» ЛДГ-4 , ЛДГ-5 и снижению активности низкомолекулярных форм на 90-95 % /рис.1 в/. При действии токсикантов ингибированию в больией мере подвержена мемб-раносвязанная форма ЛДГ-5.

Реанимация активного ила в течение 24 ч после залпового сброса характеризовалась индукцией множества низкомолекулярных форм фермента и частичным восстановлением активности ЛДГ-4 и ЛДГ-5. Дальнейшая аэробная стабилизация с-трессированного ила сопровождалась реактивацией высокомолекулярных форм фермента, а в низкомолекулярных зонах фореграмм выявлено до семи фракций ЛДГ с выраженной активностью /рис.1 г/.

В образцах грунтов водохранилищ и малых рек выявлены как низкомолекулярные так и высокомолекулярные формы ЛДГ, однако отмечено преобладание относительной активности высокомолекулярной фор-. мы фермента, что указывает на лимит кислорода в придонных участках и бентосе водоемов. В районах сброса сточных вод городов Самары, Саратова, а также на протяжении 10-30 км по течению степень гетерогенности WI> ЛДГ наиболее выражена.

Таким образом, изоферментный профиль, состав и динамика ак-

ыа

2 3

2 Г

-—Л

Рис Л. Спектры Mi ЛЛГ экосистем активного ила.

А - в моделях в фазах адаптации /1/, лог-роста /2/, стационарной /3/ и отмирания /4/.

Б - в иловой годе в фазах лог-роста /1/, в начале стационарной /2/ и в конца стационарной /3/.

В - после залповых сбросов сточных вод производств CMC "Прогресс" /1/, карбамида /2/, синтетических жирных кислот /3/ и заводского коллектора /4/.

Г - при реанимации после залповых сбросов сточных вод CMC "Прогресс" 24 ч /1/, то жэ 72 ч /2/ и заводского коллектора /3/.

тивности МФ ЛДГ в моделях экосистем ила, в процессе биологической очистки бытовых и промышленных сточных вод. свидетельствуют о наличии механизмов регуляции окислительно-восстановительных реакций метаболизма на фрагменте гликолиза лактат-пируват в клетках активного ила и в водной среде. Установлена гетерогенная структура ЛДГ сообществ активного ила в моделях и на действующих сооружениях биологической очистки. Число МЪ фермента увеличивается от фазы адаптации к фазе лог-роста, а также от вторичных отстойников и регенераторов к центрам аэротенков. Увеличение гетерогенности достигается низкомолекулярными формами, вероятно, димерзми или мономерами с сохраненной каталитической активностью, причем, максимум гетерогенности фермента определен в фазе лог-роста, стационарной фазе и в момент основного этапа изъятия загрязнителей из сточных вод. Это позволяет предположить существование прямой зависимости между достижением стабильности гидроэкосистем и изоферментным профилем ЛДГ ила. Активация ЛДГ-5 в относительно анаэробных условиях и значительное ее ингибирование при аэрации указывает на зависимость между скоростью синтеза мембраносвязанной формы и концентрацией кислорода в водной среде. Эта информация крайне важна при технологическом контроле за работой сооружений биологической очистки.

Выявление в водной среде экосистемы ила низкомолекулярных форм фермента на данном этапе не находит однозначного объяснения. В равной мере это может быть результатом или автолиза меток ила или индукции и транспорта МФ через клеточную оболочку. Более вероятно второе предположение, поскольку МФ не обнаружены в фазе адаптации и в конце стационарной фазы, где клетки ила в наибольшей степени подвержены автолизу. 'Действие высокогоксичных сточных вод и их компонентов приводит к частичному или полному блокированию гликолиза на фрагменте лактат-пируват, причем, в большей мере под-

вержена ингибированию мембракосвязанная форма ЛДГ-5, что использовано в основе разработанного способа биотестирования токсичности сточных вод промышленных производств. Реанимация и стабилизация илов, подвергшихся стрессу, сопровождается синтезом множества низкомолекулярных форм фермента - "реаниматоров" и реактивацией высокомолекулярных форм фермента. Однако исходного состояния по структурной организации и активности ДЦГ ила достигает после 72-х ч аэробной стабилизации.

Более выранена гетерогенность ЛДГ микросообществ грунтов водохранилищ в районах сброса городских сточных вод и в устьях малых рек. Зто может быть следствием модифицирующего влияния загрязнителей на генетический аппарат гядробионгов. В равной степени это относится и к образцам грунтов малых рек, принимающих условно чистые сточные воды промышленных предприятий после биологической очистки и без таковсй. Следует отметить, что увеличение степени гетерогенности ДЦГ достигается низкомолекулярными формами.

Структурная организация, динамика состава и активности М1 ЛДГ ценозов модельных и естественных гидроэкосистем, развивающихся в нормальных условиях и при действии мощных антропогенных факторов, являются я значительной степени информативными составляющими в оценке функционального состояния и биомонитсрииге последних, а также для определения характера действия сточных вод и их компонентов на микросообщества гидроэкосистем.

3. ЭНЗШМЖТОРИНГ АКТИВНЫХ ИЛОВ, ГРУНТОВ ВОДОХРАНИЛИЩ и МАЛЫХ РЕК ПО ДИНАМИКЕ АКТИВНОСТИ И ГЕТЕРОГЕННОСТИ № а-ГФД

сс-глииерофосфатдегидрогеназа /Ъ-глицерол-З-фосфат: ЫАБ-окси-доредуктаза, 1.1.1.8, «-ГФД/ катализирует взаимопревращение «-глицерофосфата и диоксиацетонфосфата. Основной функцией фермента яв-

ляется транспорт водорода в дыхательную цепь.

На всех фазах развития модельных экосистем ила а -ГФД представлена пятью активными зонами, включаюшдми в зависимости от фаз до девяти МФ. Максимум гетерогенности фермента отмечен в фазах лог-роста и замедленного роста. Представляет интерес ди-

намика изменения соотношения активности МФ фермента по мере развития экосистемы ила /табл.3/.

Таблица 3

Относительная активность Ш> а-Г£>Д ила по фазам развития Фазы развития Зоны активности, изменения в 7.7.

1 2 3 4 5

адаптации 16,5 9,0 7,5 10,3 56,7

лог-роста 17,4 9,8 7,2 10,5 55,1

замедленного роста 24,8 11,0 7,5 11,7 45,0

стационарная 14,7 8,4 9,3 11,3 55,3

отмирания 7,0 5,0 9,7 16,3 62,0

Полученные данные позволяют предположить в фазах адаптации и лог-роста сдвиг реакции в сторону образования дкоксиацетонфосфата, включение его в гликолиз и накопление энергии в фосфатных связях. В целом в реакции преобладает высокомолекулярная мембраносвязанная форма а-ГФД-5. В фазе замедленного роста происходит переключение на образование с<-глидарофосфата с последующим вероятным использованием его для биосинтеза фосфолипидов. В стационарной фазе и, особенно, в фазе отмирания вновь начинают преобладать мембранные процессы со смещением реакции в сторону образования диоксиацетонфос-фата. Эти предположения вполне подтверждаются увеличением степени гетерогенности и активности низкомолекулярных форм в фазах лог-роста и замедленного роста.

В экспериментах по лимитированию экосистемы кислородом полу-

чени сведения о локализации 1Л1> в клетках ила и зависимости направления реакций превращения «-глицерофосфата от концентрации кислорода: при нормальном режиме аэрации преобладают мембранные процессы окисления «-глицерофосфата в диоксиацетонфосфаг. с накоплением энергии в форме iiADH, а в условиях лимита кислорода диоксиацетонфосфат восстанавливается до ос- глицерофосфата с последующим синтезом фоофо- -лилидов за счет накопленной в форме АТР энергии.

В воднсй среде модельных экосистем ила в начале стационарной фазы обнаружены активные фракции в области а-ГДФ-1 и а-ГФД-2.

На других фазах развития Ш фермента в иловой воде не выявлены, однако интенсивное фоновое окрашивание фореграмм формазаном свидетельствует о существовании неспецифических реакций дегидрирования а-глицерофосфата.

Динамита изменения относительной активности Ш> а-ГФД ила в процессе биологической очистки сточных вод НПЗ показана в табл.4.

Таблица 4

Относительная активность Ш «-ГФД ила в процессе очистки сточных вод НПЗ

Место отбора Зоны активности, изменения в %%

проб ила ---

1 2 3 4 5

Первая ступень

вход в азротенк 7,1 17,3 26,9 20, ,5 28,2

центр аэротенка 5,5 9,5 24,5 25, ,5 35,0

выход из аэротенка 4,0 11,0 29,0 16, .7 38,7

вторичный отстойник 8,4 16,1 25,8 19, ,5 30,2

Вторая ступень

центр аэротенка 6,5 10,3 18,2, 16, ,1 48,9

вторичный отстойник 10,0 14,4 24,0 21, ,4 30,2

Результаты показывают, что на Еходе в аэротенки и во вторичных отстойниках, где экосистемы лимитированы кислородом, преобла-

дают цитоплазматические процессы оксидоредукции «-глицерофосфата над мембранными. В центре аэротенков и на выходе из них в условиях насыщения среды кислородом активируются мембранные процессы дегидрирования «-глицерофосфата с последующей деградацией диоксиацетон-фосфата в гликолизе и накоплением энергии в форме NADH. Это вполне согласуется с экспериментально подтвержденными данными об увеличении выхода диоксиацетона при окислении глицерина бактериальными клетками в условиях интенсивной аэрации и, наоборот, при лимитировании процесса кислородом скорость синтеза диоксиацетона падает.

Залповый сброс сточных вод производства CMC "Прогресс" практически полностью блокировал фермент, на электрофореграммзх заметны деструктивные явления в составе МФ, о чем свидетельствуют усиление фонового окрашивания поля фореграмм и изменение относительной электрофоретической подвижности фракций. Такие же результаты получены при действии сточных вод производства алкилсапицилатнах присадок и свинецсодержащмх сточных вод.

Реанимация экосистемы после залпового сброса сточных вод CMC "Прогресс", алкилсалицилатных присадок, свинецсодержащих сточных вод и сточных вод заводского коллектора сопровождалась реактивацией высокомолекулярных форм фермента и выявлением в низкомолекулярной области от пяти до девяти фракций с выраженной а -ГФД активностью.

В микросообществах грунтов водохранилищ гетерогенность а -ГФД в наибольшей степени выражена в районах сброса сточных вод городов и в устьях малых рек. Необходимо отметить большую встречаемость низкомолекулярных форм фермента, а в образцах грунтов от Самары до Еалаково обнаружены только «-ГФД-1, <х-ГФД-2 и а-ГФД-3, что указывает на преобладание анаэробных процессов нал аэробными. В пробах грунтов малых рек в основном выявлены низкомолекулярные формы фермента. Полученные данные убедительно доказывают зависимость тер-

минального окисления «-глицерофосфата от кислородного режима гидроэкосистем. В нормальном режиме аэрации мембраносвязанная с*-ГФД-5 окисляет с<-глицерофосфат до диоксиацетонфосфата с последующим включением его в гликолиз и накоплением энергии в форме МИН. В условиях лимита кислорода диоксиацетонфосфат восстанавливается до «-глицерофосфата. Обратимость реакции обеспечивает тесную взаимосвязь функционирования цитоплазмы и мембран клеток микросообшеств гидрозкосистем. а также интегрированность углеводного и липидного обменов. Увеличение степени гетерогенности фермента за счет низко-молекудярких форм в фазах лог-роста и в начале стационарной, а также л момент основного этапа изъятия загрязнителей из сточных еол указывает на участие в стабилизации гидроэкосистем биологических регуляторов - длмеров или каталитически активных мономеров й-ГФД. Большая встречаемость в грунтах природных гидрозкосистем низкомолекулярных форм свидетельствует о неблагоприятном кислородном режиме. Это может быть использовано для организации биомониторинга последних.

4. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ПО ИЗМЕНЕНИЮ

АКТИВНОСТИ Ш> МДГ АКТИВНЫХ ЙЛОВ Малатдегидрогеназа /Ъ-малат: НАД-оксидоредуктаза, 1.1.1.37, МДГ/ участвует в цикле трикарбоновых кислот и катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты.

ЩГ в моделях активного ила на всех фазах развития представлена тремя активными зонами. Установлена значительная гетерогенность МДГ ила, максимум которой приходится на фазу лог-роста и начало стационарной фазы в момент перехода экосистемы в наиболее стабильное состояние /рис.3 а/. Наряду с общепринятым путем стабилизации гидроэкосистем за счет увеличения их видового разнообразия

существует альтернативный путь - стабилизация посредством индукции относительно низкомолекулярных форм ферментов, в частности, Ш> МДГ.

Изменения общей активности МДГ ила по фазам развития экосистемы и относительной активности ее МФ представлены в табл.5.

Таблица 5

Относительная активность Ш> МДГ экосистемы ила по фазам развития

Фазы развития Общая активность Относительная активность, Z

экосистемы мкМоль/мин/мг белка

1 2 3

адаптации 0,0156 20,5 61,0 18,5

лог-роста 0,0260 18,0 64,5 17,5

стационарная 0,0288 8,0 71,5 20,5

Согласно полученным данным интенсивность окислительных процессов цикла Кребса на участке малат-оксалоацетат 'возрастает от фазы адаптации к стационарной фазе, причем,это достигается относительно высокомолекулярными формами фермента, а активность МДГ-1 от фазы адаптации к стационарной снижается более, чем в два раза.

В иловой воде модельных экосистем ила в фазе адаптации № МДГ не обнаружены. В начале фазы лог-роста выявлено до шести фракций с выраженной активностью, причем, по относительной злектрофорети-ческой подвижности они соответствуют эндоферменгам. Экзогенные МФ МДГ локализуются преимущественно в области МДГ-1 и низкомолекуллр-ной области МДГ-2 /рис.26/, не выявлены фракции МДГ-3. Число МФ не изменяется до второй половины стационарной фазы, в фазе отмирания МФ выявлены только в области МДГ-1.

Анализ спектров МФ МДГ ила в моделях позволяет предположить возможность индукции МФ фермента уже в начале фазы лог-роста. В роли индукторов, вероятно, выступают спонтанно синтезируемые эндо-

и зкзометаоолиты в клетках ила и во внешней среде. Это могут быть соединения, близкие по конфигурации и химической структуре к субстрату. Выход Ш> МДГ во внешнюю среду в фазе лог-роста можно объяснить быстрым накоплением в иловой жидкости субстратов МДГ. Это вполне согласуется с данными, указывающими на регуляцию синтеза внеклеточных ферментов микроорганизмов..внешней средой. Низкомо--. лекулярные формы МДГ локализуются в цитоплазме клеток ила и относятся к растворимым формам. Именно они обнаруживаются в иловой жидкости, а высокомолекулярная форма МДГ-3 погружена в толщу мембран, что объясняет отсутствие МДГ-3 во внешней среде.

Спектры М*> МДГ активного ила в процессе очистки сточных вод на городских станциях аэрации показаны на рис. 2 в. МФ МДГ ила регенератора представлены в составе трех активных зон, зона МДГ-2 включает четыре МФ. По относительной активности МДГ-1 и МДГ-2 преобладает над мембраносвязанной №-3. В иловой жидкости регенератора содержится минимальное количество загрязнителей, поэтому можно предположить, что окислительные процессы протекают преимущественно в цитоплазме клеток ила и на внутренней поверхности цитоп-лазматической мембраны. По мере прохождения биомассы ила по секциям азротенка наблюдали трехкратную активацию МДГ-3 и значительное повышение активности МДГ-2, особенно ее относительно высокомолекулярных форм, однако снижение таковой у МДГ-1. Следует отметить увеличение гетерогенности фермента ила к центру азротенка. Такое динамическое состояние К® характерно для интенсивных процессов изъятия загрязнителей из сточных вод и их окислением как в толще мембран, так и в цитозоле клеток ила. На выходе из азротенка активность МДГ-3 достигает уровня таковой в регенераторе. Интенсивность мембранных окислительных процессов снижается, также' понижается активность МДГ-2 и МДГ-1. Это соответствует заключительному этапу очистки сточных вод. Динамика активности МФ МДГ ила в про-

цессе очистки полностью подтверждается динамикой изъятия загрязнителей по ХЛК и фосфат-ионам /табл.б/

Таблица б

Динамика изъятия загрязнителей в процессе очистки сточных вод городской канализации

Показатели, мг/мл Секции азротенка

регенератор первая вторая третья выход

ХПК 64,1 237,6 79,2 53,4 39,6

фосфат-анионы 66,7 39,2 10,4 10,0 1,4

Приведенные данные указывают на поэтапное изъятие загрязнителей из сточных вод с последовательным включением М5 МДГ ила в процессы окисления ксенобиотиков. Обнаружена индукция низкомолекулярных форм ЩГ по мере возрастааия зндо- и зкзометаболитов в экосистеме ила.

Состав и динамика активности МФ МДГ ила в процессе очистки сточных вод ИГО в целом соответствуют таковым на городских станциях аэрации. Во вторичных отстойниках и в головных отсека* аэротенков более выражена активность МДГ-1 и низкомодекуяярных форм МДГ-2. По мере прохождения ила через аэротенки активность МДГ-З и высокомолекулярных форм МДГ-2 удваивается. ВДГ-1 падает. МДГ-2 ила включает до шести К®.

Залповые сбросы сточных вод НПЗ и их компонентов приводили к различной степени ингибирования МФ МДГ ила /табл.7/.

В большей мере под действием токсикантов ингибируется высокомолекулярная мембраносвязанная форма ЩГ-3. Инактивация МДГ-2 и МДГ-1 выражена значительно меньше. Заметна деструкция МФ МДГ, на это указывает изменение относительной злектрофоретической подвижности ее фракций. Действие CMC "Прогресс" приводит к диссоциации МДГ-1 на два протомера со значительной потерей активности.

Таблица 7

Изменение- относительной активности К® МДГ ила при действии сточных вод НПЗ

Название производства, Снижение активности, %%

концентрация,мг/г ила, --------:-

ст. вода : иловая смесь ,12 3

СМС "Прогресс" 75- -80 51,32 34, ,53 57,15

то же 95- •100 57,45 49, .50 71,16

то же 145- -150 63,46 66 ,70 100,00

СЖК 1 : 20 58,20 67; ,50 85,40

Карбамид 1 : 20 70,00 82: ,70 94,00

Алкилсалицилат- 1 : 20 66,00 65, ,20 78,30

ные присадки

Реанимация активного ила после залпового сброса сточных вод НПЗ сопровождалась индукцией низкомолекулярных форм фермента с частичным восстановлением активности ВДГ-2 и МДГ-3. Аэробная стабилизация ила в течение 72 ч приводила к реактивации МДГ-2 и МДГ-3, в области МЦГ-1 и МДГ-2 выявлено до пяти дополнительных активных фракций /рис.2г/. Максимальная гетерогенность МДГ в образцах грунтов водохранилищ и малых рек обнаружена в районах антропогенных нагрузок на водоемы, причем, выявляются преимущественно низкомолекулярные формы фермента.

Таким образом, изозимный профиль МДГ и динамика активности ее МФ в микросообществах гидрсэкосистем указывают на существование тонкой регуляции окислительно-восстановительных реакций метаболизма на уровне одного из ключевых ферментов цикла Кребса. Увеличение гетерогенности фермента от фазы адаптации к фазе лог-роста, а также от вторичных отстойников и регенераторов к выходу из аэротенков связано с индукцией адаптивных МФ МДГ в ответ на рост разнообразия экзо- и эндометаболитов в экосистеме и направлено на стабилизацию последней. Низкомолекулярные формы фермента локализованы в цитоп-

А Б

S3 -з- М ---

= 'ЛК ашв »4 ■ ---

-1- «а s=

1 2 Б 3 4 1 2 Г 3

— ---- ---- ---- © ---- ---- ----1 з:-

3SS — ... шш His Я ehzs

===== - Tj ЕШ —

= —"

Hi —

1 2 3 4 1 2 3

Рис.2. Спектры МФ МДГ экосистем активного ила.

А - в моделях в фазах адаптации /1/, лог-роста /2/, стационарной /3/ и отмирания /4/.

Б - в иловой воде в фазах лог-роста /1/, в начале стационарной /2/ и в конце стационарной /3/.

В - городской станции аэрации в регенераторе /1/, в первой секции аэротенка /2/, во второй секши аэротен-ка /3/ и на выходе из аэротенка /4/.

Г - при реанимации в течение 24 ч после залгогого сброса сточных вол CMC "Прогресс" /1/, то же через 72 ч /2/ и залпового сброса сточннх вод заводского коллектора /3/.

лазме клеток.они растворимы, а высокомолекулярная форма МДГ-3 мембраносвязанная. Направление реакции малат-оксалоацетат зависит от степени насыщения водной среды кислородом и субстратами. В условиях насыщения среды кислородом и субстратами активируется мембраносвязанная МДГ-3. Реакция сдвигается в сторону окисления малата и накопления энергии в NADH. Лимит субстрата и кислорода смещает реакцию в сторону образования малата из оксалоацетата и NADH с преобладанием активности низкомолекулярных форм фермента. Транспорт низкомолекулярных форм МДГ в водную среду обусловлен накоплением субстратов и их аналогов.

Высокотоксичные сточные воды НПЗ и их компоненты частично или *

полностью блокируют фрагмент цикла Кребса малат-оксалоацетат, в большей мере подвержена ингибированию мембраносвязанная МДГ-3. Реанимация и стабилизация стрессированных гидроэкосистем осуществляется индукцией в микросообществах множества низкомолекулярных форм фермента - "реаниматоров". Большая частота встречаемости низкомолекулярных форм МДГ в грунтах водохранилищ и малых рек, особенно в районах мощного антропогенного воздействия может быть следствием модифицирующего или постсинтетического влияния последнего на белковые слигомеры гидробионтов.

5. ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯ АКТИВНЫХ ИЛОВ И ГРУНТОВ ВОДОХРАНИЛИЩ ПО ДИНАМИКЕ АКТИВНОСТИ MI ГДГ

Глутаматдегидрогеназа /L-глутамат: NAD-оксидоредуктаза деза-минирующая, 1.4.1.2, ГДГ /катализирует обратимое превращение L-глутамата в 2-оксоглутарат:

L-глутамат + НгО + NAD г=^2- оксоглутарат + NH3+ NADH ГДГ является ведущим дезаминирующим ферментом метаболизма белков и аминокислот. Аминогруппы последних переносятся на 2-оксог-

лутаровую кислоту с образованием глутамата. Под действием ГДГ глу-тамат вновь превращается в 2-оксоглутаровую кислоту. Обратимость этой реакции имеет фундаментальное значение в синтезе аминокислот, обмене белков и углеводов, включения промежуточных продуктов метаболизма в цикл трикарбоковых'кислот. Биосинтетические пути глутамата предположительно-одинаковы для всех живых систем, в том числе и для микросообществ гидроэкосистем. Это определяет важность исследования этого ключевого фермента.

В моделях экосистем активного ила на всех фазах развития ГДГ представлена пятью Ш>, незначительно отличающимися по электрофоре-тической подвижности. Это подтверждает данные о структурной организации бактериальных ГДГ. На электрофореграммач выявлена основная форма ГДГ-5 и четыре конформационных изомера - минорные формы ГДГ-1, ГДГ-2, ГДГ-3 и ГДГ-4 /рис.8 в/. Динамика активности фермента по мере развития экосистемы свидетельствует, что до стационарной фазы катализируется преимущественно реакция окисления глутамата. В фазах лог-роста и замедленного роста экосистема краше нуждается в энергии, которая образуется при окислении глутамата до 2-оксоглутарата и накапливается в виде NADH, тем самым обеспечивая клетки ила энергией через электронно-транспортную цепь. По мере перехода к стационарной фазе энергетические потребности экосистемы снижаются, активность ГДГ стабилизируется. Именно на этой стадии констатируется преобладание активности минорных форм ГДГ. Завершение стационарной фазы характеризуется резкой активацией ГДГ. причем, основная активность теперь локализуется в области ГДГ-5. Вероятно, при выходе из стабильного стационарного состояния экосистема для рестабилизации вновь интенсивно окисляет глутамат и запасает энергию в форме МАОН.

В водной среде модельных экосистем ила активные фракции выявлены в начале фазы лог-роста, лог-роста и замедленного роста. По

относительной электрофоретической подвижности они отличаются от ондоЛерментов большей подвижностью /рис.3 б/. Это указывает на индукцию и транспорт модифицированных форм ГДГ-трипептидов и дипеп-тидов с сохраненной каталитической активностью в водную среду, что вполне согласуется с данными авторов, установивших явление полуассоциации субъединиц и образование каталитически активных димеров и тримеров ГДГ.

Динамика изменения относительной активности № ГДГ или в процессе биологической очистки сточных вод НПЗ показана в табл.8.

Таблица 8

Относительная активность МФ ГДГ ила в процессе очистки сточных вод НПЗ

Место отбора Зоны активности, изменения в 7.Х

проб ила ----

1 2 3 4 5

Первая ступень

вход в аэротенк 10,0 16,5 15,0 14,0 44,0

Центр азротенка 8.5- 26,0 19,5 16,5 - 29,5

Выход из азротенка 8,5 36,5 21,0 14,0 20,0

Вторичный отстойник 6,0 8,0 10,5 20,5 55,0

Вторая ступень

Центр азротенка ' 9,5 34,5 23,0 22,5 10,5

Вторичный отстойник 3.5 7,5 12,5 28,0 48,5

Максимум общей активности фермента установлен во вторичных отстойниках, далее по мере прохождения ила через аэротенки активность ГДГ значительно снижается и перестраивается соотношение активности основной и минорных форм фермента. Во вторичных отстойниках и в головных отсеках аэротенков преобладает реакция окислительного деваминирования глутамата и обеспечение клеток ила энергией НАШ. Это подтверждается активацией основной формы фермента -ГДГ-5. Ингибирование ГДГ-5 и увеличение относительной активности

минорных форм к центрам азротенков и к выходу из них подтверждает переключение реакции окислительного дезаминирования глутамата на восстановительное аминирование 2-оксоглутарата. Последнее позволяет предположить наличие неконкурентного ингибирования ГДГ-5 адели-латами, поскольку в центре азротенков происходит изъятие основной массы загрязнителей из сточных вод и их окисление, а соответственно и улавливание энергии в форме ГТЗ> и АТФ. Снижение же концентрации АТФ в иле вторичных отстойников, а соответственно увеличение АДФ и неорганического фосфата играют роль положительных модуляторов ГДГ-5.

Серии экспериментов по исследованию динамики активности ГДГ и ее Ш> в процессе очистки сточных вод на городских станциях аэрации полностью подтвердили смещение реакции в сторону окислительного дезаминирования глутамата в илах регенераторов и переключение на восстановительное аминирование 2-оксоглутарата по мере прохождения биомассы через аэротенк /табл.9/.

Таблица 9

Относительная активность М£ ГДГ в процессе очистки сточных вод на городских станциях аэрации

Место отбора Зоны активности, изменения в 7Л проб ила ------

1 2 3 4 5

регенератор 5,0 8,5 12,0 19,0 55,0

Первая секция 10,5 15,5 17,5 14,5 42,0

Вторая секция 12,0 19,0 21,0 14,0 33,5

Третья секция 12,5 17.0 20,0 16.5 34,0

Выход из аэротенка 10,0 17,5 24.5 18,0 30.0

Залповые сбросы сточных вод CMC "Прогресс", свинецсодсржаших сточных вод и сточных вод заводского коллектора приводили практически к полному блокирование фермента и, как следствие, к остановке всех процессов метаболизма, функционально связанных с этим клю-

два

22223 ВЕЯВ

Рио.З. Спектры ТДФ ГДГ экосистем активного ила и микросооб-щэств донных осадков водохранилищ.

А - в моделях в фазах адаптации /1/, лог-роста /2/, стационарной /3/ и в конце стационарной /4/.

Б - в иловой воде в начале фазы лог-роста /1/, в центре фазы лог-роста /2/ и в начале стационарной фазы /3/.

В - посла залпового сброса сточных вод заводского коллектора /1/ и свинецсодержащих сточных род /2/.

Г - при реанимации в течение 48 ч после залпового сброса сточных вод заводского коллектора /1/, то же 72 ч /2/.

Д - р.Волга, 2205 км, ниже сброса сточных вод г.Саратова /1/, р.Волга, 2215 км,/2/, р.Волга, устье р.Б.Иргиз /3/.

чевым ферментом. Следует обратить особое внимание ьа инактивацию ГДГ ила сточными водами заводского коллектора, содержащими до 140 мг/г ила аммонийного азота, поскольку здесь имеет место субстратное ингибирование, причем, более чувствительна к таковому основная форма ГДГ-5 /рис.3 в/. Реанимация и аэробная стабилизация плов, подвергшихся стрессу, сопровождалась индукцией и выявлением от трех до пяти низкомолекулярных активных фракций фермента /рис.3 г/.

Максимальная гетерогенность и активность ГДГ установлена в образцах грунтов водохранилищ в районах сброса сточных вод городов, причем, активность минорных форм фермента в несколько раз превышает таковую ГДГ-5. Данные указывают на интенсивные процессы восстановительного аминирования 2-оксоглутарата и, соответственно, ассимиляционные функции фермента с активным изъятием аммонийного азота из водной среды /рис.3 д/. Гидрохимические анализы в этом случае подтвердили наличие значительных количеств неорганического азота / ЫН4-, N02", Шз~ / в воде.

Таким образом, структурная организация бактериальных ГДГ модельных и природных гидроэкосисгем, динамика активности МФ фермента в моделях и на действующих сооружениях биологической очистки свидетельствуют о существовании тонких механизмов регуляции аминокислотного и белкового обменов в клетках активного ила и в водной среде гидроэкосистем на уровне субстратов и энергетического статуса.

6. ДИНАМИКА МФ Гл-6-ФД АКТИВНЫХ ОДЮВ, ГРУНТОВ ВОДОХРАНИЛИЩ И МАЛЫХ РЕК

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа /В-глюкозо-б-фосфат: ЫАОР-окси-дсредуктаза, 1.1.1.49, Гл-6-ФД/ - ключевой фермент пентозофосфат-ного цикла, окисляет глюкозо-6-фосфат в фосфоглюконовую кислоту

через б-фосфоглюконолактон.

Пентозофосфагный цикл окисления углеводов имеет ойцебиологи-ческое значение. Обратимость реакции гексоза-пентоза, образование пентоз для синтеза нуклеиновых кислот, многих коферментов, отщепление* и перенос фосфорных групп, электронов, протонов, регенерация восстановленных NAD и NADP - далеко неполный перечень протекающих в цикле реакций.

В фазе адаптации моделей активного ила Гл-б-ФД представлена четырьмя активными зонами, включающими пять К©. Уже в начале фазы лог-роста установлено пять зон фермента, при этом число МФ# возрастает до девяти/ рис.4 а,(^В стационарной фазе число МФ становится равным семи и остается без изменения до фазы отмирания.

В фазе адаптации не обнаружена вторая зона активности, но уже в начале фазы лог-роста она была выявлена и не потеряла своей активности до отмирания экосистемы.- Максимальное количество ферментного белка прослеживается в области высокомолекулярной пятой зоны. На фоне увеличения общей активности Гл-б-ФД в 1,5-2,0 раза от фазы адаптации к стационарной, достоверных изменений относительной активности первой и пятой зон не установлено. Достоверные изменения наблюдали во второй, в третьей и четвертой зонах.

Полученные данные подтверждают наличие пентозофосфатного пути превращения гексоз в моделях активного ила, интенсивность которого возрастает по мере развития экосистемы. Изозимный профиль фермента. изменение его гетерогенности и выявление в фазе лог-роста еще одной зоны активности позволяют предположить тонкую регуляцию пентозофосфатного цикла. Это осуществляется относительно низкомолекулярными формами фермента, поскольку именно они наиболее динамичны ъ развивающейся экосистеме. Максимальная гетерогенность Гл-6-ФД наблюдается в фазе лог-роста, что может быть объяснено нарастанием разнообразия метаболитов, достижением гомеостаза и стабилизацией

¡¿5мм

Рис. 4. Спектры МФ Гл-бчВД экосистем активного ила.

А - в моделях в фазе адаптации; Б - в моделях в фазе лог-роста. 1-5 зоны активности формента.

В - после залповых сбросов сточных вод производства CMC "Прогресс" /1/, свинец- /2/ и фенолсодержащкх /3/ сточных вод.

Г - при лимитировании экосистемы кислородом /1/, при реанимации после залповых, сбросов с-ринецсодеряащих сточных вод 72 ч /2/ и заводского коллектора 24 ч /3/.

экосистемы.

Лимитирование экосистемы ила кислородом обнаружило увеличение гетерогенности фермента, при этом, увеличение числа Ш обеспечивается низкомолекулярными формами. Отмечено некоторое снижение активности Гл-6-ФД-4 и Гл-б-ФД-5 при одновременном увеличении таковой у низкомолекулярных форм в первые 3-4 часа после прекращения аэрации. Такое изменение ссотноиения активности МФ в целом не приводит к снижению эффективности пентозофосфатного цикла. Далее с уменьшением содержания кислорода в экосистеме активность фермента падает и превращение гексоз полностью переходит на путь гликолиза.

На рис. 3 /5, в/ показаны спектры № Гл-б-ФД ила при действии некоторых, сточных вод НПЗ и их компонентов. Большинство последних в той ми иной мере блокировали пентозофосфатный путь превращения гексоз. Реанимация и аэробная стабилизация экосистем ила сопровождалась реактивацией фермента и выявлением множества низкомолекулярных форм "реаниматоров"/ рис. 4г/.

В образцах грунтов водохранилищ и малых рек преобладают низкомолекулярные формы Гл-б-ФД, причем гетерогенность фермента более выражена в грунтах малых рек, что, вероятно, связано гидрохимическим режимом и содержанием кислорода в воде водоемов.

Подводя итог, можно сказать, что одним из альтернативных путей превращения гексоз микроценозами модельных и природных гидроэкосистем является пентозофосфатный путь. Установлена гетерогенная структура ключевого фермента пентозофосфатного цикла как в экосистемах активного ила. так и в микросообществах донных осадков водоемов. Развитие экосистемы ила сопровождается увеличением степени гетерогенности Гл-б-ФД. Это. вероятно, связано с индуцированным синтезом ад&птившх низкомолекулярных форм в ответ на увеличение разнообразия эндо- и зкзомегаболитов и в целом направлено на стабилизацию экосистем.

7. КАТАЛАЗА И ЕЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФОРМЫ В ШКРОСООБШЕСТВАХ МОДЕЛЬНЫХ И ПРИРОДНЫХ ГИДРОЭКОСИСТШ

Каталаза/Н2О2: Н2О2 -оксидоредуктаза, 1.11.1.б./'- фермеит-гемпротеид, катализирует превращение пероксида водорода до молекулярного кислорода и воды:

Н202 + Н20г = 02 + 2Н20

По современным представлениям пероксид водорода можно рассматривать как косубстрат некоторых ферментов и как компонент антибактериальных и антивирусных систем. Однако главным образом он известен как соединение, потенциально токсичное для клеток. Каталаза обнаружена почти у всех аэробных микроорганизмов и у некоторых факультативных анаэробов.

Общая активность каталазы в моделях экосистем ила возрастала от фазы адаптации к стационарной и достигала максимума в конце стационарной .фазы /табл.12/

Таблица 12

Активность кагалазы в моделях ила по фазам развития

Фазы развития экосистемы

адапта- лог-роста стацио- окончание ции парная стационарной

Каталазный показатель 2,67 4,03 7,50 8,91

/каталазное число/мг

белка/

Фермент представлен двумя МФ - К-1 и К-2. Динамика активности МФ каталазы полностью подтверждает динамику общей активности фермента в моделях экосистем ила. Основная активность локализуется в области К-2, которая превышает таковую К-1 в 2-2,5 раза. Пика ач-

тивности достигают к окончанию стационарной фазы, причем, наблюдается образование в области К-2 двух фракций /рис.б а/. Результаты вполне согласуются с данными авторов, установивших рост активности бактериальных каталаз к стационарной фазе и увеличение их гетерогенности в высокомолекулярной области.

В иловой жидкости моделей экосистем ила в фазе адаптации выявлено две Ш\ причем, более выражена активность К-1. По мере развития экосистемы активность экзогенных МФ каталазы возрастает и достигает максимума к окончанию стационарной фазы, число МФ фермента становится равным четырем /рис.б б/. По структурной организации экзогенная каталаза отличается от эндогенной большим числом МФ, большими значениями относительной электрофоретической подвижности и более выраженной активностью низкс.молекулярных ферм, вероятно, димэров или каталитически активных субъединиц. Как следует из дачных Сузчной Н.Е., продукты реакции на каталазу обнаружены на поверхности клеточных стенок метанотрофных бактерий и в периплазме. Вероятно, локализация каталазы в клетках микроорганизмов способствует ее выходу в водную среду еще в фазе адаптации и включению в реакции сксидоредукции. Таким образом, предположения о существовании экзогенной каталазы в чистых и смешанных популяциях микроценоаов гидроэкосистем полностью подтвердились.

Динамика общей активности каталазы и ее МФ в иле сооружений биологической очистки сточных вод НПЗ представлена в табл.13.

По ходу биологической очистки сточных вод активность каталазы увеличивается, что является следствием генерирования пероксида-водорода и его интенсивного превращения каталазой клеток ила. По мере прохождения биомассы ила к центру аэротенков активность МФ фермента увеличивалась и достигала максимума на выходе из них, причем. основная активность каталазы локализована в области К-2 /рис.5 в/. Низкая активность фермента вс вторичных отстойниках и

на входе в аэротенки, вероятно, связана с лимитом кислорода, поскольку в модельных экспериментах прекращение аэрации неизменно приводило к почти двухкратной инактивации каталазы.

Таблица 13

Показатели общей активности каталазы' и ее № ила сооружений биологической очистки сточных вод НПЗ .

Перьая ступень Вторая ступень

Показатели

вход центр выход вторичный отстойник центр вторичныи отстойник

Общая актив- 1,83 3,27 6,14 1,05 5,90 2,86

ность /кат.

число/мг

белка/

К-1 33,0 26,0 19,0 41,0 19,0 47,0

К-2 67,0 74,0 81,0 59,0 62,0 53,0

К-3 - - - - 19,0 -

Моделирование залповых сбросов сточных вод нефтехимических производств, а также залповые сбросы в производственных условиях показали значительную резистентность каталазы к действию токсикантов. К полному блокированию фермента приводила инкубация ила со свинецсодержащими сточными водами, а действие большинства органических компонентов сточных вод вызывало активацию каталазы /рис.5 г табл. 14/.

Реанимация и аэробная стабилизация ила, подвергшегося действию залповых сбросов сточных вод характеризовалась реактивацией фермента и выявлением большего числа МФ, чем в исходной экосистеме /рис.5 д/. Это подтверждают предположения об индуцированном синтезе полипептидов, обладающих каталазной активностью в ответ на окислительный и иные стрессы.

1 2 3

.11©

мттп

шш

Рис. А -

Б -

В -

Г -Д -

2 3:4 12 1

б. Спектры МФ каталазы экосистем актирного ила.

в моделях р фазах адаптации /1/, лог-роста /2/, стапио-к at пой /3/ г у конпе стационарной фазы /4/. р иловой роде р фазах адаптации /1/, лог-роста /2/ и г хонпэ стационарной фазы /3/.

первой ступени биологической счистки сточных род БЕЗ в

первой секции аэротенка /1/, в центре аэротенка /2/, на

выходе из аэротенка /3/ и в регенераторе /4/.

после залповых сбросов свкнепсодеркащях сточных вод /1/

и сточных вод производства CMC "Прогресс" /2/.

при реанимации после залпового сброса СЕИНвцсодбржащих

стсчкнх вод 24 ч /1/, то же 72 ч /2/.

Таблица 14

Общая активность каталазы ила после залповых сбросов сточных вод и их компонентов

Сточные воды, компоненты сточных вод

Каталазный показатель /каталазное число/мг белка/

СЖК . заводской фенол о-крезол диизобутил-

кодлектор

паракрезол

контроль опыт

г,18 1,73 1,80 2,05 1,03 3,40 2,94 3,99

2,00 3,47

Во всех образцах микросообществ грунтов водохранилищ и малых рек обнаружена каталаза. Установлена тенденция к увеличению ее активности в грунтах р. Волга в направлении от Самары к Саратову. В микросообществах донных осадков малых рек, принимающих условно чистые сточные воды промышленных производств, активность каталазы и ее гетерогенность значительно выше, чем в малых реках с естественным водосбором. Увеличение гетерогенности и активности фермента также установлено в районе сброса сточных вод Самары. Это является следствием накопления пероксида водорода в результате деградации органических загрязнений в клетках микросообцеств и в водной среде. Полученные результаты могут быть использованы при мониторинге гидроэкосистем.

Исследования белкового состава микробных сообществ активного ила и природных гидроэкосистем обоснованы тем, что информация подобного рода дает возможность оценить степень влияния различных факторов и стрессовых ситуаций на механизмы реализации генетической информации, прогнозировать последствия загрязнения водоемов и корректировать технологию биологической очистки сточных вод.

8. ФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ АКТИВНОГО ИЛА И ШКГОС00БЩЕСТВ ГРУНТОВ ВОДОХРАНИЛИЩ

На рис.6 а представлен спектр белковых фракций активного ила по фазам развития. Выявлено три фракции - быстрсмигрирующая с молекулярной массой J4,5-15,0 кД, вторая 43,5-45,0 кД и третья 57,0-60,0 кД. Пик концентрации белка во всех фракциях приходится на фазу адаптации,' далее наблюдается значительное снижение содержания белка во фракциях.

Фракционный состав белков активного ила действующих сооружений биологической очистки сточных вод НПЗ представлен на рис.6 б. В иле регенератора содержание белка в 1,5-2,0 раза выше, чем в других точках аэротенка. В первой секции в момент контакта ила со сточной водой установлено уменьшение белка во фракциях, а активность дегидрогеназ достигала максимума. Логично предположить, что количественные изменения в составе фракций белка обусловлены синтезом ферментов в фазе лог-роста в моделях и в первой секции аэротенка из нигкомолекулярных пептидов-предшественников, образующихся" из неферментного белка.

Фракции белка ила при действии сточных вод HIB и их компонентов представлены на рис.6' в. Инкубация ила с CMC "Прогресс" в зависимости от концентрации приводила к изменению электрофорети-ческой подвижности фракций, причем, последние выявлялись в виде "подков с зубчиками на краях" и с меньшим содержанием- белка. При концентрации детергента 150,0 мг/г ила фракции белка не выявились. Такие же результаты были получены при действии большинства компонентов сточных вод, сточных вод отдельных производств НПЗ и заводского коллектора. Реанимация и аэробная стабилизация илов сопровождалась индукцией и выявлением множества низкомолекулярных фракций белка/рис.6 г/. Эти данные подтверждают сведения о синтезе ни&комолекулярных индуцибельных металл-связывающих и стресс-зависимых белков.

В образцах грунтов водохранилищ к малых рек преобладают низ-

1234 1234

В Г

Рис,6. Фракционный состаг белков активного ила.

А - в моделях в фазах адаптации /1/, лог-роста /2/, стационарной /3/ и отмирания /4/.

Б - первой ступени биологической очистки сточных вод НПЗ в регенераторе /1/, в первой секции аэротвика /2/, в центре аэротенка /3/ и на выходе из аэротенка /4/.

В - после залповых сбросов сточных вод производства CMC "Прогресс" 50 мг/г ила /1/, то же 150 мг/г ила /2/ и свинецсодержащих сточных вод /3/.

Г - при реанимации после залповых сбросов сточных вод CMC "Прогресс" /1/, свинецсодержащих сточных вод 24 ч /2/, то же 72 ч /3/.

комолекулярные быстромигрирующие фракции, особенно в районах сброса сточных вод. Это может свидетельствовать о модифицирующем влиянии сточных вод и их компонентов на генетический аппарат гидроби-онтов или о постсинтетических изменениях фи8ико-химических свойств белковых олигомеров.

Таким образом, информация о структурной организации белков в микросообществах гидроэкосистем без вмешательства извне и при действии антропогенных факторов может быть положена в основу интегральной оценки их функционального состояния. С увеличением концентрации токсикантов белки клеток активного ила постепенно теряют способность фиксировать специфические красители. Это позволяет заключить, что действие сточных вод и их компонентов приводит к глубоким изменениям структуры белков и величины заряда, что в свою очередь является причиной нарушения механизмов электростатического взаимодействия молекул красителя с основными группами белка. Установленная зависимость применена при разработке способа биотестирования токсичности сточных вод.

9.БИОМОНИТОРИНГ АКТИВНЫХ ИЛОВ И ГРУНТОВ ВОДОХРАНИЛИЩ.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВЗАИМОСВЯЗЬ ДЕГЙДРОГЕНАЗ И КАТАЛАЗЫ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Модельные экосистемы активного ила функционируют и развиваются по классической схеме развития природных гидрозкосистем. К ним применимы общие положения окислительного обмена и представления о ферментах, как о самонастраивающихся катализаторах. В экспериментах указанные гидроэкосистемы выгодно отличаются тем, что цикл их развития можно проследить за несколько суток, а также возможностью варьирования факторов внешней среды в любых пределах и на любых уровнях.

Все исследуемые ферменты метаболизма ила представляют собой

олигомеры с различной степенью гетерогенности. Такая организация олигомерных ферментов по сравнению с мономеркыми имеет ряд преимуществ, хотя и кинетическая кооперативность не является следствием субъединичного строения. Агрегация субъединиц приводит к тому, что соотношение площади внешней поверхности к объему белка становится более благоприятным с точки зрения значения энергии стабилизации. Интересно отметить, что основная активность большинства ферментов концентрируется в области высокомолекулярных форм.

На переходе экосистемы ила из фазы адаптации в фазу лог-роста на фоне увеличения общей активности ферментов установлено значительное увеличение степени гетерогенности оксидоредуктаз за счет низкомолекулярных форм. Это объясняется или диссоциацией олигоме-ров на протомеры или индукцией адаптивных форм ферментов. Индукторами могут быть метаболиты, структурно схожие с субстратами, тем более, что для многих дегидрогеназ прокариотов нехарактерна строгая субстратная специфичность. Несомненно, что увеличение гетерогенности ферментов направлено на усиление гомеостаза экосистемы и ее стабилизацию. Переход экосистемы ила в фазу лог-роста характеризуется нарастанием каталитических функций цитоплазматических МФ и уменьшением количества неферментного белка в ¡метках ила.

При переходе в стационарную фазу установлено преобладание каталитических функций цитоплазматических К© у .ЛДГ и ГДГ, относительная активность мембрачосвяэачных форм ниже, что может быть объяснено усилением аэробных процессов и повышением напряжения кислорода в клетках ила. К, наоборот, отмечена активация мембра-носвязанных форм Гл-6-ФД, МДГ, а-ГФД и каталазы, цитоплазматичес-кие функции указанных ферментов много ниже. Эксперименты по лимитированию экосистем кислородом полностью подтвердили наши предположения: лимит кислорода активировал мембраносвязанные формы ЛД'Г и ГДГ и значительно снижал активность высокомолекулярных форм

Гл-6-ФД. МДГ и а-ГФД. Это позволило характеризовать ЛДГ и ГДГ как Ферменты анаэробна-аэробного метаболизма, а другие как ферменты аэробно-анаэробного метаболизма.

Общая активность всех исследуемых ферментов ила действующих сооружений биологической очистки» кроме ГДГ, возрастала от входа в азротенки к центрам. Во вторичных отстойниках, регенераторах и на входе в аэротевки установлено явное преобладание каталитических функций мембранных форм ЛДГ и ГДГ, а соответственно и реакций дегидрирования лактата и окислительного дезаминирования глутамата. В указанных точках сооружений биологической очистки наблюдается лимит кислорода. В момент контакта ила со сточной водой и перехода биомассы в аэрируемые участки активность мембранных форм ЛДГ и ГДГ резко снижается, в то же время активируются мембранные формы МДГ, Гл-6-ФД и й-ГФД. Мембраносвяаанная форма каталазы на протяжении зсего цикла очистки была более активной,■ чем даголлазматическая. Таким образом, в условиях относительного анаэробиоза генерация восстановленного NAD и энергетическое обеспечение клеток ила осуществляется ЛДГ и ГДГ. в аэробных условиях функции энергообеспечения передаются МДГ, Гл-6-ФД и «-ГФД. Последовательное включение МФ исследуемых ферментов в процессы окисления указывает на тонкую регуляцию функционирования систем биологической очистки.

Гетерогенность оксидоредуктаз ила возрастает от регенераторов и вторичных отстойников к центрам азротенков. Установленная закономерность объясняется нарастанием разнообразия метаболитов в процессе очистки сточных вод. Здесь следует остановиться на факте уменьшения количества белка в неферментных фракциях от вторичных отстойников и регенераторов к центрам азротенков, такую же закономерность наблюдали при переходе от фазы адаптации к фазе лог-роста. Это подтверждает синтез специфических ферментов из низкомолекулярных белков-предшественников, образующихся путем частичного

протеолиза неферментного белка клеток ила.

В иловой воде экосистем ила обнаружены только ниэкомолекуляр-ные формы ферментов, мембраносвязанные не установлены. Причем, МФ выявлены в основном только в фазе лог-роста и стационарной. Исключением является каталаза, Ш> которой прослеживаются на всех фазах, развития экосистемы. По электрофоретической подвижности зкзофер-менты ЛДГ, «-ГФД, Гл-6-ФД и МДГ соответствуют таковым эндофермен-тов, у ГДР и каталазы такого соответствия нет. Индукция и транспорт низкомолекулярных форм ГДГ и каталазы объясняются избытком субстратов - пероксида водорода и аммонийного азота, свободно диффундирующих в водную среду. В иловой воде выявлены только минорные формы ГДГ, обладающие ассимиляционными, аминирующими функциями. На данном этапе не представляется возможным дать однозначный ответ на факт генерации каталитически активных МФ ЛДГ', МДГ, Гл-6-ФД и а-ГФД вне клеток ила. Этот вопрос может быть решен только после проведения специальных экспериментов. Тем не менее, наличие их в водной среде указывает на непосредственное участие низкомоле-кулярньи каталитически активных пептидов в достижении гомеостаза экосистемы и ее стабилизации.

Острые токсикологические эксперименты в моделях ила и на действующих сооружениях биологической очистки показали, что большинство сточных вод НПЗ и их компоненты являются неконкурентными ингибиторами ферментов окислительного метаболизма. Следует отметить, что высокомолекулярные мембраносвязанные формы ферментов ила более подвержены действию токсикантов, следствием чего является блокирование мембранных систем энергообеспечения клеток ила и нарушение взаимосвязи функционирования цитоплазмы и мембран. Это в свою очередь приводит к дисбалансу энергетики активного ила, размыканию цепи событий метаболизма в ключевых точках и нарушению общей системы энергетического статуса гидроэкосистем. Действие

токсичных компонентов сточных вод в зависимости от концентрации приводит к различной степени изменениям в структурной организации белков активного ила и перераспределению соотношения полярных и неполярных групп на поверхности молекул белка, что является основной причиной нарушения механизмов электростатического взаимодействия молекул красителей g основными группами белка. Установленная закономерность нами применена как основа разработанного способа биотестирования токсичности сточных вод.

Перейдем к рассмотрению биохимических адаптационных механизмов микросообщестЕ гидроэкосистем в ответ на действие антропогенных факторов. Как указывалось выше, залповые сбросы сточных вод приводили к блокированию большинства исследуемых ферментов ила, экосистемы оказывались на грачи метаболического шока. Устранение действия токсикантов, реанимация и стабилизация ила сопровождалась индукцией и выявлением множества низкомолекулярных форм ферментов и неферментного белка. Анализируя результаты, мы пришли к выводу, что в стрессовых ситуациях в микросообществах гидроэкосистем срабатывают механизмы компенсаторной адаптации, заключающиеся в следующем: резкое ингибирование активности мембраносвязанных форм ферментов приводило к неадекватному уменьшению образования восстановленного NAD в мембранах, а следовательно и к уменьшению потока электронов и протонов в системе дыхательной цепи. Поскольку перенос электронов сопряжен с окислительным фосфорилированием, 'соотношение ATP/ADP падает, экосистема оказывается в ситуации энергетического кризиса. Понижение энергетического заряда ведет к мобилизации ферментов окислительного метаболизма, положительным модулятором является повышение концентрации ADP. Экспресс--биосинтез субъединиц мембранного типа не сопровождается их кооперацией в олигомеры и локализацией в цитоплазматической мембране. Каталитически активные субъединицы ориентируются в околомембранном прост-

ранстве и выполняют роль "реаниматоров". В условиях, лимитированных энергией, по-видимому, выгоднее вырабатывать каталитически активные субъединицы с возможно более широкой субстратной специфичностью, чем олигоыер с пониженными каталитическими функциями. Иными словами, в ситуациях, близких к состоянию метаболического шока, клетки микросообществ гидроэкосистем синтезируют низкомолекулярные субъединицы ферментов с гибкой третичной структурой, а не олигоме-ры, слабые связи которых в условиях уменьшения энергии становятся довольно жесткими и прочными. По активности они уступают олигомер-ным Щ>, однако роль их чрезвычайно важна - обеспечение жизнеспособности клеток в экстремальных условиях.

Почти во всех образцах грунтов исследуемых водохранилищ и малых рек обнаружены МФ оксид ope дуктаз с. различной степень» гетерогенности. Частота встречаемости низкомолекулярных форм МДГ, «-ГФД и Гл-6-ФД выше, чем мембраносвязанных. В районах сброса сточных зод городов, ajraraie 20-30 км по течению от мест сброса гетерогенность ферментов и белка более выражена. Отдельно следует рассмотреть структурные особенности и активность МФ ГДГ в микросообществах грунтов водоемов. Выявлены как основная, так и минорные формы фермента, однако активность минорных форм в 5-8 раз выше ГДГ-5, Это свидетельствует об интенсивнейших процессах восстановительного аминирования 2-оксоглутарата и, соответственно, об ассимиляционных функциях фермента и изъятия m воды аммонийного азота. Установленная динамика МФ фермента указывает на избыток субстрата - аммонийного азота в водной среде, что подтверждено химическими анализами. В образцах грунтов малых рек, связанных с повышенной техногенной нагрузкой, также установлена более выраженная гетерогенность исследуемых ферментов.

Таким образом, структурная организация и динамика активности оксидоредуктаз микросообществ грунтов в целом свидетельствуют о

неблагоприятной ситуации водоемов Среднего Поволжья. Увеличение гетерогенности ферментов окислительного метаболизма и неферментных белков направлено на достижение гомеостаза и стабильности гидроэкосистем, подвергающихся мощным-антропогенным нагрузкам. Изменения в структурной организации некоторых ферментов энергетического обмена и неферментных белков микросообществ грунтов водоемов указывают на модифицирующее влияние сточных вод городов на генетический аппарат гидробионтов, а также на возможность постсинтетических изменений физико-химических свойств белковых олигомеров.

ВЫВОДЫ

1. В фермент,ах активных илов, грунтов водохранилищ и малых рек обнаружены молекулярные формы. В зависимости от возраста, функционального состояния и других факторов устанавливаются определенные соотношения между набором К© и активностью ферментов. Изменение набора и активности МФ ферментов сообществ гидроэкосистем является одним из основных способов регуляции и коррекции метаболизма. Результаты исследований позволили дополнить общепринятую систему биохимической адаптации водных экосистем П.Хочачки и Дж.Сомеро.

2. В моделях активного ила и в процессе биологической очистки сточных вод в производственных условиях установлено увеличение гетерогенности ферментов окислительного метаболизма в области низкомолекулярных форм, направленное на усиление гомеостаза и стабилизацию экосистем активного ила. Это объясняется или диссоциацией олигомерных МФ на димеры и лрогомеры, или индукцией адаптивных низкомолекулярных форм ферментов, индукторами которых могут быть метаболиты, структурно схожие о субстратами специфических ферментов.

3. Энергетическое обеспечение клеток активного ила в условиях относительного анаэробиоза (вторичный отстойник, регенератор) осуществляется ферментами анаэробно-аэробного метаболизма (ДЦГ, ГДГ), а в аэробных условиях функции энергообеспечения передаются ферментам аэробно-анаэробного метаболизма .(МДГ , Гл-6-ФД, «-ГОД). Последовательное включение ферментов в процессы окисления свидетельствует о тонкой регуляции метаболизма и функционирования активного ила.

4. При переходе от фазы адаптации к фазе лог-роста в моделях, а также от вторичных отстойников и регенераторов к центру аэротенков на фоне двух-трехкратной активации ферментов установлено уменьшение в клетках активного ила неспецифического белка. Это позволяет предположить, что в активных илах кроме тонкой и быстрой субстратной и аллостерической регуляции активности оксидоредуктаэ существует грубый и медленный контроль вследствие увеличения концентрации ферментных белков за счет сборки последних из низкомолекулярных пептидов-предшественников.

5. Индукция, синтез и выход в водную среду низкомолекулярных форм ферментов активного ила в моделях и на действующих сооружениях биологической очистки обусловлена нарастанием разнообразия экзомета-болитов-аналогов субстратов и направлены на достижение гомеостаза и стабилизацию экосистем активного ила.

6. Высокомолекулярные мембраносвяванные формы ферментов активного ила в больней мере подвержены ингибирующему действию сточных еод нефтехимических производств и их компонентов, чем низкомолекулярные. Следствием этого является блокирование мембранных систем энергообеспечения организмов активного ила и нарушение взаимосвязи функционирования цитоплазмы и мембранных структур, что в свою очередь приводит к дисбалансу всей энергетики вплоть до метаболичес-

кого шока.

7. Действие высокотоксичных сточных вод нефтехимических производств и их компонентов приводит к различной степени изменениям в структурной организации белков активного ила, заключающимся в вероятном перераспределении соотношения полярных л неполярных.групп на поверхности молекулы белка с последуюп№»-иэменением-ее химической активности и злектрофорегкческой подвижности.

8. Реанимация и аэробная стабилизация экосистем активного ила, подвергшихся действию высокотоксичных сточных вод и их компонентов, сопровождается выявлением в низкомолекулярных областях элект-рофореграмм множества МФ, МЯГ.ГДГ, Гл-6-ФД, а-ГФД, каталазы и фракций неспецифического белка.

9. В стрессовых ситуациях в активных плах вследствие резкого инги-бироваиия мембраносвязанных № Ферментов энергетического метаболизма срабатывают механизмы компенсаторной адаптации, обусловленные мобилизацией ферментов энергетического обмена и экспресс-биосинтезом низкомолекулярных субъединиц мембранного типа - "реаниматоров"

10. В микросообществах грунтов водохранилищ и малых рек при действии антропогенных факторов происходят изменения в структурной организации ферментов энергетического обмена, каталазы и фракций неспецифического белка. Это свидетельствует о модифицирующем влиянии последних на генетический аппарат гидробионтов или о постсин-тетичесушх изменениях физико-химических свойств белковых олигоме-ров, что может служить тестом для оценки и прогноза экологических последствий загрязнения водоемов.

11. Впервые показана перспективность метода диск-электрофореза в гидробиологии, позволившего разработать систему экспрессных, высо-

¡«информативных, интегральных способов биомониторинга модельных и природных гидроэкосистем по динамике изменения активности и степени гетерогенности Кй> некоторых ключевых ферментов окислительного метаболизма. Способы подтвержены авторскими свидетельствами и патентами. Внедрение способов биотестирования токсичности промышленных сточных вод и их компонентов, а также способа технологического контроля за работой сооружений биологической очистки в практике лабораторий охраны окружающей среды на промышленных предприятиях и городской станции аэрации позволило значительно улучшить состояние водоемов Самарской области.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы :

1. Гюнтер Л.И., Шаталаев И. Ф., Еакулкн Н.Д. Оценка токсичности компонентов сточных вод нефтехимических производств,- Водоснабжение и санитарная техника.- 1983.- N 7.- С. 26.

2. Шаталаев И.Ф. Вакулин Н.Д., Либерман А.Д. Оценка комбинированного токсического действия некоторых компонентов сточных вод нефтехимических производств по дегадрогеназной активности ила.-Тез.докл.респ.конференции "Окружающая среда и здоровье населения".- Таллин, 1984.- С. 62-64.

3. Шаталаев И.Ф., Вакулин Н.Д., Либерман А.Д. Исследование комбинированного токсического действия некоторых фенолов и альдегидов на дегидрогеназы активного ила.- В сб. "Вопросы коммунальной и промышленной гигиены".- М., 1984.- С. 33-37.

4. Гюнтер Л.И., Шаталаев И.Ф. К предупреждению загрязнения водоемов сточными водами нефтехимических производств.- Водные ресурсы.-1986.- N г.- С. 135-143.

5. Шаталаев И.Ф., Волгина Т.Е., Первушкин C.B. Множественные молекулярные формы малатдегидрогеназы экосистемы активного ила.-Тез.докл.регион.конференции "Экологические проблемы Волги",- Саратов, 1989.- С. 264-265.

6. Шаталаев И.Ф., Щеголева Е.В., Вакулин Н.Д. Активность каталазы и ее множественных молекулярных форм в процессе биологической очистки сточных вод органических производств.- Тез.докл. регион, конференции "Экологические проблемы Волги",- Саратов, 1989,-С.266-267.

7. Щзтэлаев й.Ф., ¡Цеголева Е.В., Либерман А.Д. Активность глута-матдегидрогенавн и ее множественных молекулярных форм в процессе биологической очистки сточных вод органических производств.-Тез.докл.Всесоюзн.конференции "Технология очистки воды и создание водооборотных систем",- Одесса, 1989.С. 149-150.

8. Волгина Т.Е., Шаталаев И.Ф., Первушкин C.B. Множественные молекулярные формы лактатдегидрогенааы экосистемы активного ила.-Тез.докл.Всесоюзн.конференции "Технология очистки воды и создание водооборотных систем",- Одесса, 1989,- С. 151-153.

9. Шаталаев И.Ф. и др. Активность неспецифических дегидрогеназ ила в процессе очистки сточных вод промышленных производств.- Рукопись дел. в ВИНИТИ.- N 2471-В 89,- Куйбышев, 1989,- 12 с.

10. Шаталаев И.Ф., Бакулин Н.Д., Тумаков С.А., Первушкин C.B. Способ определения токсичности сточных вод промышленных производств.-Авторское свидетельство СССР.- 1990.- N 1622400.

11. Шаталаев И.Ф. и др. Исследование лактатдегидрогеназы, малатде-гидрогенааы, каталазы и их молекулярных форм в процессе биологической очистки сточных вод органических производств.- В сб.научн. тр. "Гигиеническая оценка окружающей среды".- М., изд-во Московского НИИГ им. Ф.Ф. Зрисмана,- 1989,- С. 87-91.

12. Шаталаев И.Ф., Волгина Т.Б. Метод биотестирования токсичности соединений антропогенного происхождения.- Тез.докл.респ.конференции "Пути уменьшения антропогенного воздействия на курортные ресурсы".- Одесса., 1990.- С.141-143.

13. Шаталаев И.Ф. и др. Способ биотестирования токсичности промышленных сточных вод.- Авторское свидетельство СССР.- 1991,- N 1684664.

14. Шаталаев И.Ф., Бакулин Н.Д. Электрофорез в контроле биологической очистки сточных вод промышленнах производств.- В сб. на-учн.тр.СМИ. - Самара, 1951.- С. 75-81.

15. Телитченко М.М., Шаталаев И.Ф. Биохимическое разнообразие как регулятор устойчивости экосистем.- Дога. АН СССР,- 1991.- 321, N 6.- С. 1288-1290.

16. Шаталаев И.Ф. и др. Способ определения токсичности промышленных сточных вод.- Авторское свидетельство СССР.- 1992.- N 1751670.

17. Шаталаев И.Ф., Телитченко М.М. Молекулярные формы малатдегид-рогеназы активного ила в процессе очистки сточных вод на городских станциях аэрации,- Химия и технология воды.- 1992.- 14, N 9.- С. 713-717.

18. Телитченко М.М.. Шаталаев И.Ф., Волгина Т. Б. Динамика молекулярных форм лактат-, малат- и глюкозо-6-фосфатдегвдрогеназ в моделях экосистемы активного ила,- Гидробиологический журнач,- 1992.28, N 3,- С. 32-39.

19. Телитченко'М.М., Шаталаев И.Ф. Методы выявления молекулярных форм некоторых оксидоредуктаз микроорганизмов активного ила.- Гидробиологический журнал.- 1992." 28, N 2,- С.70-74.

20. Шаталаев И.Ф. Фракционный состав белков активного ила очистных сооружений нефтеперерабатывающего завода,- Гидробиологический журнал,- 1992.- 28, N 5.- С. 28-32.

21. Шаталаев И.Ф., Телитченко М.М. Динамика ключевых ферментов организмов активного ила.- Водные ресурсы.- 1993.- 20, N1.-0. 19-23.

22. Шаталаев И.Ф., Телитченко М.М., Чистяков Н.Е., Калинин И.В. Способ технологического контроля процессов биологической очистки сточных вод на городских станциях аэрации.- Патент РФ.- 1994,- N 2014596.

23. Махова А. Н., Суздальцева Т.Н., Шаталаев И.Ф. Исследование влияния производных полихлорбензола ЧЗХУ на окружающую среду и здоровье человека.- Тез.докл. Всеросс..конференции "Экология городов. Ресурсосберегающие и экологически чистые технологии",- Самара, 1993.- С.54-56.

Информация о работе

Шаталаев, Иван Федорович
доктора биологических наук
Москва, 1995
ВАК 11.00.11

Автореферат

Похожие работы