Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дуб черешчатый (Quercus robur L.) на Южном Урале

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Дуб черешчатый (Quercus robur L.) на Южном Урале"

На правах рукописи

ГАБИТОВА АЙГУЛЬ АЙДАРОВНА

ДУБ ЧЕРЕШЧАТЫЙ ((ЗиЕКСШ ловил Ь.) НА ЮЖНОМ УРАЛЕ: ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИОННОЙ СТРУКТУРЫ.

Специальности:

03.02.08-Экология (биологические науки) и 03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 Ш

УФА-2012

005016222

Работа выполнена на кафедре лесоводства и ландшафтного дизайна ФГБОУ ВГТО «Башкирский государственный аграрный университет»

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Янбаев Юлай Аглямович

Научный консультант:

Доктор биологических наук, доцент Боронникова Светлана Витальевна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Путенихин Валерий Петрович Доктор биологических наук, профессор Усманов Искандер Юсуфович

Ведущая организация: ФГБУН Институт экологии Волжского

бассейна РАН

Защита состоится «18» мая 2012 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г.Уфа, Проспект Октября, 69. Тел./факс (347) 235-53-62. E-mail: ib@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии УНЦ РАН, с авторефератом — в сети Интернет по адресу http://www.anrb.ru/inbio/dissovet/index.htm и на сайте ВАК Минобрнауки РФ.

Автореферат разослан «16» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

О,

"Ч

Уразгильдин Р.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Внутри- и межпопуляционные взаимодействия растений играют ключевую роль в динамике во времени и в пространстве генофондов (Slatkin, 1987) и, через ее регуляцию, в формировании устойчивости на популяционном уровне к экологическим факторам среды. Это положение особенно актуально для видов на границах ареалов, где условия среды для них экологически более экстремальны. Здесь из-за небольшой численности популяции больше подвержены к действию дрейфа генов и инбридинга, чувствительны к эрозии генофонда (Geber, 2008). Возможность противодействия этим неблагоприятным явлениям определяется способностью популяционных систем поддерживать оптимальный уровень внутривидой пространственной под-разделенности (Алтухов, 1 995). Новые комбинации генотипов, образующиеся на границах ареалов, могут позволить видам быстрее эволюционировать и дать дополнительные возможности для адаптации и выживания (Petit et al., 2008). Данный процесс в значительной степени определяется эффективностью меж-популяционного генетического потока (Rousseau et al., 2008).

Популяционная структура дуба черешчатого (Querciis robur L. (Fagaceae)) исследована на большей части ареала и достаточно детально (Ducousso, Вог-dacs, 2004). Однако на Южном Урале, где проходят его восточная граница (Семериков, 1981), факторы формирования и поддержания генофонда вида практически не изучены (Яковлев, Клейншмит, 2002), особенно с применением современных и информативных молекулярно-биологических методов (Редькина и др., 2008). Данная проблема не позволяет научно обоснованно разрабатывать системные меры для повышении устойчивости дубрав к неблагоприятным экологическим факторам, оценить эколого-генетические последствия наблюдающейся в последние десятилетия деградации дубняков (Григорьев и др., 2000), сохранять и рационально использовать на популяционной основе генофонд вида (Янбаев и др., 2002), совершенствовать в регионе лесо-семенное и лесокультурное дело.

Цель исследований - эколого-генетический анализ популяционной структуры дуба черешчатого на границах его ареала на Южном Урале и комплекса факторов, ответственных за формирование и поддержание его генофонда.

В связи с ней решались следующие задачи:

1) исследовать генетическое разнообразие популяций из различных природно-климатических зон региона и экологических условий местообитаний;

2) сравнить структуру популяций, расположенных в местообитаниях, типичных для вида, и экологически пессимальных условиях среды;

3) исследовать роль генетически реализованной миграции пыльцы на дальние расстояния в формировании и поддержании генетического разнообразия популяционных структур;

4) провести анализ влияния особенностей семенного возобновления на формирование генотипического состава в насаждениях.

Научная новизна. Впервые с применением комплекса биохимических и

молекулярно-генетических методов (аллозимных, ISSR- и микросателлитных локусов), современного научного оборудования и системы математических методов обработки результатов экспериментов изучена популяционная структура дуба черешчатого в восточной части его ареала. Установлено, что на Южном Урале генетическая дифференциация популяций из характерной для вида экологической среды обитания сравнительно невысока и обусловлена приуроченностью к крупным геоморфологическим образованиям и зонам растительности. Популяции из экологически экстремальной (пессимальной) для вида среды обитания генетически подразделены в большей степени. Относительно высокое генетическое разнообразие краевых популяций, в том числе расположенных вне ареала, формируется за счет изменчивого по годам генетически реализованного переноса пыльцы на дальние расстояния. Динамика генетической структуры отдельных популяций в пространстве в существенной степени обусловлена особенностями семенного возобновления. Полученные результаты не только выявляют эколого-генетические факторы формирования популяционных структур дуба черешчатого на географической и экологической границах ареала, но и расширяют теоретические представления об адаптации древесных растений к экстремальным экологическим факторам среды обитания с использованием популяционных механизмов.

Практическая значимость. Результаты исследований и практические рекомендации предлагаются для использования Федеральным агентством лесного хозяйства РФ, научными учреждениями, высшими учебными заведениями в их деятельности, в т.ч. для разработки системы мер для повышения устойчивости дубрав и адаптации дуба черешчатого к факторам среды, для разработки программ сохранения и рационального использования генофонда вида на восточной части ее ареала, совершенствования лесосеменного и лесокуль-турного дела. Теоретические и практические результаты диссертационной работы могут быть рекомендованы для повышения уровня подготовки бакалавров по направлениям «Биология», «Экология», «Генетика» и «Лесное дело», а также магистров и научно-педагогических кадров высшей квалификации.

Организация исследований. Работа выполнена в 2008-2012 г. на кафедре лесоводства и ландшафтного дизайна ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» (БГАУ). Исследования с применением изоферментного анализа проводили в лаборатории биоразнообразия научно-образовательного центра БГАУ, с использованием lSSR-метода анализа ДНК -в лаборатории молекулярной биологии и генетики Естественно-научного института ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» (ЕНИ ПГНИУ). Изучение микросателлитных локусов проведено в лабораториях Института лесной генетики Федерального министерства продовольствия, сельского хозяйства и защиты потребителей Германии. Диссертационная работа выполнена в рамках плановых тем научно-исследовательских работ ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ, а также по Программе сотрудничества в сфере аграрных исследований между ФРГ и РФ (2009-2011 и 2012-2013 гг., проект № 3/07 «Oekologisch-genetische Untersuchungen im Hinblick auf Biodiversitaet und Monitoring»), по проекту «Ef-

ficient long-distance gene flow into an isolated relict oak stand beyond the eastern range margin of Quercus robur L.» (2007-2009 гг.), поддержанном указанным выше министерством ФРГ, при поддержке грантов Ассоциации «Агрообразо-вание» (тема ««Экологические и генетические исследования биологического разнообразия дуба черешчатого на границах ареала (на примере Южного Урала)»», 2010 г.), Института фон Тюнена Федерального исследовательского института сельскохозяйственных земель, лесоводства и рыболовства ФРГ (тема «Identifizierung von Holzherkünften», 2011 г.), Федеральной лесной службы США, выделенного на выполнение консорциумом исследователей из России (Башкирский ГАУ), США, Германии, Австралии и Сингапура проекта «Supporting a robust and reliable timber supply with cutting-edge technology» (20122014 гг.).

Личный вклад автора состоит в разработке программы исследований согласно поставленным задачам работы, в выборе объектов и методов, в проведении полевых и лабораторных исследований, в обработке и интерпретации полученных результатов, в их сопоставлении с литературными данными, в подготовке рукописей диссертации и ее автореферата. Подготовка публикаций осуществлена самостоятельно или при активном участии автора диссертационной работы.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы были представлены и обсуждались на 12 научных и научно-практических конференциях. В их числе 6 международных (Молодежная наука и АПК - проблемы и перспективы: Уфа, 2010; Состояние, проблемы и перспективы развития АПК: Уфа, 2010; ЕС-Россия - 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, лесного, рыбного хозяйства и пищи: Уфа, 2010; Синтез знаний в естественных науках: Пермь, 2011; Проблемы популяционной и общей генетики: Москва, 2011; Третье международное совещание по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири: Красноярск, 2011) и 6 всероссийских (Актуальные вопросы современной науки и образования: Сибай, 2010; Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий: Оренбург, 2010; Агрокомплекс-2010: Уфа, 2010; Агрокомплекс-2011: Уфа, 2011; Научное обеспечение инновационного развития АПК: Уфа, 2011, Агрокомплекс-2012: Уфа, 2012) научных форумов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов. Она изложена на 152 страницах машинописи, содержит 13 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 284 источника, из которых 219 - иностранных.

Благодарности: директору Института лесной генетики Федерального Министерства продовольствия, сельского хозяйства и защиты потребителей Германии д-ру Б. Дегену за предоставленную возможность исследования мик-росателлитных локусов в лабораториях института; его сотруднику д-ру Ю. Бушбом за организацию выполнения экспериментов и консультации; сотрудникам лаборатории «Молекулярной биологии и генетики» ЕНИ ФГБОУ ВПО

«Пермский государственный национальный исследовательский университет», содействовавшим в постановке ^БЯ-метода анализа полиморфизма ДНК дуба черешчатого; аспирантам кафедры лесоводства и ландшафтного дизайна Башкирского ГАУ за помощь в сборе растительного материала.

ГЛАВА 1. ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВИДОВ ОУЕЯСиБ Ь.

Проведен анализ отечественных и зарубежных работ по изучению популя-ционной структуры с применением молекулярно-генетических маркеров у видов Quercus Ь. Сделан вывод, что выявленная противоречивость результатов вызвана недостаточным учетом воздействия на генофонды комплекса факторов (в первую очередь экологических), а также применением ограниченного круга методов молекулярно-генетического анализа популяций, каждый из которых обладает своими преимуществами и недостатками. В условиях Западной Европы, где исследования популяционной биологии Оиегсия Ь. проводятся все возрастающими темпами, дубовые леса в последние столетия деградируют из-за их хозяйственного использования. По этим причинам остается трудно достижимым выяснение популяционных механизмов, ответственных за выживание и адаптацию дубов в условиях усиления антропогенного пресса на природу и в экологически экстремальной среде. На многие такие вопросы можно дать ответ лишь при изучении популяций, мало нарушенных человеком, например, в условиях России, где на восточных границах ареала вида сохранились автохтонные насаждения. К сожалению, проведенные в этих условиях исследования единичны (Янбаев и др., 2002; Яковлев, Клейншмит, 2002; Редькина и др., 2008). С учетом проведенного анализа литературы, имеющихся и большей частью нерешенных вопросов и проблем разработан план работы, осуществлен подбор методов, адекватных поставленным цели и задачам.

ГЛАВА 2. РЕГИОН, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Район проведения исследований охватывает лесостепную (Предуралье), степную (Зауралье, юг Зилаирского плато) и горно-лесную (низко- и среднего-рья южно-уральских хребтов) зоны Южного Урала (Попов, 1980) — основную часть ареала дуба черешчатого на восточной его границе размером около 650 на 400 км (север-юг и восток-запад, соответственно). В диссертации по работам (Крашенинников, 1939; Колесников, 1969; Горчаковский, 1972; Кадильников, Тайчинов, 1973; Попов, 1980; Мукатанов 1986 и др.) приведено описание природно-климатических условий и растительности региона, показано высокое разнообразие лесных экосистем с участием дуба черешчатого.

Приведено описание биоэкологических свойств (Унегсия гоЬиг Ь. и состояния его насаждений на Южном Урале. Здесь вид обитает на восточной границе ареала, имеет сложную историю расселения, существует в большом экологическом спектре местообитаний, его популяции в различной степени затронуты неблагоприятными климатическими и экологическими (природными и антропогенными) воздействиями. Это обстоятельство может влиять на уровни генетического разнообразия и дифференциации популяций. Однако, мало известно -

в какой степени комплекс этих процессов повлиял на генофонд дуба черешча-того на его восточной границе ареала?

В пределах всей исследованной части ареала дуба черешчатого в разных растительных зонах и экологических условиях были заложены 16 пробных площадей (рис. 1). В каждой из них случайным образом были отобраны в среднем по 32 дерева генеративного возраста, с которых были собраны растительные образцы (почки) для лабораторного анализа.

Рис. 1. Схема размещения выборок Q. robur Примечание: 1,2 и 3 - насаждения с доминированием, участием дуба черешчатого и с его единичными деревьями, соответственно.

Для анализа изоферментов использовали разработанную ранее методику (Редькина, 2008). Разделение аллозимов осуществляли с использованием поли-акриламидного гель-электрофореза в 7,5 %-ном щелочном геле (Ornstein, 1964; Davis, 1964). Гистохимическое выявление ферментативной активности в гелях проведели по стандартным методикам (Корочкин и др., 1977). Обозначение ферментов и локусов осуществляли согласно одной из номенклатур (Prakash et al., 1969). Исследованы полиморфные локусы Skdh-1, Fdh-1, Аар-1, Lap-2 и Dia-1, кодирующих изоферменты шикиматдегидрогеназы (SKDH, Е.С. 1.1.1.25), формиатдегидрогеназы (FDH, 1.2.1.2.), аланинаминопептидазы (AAP, 3.4.11.1.),

лейцинаминопептидазы (LAP, 3.4.11.1.) и диафоразы (DIA, Е.С. 1.6.4.3.). Генетический контроль наследования этих ферментов исследован при анализе потомства дуба от межвидовых скрещиваний (Muller-Starck et al., 1996), а изменчивость локуса димерной FDH - при помощи статистических методов (Редьки-на и др., 2008).Для анализа популяционных структур использованы показатели, определяемые компьютерной программой BIOSYS-1 (Swofford, Seiander, 1981), в том числе частота аллелей, число аллелей на локус А, доля полиморфных ло-кусов Р, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность (#0 и НЕ, соответственно), показатель межпопуляционной подразделенности FST и индекс фиксации (коэффициент фиксации) F (Wright, 1969), генетическое расстояние М. Нея D (Nei, 1972). При определении статистической достоверности различий выборок, наблюдаемых и теоретически ожидаемых по правилу Харди-Вайнберга частот генотипов, использованы тесты f и С,а также при необходимости осуществлялось объединение генотипов в отдельные классы (Животовский, 1981). Эти вычисления осуществлены с использованием программы GSED (Gillet, 1998). С ее помощью выборки также сравнивались по генотипическим частотам, определялись параметры внутрипопуляционного разнообразия v(p), популяционной дифференциации ST, генетическое расстояние Грегориуса (Gregorius, 1974, 1978). С применением этой программы определялись многолокусные генотипы отдельных особей.

Молекулярно-генетический анализ проведен в лаборатории молекулярной биологии и генетики ЕНИ ПГНИУ с использованием 1SSR- (Inter Simple Sequence Repeats, Zietkiewicz et al., 1994)-метода с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК из почек дуба черешчатого выделяли методом A.M. Торрес (Torres et al., 1993). Концентрацию и спектральную характеристику ДНК определяли на приборе Spectrofotometr™ NanoDrop 2000 («Thermo scientific», USA). Амплификацию ДНК проводили в термоциклере MJ MiniCycler («Bio-rad», США) по стандартной для ISSR-метода программе (Молекулярная генетика..., 2007) . Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1.7 %-ном агарозном геле в lx TBE буфере, окрашивали бромистым этидием и сканировали в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA). Для определения длин фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярной массы («СибЭнзим-М», Россия) и программу Quantity One («Bio-Rad», USA). Проведен анализ полиморфизма 99 ISSR-PCR маркеров. Для проверки достоверности полученных результатов опыты повторяли не менее трех раз. Компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью программы POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999) и специализированного макроса GenAlExô (Peakall, Smouse, 2006) для MS-Excel с определением доли полиморфных локусов я95 (Williams et al., 1990), общего числа аллелей («_), эффективного числа аллелей (пе) (Kimura et al., 1964), ожидаемой гетерозиготно-сти ( ИF ) (Nei, 1987) и коэффициента межпопуляционной подразделенности G',T. (Nei, 1975). Дендрограммы по ISSR-спектрам были построены при помощи компьютерных программ Treecon 1 .ЗЬ и POPGENE 1.31.

Исследования микросателлитных локусов проводили в лабораториях Института лесной генетики и селекции Федерального исследовательского центра сельскохозяйственных земель, лесоводства и рыбоводства Германии. ДНК из растительных образцов выделяли по методике (Dumolin et al., 1995). Количество ДНК определяли на биофотометре Eppendorf (Германия). С применением ПЦР-реакции изучали полиморфизм микросателлитных локусов QpZAG112, QrZAG96, QpZAGl 10, QrZAGll, QrZAG87, QrZAG7, QrZAG20, QrZAG5b и QrZAG65 (Schueler et al., 2003; Testolin et al. 2000; Dirlewanger et al. 2002). Фрагменты анализировали на генетическом анализаторе Megabace (Amersham Biosciences, Великобритания) и с применением MegaBace Fragment Profiler vi .2 (тот же производитель). Для оценки уровня генетического разнообразия у деревьев и зародышей вычисляли параметры А, И0 и НЕ (см. выше). Для определения уровня дифференциации популяций применяли показатели F^ и ее стандартизированную величину (Hedrick, 2005)_ параметры внутрипопуляционного разнообразия v(p) и популяционной дифференциации 8Т. Для определения пространственной генотипической структуры популяций (Cliff, Ord, 1981; Epperson, 1991) с применением аллелей микросателлитных локусов использовали программу автокорреляционного анализа SGS (Degen et al., 2001). В качестве меры сходства особей в пределах популяций выбрали расстояние Грего-риуса d (1978).

Статистическую обработку данных анализа аллозимных, ISSR- и микросателлитных локусов проводили с использованием также других параметров, процедур и методов (Животовский, 1983, 1990). Статистический анализ различных других вариационных рядов выполнены при помощи программы "STATISTICA 6.0" (версия 6.0.) и MS EXCEL.

ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ В ПОПУЛЯЦИЯХ ДУБА ЧЕРЕШЧАТОГО

Во всех выборках при изучении полиморфных аллозимных локусов Skdh-1, Fdh-1, Аар-1, Lap-2 и Dia-1 нами обнаружено 30 аллелей. Выявление генотипов с уникальным (не встречающимся у других особей) набором аллелей показало, что в среднем на одну выборку 94,3 + 2,12 % деревьев обладали отличающимся набором аллозимов. Эта доля варьировала по пробным площадям от 78,1 до 100 (в восьми из четырнадцати изученных популяций) %. В каждой выборке недостаточно точно идентифицированы генотипы лишь 1-2 деревьев (в среднем 5,7 %) на каждой пробной площади. Это демонстрирует относительную информативность использованного нами набора полиморфных аллозимных локусов для генотипирования деревьев.

Анализ таблицы 1 показал, что географически краевые популяции имеют в среднем большее аллельное разнообразие, ожидаемая и наблюдаемая гетерози-готность у них выше, чем в популяциях, расположенных в типичных для вида экологических условиях (группа 2). В группе 1 значение среднего коэффициента инбридинга меньше. Популяции из экологически пессимальных условий среды (группа 3) уступают им по уровню изменчивости и полиморфизму алло-

зимных локусов. Снижение соответствующих параметров получены у них в основном за счет выборки Brz, где полиморфными были лишь два локуса. Без учета данной популяции вычисленные показатели генетической изменчивости

группы 3 (Л=3,00±0,60, НЕ=0,377+0,018, //0 =0,309+0,015, F =+0,180) и остальных популяций (в том числе представляющих географически изолированные малые насаждения Вш1,2 с крайне низкой численностью особей) становятся сопоставимыми. Этот феномен противоречит теоретическим представлениям, что наибольшее генетическое разнообразие складывается в центральных популяциях. В качестве причины низкого полиморфизма малой по объему популяции Brz, расположенной на экологическом краю ареала и имеющую у особей нехарактерную для вида стланиковую форму, может быть фенологическая изоляция деревьев местообитания, приводящая к ограничению генетического потока извне.

Выявленный относительно высокий полиморфизм не является характерным лишь для аллозимных локусов. Анализ полиморфизма ISSR-PCR маркеров показал, что в выборке Bml имеется 1,31 ±0,47 аллелей на локус, в то время в популяциях Azvl, Orb, Ufa, Tts и Inz значения параметра варьируют от 1,39 + 0,491 до 1,60+0,493 (в среднем 1,47±0,04, различия с Bml в 12 % статистически недостоверны). Это заключение сделано при анализе 99 амплифици-рованных фрагментов ДНК, среди которых 67 были полиморфными (Р95=0,677). Самая высокая доля полиморфных ISSR-локусов отмечена в популяции Azvl ( Р,, =0,743), но выборка Bml мало уступала по этому параметру как ей, так и другим сравнительно большим по объему популяциям Orb, Ufa, Tts и Inz (рис. 2., см. там также число фрагментов, в т.ч. редких). В Bml ожидаемая гетерозиготность составила НЕ =0,076 + 0,014, в Inz - 0,091 ±0,015, в то время в популяциях Azvl, Orb, Ufa и Tts она варьируют от 0,104±0,011 до 0,126±0,017 (то есть не намного выше, с учетом больших объемов популяций).

Аналогичное заключение сделано нами при анализе 9 использованных микросателлитных локусов. Насаждения Bml и Вт2, географически изолированные (до ближайших дубрав расстояние не менее 80 км) и имеющие небольшую численность (27 и 7 деревьев генеративного возраста, соответственно), практически не уступают по гетерозиготности (//,,=0,81 ± 0,03, На =0,85 ±0,04 и //Е =0,69 ±0,07, Н0=0,75±0,109, соответственно) двум популяциям дуба череш-чатого - из Германии (НЕ =0,81 ± 0,017 - 0,82 ± 0,19, Н0 =0,78 ±0,18 - 0,81 + 0,18) (Бушбом и др., 2010), а также (табл. 2) из контрольного насаждения Azvl из Южного Урала (НЕ=0,80±0,06, //„=0,85 + 0,04). В выборках Azvl и Bml в среднем на локус выявлено редких аллелей 6,88+ 1,48 и 4,33± 1,19, соответственно. В насаждении Вгп2 редкие аллели не обнаружены. Причиной такого снижения параметра, как и в случае с числом аллелей на локус, может быть малое число деревьев (всего семь особей). В выборке желудей, имеющей больший объем, как будет показано ниже, аллельное разнообразие близко к значению А в Azvl. Выявленные уровни генетического разнообразия популяции Bml,2 представляются относительно высокими с учетом крайне малой численности в

насаждении материнских деревьев и географической удаленности (не менее 80 км) насаждения от других дубрав.

Таблица 1.

Генетическая изменчивость аллозимных локусов в популяциях дуба

Выборки Р,% А нЕ Но Р

Группа 1

ОгЬ1 100 3,8 0,454+0,108 0,420±0,105 +0,075

1пг2 100 3,6 0,395 ±0,081 0,324± 0,051 +0,179

Ргт 1,23 100 3,8 0,431 ±0,079 0,371 ± 0,059 +0,139

В среднем 100 3,7 0,426 ±0,17 0,371 ±0,028 +0,129

Группа 2

АЬг4 100 3,0 0,427±0,067 0,422+0,083 +0,012

Яг4 100 2,8 0,388± 0,084 0,329 ±0,069 +0,152

Ктг4 100 3,4 0,417± 0,068 0,387 ±0,072 +0,071

Уш§4 100 3,2 0,379 ±0,083 0,394 ±0,082 -0,039

Агу14 100 4,2 0,449 ±0,087 0,294 ±0,071 +0,345

Л?л<24 100 4,6 0,458 ±0,083 0,294 + 0,047 +0,358

Ша4 100 2,0 0,294 ±0,081 0,311 ±0,084 -0,058

В ¡г4 100 3,4 0,407± 0,087 0,340±0,117 +0,165

ТЬз5 100 3,2 0.394 ±0,092 0,303 ±0,068 +0,231

В среднем 100 3,3 0,401 ±0,016 0,342± 0,016 +0,147

Группа 3

Гпг2 100 3,6 0,395 ±0,081 0,324 ±0,051 +0,179

Втк 1,2 80 2,4 0,359± 0,128 0,294± 0,097 +0,181

Вгг 40 2,0 0,216±0,133 0,127 ±0,079 +0,412

В среднем 73 2,7 0,323 ±0,055 0,248 ±0,061 +0,180

востоке (2) и юго-востоке (3) ареала; группа 2 - популяции широколиственной (4) и хвойно-широколиственной (5) зон; Группа 3 - насаждения из экологически песси-мальных условий среды, в том числе географически изолированные и малые по объему дубравы (Вшк 1,2 и Вгг). Р- доля полиморфных локусов, А - число аллелей на локус, Н0 и НЕ - наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность, соответственно), Р -коэффициент инбридинга.

ГЛАВА 4. МЕЖПОПУЛЯЦИОННАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ДУБА ЧЕРЕШЧАТОГО НА ЮЖНОМ УРАЛЕ

Определение параметров ^ -статистики Райта показало, что по всем использованным полиморфным аллозимным локусам в среднем 90,3 % всей генетической изменчивости популяций относится к ее внутривыборочной составляющей. Межвыборочная дифференциация =0,097) дуба черешчатого Южного Урала выражена больше, чем межпопуляционная подразделенность западно-европейских популяций (МиИег^агск й а1., 1993). Вычисление генетической дистанции М. Нея показало, что максимальные различия южноуральских популяций наблюдаются на сравнительно высоком уровне О =0,117.

Относительно высокая межпопуляционная изменчивость дуба черешчатого на Южном Урале может быть обусловлено несколькими причинами. Исследованные насаждения расположены в экологически различающихся местообитаниях. Формирование дубрав в регионе в последнее геологическое время могло происходить за счет разных генофондов — из локальных рефугиумов и мигрантов из убежищ Поволжья. В последние десятилетия наблюдается массовое, но неравномерное по региону, усыхание дуба из-за чередующихся экстремально холодных зим и последующих вспышек численности энтомовредителей дуба.

80 60 40 20 0

0,200 0,150 0,100 0,050 0

А тм 1

ш Число фрагментов ДНК и Число полиморфных фрагментов ДНК 15 Число редких фрагментов ДНК Средняя ожидаемая гетерозиготность

Рис.2. Показатели генетического разнообразия популяций гоЬиг на основании полиморфизма ВЗЯ-РСЙ. маркеров

Таблица 2.

Полиморфизм и изменчивость микросателлитных локусов

Локусы А НЕ Но

Агу1 Вш1 Вш2 А7.\> 1 Вт1 Вт2 Ах\ 1 Вт1 Вт2

0р2АС112 16(8) 13(8) 4(0) 0,881 0,815 0,459 0,895 0,833 0,429

0гёАО96 8(6) 5(1) 2(0) 0,405 0,566 0,245 0,417 0,556 0,286

Орглопо 8(3) 7(0) 5(0) 0,628 0,836 0.845 0,667 0,878 1,000

0гёАО1 1 19(10) 12(7) 7(0) 0,903 0.826 0,796 0,972 0,889 1,000

0ггАО87 11(4) 10(5) 4(0) 0,861 0,787 0,612 1,000 0,778 0,429

дрХАО! 12 11(3) 8(1) 8(0) 0,876^ 0,824 0,827 1,000 0,889 1,000

дгёАС96 12(5) 7(1) 5(0) 0,816 0,812 0,662 0,939 0,778 0,714

<Зр2А0110 26(17) 16(9) 9(0) 0,939 0,907 0,857 0,889 1,000 0,857

ОггАО 11 15(6) 13(7) 8(0) 0,900 0.873 0,864 0,846 1,000 1,000

В среднем 14,00 10,11 5,78 0,801 0,805 0,685 0,847 0,845 0,746

± т 1,93 1,21 0 0,058 0,032 0,072 0,064 0,045 0,097

Примечания: в скобках приведено число аллелей с частотой менее 5 %, т - ошибка среднеарифметических значений. См. также примечания таблицы 2.

Основной вклад в дифференциацию популяций вносят Inz, Brz и Bml/ Вт2, расположенные в пессимальных экологических условиях обитания и генетически отличающиеся на относительно высоком уровне как друг от друга (D =0,087), так и других популяций. Без их учета наблюдается снижение генетической дистанции между остальными выборками до £>=0,074. Оставшиеся популяции объединились (рис. 3) в три группы кластеров, условно отнесенных нами к северным (Prml, Prm2, Tts), центральным (Bir, Ufa, Azvl, Azv2, Ymg) и к южным (Kmr, ZIr, Abz, Orb) дубравам. При этом в двух последних группах наблюдается закономерная структурированность генетической изменчивости -коэффициент корреляции между генетической дистанцией и географическим расстоянием является статистически достоверным (л-=0,34, р <0,05). Северные и центральная насаждения расположены в зонах хвойно-широколиственных и широколиственных лесов Башкортостана, соответственно. Южные популяции расположены вне этих зон на Зилаирском плато и прилегающей южнее лесостепи. Из этой закономерности выбивается лишь выборка Inz, представляющая дубравы из экологического и географического края ареала, расположенных на стыке хвойно-широколиственной и широколиственной зон растительности. В целом же генетическая дифференциация дубрав, произрастающих в относительно характерных для дуба черешчатого экологических условиях, по алло-зимным локусам в целом соответствует известным представлениям (Семериков, 1981) об истории расселения вида на Южном Урале, приуроченности вида к отдельным растительным и природно-климатическим зонам и крупным геоморфологическим образованиям.

В среднем для одного ISSR-локуса величина показателя межпопуляцион-ной подразделенное™ G'„. составила 0,530 ±0,032. Различия в абсолютных величинах параметров G>T и /\т по аллозимным (см. выше) и ISSR-локусам, как показало сравнение авторских данных и результатов, известных в научной литературе, может быть связано с кодированием ими функционально разных частей генома (Янбаев и др., 2008). Тем не менее, метод позволил подтвердить общее заключение, сделанное при анализе аллозимов. Два насаждения Вт! и Inz из экологически пессимальных условий дифференцированы генетически практически на том же уровне (G,,T =0,557), как и популяции Orb, Azvl, Ufa и Tts (Оя. =0,615), находящиеся на значительно большем удалении друг от друга, принадлежащие разным зонам растительности и расположенные на разных крупных геоморфологических образованиях Южного Урала. Более того, выборка Inz существенно отличается по частотам ISSR-фрагментов и от находящейся поблизости (чуть более 60 км по прямой) популяции Azv.

Для проверки гипотезы, что географически изолированные малые по численности древостоя дубравы, отличающиеся по генотипической структуре от больших по объему популяций по данным аллозимных и ISSR-локусов, должны быть генетически дифференцированы и по аллелям микросателлитных локусов, нами с использованием последних сравнены выборки Bml и Azvl. Установлено, что генетическое расстояние М. Нея для пары Bml/Azvl составило относительно высокое значение £>=0,226. В этом отношении генотипический состав в

выборке Агу1 и в двух насаждениях Германии (см. Бушбом и др., 2010) ближе, чем генетическая дифференциация популяций Южного Урала, отличающиеся экологическими условиями обитания и численностью особей.

ГЛАВА 5. ВНУТРИ- И МЕЖПОПУЛЯЦИОННЫЙ ПОТОК ГЕНОВ КАК ФАКТОР ФОРМИРОВАНИЯ ПОПУЛЯЦИОННОЙ СТРУКТУРЫ ДУБА ЧЕРЕШЧАТОГО НА ЮЖНОМ УРАЛЕ

На основе результатов, изложенных в Главах 3 и 4 выдвинута гипотеза, что по пуляции, расположенные на экологическом и географическом краях ареала и обладающие относительно малыми объемами, но сравнительно высоким генетическим разнообразием, для предотвращения деградации генофондов из-за дрейфа генов и инбридинга должны обладать механизмами, препятствующими этим силам. Анализ литературы позволил выдвинуть предположение, что основной действующей силой при этом может быть межпопуляционный поток генов, реализуемый посредством распространения пыльцы. Однако известные в научной литературе представления об эффективности дальнего переноса пыльцы и возможностях ее генетической реализации противоречили данной идее, в частности, тому, что они могут быть существенным фактором формирования популяционной структуры в таких дубравах, как Вт, географически изолированных от других дубняков расстоянием около 80 км.

Рис. 3. Дендрограмма, построенная на основе генетических расстояний £> между популяциями дуба черешчатого по аллозимным локусам

Для проверки или опровержения этой гипотезы использованы микросател-литные локусы. При этом использован оригинальный методический подход — применение в качестве модельных объектов географически изолированных ма-

лых популяций, в которых возможно генотипирование всех имеющихся деревьев и необходимого числа зародышей. Исследование проведено на примере насаждений из Башкирского Зауралья Вш1 и Вт2, расположенных на расстоянии минимум 80 км от основной части дубняков Южного Урала и насчитывающих всего 7 и 27 деревьев репродуктивного возраста, соответственно. На основе ге-нотипирования семи плодоносящих деревьев и их зародышей в желудях урожая двух лет на пробной площади Вш2 были определены все возможные генетические комбинации у потомства для анализа трех сценариев: 1) образование потомства происходит только за счет собственной пыльцы; 2) формирование генотипов зародышей осуществляется дополнительно пыльцой, поступающей из древостоя Вш1; 3) в насаждении обнаруживаются аллели, отсутствующие в Вт1 и Вт2.

Показано, что поступление пыльцы из неизвестных источников обусловило появление аллелей, не встречающихся во всех возможных родительских парах в Вш1 и Вт2, у 41 % исследованных желудей. Таким образом, причиной относительно высокой генетической изменчивости краевых популяций дуба череш-чатого на Южном Урале (не только Вт, но и других) может быть генетически эффективно реализованный поток пыльцы на дальние расстояния.

Установлено, что комплекс экологических факторов (в первую очередь погодные условия и ветровой режим), с учетом чувствительности к ним пыльцы черешчатого, может модулировать генетическую реализацию дальнего транспорта пыльцы в географически изолированные насаждения дуба черешчатого. Доказательства получены при сравнении полиморфизма микросателлитных ло-кусов зародышей выборки Вт2а (желуди собраны с деревьев) и Вт2Ь (мумифицированные в земле желуди предыдущего года). В выборке Вт2Ь число аллелей на локус составляет Л =5,56+2,36, ожидаемая гетерозиготность НЕ =0,63 + 0,21, наблюдаемая - на =0,74 ±0,27. Для желудей следующего года плодоношения получены следующие данные. Число аллелей на локус было почти в два раза больше (А, = 10,22 ±2,57), хотя значения гетерозиготности отличались незначительно (Нв=0,77±0,16, Н0 =0,69±0,15). Выявленные различия позволили сделать заключение, что для генетически эффективного транспорта пыльцы, видимо, необходимо благоприятное стечение погодных и климатических условий.

Данные, изложенные в Главах 3 и 4, ставят вопрос - по какой причине малые и географически изолированные популяции генетически сравнительно сильно дифференцированы от больших по объему популяций? Для ответа на него нами проверена гипотеза, что особенности семенного возобновления дуба черешчатого являются для них существенным фактором увеличения генетического разнообразия. В этих целях в насаждении Вт1 проведен основанный на С18-технологиях и симуляции Монте-Карло автокорреляционный анализ, позволяющий статистически оценить убывание генетического родства пар деревьев с ростом расстояния между ними. При этом сразу три микросателлитных локуса показали феномен «изоляции дистанцией» - генетическое расстояние Г.-Р. Грегориуса статистически достоверно росло с увеличением класса дистанции

с 20, 31 и 51 м до 124 -153 м. С этих расстояний на графике-дистограмме линия, показывающая увеличение параметра Ы, выходит за пределы 95 %-ного доверительного интервала, начиная случайно флуктуировать. Анализ особенностей семенного возобновления дуба черешчатого позволил выбрать наиболее вероятное объяснение этой динамики — гравитационный механизм распространения желудей и с ними материнских аллелей, из-за чего концентрация последних убывает с расстоянием. Малые размеры популяций из экологически пессималь-ных условий среды должны способствовать этому процессу, так доля каждого дерева-источника семян в образовании общего урожая в этих условиях намного больше, чем в больших по численности древостоях.

ВЫВОДЫ

1) Три разных типа молекулярно-генетических маркеров (аллозимные, [БвЯ- и микросателлитные локусы) показывают сравнительно высокое генетическое разнообразие дуба черешчатого Южного Урала, в том числе в расположенных в экологически пессимапьных условиях среды краевых географически изолированных малых популяциях.

2) Расположенные в типичных для вида условиях среды популяции, по результатам анализа аллозимных локусов, сгруппировались по приуроченности к отдельным зонам растительности Южного Урала и к крупным геоморфологическим образованиям. Выделены северная (зона хвойно-широколиственных лесов на севере Камско-Бельского понижения), центральная (зона широколиственных лесов центральной части Камско-Бельского понижения и низкогорий западного макросклона южно-уральских гор) и южная (граница бореально-лесной и степной зон, юг Зилаирского плато) группы популяций с относительно слабой внутригрупповой генетической дифференциацией.

3) Основной вклад во внутривидовую пространственно-генетическую дифференциацию дуба черешчатого на Южном Урале вносят малые популяции эколого-географического края ареала, расположенные в экологически песси-мальных условиях среды.

4) Генетически реализованный поток пыльцы, переносимой на дальние расстояния, является важным фактором формирования относительно высокого аллельного разнообразия в географически изолированных малых популяциях, снижая вероятность воздействия на их генофонд дрейфа генов и инбридинга.

5) Аллельное разнообразие потомства в краевых малых популяциях существенно варьирует по годам. Наиболее вероятной причиной данного феномена может быть воздействие комплекса экологических факторов (погодные условия, ветровой режим и др.), изменяющее качество пыльцы.

6) Гравитационный механизм распространения семян (желудей) дуба черешчатого в малых по численности деревьев географически изолированных дубравах, создавая в древостоях выраженную пространственно-семейную кластеризацию генотипов, является фактором, ответственным за относительно высокое генетическое своебразие популяций на экологической и географической границах ареала.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Янбаев Ю.А., Габитова A.A., Бушбом Ю. и др. Естественное возобновление дуба черешчатого на северо-восточной границе ареала // Аграрная Россия (специальный выпуск «Актуальные проблемы дендроэкологии и адаптации растений», посвященный 80-летию со дня рождения профессора Ю.З. Кулагина). - 2009. - С. 16-17.

2. Коновалов В.Ф., Янбаев Ю.А., Галлеев Э.И., Саитова P.M., Габитова A.A. Состояние и перспективы развития селекции древесных растений в Республике Башкортостан // Аграрный вестник Урала. - 2010. - № 3. - С. 98-99.

3. Бушбом Ю., Янбаев Ю. А., Деген Б., Габитова А. А. Динамика генетического разнообразия во времени в изолированной популяции дуба черешчатого Qiiercus robur L. (Fagaceae) II Генетика. - 2012. - T. 48. - № I. - С. 135-137.

4. Янбаев Ю.А., Габитова A.A., Боронникова C.B. Экологическая обусловленность межпопуляционной генетической дифференциации дуба черешчатого на Южном Урале // Вестник БГАУ. 2012. - № 2. - С. 63-65.

Публикации в других изданиях

5. Габитова A.A. Об естественном возобновлении дуба черешчатого // Молодежная наука и АПК. Проблемы и перспективы: матер, междунар. науч-практ. конф. - Уфа, 2010 г. - С. 198-200.

6. Садыков Х.Х., Габитова A.A., Янбаев Ю.А. О формировании культур дуба черешчатого // Актуальные проблемы современной науки и образования: материалы всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Уфа: РИЦ Баш-ГУ, 2010.-С. 170-173.

7. Бушбом Ю., Деген Б., Янбаев Ю.А., Редькина H.H. и др. Эффективность генетического потока в изолированные малые популяции дуба черешчатого) // Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий: матер. V всерос. науч.-практ. конф. - Оренбург, 2010. — С. 20-22.

8. Габитова A.A., Ахметов А.Р., Ситдиков М.Р. О сохранении биоразнообразия древесных пород в республике Башкортостан // Состояние, проблемы и перспективы развития АПК: матер, междунар. науч.-практ. конф. - Уфа, 2010 г. - 96-98.

9. Габитова A.A., Янбаев Ю.А., Муллагулов Р.Ю., Редькина H.H. и др. Об аллельном разнообразии древесных растений на восточной границе ареала на Южном Урале // ЕС-Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, лесного, рыбного хозяйства и пищи: матер, междунар. науч.-практ. конф. с элементами научной школы для молодежи. - Уфа, 2010. - С. 81-83.

10. Янбаев Ю.А., Габитова A.A. Полиморфизм изоферментов дуба черешчатого (Qiiercus robur L.) II Научное обеспечение инновационного развития АПК: мат. всерос. науч.-практ. конф. в рамках XX юбилейной специализированной выставки «Агрокомплекс-2010». - Уфа, Башкирский ГАУ. - 2011. - С. 317-319.

11. Габитова A.A., Янбаев Р.Ю. Генетическое разнообразие дуба черешчатого Южного Урала // Агрокомплекс-2011 : мат. всерос. науч.-практ. конф. в

рамках XXI международной специализированной выставки. - Уфа, 2011. - 209211.

12. Садыков Х.Х., Янбаев Ю.А., Габитова A.A., Ахметов А.Р. и др. Эколо-го-генетические процессы при естественном возобновлении широколиственных лесов Южного Урала // Синтез знаний в естественных науках: матер, межд. науч. конф. — Пермь: Перм. гос. иссл. ун-т., 2011. - Т. 2. - С. 197-200.

13. Габитова A.A., Янбаев Ю.А., Боронникова C.B. Анализ генетического разнообразия дуба черешчатого с применением ISSR-PCR маркеров // Проблемы популяционной и общей генетики: мат. междунар. конф., посвященные памятной дате - 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова. - Москва, 2011.-С. 102.

14. Янбаев Ю.А., Бушбом Ю., Деген Б., Габитова A.A. Формирование генетического разнообразия изолированных малых популяций дуба черешчатого на Южном Урале // Проблемы популяционной и общей генетики: мат. междунар. конф., посвященные памятной дате — 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова. - Москва, 2011. - С. 123.

15. Габитова A.A., Янбаев Ю.А. Экология семенного размножения дуба черешчатого и формирования генотипического состава популяций з пространстве // Агрокомплекс-2012: мат. всерос. науч.-практ. конф. в рамках XXII международной специализированной выставки. - 2012. - С. 42-44.

Подписано в печать 13.04.2012 г. Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Типограф-У» 450098, г.Уфа, ул.Комсомольская, 2; тел. 8(347)299-19-80 Заказ №908, т.120, Формат 60x90 1/16. Уч. п.л. 1,3, усл. печ. л. 1,16 Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Габитова, Айгуль Айдаровна, Уфа

61 12-3/1132

На правах рукописи

ГАБИТОВА АЙГУЛЬ АЙДАРОВНА

ДУБ ЧЕРЕШЧАТЫЙ (ОиЕЫСШ КОВШ* Ь.) НА ЮЖНОМ УРАЛЕ: ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИОННОЙ

СТРУКТУРЫ.

Специальности:

03.02.08-Экология (биологические науки) и 03.02.07 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Янбаев Юлай Аглямович

Доктор биологических наук, доцент Боронникова Светлана Витальевна

УФА-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление 2

Введение 3

Глава 1. Эколого-генетические исследования видов <2иегст Ь. 9

1.1. Разработка молекулярно-генетических методов 9 исследования видов Оиегст Ь.

1.2. Основные направления исследований в популяционной биологии 13 Оиегст Ь. с применением молекулярно-генетических маркеров

Глава 2. Регион, объекты и методы исследований 34

2.1. Краткая характеристика региона исследований 3 4

2.2. Объект исследований 39

2.3. Методы исследований 45 Глава 3. Генетическое разнообразие в популяциях дуба черешчатого 61 Глава 4. Межпопуляционная дифференциация дуба черешчатого на 78 Южном Урале

Глава 5.Внутри- и межпопуляционный поток генов как фактор 108 формирования популяционной структуры дуба черешчатого на Южном Урале

Выводы 122

Список работ, опубликованных по теме диссертационной работы 124

Список цитированной литературы 127

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Внутри- и межпопуляционные взаимодействия растений играют ключевую роль в динамике во времени и в пространстве генофондов (Slatkin, 1987) и, через ее регуляцию, в формировании устойчивости на популяционном уровне к экологическим факторам среды. Это положение особенно актуально для видов на границах ареалов, где условия среды для них экологически более экстремальны. Здесь из-за небольшой численности популяции больше подвержены к действию дрейфа генов и инбридинга, чувствительны к эрозии генофонда (Geber, 2008). Возможность противодействия этим неблагоприятным явлениям определяется способностью популяционных систем поддерживать оптимальный уровень внутривидой пространственной подразделенности (Алтухов, 1995). Новые комбинации генотипов, легче образующиеся на границах ареалов, могут позволить видам быстрее эволюционировать и дать дополнительные возможности для адаптации и выживания (Petit et al., 2008), Эффективный генетический поток является при этом рассматривается в качестве одного из важнейших факторов (Rousseau et al., 2008).

Генетическая структура популяций дуба черешчатого {Quercus robur L. (Fagaceae)) исследована на большей части ареала и достаточно детально (Ducousso, Bordacs, 2004). Однако на Южном Урале, где проходят его восточная граница (Семериков, 1981), факторы формирования и поддержания генофонда вида практически не изучены (Яковлев, Клейншмит, 2002), особенно с применением современных и информативных молекулярно-биологических методов (Редькина и др., 2008). Данная проблема не позволяет научно обоснованно разрабатывать системные меры для повышении устойчивости дубрав к неблагоприятным экологическим факторам, оценить эколого-генетические последствия наблюдающейся в последние десятилетия деградации дубняков (Григорьев и др., 2000), сохранять и рационально использовать на популяционной основе генофонд

вида (Янбаев и др., 2002), совершенствовать в регионе лесосеменное и лесокультурное дело.

Цель исследований - проведение эколого-генетического анализа популяционной структуры дуба черешчатого на границах его ареала на Южном Урале и комплекса факторов, ответственных за формирование и поддержание его генофонда.

В связи с ней решались следующие задачи:

1) Исследовать генетическое разнообразие популяций из различных природно-климатических зон региона и экологических условий местообитаний;

2) Изучить генетическую дифференциацию популяций, расположенных в местообитаниях, характерных для дуба черешчатого, и экологически пессимальных условиях среды;

3) Исследовать роль генетически реализованной миграции пыльцы на дальние расстояния в формировании и поддержании генетического разнообразия популяционных структур;

4) Провести анализ влияния особенностей семенного возобновления на формирование генотипического состава в насаждениях.

Научная новизна. Впервые с применением комплекса молекулярно-генетических методов (аллозимных, 18811- и микросателлитных локусов), современного научного оборудования и системы математических методов обработки результатов экспериментов изучена популяционная структура дуба черешчатого в восточной части его области распространения. Установлено, что на Южном Урале генетическая дифференциация популяций из характерной для вида экологической среды обитания сравнительно невысока и обусловлена приуроченностью к крупным геоморфологическим образованиям и зонам растительности. Популяции из экологически экстремальной (пессимальной) для вида среды обитания генетически сравнительно более подразделены. Относительно высокое

генетическое разнообразие краевых популяций, в том числе расположенных вне ареала, формируется за счет изменчивого по годам генетически реализованного переноса пыльцы на дальние расстояния. Динамика генетической структуры отдельных популяций в пространстве в существенной степени обусловлено особенностей семенного возобновления. Полученные результаты не только выявляют эколого-генетические механизмы формирования генофонда дуба черешчатого на географической и экологической границах ареала, но и расширяют теоретические представления об адаптации древесных растений на популяционной основе к экстремальным экологическим факторам среды обитания.

Практическая значимость. Результаты исследований и практические рекомендации предлагаются для использования Федеральным агентством лесного хозяйства РФ, научными учреждениями, высшими учебными заведениями в их деятельности, в т.ч. для разработки системы мер для повышения устойчивости дубрав и адаптации дуба черешчатого к факторам среды, для разработки программ сохранения и рационального использования на популяционной основе генофонда вида на восточной части ее ареала, совершенствования здесь лесосеменного и лесокультурного дела. Теоретические и практические результаты диссертационной работы могут быть рекомендованы для повышения уровня подготовки бакалавров по направлениям «Биология», «Экология», «Генетика» и «Лесное дело», а также магистров и научно-педагогических кадров высшей квалификации.

Организация исследований. Работа выполнена диссертантом в 20082012.Г., в т.ч. в качестве аспиранта очного обучения на кафедре лесоводства и ландшафтного дизайна ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» (Башкирский ГАУ). Исследования с применением изоферментного анализа осуществлены в лаборатории биоразнообразия научно-образовательного центра данного ВУЗа, с использованием 18811-метода анализа ДНК - в лаборатории «Молекулярной биологии и генетики»

Естественно-научного института ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет». Изучение

микросателлитных локусов проведено в лабораториях Института лесной генетики Федерального министерства продовольствия, сельского хозяйства и защиты потребителей Германии. Диссертационная работа выполнена в рамках плановых тем научно-исследовательских работ ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ, а также по Программе сотрудничества в сфере аграрных исследований между ФРГ и РФ (2009-2011 и 2012-2013 гг., проект № 3/07 «Oekologisch-genetische Untersuchungen im Hinblick auf Biodiversitaet und Monitoring»), по проекту «Efficient long-distance gene flow into an isolated relict oak stand beyond the eastern range margin of Quercus robur L.» (20072009 гг.), указанным выше министерством ФРГ, при поддержке грантов Ассоциации «Агрообразование» (тема ««Экологические и генетические исследования биологического разнообразия дуба черещчатого на границах ареала (на примере Южного Урала)»», 2010 г.) и Института фон Тюнена Федерального исследовательского института сельскохозяйственных земель, лесоводства и рыболовства Германии («Identifizierung von Holzherkünften», 2011 г.). Результаты диссертационной работы послужили в качестве научного задела проекта «Supporting a robust and reliable timber supply with cutting-edge technology», который начал выполняться при участии автора диссертации международным консорциумом исследователей России (Башкирский ГАУ), США, Германии, Австралии и Сингапура при финансовой поддержке Федеральной лесной службы CHIA (2012-2014 гг.).

Личный вклад автора состоит в разработке программы исследований согласно поставленным задачам работы, в выборе объектов и методов, в проведении полевых и лабораторных исследований, в обработке и интерпретации полученных результатов, в их сопоставлении с литературными данными, в подготовке рукописей диссертации и ее автореферата, личной апробации полученных результатов. Подготовка публикаций осуществлена самостоятельно или при активном участии автора

диссертационной работы, результаты имеющихся совместных исследований опубликованы.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы были представлены и обсуждались на 12 научных и научно-практических конференциях. В их числе 6 международных (Молодежная наука и АПК -проблемы и перспективы: Уфа, 2010; Состояние, проблемы и перспективы развития АПК: Уфа, 2010; ЕС-Россия - 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, лесного, рыбного хозяйства и пищи: Уфа, 2010; Синтез знаний в естественных науках: Пермь, 2011; Проблемы популяционной и общей генетики: Москва, 2011; Третье международное совещание по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири: Красноярск, 2011) и 6 всероссийских (Актуальные вопросы современной науки и образования: Сибай, 2010; Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий: Оренбург, 2010; Агрокомплекс-2010: Уфа, 2010; Агрокомплекс-2011: Уфа, 2011; Научное обеспечение инновационного развития АПК: Уфа, 2011, Агрокомплекс-2012: Уфа, 2012) научных форумов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов. Она изложена на 152 машинописной странице, содержит 13 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 284 источника, из которых 219 - иностранных.

Благодарности: директору Института лесной генетики Федерального Министерства продовольствия, сельского хозяйства и защиты потребителей Германии д-ру Б. Дегену за предоставленную возможность исследования микросателлитных локусов в лабораториях института; его сотруднику д-ру Ю. Бушбом за организацию выполнения экспериментов и консультации; сотрудникам лаборатории «Молекулярной биологии и генетики» ЕНИ ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет», содействовавшим в постановке 18811-

метода анализа полиморфизма ДНК дуба черешчатого; аспирантам кафедры лесоводства и ландшафтного дизайна Башкирского ГАУ за помощь в сборе растительного материала.

ГЛАВА 1. ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВИДОВ QUERCUS L.

Литературный обзор работ в областях, близких к проведенному диссертационному исследованию, проведен в три этапа. На первом из них проводился анализ отечественных публикаций с применением традиционного анализа тезисов докладов, статей и монографий в библиотеках различных научных и образовательных учреждений, а также Российской государственной библиотеки. Поиск зарубежной информации по популяционной биологии видов Quercus L. затем осуществлен по ключевым словам на сайте Национальной библиотеки США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) и в других поисковых системах сети Интернет. Далее на основе составленной базы отобранных абстрактов полные тексты статей для последующего анализа были получены автором диссертационной работы в Институте лесной генетики Института фон Тюнена Федерального исследовательского центра сельскохозяйственных земель, лесоводства и рыбоводства Германии (Institute of forest genetics, Johann Heinrich von Thünen-Institute vTI, Federal Research Institute for Rural Areas, Forestry and Fisheries), имеющего свободный доступ к базам всех ведущих издательств, а также в библиотеке данного учреждения.

1.1. Разработка молекулярно-генетических методов исследования видов Quercus L.

До тех пор, пока в арсенале исследователей не появились генетические маркеры, популяционная биология видов рода Quercus L. исследовалась в основном с применением по фенотипическим признакам (Кривошея, 1972; Лигачев, 1986; Лукьянец, 1979; Семериков, 1981 и др.). Но успешное решение в северном полушарии (основной части ареала видов Quercus L.) эколого-генетических, популяционно-генетических, экологических,

ботанических, эволюционных проблем исследований дуба связано с быстрым развитием биохимии и молекулярной биологии. Как и для других видов растений (Левитес, 1986), применение маркеров (не считая вторичных метаболитов и др., например, монотерпенов) в этих целях связано с изоферментами, позволивших за более чем тридцатилетний период решить множество проблем популяционной биологии (Алтухов, 1988) и имеющих собственные методические и методологические преимущества (Политов, 2007).

В аллозимных исследованиях дубов одними из первых сообщений выступили работы (Müller-Starck et al., 1996; Zanetto et al., 1996), посвященные анализу генетического контроля биосинтеза изоферментов европейских видов Quercus robur Liebl. и Quercus petraea Matt.

Эфективность аллозимных маркеров локуса NAD-зависимой дегидрогеназы продемонстрирована на примере выявления различий Q. robur и Q. petraea (Gömöry, 2000).

Поиск, осуществленный нами, не позволил обнаружить ссылки на исследования ДНК дуба при помощи технологий клонирования и секвенирования ДНК - методов, широко применявшихся с 70-х годов (Чемерис и др., 2005) у множества других групп растений. Одним исключением является работа (Zoldos et al., 1999), где геномы комплекса 11 видов рода изучены не только с применением цитогенетических методов, но и с использованием рибосомальных генов. В другом исследовании (Barreneche et al., 1998) маркеры 5S rDNA использованы вместе с другими.

Наиболее существенные результаты в эколого-генетических исследованиях видов дуба получены при использовании возможностей поЛимеразной цепной реакции (Saiki et al., 1985), благодаря которой можно получать копии фрагментов ДНК в практически неограниченных количествах.

Как и в других областях исследований природных популяций, из молекулярных методов вначале применялись RAPD-маркеры (Moreau, 1993)

- например, при изучении видов дуба из Венгрии (Bordács, Burg, 1997). Соответствующие работы, число которых снижалось с каждым последующим годом, проведены исследователями в различных частях мира -для Q. petraea (Le Corre et al., 1997), Q. robur (Яковлев, Клейншмит, 2002; Barrenecheet al., 1998). Quercus affinis Scheidw., Quercus laurina Bonpl. (González-Rodríguez et al., 2005). Однако из-за методологических недостатков (Политов, и др., 2007) RAPD-анализа популяций внимание исследователей в последнее десятилетие привлекли молекулярно-генетические маркеры других типов. В то же время практически нет работ, выполненных с применением ISSR-анализа (Габитова и др., 2011).

История использования более эффективных молекулярных маркеров началась, видимо, с работы (Demesure et al., 1995), в которой представлены универсальные праймеры для амплификации полиморфных некодирующих областей митохондриальной и хлоропластной ДНК растений. Практически одновременно были охарактеризованы высоко вариабельные (GA/CT)n-микросателлиты Quercus macrocarp Michx. из Северной Америки (Dow et al., 1995), а также идентифицированы для Q. petraea из Европы (GA/CT)n-микросателлиты (Steinkellner et al., 1997). Для других видов дуба далее специально были подобраны наборы праймеров для амплификации хлоропластных микросателлитов видов Quercus L. (Deguilloux et al., 2003), с успехом использованные для выявления дифференциации популяций дуба (Deguilloux et al., 2004). Одним из ключевых объектов при этом являлся дуб черешчатый, для которой описаны (ОА)п-микросателлитные локусы (Kampfer et al., 2004). Разработаны методы амплификации микросателлитных маркеров и красных (Aldrich et al., 2002) и европейских белых дубов (Aldrich et al., 2003). Проведен анализ последовательности ITS-областей генома дуба из Италии (Bellarosa et al., 2005). Важным, с точки зрения возможностей использования в популяционной и экологической генетике, явилась разработка специальных протоколов PCR-реакции для анализа наследования хлоропластных и митохондриальных геномов дуба черешчатого (Dumolin et

al., 1995). Многие филогенетические и филогеографические вопросы для видов дуба успешно решены за счет разработки протоколов исследования хлоропластной ДНК - на Балканах и Карпатском бассейне (Bordacs et al., 1997). В некоторых работах (Scotti-Saintagne et al., 2004) использован одновременно комплекс (изоферменты, AFLP, SCAR, микросателлиты, SNP) маркеров.

В последние годы прорывным направлением стали исследования локусов количественных признаков (QTL), в т.ч. связанных с контролем эффективности использования воды у Q. robur (Brendel et al., 2008). У разных видов дуба исследован