Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экдистероиды в культуре тканей и клеток Ajuga turkestanica (Rgl.) Briq. и возможность регуляции их биосинтеза

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Экдистероиды в культуре тканей и клеток Ajuga turkestanica (Rgl.) Briq. и возможность регуляции их биосинтеза"

академия наук республики узбекистан Институт микросиологш

На правах рукописи

ЗАКИРСВА Рано Пулатовна

экдмстерсиды в культуре тканей и клеток А^ига

гиткезгап1са (ВД..) ВгЗц. И возможность регуляци». их биосинтеза

03.00.23 - Биотехнология

автореферат диссертации Еа соискэние ученой степени кандвдата биологических наук

Ташкент - 1992

Работа выполнена в Институте химии растительных веществ АН РУз.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

ЛЕВ C.B.

Научный консультант: чл.-корр. АН РУз, доктор

химических наук АБУБ&КИРОВ Н.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

проф. РАХИМОВ М.М. доктор биологических наук 1ЖЧЕНИЩН В.П.

Ведущая организация - Институт эксперимэьтальнсй биологии

растений АН РУз.

Защита состоится HÎ^i^fr. 1992г. в /Л\ час на

заседании специализированного совета Д 015.02.01 по защите диссертаций на соитясанче ученой степени доктора наук в Инсгитуте микробиологии АН Республк-аа Узбекистан по адресу: 700128, Ташкент, ул.А.Кадыри, 76.

С диссертацией мояно ознакомиться в фундаментальной биб-лиогеке АН РУз.

Автореферат разослан ".гГ." . 1992г.

Ученый секрэтарь специализированного совета, гэшщцат биологических наук

ХОДШЗАЕВА С.М.

8"V-'-; .-rr.EHStt!

дисс-лщиб

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГАБОТЫ

Актуальность проблемы. Растительный мир является огромным источником для химико-фармацевтической промышленности. 'Растения остаются поставщиками широкого набора лекарственных веществ. Большой практический интерес представляет фитоэкдистероиды, обладанию высокой физиологической активностью. По свогп структуре их относят к гормонам линьки насекомых. Поэтому они могут использоваться для разведения полезных насекомых или применяться как безопасное для окруаавдей среды средство защиты растений от вредителей. Установлено анаболическое и тонизирущее действие этих соединений (Сырев, Курмуков; 1976, Абубакиров и др., 1936; Ахрем, Ковченко, 1989). К настоящему времени экдкетероицы обнаружена приблизительно в 90 видах растений (Абубакиров, 1981). Однако ареал большинства из них ограничен. Для культивирования полезных растений необходимо привлекать новые посевные площади. Растительное сырье не может заготавливаться круглогодично, содержание полезных веществ в нем не стабильно, зависит от поч-венно-клшатических условий, сроков заготовки.

Альтернативным способом получения продуктов Еторичного метаболизма является метод культуры клеток и тканей растений. Экологическая и экономическая ситуация в мире позволяет считать, что метод клеточной технологии является наиболее перспективным.

Многочисленные ¿эксперименты убедительно доказали, что в условиях стерильной культуры реально получить все группы вешеств с различным спектром фармакологического действия (Fukuya, 1967; Puhan, Martin, 1971; Фаулер, 1987)

Основными этапами работ по созданию препаратов методом культуры тканей и клеток язляются следующие : экономически обоснованный выбор объекта, пэрвкчгое введение в культуру in vitro интересурдего вида растения, химичеокое и фармакологическое изучение по количественному и качественному составу биологически активных веществ, оптимизация сред и параметров выращивания для роста и выхода продукта метаболизма, генетическая работа по получению продуктивных мутантов (Fowler, 1986).

Пель и задачи исследования. Целью настоящих исследований являлось получение культуры тканей и клеток, продуцирукдих экдистероиды в условиях in vitro, а такхе изучение возможности

регуляции роста культуры и биосинтеза продуктов вторичного метаболизма воздействием различных факторов.

В этой связи били поставлены следущиэ задачи:

1. Ввести е культуру -тканей некоторые виды растений, продуцирующие экдистероиды.

2. Разработать условия культивирования каллусных тканей из разных оргазов растений.

3. Получить суспензионную культуру клеток из продуктивной каллусной ткани.

4. Установить оптимальные концентрации минеральных солей, углеводов и фихогормонов для максимального Еыхода биомассы и продуктов вторичного метаболизма.

5. Изучить действие мутагена на продуктивность каллусной ткани.

6. Провести качественный и количественный анализ химического состава синтезируелщх веществ.

Научная новизна. Впервые получены каллусные ткани из разных органов растений видов Rhaponticum carthamoides (Wild. Iljln) Silene praemixta M.Pop., Silene brahuica Вэ1бз., AJuga turkesta-nica (Kgl.) Briq. Получена суспензионная культура клеток A.tur-kestanlca, сохраняющая способность синтезировать экдистероиды.

Проведена полная идентификация продуктов Еторичного метаболизма и установлено количественное содержание эвдистероидов в каллусной и суспензионной культуре.

Изучено влияние компонентов питательной среды на рост суспензионной культуры A.turkestanlca и на выход эвдистероидов. •

Исследовано 'действие мутагена N-HMM на выход продуктов вторичного метаболизма.

Показана возможность получения эвдистероидов методом культуры клеток.

Практическая ценность. Определены циклы роста, сроки культивирования каллусной и суспензионной культуры клеток. Получен продуктивный мутантный штамм. Клеточная культура AJuga turkestanlca изучена в лабораторных условиях и может быть использована при разработке технологии выращивания клеток в промышленности. Культура клеток А,turkestanlca является перспективным источником эвдистероидов.

Публикация результатов исследований и апробация. Материалы диссертации представлены в двух печатных работах. Результаты

исследований долозены и представлены на конференции колодах ' ученых Института химии растительных веществ АН УзССР (1987} н? ВсесошЕом Менделеевском съезде (1968), на I и II Всесоюзных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (I9S0, 1391).

Объем работы. Диссертация состоит Еве^едия, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и приложения. Работа изложена на 126 страницах. Список литераторы содержит 217 названия, в том числе 125 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 19 рисунками.

Автор вкражает признательность за помощь в проведении экспериментов и ценные замечания чл.-корр. РАН Бутенко Р.Г., к.б.н. Носову A.M., к.б.н. Карановой C.JI. (Институт фиьиологш растений Российской Академии Наук).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. -

Объектами ^следований служили следуодта виды растений:

1. Rhaponticum carthasnolúes (Wild. 11,11л) семейство Coipoaitae. В цветках и листьях содержатся соответственно 0,276% и 0,058£ экдистерона (Якубова и др., 1977; Аоубакиров, 1981).

2. Sllene trahulca. Boisa, (сем. Caryoplijllceae). В цветк£х, в листьях и корнях растения содержится экдистерон (Саатэв. и др., 1981)

3. Silene praealxta H.Pop. - еыхом в цветках и листьях составляет 0,65% (Саатов и др., 1979) ,.

4. AJuga turkestnnica (.Tgl.) BrJq. (сэм. LaMatae). В надземных и подгемеьх органах содержатся пкдистёрон и другие экдистероиды (Усманов и др., 1973, 1975, 1978).

Растения предоставлены Боташгсвсхим садом им. Ф.Н.Русанова АН ?Уз.

Метод получения кзллусной ткани. Каллусные ткани получали по общепринятой методике (Бутенко, 1964; Диксон, 1989). Зксплян-ты ЕпсахиЕали на поверхность агаризс-занной питательной среды, состав которой следующий: минеральная часть - по Мурасиге и Ску-гу (Murashige, Skoog, 1962), инозит - 100 чг/-; тиамин НС1 -0.4 мг/л, сахароза - Зс, агар - 0.75?, рН'- 5,7.

Ткани выралитвали при температуре 26 ± 2 °С, освещенности

5000-7000 лике с 16-часовым фэтопэриодом или в темноте. Пересадку культуры осуществляли через каждые 4-5 недель.

Для индукции каллусогенеза были составлены следущие соотношения регуляторов роста:

- инд-лил-3-уксусная кислота (НТК) - 2 мг/л и тидиазурсн (дефолиант Дропп) - 0,002 мг/л;

- ИУЕ - 2 мг/л и кинетин - 0,2 мг/л;

- 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) - 0,1 кг/j. и Дропп - 0,002 мг/л;

- 2,4-Д - 0,1 кг/л и кинетин - 0,2 мг/л.

Дальнейшее пассирование ткани проводил: на средах со следующим соотношением регуляторов роста:

- без добавления регуляторов роста;

- а-нафтилуксусная кислота (ПУК) - 0,1 мг/л и Дропп - 0,0002 мг/л;

- НУК - 0,1 мг/л и Дропп - 0,002 мг/л;

- НУК - I мг/л и Дропп - 0,0002 мг/л;

- НУК - I мг/л и Дрот - 0,002 мг/л.

Метод получения суспензионной культуры клеток. Каллусную ткань переносили в жидкую питательную среду следующего состава: 1/2 части минеральных солей по Мурасиге и Скугу , сахароза -30000 Ш'/л. инозит - 100 мг/л, тиамин HCl - 0,4 мг/л, НУК -I мг/л и Дропп - 0,0002 мг/л. Колбы с культурой помещали на качалку с эллиптическим вращением ь выдерживали в темноте при 26°С и частоте качания 100 об/мин.

Для получения высокодиспергированной клеточной суспензии использовали методику Негруци и Джекобса (Ne^utlu, Jacobs, 1977). Суспензионную культуру клеток пассировал! через 14 дней. Для этого инекулят переносили в стерильных условиях в свекую питательную среду в соотношении 1:4.

Показатели роста (сырая и сухая масса, плотность клеточной популяции, жизнеспособность клеток) определяли по общепринятой методике (Диксон, 1989).

Метод химического анализа каллусной и суспензионной культур. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на закрепленном слое силикагеяя, содержащего 7% гипса и на пластинках Slluíol (ЧССР). Хроматографировали системой хлороформ - метанол в соотношении 4:1. Природные зкдистероиды проявляли на ТСХ ванилин - серной кислотой (Ахрем, Ковчанко, 1989).

Полуколичественный метод основан на использовании стандартного образца для контроля индивидуальных лекарственных веществ (Арзамасцэв и др., 1978).

Выделение экдистеровдов из культуры клеток и тканей проводила методом колоночной хроматографии.

Метод математического планирования эксперимента. Оптимизацию питательной среды проводили по методу В.П.Малышеза (1977). Рассматривали следушие факторы питательной ереды: HH4N03,KN0a, КН2?Ол, сахарозу, НУК и Дропп. Выбранные интервалы уровней изменения факторов сведены в табл.1. Составлено 25 вариантов питательных сред согласно матрице экспэримегта, на которше высевали суспензионную культуру клеток. На 14 день культивирования определяли сырой вес и содергание туркестерона в сухих образцах

Обработку экспериментальных данных проводили на основе разработанного комплекса прикладных программ на языке "Фортран" для персональных ЭВМ типа JBM PC/AT/ХТ.

Табл.1

Уровни варьирования факторов (мг/л)

Факторы Уровни концентрации

X NH N0 4 3 250 500 750 1000 1250

X КН РС> 2 4 25 50 75 100 150

X кто. э 50 250 500 750 1250

X Сахароза 10000 20000 30000 40000 500G0

X НУК 0 0.1 0.5 1 5

X Дропп 0 0.0002 0.001. 0.002 0.01

Изучение мутагенного действия К-НММ на калдусную культуру. Я-НШ растворяли в дкметилформ^лиде и разбавляли кадкой питательной срэдой. Стерилизовали через бяк-гэриалышй фильтр (ЗС5) и добавляли асептически к клетсчной массе. Культуру инкубиро-

вали з растворе мутагена в .еченке I часа, затем 3-5 кратно отмывали избытком св®кей питательной среды. Каллуснуа культуру рассеивали в чажки Петри по 5 инокулшов весом по 500 мг. Клеточную суспензию высаживали в колбы с кидкой питательной средой. Интенсивность роста определяли к концу второй недели культивирования. Применяли методику экспериментального мутагенеза, разработанную для диоскереи дельтовидной (Каранова, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. •

Отбор продуктивной каллусной ткани. Для получения перьич-ного каллуса были использованы стебли и листья стерильных проростков Hiiapontlcum cartamoides и Sllene brabulca, а также листья и стебли Sllene praemlxta, стебли и завязи.AJuga tur-kestanlca генеративных растений.

Наблюдения показали, что оптимальными индукционными вариантами были среды, содержащие ИУК - 2 мг/л и кинетин - 0,2 иг/л; 2,4-Д - 0,1 мг/л и Дропп - 0,Х2 мг/л. Однако время пролиферации, форма г- интенсивность каллусообразования в значительной степени зависила от ввдз и происхождения экспланта. Так, у листовых и стеблевых эксплаятов S.praemlxta каллусогепез начинался через 4-5 дней. Медленное образование каллуса было характерно для S.brshulca и A.turKestanlca. Экспланты S.tirahuica давали обесцвеченную плохо растущую ткань. Можно говорить о том, что переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к активному клеточному делению обусловлен изменениями в реализации генетической информации на основа ее репрессии и депрессии. У растений различных систематических групп это проявляется неодинаково.

Б процессе пассирования наибольший прирост биомассы дала каллусная ткань Aduga turkestanlca. На среде без регуляторов роста и на среде, где концентрация НУК составляет ОД мг/л пролиферация каллуса как стеблевого, так и полученного из завязи была слабой. ПУК в концентрации I мг/л шесте с Дропп в концентрации 0,002 мг/л наиболее сильно индуцировала каллусов-'рззова-ние. 3s 5-6 недельный цикл роста скрой вес каллусной ткани А. turkestanlca увеличивался в 6-7 раз. Наименьший рост ткани наблюдался у R.carthsEoldes.

Анализ показал, что синтез экдистеропдов, свойственных

интзктнем растениям ЕЬаропИсш саг^ато1с!ез, БИепе ЬгаЬи1са, 511епе ргает1х1;а на уровне неорганизованно растущей каллусной ткани не сохраняется. Только в каллуснкх тканях, полученных из завязи и стебля А^иза tuг]ceзtanIca обнаружены эвдистероя и туркестерон (таблица.2).

Таблща 2. Наличие экдистерсидов в кэллусных тканях исследованных видов.

Ввд растения Исходный орган Налит» экдистароидов

эвдистерон туркестерон

Кшр^пгХсит стебель _

оаг'кЬааю1йев лист проростка - - -

ЗИепе ргае- стебель -

mlxta лист взрослого

растения — —

Б11епе ЪгаЬи- стеболь пророст- - -

1са ка

А^и^а 1гигк9б- стебель взросло-

tarllca го растения + +

завязь взрослого

растения + +

Выход этих соединений в ткани полученной из завязи был на порядок визе, чем в ткани стеблевого происхождения. Поэтому дальнейшие исследовгнпя проводилюь с этой культурой.Пассировали каллусную ткань завязи АЛигкез1ап1са на среде с НУК - I мг/л и Дропп - 0,002 мг/л.

Изучение физиологических особенностей роста суспензионной культуры клеток АЛида *игкезгап1са. Задачей данных исследований бпло получений пассируемой, активно-растущей суспензионной кло-точной культуры АЗи^а гиг!сезгап1са, изучение ее динамики роста.

Трехнедельную каллусную ткгнь, предварительно измельченную, переносили в жидкую питательную среду.

В первые пассажи клеточная культура А^ида. Шгкез1ап1са

характеризовалась образованием крупных агрегатов с сильно выраженным ризогенезом. Крупные агрегаты отличались высокой жизнеспособностью и активным делением клеток. Одиночные и небольшие группы клеток в основном были разрушены.

Жизнеспособная клеточная культура была получена после многократного отбора ыелкоагрегирозанной фракции. В цэлях изучения динамики "роста клеточной популяции на 3, 6, Э, 12, 15, 13, 24 день культивирования снимали пробы для определения показателей роста: сырая и сухая масса, жизнеспособность клеток, плотность клеточной популяции, кривую роста составляли по трем повторностям. Рост клеточной культуры характеризовался Б-об-разной кривой (рис.1). После пересадки на свежую питательную среду лаг-фаза длится в течение 3 суток. На 4 сутки начинается экспоненциальная фаза роста, в ходе которого происходит логарифмическое увеличение числа клеток и сухого вещества. Эта фаза длится 3-4 суток. Линейная фаза характеризуется сшшэнием удельной скорости роста, замедлением клеточного деления, увеличения среднего размера клеток и клеточной диссоциации. Максимальное число клеток культура достигала на 14 дэзь культивирования. Жизнеспособность культуры .составляла 85 % (Рис',1). Дальнейшее увеличение веса связано с растяжением клеток. Увеличивается обьем цитоплззмы клетки, размеры клеток.

Анализ проведенный методом ТСХ показал наличие в культуре экдистероне и туркестерона.

Полученная суспензионная культура представляет интерес для дальнейшее физиологических и генетических исследований в целях получения более продуктивных штаммов.

Выделение и количественное определение продуктов вторичного метаболизма. Для проведения химического анализа использована каллусная ткань после 6-7 пассажа в 5 недельном возрасте и суспензионная культура клеток 5-6 пассажа на 20 сутки культивирования.

Количественное определение с помощью весового метода проводили два раза. При выделении из. сухой биомассы каллуса в пэпвох случае из 40 г было выделеЕО 43 мг зкдистерона и 13 мг туркестерона, во втором случае из 30 г сухой ткани выделено 34 мг и 10 мг соответственно. Содержание зкдистерона и туркестерона в культуре клеток А.tщ•Kestanica роставило в первом случае из 45 г — 54 мг и 16 мг, во втором из 30 г сухой культуры - 36 мг и II мг исследуемых веществ соответственно.

(vw;яошвгх)sG¡ * / 9urùO/tuJOt>u

чъ

<о

00

<\i

о>

г

*ои/г>1/и С/í) QUJ30HÇD20û0dHçr>tft *

§

Vi.

с*

\

у

-л

\ \ n * • ч

Ч \ *

\

*

N

з

о

>

а ç

■о

* о

V U

? "

ч

nS4

\

\

\ > \

\

\

5« ö> о

с/г ) 0*9 рохЛд

<г>

<3

»о

я

О

О

а,

с>

«О

О

о

ю

S

s

Vj

(У/г) nodutj

о

Анализ показал, что содержание эвдистерона в каллусной ткани и суспензионной культуре АЗл^а 1игкезгап1са в несколько раз больше, чем в надземной части и корнях растения (табл.З). Содержание туркесторона е корнях растения, произрастающего в естественных условиях в каллусной ткани и в культуре клеток вполне ср2?н::мо. В надземных органах естественно произрастающих растений туркестероз отсутствует. дц

Табл.3

Сравнительное содержание экдистерона и туркестерона ' в растительном сырье, каллусной ткани и культуре клеток.

Вид сырья В % от веса воздушно-сухого сырья

Эвдистерон Туркестерон

Листья растения (Усманов и др.,1977) Корни растения (Усманов и др.,1977) 0С020 0,045 0,052

Каллусяая ткань:

Эксперимент I С,100 0,032

Эксперимент 2 0,110 0,033

Культура клеток:

Эксперимент I 0,12 0,035

Эксперименх 2 0,12 0,036

Полученные вещества по своим физико-химическим■константам

i спектральным данным (ИК-, ПМР-, масс-спектроскопия) идонгифя-щрованы соответственно с известными экдистероидами: екдостерон i туркестерон (?аол.4,5).

I Оптимизация питательной среды для прироста Сиеуассы куль^ туры AJnga turkestanlca. Работа по оптимизации питательной среды для клеточной культуры A.turKesxanica проводилась в два этапа. Первый включал эксперименты по подбору концентраций . солей ас.ота и фосфора, сахарозы и регуляторов роста - НУК и Дрога для увеличения выхода сырой биомассы. На втором .-этапе определялось влияние исследуемых факторов на биооинтетичискую активность культуры.

На 14 день культивирования суспензионной культуры A.tur-kestanica снимали показатели сырого веса.

При визуально?., анализе отмечено существенное стлкчие вариантов по агрегированное™, ризогонезу я цьету биомассы. В контрольном варианте, где минеральные соли составляют Т/2 части по Мурасиге-Скугу, сахароза - 30 г/л,. НУК - I мг/л, Дропп -0,002 мг/л прирост культуры составлял 43 г/л. В некоторых случаях г.^сокий- выход сырой массы был вызван образованием большого количества корней. Мзксимглыый выход наблвдзлея в вариэнте, где концентрации веществ следующие: Ш4ЫОэ - 250 мг/л, ENC3 -• 500 мг/л, КН2?04 - 75 мг/л, сахаросс - 30000 мг/л, НУК - 0,5 мг/л, Дропп - 0,001 мг/л. Культура характеризовалась высокой степенью агрегированное™ к сильным ризогенозом.

Концентрация НУК - I мг/л обеспечивала наибольший прирост биомассы за весь период накопительного культивирования. Активный органогенез наблюдался на питательных ерздах, где концентрация НУК была 0,1-0,5 мг/л. При полном отсутствуя в среде ауксина клеточная культурна характеризовалась пе'нат.телккым приростом биомассы, крупными arporaTai/i* и дшшта: до 2 см корнями.- На средах, где концентрация фытогормона составляла 5 кг/л, корни отсутствовали.

Внсокодксперпфованнея, жизнеспособная культура б'хла получена на среде, содержащей: ЭДПТО^ - 1000 кг/л, КИ0Э - 500 мг/л, КН2?04 - 50 мг/л, сахароза - 10000 мг/л, НУК - I мг/л, Дрсга -0,01 мг/л.

Определены коэффициент корреляции и его значимость для исследуемых функций, по которым установлено, что для выхода

Таблица 4.

Физико-химические свойства экдистерона, полученного из растительного сырья, культуры тканей и клеток.

Константы

Источник получения

Надземная часть и корни растения

Каллусная ткань

Культура клеток

Элементный состав Т.пл.

Удельное вращение I ajD

УФ-спектр X

r max

ИК-спектр ^ (см"'):

Масс-спектр,и/2

ПМР-спектр(С5Ь3К О-ГОДС.б.м.д.).

С н О

27 44 7

242-244° +54,5(метанол)

243 нм

3370-3450(03) 1660(А -6-кето-групшшровка)

480,462,444,426 408,340,344,328 327,99,81

0,93(ЗН ПРИ C-I9.C), 1,06 (ЗН ггои С-18,с) 1,24(6Н при С-26 И С-27,С), 1,44(ЗН при С-21,с), 6,б(К при С-7)

С Н О

2 V 4 4 j 7

241-242° +63,0(метанол)

244 нм

3470(ОН) 1665(А -6-ке-тогруппир.)

462,444,429, 426,411,408, 393,363,345, 327,301,300, 269,250,161, 143,125,99, 81

0,90(ЗН при С-19,с), 1,07 (ЗН при С-18,с), 1,25 (6Н при С-26 и С-27,с), 1,44(ЗН при С-21,с), 4,0 (2Н при С-2 и С-3,м), 3,70 (Н при С-22,м 6,07(11 при С-уш.с)

С Н О

27 44 7

•70

241-242' +63,4(метанол)

244 нм

3470(ОН) 1665(А -6-ке-тогрупгщр.)

462,444,429,

426,411,408,

393,363,345,

327,301,300,

269,250,161,

143,125,99,

81

0,92(ЗН при С-19,с), I,09(ЗН при С-18,0), 1,28(6Н при С-26 И С-27, С), 1,45(ЗН при С-21,с), 4,02(2Н ГфИ С-2 И С-3,М 3,72(Н при С-22,М), 6,03(Н при С-7,уш.С)

Обозначения: ^-синглет, м-ыультхшлет, уш.с-уширенний синглет

Таблица Ь.

Физико-химические константы туркестерона, полученного из растительного сырья, культуры каллусгых тканей и клеток.'

Константы

Элементный состав г.пл.

Удельное врещензсз [а ]

С Н 03

УФ-спектр X

с таа

ИК-спектр 7кВЧ (см"1): тоа:г

Масс-спзктп, m/z

ПМР-спектр(С=Б=Ы О-ЩЦС.б.м.д.)

Источник

получения

К-рни

аморфный +52,0(метанол)

244 нм

ЗЗОО-ЗБОО(ОН) 1660(Д -6-кето-групппировка)

460,442,424, 409,379,361, 343,325,300, 143,125,99, 81,69

1,12(ЗН при С-18.С), 1,18 (ЗН при С--19,с) 1,24(БН при С-26 и С-27, с), 1,45(3x1 при С-21,с), 3,45(2Н При С-2 и С-11, М), 4,06(К при С-3,М), 3,75 (2Н при С-9 И С-22,м), 6Д2(Н при С-7, уш.с)

Каллусная ткань

аморфный +52,0(метгнол)

244 нм

3300-3500(0К) 16сО(Д -6-ке-тогруппир.)

460,442,427, 424,409,391, 379,361,343, 326,301,300, 143,126,125, 99,81,69

1.13(3н при 0-18,с) 1,18 (ЗН при С-19,С), 1,24 (6Н При С-26 И С-27,С), I,45(ЗН при С-21,С), 3,45 (?.Н при 0-2 и С-П.М), 4,07

(Н при с-з,м) 3,76(2Н при С-9 и С-22,м) 6,12(Н при С-7 уш.с)

Культура клеток

амсрфянЯ i52,2(метанол

245

3300-3500(0Н IS65(A -6-кетогрупп.)

460,442,427, 424,409.391, 373,:'о1,343, 326,30 i,300, 143,126,125, 99,81,69

I,I5(3H ти C-I8.C), 12,0(ЗН при С-19,с), I,26(6Н при С-23 И С-27. с), 1,48(ЗН при C-2I, с), 3.46(2Н при С-2 и C-II, М), 4,0S(H пои С-3,м). 3\78(2Н при С-9 и С-22, М), 6,14(Н при С-7, уш.с)

Обозначенгя: С-синглет, м-мультиплет, уш.с-уширенный синглет

Оиомзссы загнил-! факторами питательной среды являются Ш4Ж>э, KN0,, НУК (табл.6).

Расчетные значения частных функций показывают, что прирост сырого веса в большей стбпсЕЛ зависим от концентрации NH4N0a. {^ксимальнкй выход биомассы был яэ средах, где количество нитрата ажония - 250 мг/л, что составляет 2Q,3% от контрольного уровня. Зависимость прироста веса сырого вощества суспгызиоякой культуры от концентрации НУК п^хсазывает, что еысокий выход био-

Табляца 6. Коэффициент корреляции (R) и его

значимость (tR) для частных функций

- Функция к Значимость функции

У» 0.77 Э.25 Значима

V 0.60 1.61 Назначила

Уз 0.7S 3.71 Значима

0.57 1.48 Незначима

0.84 5.05 Значима

V 0.20 0.36 Незначима

массы наблюдается при концентрации 2,6 мг/л (Рис.'3 ). Меньшие концентрации лимитируют, а большие - ингкбируют клеточное деление.

На основе полученных данных оптимальная среда для прироста биомассы должна содержать NH4N0s- 250 мг/л, КГОэ- 500 мг/л, ЧУК - 2,6 мг/л.

Изучение влияния элементов питательной среды на количественный выход эг.тистерсэдоз. .Длительное культивирование суспензионной культуры привело к изменению соотношения экдистеровдов. К 12 пассажу выход экдостерона составлял 0,04% от сухого веса, содержание туркестерояа - 0,1%. На основании проведенных исследований выявлена зависимость выхода туркестерона от концентраций солей азота и фосфора, сахарj3H, регуляторов роста.

Из 25 вариантов наиболее продуктивной оказалась среда •следующего состава: Ш4ГГОЭ - 500 мг/л; ЮГО3- 500 мг/л; КН2Р04 . - 100 мг/л; сахароза - 50000 мг/л; Дропп - 0.0002 мг/л; НУК

о ij

с *

'а

О

m 45

о

4"

К h'Оs

SO 250 500 950 «00 /lío

■О

Рис.3. Зависимость прироста сир1"!! ;,:ассьг от концентраций компонентов питатз;;ьнс;1 среды.

гсутствоЕчла. На этой среде туркостерон составлял 0,29635 ст сухого весе и паблодался минимальный прирост биомассы - 18,67 г/л.

Ка гадательной среде, где выход сырой массы был наибольший, отмечен самый низкий выход туркестерона -0.077Ж. Эта среда со-дерзала Ж4Шз- 250 ыг/л; КН2?04- 75 мг/л, КЖ)а- 500 мг/л, сахара зы - 30 г/л, КУК - 0,5 мг/л, Дрош - 0,001 мг/л. По составу эти среды отличаются по концентрациям нитрата аммония, фосфата калия, сахарозы и фитогормоноЕ.

После подбора всех частных зависимостей определены расчетные значения частных функций, на основании которых построены точечные графики (Рис.4). Анализ данных показывает.зависимость выхода туркестерона ст концентраций каждого фактора в отдельности. Высокий уровень нитрата аммония -1250 мг/л способствует высокому выходу туркестерона. Увеличение концентрации сахарозы до 5Ж вызывает повышение продукта метаболизма. Влияние повышенного содержания сахарозы объясняется видимо тем, что к концу цикла роста истощения источника углевода в среде не происходит, что необходимо для вторичного метаболизма.

Высокий выход туркестерона наблюдается цри отсутствии в среде ауксина. Роль ауксина б регуляции продуктов вторичного метаболизма, возможно, следующая: НУК влияет на синтез, изменяя характер роста и морфогенез культур, т.е. косвенно влияет на накопление вторичных веществ.

По полученным результатам можно сказать, что на еыход туркестерона влияют все исследуемые факторы (табл.7).

Таким образом, экспериментальные данные позволяют сделать слоцущпе выводы, соли азоте оказывают влияние как на выход сырой массы, так ь на выход продуктов метаболитов. Низкая концентрация Ш4Н0в активизирует клеточный рост и ^имитирует выход окдистеровдов. Позжениэ концентрации до 1250 мг/л вызывает обратное действие. На этом уровне наблвдазтея максимальный выход туркестерона - 0,217 % на сухой вес. Повышенная концентрация фосфата - 125 мг/л не вызывала увеличение как роста так и синтеза продукта метаболизма. Концентрация 50 ыг/л являлась оптимальной для клеточного роста.

Выявлена противоположная зависимость между выходом сырсй массы с одной стороны и продуктов метаболизма с другой от содержания регулятороз роста. При отсутствии в питательной среде НУК набладался минимальный прирост биомассы, а выход туркесте-

•$?<? 750 {ООО 1250

КНяР0<,

30 Ш /!5 150

О. »:

с, *

£ §

<1

%

о, го о.«

о.ю

%

0.20 о. и

б0 250 300 р50 той 115с,

0.Ю

Сахарозе

<0000 гоооо ¿0000 Шоо

10000

0 0.002

ООО* 0.005 ЯШ вха

РИС.4. Зависимость выхода туркестерона от кояшнтояний компонентов питательной среды.

Таблица 7. Коэффициент корреляции (Е) и ого значимость (t„) для частпш функция

Сункцкя П ч Значимость функции

у» С.98 51.18 Значима

У. 0.87 6.16 Значима

К 0.72 2.58 Значима

{ 4 0.93 11.15 Значима

7. 0.84 5.02 Значима

0.90 8.50 Значила

i___________

рсна составлял 0,189 %. Высикий уровень ПУК и Дрош не окатаивают влияние на выход продуктов метаболизма.

Fía основании проведенных экспериментов установлены оптимальные концентрация компонентов питательной среды для прироста биомассы и выхода экдистероидов .

Изучение действия ¡иутагена N-ШМ на общую продуктивность каллусной ткани АДида turKestanlca. после обработка мутагеном (0-й пассаж) бьли выявлены следукяще эффекты: стимуляция, инги-бированио у. су¿летальное действие.

Эффект стимуляции наблг-одался после обработки дозами 0,5, I и 2 Mlvtaac. Эти варианты Превосходят контрольный вариант по • индексу роста. Ингибирунцео действие наблщалось после обра--боткк дозой -i мМхчас. Рост тканей, обработанных дозами 8 к Í0 мМияз был подавлен. На потемневших'тканях образовались жизнеспособные колонии клеток, которые в дальнейшем были размножены.

По выходу- экдистэрона продуктивны!,', и практически ценным оказало* штзмм, полученный в результате клонирования клеток после обработки дозой 8 мМхчас. В S псссаяе количество экдис-■íepota составляло б нем 0,20 %, тогда как в контрольном варианте 0,0£ % >'Рио.5). Исходная каллусная ткань после длительного культивирования характеризовалась низким и нестабильным выходом экдистер^иа. При дальнейшем пассирования содержание в штамме : синтезируемого экдкетеропа варыгооЕало в пределах 0,08 -ГО %.

Таким образом, показана возможность получения экдистерона

Рис.о. Содержанке экдистерона в кзллусных тканях АЛиза гигкезгап1са: 1- исходная каллусная ткань; 2 - штамм, полученный после обработки Ы-НШ дозой 8 мМгч2с.

и туркестерона методом культуры клеток. Использование продукционных сред, применение экспериментального мутагенеза позволит значительно повысить выход этих веществ.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны оптимальные среды для индукции и культивирования каллусных тканей из растений - продуцентов экдисте-роидов.

2. Выявлена каллусная ткань из завязи АЗисд гиг!сез1ап1са (1*51.) Bгiq., сохраняющая бкосингетическую активность экдисте-ровдов.

3. Из каллусной ткзни А^и^а tш•lIestanica получена жизнеспособная суспензионная культура клеток.

4. Выделенные из каллусной и суспензионной культур соединения по физико-химическим константам и спектральным данным соответствуют экдистерону и туркестерону интактного растения.

5. Установлены количественные содержания зкдистерона и туркестерона з каллусной и суспензионной культурах, составляющие соответственно 0,1% и 0,036«.

6. Выявлены оптимальные уровни макросолей, сахарозы и регуляторов роста для максимального накопления сырой массы и выхода целевого продукта. ' '

7. Показано, что при высоких концентрациях нитрата аммо-

ния - 1250 мг/л в среде культивирования выход туркестерона значительно увеличивается.

8- Методом экспериментального мутагенеза получена каллус-ная ткань Ajuga turkeatanlca с устойчивым выходом экдкстерона - 0,1%.

9. Полученные каллусная и суспензионная культуры являются перспективными источниками фитоэвдистеровдов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лев C.B., Закирова Р.П., Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Экдистероиды культуры тканей и клеток AjUga turkeatcnlca.//Химия природных соединений.- 1990.-N I-- С.51-52. .

2. Лев C.B., Закирова Р.П., Саатов 3'., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Экдистероиды культуры тканей и клеток кивучки туркестанской.//Рефераты докл. и сообщ. XIV Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. М.: Наука, 1989.- Т.2.- С.278.

Разрешено в печать 02.04.92-г.

Заказ К 47. Тирад 100 экз._

Отпечатано на ротапринте СПКЕ АиЗТ 700170. г.Ташкент,Володарского,26.