Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ДОСТОВЕРНОСТЬ ИММУНОДИАГНОСТИКИ НЕКОТОРЫХ ВИРУСОВ ТОМАТА И КАРТОФЕЛЯ И ПУТИ ЕЕ ПОВЫШЕНИЯ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ДОСТОВЕРНОСТЬ ИММУНОДИАГНОСТИКИ НЕКОТОРЫХ ВИРУСОВ ТОМАТА И КАРТОФЕЛЯ И ПУТИ ЕЕ ПОВЫШЕНИЯ"



СТВЕННЫИ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

- МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи НИКОЛАЕВА Ольга Ивановна

УДК 576.858.8 : 631.527 : 632.38 : 635.21

достоверность иммунодиагностики

некоторых вирусов томата и картофеля и пути ее повышения

(Специальность 06.01.11 — _ защита растений от вредителей и болезней)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени . кандидата биологических наук

МОСКВА — 1986

- Работа выполнена на кафедре фитопатологии Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимиря-: зева.'

- Научный руководитель — кандидат _ биологических наук В. А. Шмыгля.

Официальные оппоненты — доктор сельскохозяйственных наук Ю. И. Помазков, кандидат биологических наук А. И. Зезюкин.

Ведущая организация — Всесоюзный научно-исследовательский институт фитопатологии. ;"'"' ' '-

Защита диссертации состоится . « ^> июня 1986 г.

в часов на заседании Специализированного совета

К-120.35.03 в Московской сельскохозяйственной академии-имени К- А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва. И-550, Тимирязевская ул., 49, корп. 8, Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА. !

Автореферат разослан « ^1986 г.

Ученый секретарь ' ; ' '

Специализированного совета

доцент Н. К. Торянская

0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Необходимым условием эффективности диагностики фитопатогенных вирусов в селекции и семеноводстве различных культур является использование достоверных методов, обладающих высокой чувствительностью и способностью выявлять зараженность в широком диапазоне условий. 'Накопление вирусов в растениях в высокой концентрации, дающей возможность их обнаружения сравнительно . простыми методами, например, капельным, наблюдается далеко не всегда. Основным направлением в развитии и совершенствовании методов диагностики вирусов в настоящее время является повышение их чувствительности. Наиболее чувствительной ■ считается индикаторная диагностика, особенно с применением прививки на высоковосприимчивые растения. Из числа иммунодиагностических методов первое место по чувствительности занимает имму-ноферментный анализ (ИФА). От достоверности методов диагностики зависит не только эффективность селекции растений на устойчивость к вирусам и выращивание здорового посадочного и семенного материала^ но и решение многих важных впоросов биологии фитопатогенных вирусов. Несовершенством- методов диагностики может быть объяснено большое число противоречивых данных и мнений по некоторым вопросам биологии вирусов растений. В частности, большинство авторов на основании методов, имеющих невысокую чувствительность, отрицают возможность передачи вируса табачной мозаики (ВТМ) семенами турецкого табака (Мзтьюз Р., 1973; Молдован М. Я-, 1973 и Др.). Высказаны различные, часто прямо противоположные мнения по вопросу о передаче ВТМ семенами томата (Каримов Т. М., 1978; Власов Ю. И., Ларина Э. И., 1982; Вгоас1Ьеп1 Ь., 1965 и др.). В последние годы передача ВТМ семенами табака и томата в высоком проценте была показана индикаторными методами: инокуляцией семядольных листьем огурца по Холмсу (1929) и трансплантацией живой ткани на системно-восприимчивые растения (Шмыгля В. А., Ма-каев С. Ш., Актаа

Однако эти методы непригодны для серийной диагностики, поэтому для обнаружения семенной инфекции ВТМ в селекции и семеноводстве томата и табака необходимы разработка и испытание других методов, в частности — иммунологических. Нерешенным остается также вопрос 'диагностики семенной передачи мозаичных вирусов настоящими (ботаническими) семенами картофеля. .Передача М-вируса картофеля '(МВК) сеянцам картофеля через семена обнаружена путем трансплантации живой ткани на растения томата (Шмыгля В. А., Русинова Е. Я., 1971;-Шмыгля В. А., 1973). Однако для серийной диагностики зараженности МВК гибридных сеянцев в селекции картофеля необходимы менее трудоемкие методы. Большие трудности встречаются также в диагностике МВК при выделении исходных форм для селекции картофеля на устойчивость к этому.вирусу. Установлено, что капельная серодиагностика непригодна для определения зараженности МВК межвидовых гибридов с высокой относительной устойчивостью к нему (Ог1е\¥0П5ка М. А., Озкоу/эка К., 1978; Шмыгля В. А., .Кирсанова Э. В., 1984), в то же время удобных в практической работе и достаточно надежных растений-индикаторов МВК не имеется. Наиболее вероятно, что требованиям серийной диагностики в этих условиях будут соответствовать высокочувствительные иммунологические методы.

Таким образом, в исследовательской работе по развитию и усовершенствованию методов диагностики вирусов, поражающих пасленовые культуры, стоят, в частности, следующие задачи:

— определить пригодность существующих методов диагностики и их вариантов для определения зараженности различного по характеру растительного материала (семян, проростков, сеянцев, взрослых растений), а также образцов с различной относительной устойчивостью;

— изучить соотношение между чувствительностью методов и достоверностью их результатов при анализе различного растительного материала;

— повысить достоверность методов диагностики вирусов, наиболее широко применяемых в практике селекции и семеноводства картофеля, томата и табака.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было проведение сравнительных испытаний иммунологических методов диагностики и способов подготовки к анализу растительного материала при различных путях передачи инфекции для повышения достоверности результатов диагностики ВТМ .и МВК.

В нашей работе были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить результаты диагностики ВТМ различными

методами в растениях томата и табака разного возраста при семенной и контактно-механической инфекции.

2. Сравнить результаты диагностики МВК различными методами в сеянцах и растениях клубневой репродукции картофеля и определить наиболее достоверные методы. .

3. Испытать метод иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики семенной инфекции ВТМ — на томате и табаке и М:ВК — на картофеле.

4. Разработать приемы, повышающие достоверность результатов диагностики и производительность труда при серийных анализах.

Научная новизна. 'Впервые показана возможность использования иммуноферментного анализа |(ИФА) для определения зараженности партий семян томата и табака ВТМ. Показаны границы достоверности ИФА при диагностике МВК в растениях картофеля. Предложены приемы повышения достоверности иммунологической диагностики МВК: декапитация исследуемых растений и инокуляция их ВТМ, обеспечивающие 100%-ную достоверность. '

Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют рекомендовать ИФА для определения зараженности семян томата и табака ВТМ независимо от сроков их хранения и химической обработки.

На основании экспериментальных данных рекомендуется применение ИФА для диагностики МВК в сеянцах картофеля и в образцах с высокой относительной устойчивостью к этому вирусу после предварительной подготовки материала путем декапитации растений л* инокуляции их ВТМ за 25 дней до анализа.

'В ходе исследований уточнена методика получения высокоактивной диагностической сыворотки к ВТМ, методика получения на ее основе конъюгата для ИФА, а также^ме-тодики сенсибилизации антителами суспензии латекса для диагностики ВТМ и МВК.

Испытана замена использования сока или экстракта исследуемого образца при ЙФА дисками . из листовых пластинок,, что позволяет снизить, затраты труда на проведение анализов на 35—37% без' снижения достоверности результатов. .-...'

•Материалы исследований использованы. при разработке методических рекомендаций по диагностике ВТМ в семенах томата, в разработке методов получения семян томата, сво-v "бодных от ВТМ, а также при чтении лекций студентам отделения защиты растений ТСХА.

Апробация работы. Содержание диссертации было доложено и обсуждено на научной конференции TCJCA. в июне 1985 года,

Структура и объем работы. .Диссертация изложена на 115 страницах машинописи "(не считая списка литературы) и состоит из введения, обзора литературы н четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Список использованной литературы включает 264 названия работ, в том числе" 103 на иностранных языках. Работа ¡иллюстрирована 7 фотографиями, 17 таблицами и 5 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Введение. Приведена.краткая характеристика состояния проблемы ранней диагностики вирусов в растениях, показана актуальность исследований по этой проблеме. ."

2." Обзор литературы.

2.1. 'Дана сравнительная оценка существующих в настоя-; щее время соврёменных методов серологической диагностики вирусов.

2.2. Изложены и обсуждены современные сведения о путях и методах повышения чувствительности серологической диагностики и достоверности их результатов.

" 2.3.- Изложены современные сведения о возможности по: вышення" достоверности серодиагностики путем стимулирования накопления вирусных антигенов в растениях.

2.4.'На"основании современных сведений дана характе-. ристика роли и места серологической диагностики.в селекции и "семеноводстве растений.

2.5. В заключении по' обзору литературы отмечены не-, которые вопросы практической'диагностики фитопатогенных вирусов, указывается на необходимость поиска путей.совершенствования иммунодиагностики, в частности — разработки, приемов " повышения достоверности ее результатов, а также рационального ее сочетания с другими методами обнаружения вирусной зараженности. ____

: Экспериментальная часть. " / - 3. Сравнение результатов диагностики ВТМ в семенах, проростках и растениях томата и табака иммунологическими и индикаторным методами.

3.1. Материал и методы. Материалом для опытов служили семена, проростки и взрослые растения томата с. Пионерский- и турецкого табака '(Nicotiana tabacum L.) "с. 'Самсун. ~ .' '

Для иммунодиагностики BTiM использовали "сыворотку к этому вирусу, полученную в лаборатории защиты растений ТСХЛ с гомологичным титром ""Г: 1024, неспецифических реакций не отмечено. "

; Серодиагностику капельным методом проводили по Á1. С. Дунину и Е. В. Кувшиновои (1958). Интенсивность реакции оценивали по .четырехбалльной шкале >—4|+.

Сенсибилизацию полистиролового латекса с диаметром 1,2 мкм и постановку реакции проводили по методике Берк-са (Bercks R., Í971). «

Иммуноферментный анализ проводили по методике Clark М. F., Adams A. N.,- (1977) в двойном «сэндвиче-варианте. Результаты анализа считывали с помощью фотометра (абсорбциометра MR-600) фирмы Dynatech при длине волны 490 нм. О зараженности исследуемых образцов и концентрации вируса в них судили по степени окрашивания (оптической плотности) субстрата. Числовые "значения оптической плотности OKpauieiiHoro продукта ферментативной реакции в оптических единицах (о. е.) обрабатывали для достоверного разграничения фоновых значений абсорбции (Л490) и _положительных результатов с применением формулы: Р=х<+ЗЕ, где Р — порог достоверности" положительных результатов; х — среднее "значение А4эо для отрицательного, контроля ¡(здоровый материал); ЗЕ — тройное значение максимального отклонения А490 от среднего в отрицательном; контроле. Все значения А490 выше Р считали поло; жительными результатами. * Выделение иммуноглобулинов и получение конъюгата для ИФА проводили по методике Nakane, Kowoi (1974). Индикаторную диагностику проводили методом инокуляции отделенных листьев клейкого табака (Nicotiana glutinosa L.) и методом инокуляции семядольных листьев огурца по Холмсу (1929).

3.2. Результаты и их обсуждение. В таблицах 1 и 2 представлены результаты диагностики ВТМ в семенах, проростках и взрослых растениях томата и табака четырьмя методами: капельным серологическим (КСМ), методом латекс-теста (ЛТ), путем инокуляции отделенных листьев N. glutinosa L. и семядольных листьев огурца.- ■ .

- Из таблиц 1 и 2 видно, что КСМ и JIT не обнаруживают ВТМ ы зараженных семенах томата и табака и в проростках из них. Инокуляция отделенных листьев N. glutinosa также-дала отрицательные результаты, хотя на семядольных листьях огурца положительный результат получен в 96— 100% анализированных проб. Молодые растения томата (цветение 1-й кисти) и табака, развившиеся из зараженных семян, оказались зараженными ВТМ соответственно на 100 и 68% по результатам инокуляции отделенных листьев N. glutinosa. Есть основания считать, что эта зараженность обусловлена не заражением извне, а семенной инфекцией, так как растения из здоровых семян, вегетнровавшие в тех : 5

Результаты диагностики ВТМ в семенах, проростках и растениях томата (с. Пионерский) различными методами (% положительных результатов)

Иммуно- Биотести

Материал Кол-во диагностика N. -glu-fino-,sa инокуляция семядольных листьев огурца

ЯП проб кем ЛТ

■Растения из здоровых семян в фазе . цветения 1 кисти (отрицав, контроль)

Сухие семена от зараженных растений (не обра-• ,ботаяные," - храиени© 10

мес.) - ■ Сухие семена! от зараженных растений (обраб 20% HCl) Проростки из зараженных

семян . Растения из зараженных - семян в фазе цветения

1 кисти -Взрослые растения, зараженные ВТМ (лоложи-" тельный контроль)

50 раст.

50X20

50X20 50X20

50 раст.

50 раст.

0 0

10

100

0.

0 0

-22

100

- о о

100

100

100

100 100

X

X

'Примечание:' X — анализ не проводился. ■

Т а б л и ц а 2 Результаты диагностики ВТМ в семенах, проростках и растениях табака №соиапа 1аЬасшп (с. Самсун) различными методами (% положительных результатов)

Материал

Кол-во проб

Иммунодиагностика

кем

ЛТ

Биотесты

N. glutinosa

инокуляция семядольных листьев огурца

Растения из здоровых семян (отркцат. контроль) Сухие семена от заражен ных ВТМ растений (хран. 6 месяцев) Проростки из зараженных семян

Взрослые растения из за

раженных семян Взрослые растения, зара-¡женные ВТМ (положит, .контроль)

50 раст.

20X0,1 г 50X20 50 раст.

50 раст.

0 0 6

100

0 0 16

100

0 0 68

100.

100 96 100

X

КОНТРОЛЬ

60 40 201

%

&ешищий ШШШаЦМ &еШ1Щ1Щ* ГШ ШОДЩ ВТН

v

о

е!

37

чг

—■

28

9 Л

г я. и • 2 и Н£ I п ш;

а. сеаццм КАРТОФела б. Аонр&едовскии

о

го

33,3

60

40

I Н Ж I н НЕ И Ц х ? . ме^свц^овые гц«

Рио.1. Влияние декалитации и инокуляции БТЙнп£®луль*ат^

: диагностики ЭДК ' - ■ '■ '•.. ' V ■'•-*'

I. Отрицательные и сомнительные результаты {Адэд - 0-0^20 йуй») П. Положительные результаты только ®А Ц490 - О^О-О^ЬО о,о.) . а. Положительные результаты 1ИА и КСИ (А^ » свыюв О^ЬО о,е,)Л

же условиях, были полностью свободны от вируса. Из приведенных результатов следует также, что КСМ, ЛТ и инокуляция отделенных листьев N. glutinosa непригодны для диагностики ВТМ в семенах и проростках томата. Наиболее достоверным методом ранней диагностики семенной инфекции ВТМ у томата и табака оказалась инокуляция семядольных листьев огурца по Холмсу. Однако применение этого метода в серийной диагностике ограничено вследствие его ; значительной трудоемкости-и длительности (7—8 дней), поэтому необходимы поиски и " испытания других, более удобных методов обнаружения семенной инфекции

втм. ■ - -

В таблице 3 приведены результаты диагностики семенной инфекции .ВТМ у томата двумя методами: ИФА' и инокуляцией семядольных листьев огурца по Холмсу.

По той же схеме и теми же методами был проведен анализ семян, проростков и взрослых растений „ турецкого табака с. Самсун, взрослых растений сорта Ксанти некро-' тикум и гибрида Терновского. Результаты . приведены в таблице 4. -'* -

Из данных таблиц 3 и 4 видно " следующее. Семена от здоровых растений, томата, проростки и взрослые растения томата из здоровых семян показали значения Л460 от 0,08 до 0,17 o.e., что можно с большой достоверностью принять за фон сыворотки и считать эти. результаты отрицательными. Можно -считать здоровыми - и те же -варианты N. taba-cuín (с. Самсун), а также устойчивые к-ВТМ сорт Ксанти и гибрид Терновского, однако фон здесь несколько выше (от 0,16• до-0,29 о.е.). По-видимому, в:данном случае сказывается. то, что для получения диагностической сыворотки использовали в качестве накопителей.растения N. taba-, cum. ' Взрослые, растения томата и табака, системно зараженные ВТМ контактным путем, дали очень высокие значения А4эо i(ot- 1,1 до 1,55 o.e.). Результаты ИФА и инокуляции семядольных листьев огурца полностью совпали. " С целью дальнейшего изучения свойств ВТМ при семенной инфекции мы провели ИФА растений томата при различных путях инфекции. Мы попытались проследить во время вегетации динамику накопления '.ВТМ в растениях томата при контактно-механической и семенной передаче инфекции. Полученные результаты . группировали следующим образом: 0—0,15 o.e. — область отрицательных результатов (фон); 0,15—0,25 o.e. — область сомнительных результатов; присутствие вируса возможно, но достоверно не доказано; 0,25 о. е.-—достоверно лоложительные результаты ИФА. Подопытные растения вегетировали в. условиях строгой изоляции; перезараженне путем контакта было

' ' ' . Таблица 3

Результаты диагностики ВТМ в семенах, проростках и взрослых растениях томата с. Пионерский (хранение 10 мес.)

ЛУй : * 4 ' Материал Кол-во И ФА, средние значения А<35 (о. е.) Инокуляц. семя-дольн. листьев огурца (%)

ЯП проб семена от раст., зараженных ВТМ контроль, семена от здоровых растений

семена страстен., зараженных ВТМ

Сухие семена, не обработанные .

Семена, обработанные 20% НС1 . Проростки в фазе семядольных листьев

Растения в фазе цветения 1 кисти

Растения, контактно зараженные ВТМ в фазе цветения 1 кисти.......»

93X20

93X20 93X20

50 10

0,45 ±0,10

0,32+0,05 0,32+0,09

0,49±0,10 1,10+0,30

0,1 ±0,02 Р=0,10 X

0,12±0,03 ,Р=0,21 0,13+0,04 Р=0,25

Результаты диагностики ВТМ в семенах, проростках и

100

100 93

100

•Таблица 4

• ЛУЙ Материал Кол-во И ФА; среднее значение А49о (о. е.)

ЛП ■ проб семена от раст., заражении х ВТМ контроль, семена от здоровых растений

Инокуляц. семя-дольн. листьев огурца (%)

семена отрастен., зараженных ВТА1

Сухие семена (с. Самсун) . Проростки1 (с. Самсун) Взрослые растения (с. Самсун)

Взрослые растения (с. Ксглти)'.....; .'

Взрослые растения гибрида Терновского . . .

Взрослые растения (с. Самсун) системно зараженные

ВТМ . ...........

93X0,1 .г

93X20

. 50

,50 50

, 10

0,46±0,07 0,37+0,09 0,47±0,12

1,25±0,30

0,17±0,01 /Р=0,20 0,22±0,04 Р=0,34 0,26+0,02 Р=0,32 0,21+0,03 0,20 ±0,07

100 100 100

Результат серологической диагностики ВШ в растениях томата (с. Пионерский) при различных путях инфекции (1985 г.) (% положительных результатов ло группам: I. —0—0,15 о. е.; 2. —0,16—0,25 o.e.; 3. —выше 0,25 o.e.)

Количество растений по 50 шг.

■ Варианты ; 1 анализ 2 анализ 3 алализ 4 анализ ; '

' И ФА кем ИФА кем ИФА • 1. ИФА §

; 1 X В 1 2 3 1 : 2 3 1 2 3

I. Растения 100 0 0 0 92 1 8 0 0 94 6 0 0 90 10: 0 0

из семя» от (0,12) (0,12) (0,20) (0,13)1(0,19) (0,12) (0,20)

здоровых Р=0,21 Р= 0,23 Р= 0,25 Р=0,23

. растений

(контроль)

2. Растения 0 20 80 0 0 18 82 0 0 18 82 2 0 1G 84 о

из семян ог (0,21) (0,30) (0,20) (0,33) (0,21) (0,42) (0,21) (0,44)

зараженных

, ВТЛ1 расте-

ний

3. Растения 100 0 0 0 0 0 100 100 0 ! 0 100 100 . 0 0 100 100

из семян от (0,13) ■ (0,58) (1,20) > (1,15)

здоровых Р=0,19

растений с

доследую-

щей иноку-

ляцией •

-ВТЛ1 после

1-го анализа

Примечания: 1-й анализ был проведен в возрасте 2—4 настоящих листьев, последующие — с интервалом 10 дней. В скобках показаны средние значения А<Эо для данной группы результатов. :

исключено. Результаты представлены в таблице 5. Из данг ных таблицы 5 видно, что растения из семян от зараженных растений показали высокий процент положительных результатов (до 84%), причем в течение месяца среднее значение Л«о в 3 группе изменялось незначительно (0,3— 0,44 о. е.). Совсем иначе развивается инфекция при контактно-механическом заражении: . происходит быстрое накопление в соке вирусного антигена.в высокой концентрации (до 1,2 о.е.). Анализ полученных нами данных указывает на то, что расхождения результатов трех методов диагностики: ИФА, инокуляции листьев N. glutinosa и семядольных листьев огурца не ' могут быть объяснены только низкой концентрацией вируса в проростках и растениях из зараженных семян и заставляет предположить, что ВТМ в них присутствует в иной форме, чем в контактно-зараженных растениях. Полученные нами результаты показывают, что границы рационального применения известных методов диагностики ВТМ существенно различаются при разных путях инфекции. Так/- для обнаружения семенной инфекции отого вируса в настоящее время--можно рекомендовать только ИФА и инокуляцию семядольных листьев огурца по Холмсу.

I. Сравнительная оценка некоторых иммунологических и биологического методов диагностики МВК в.растениях картофеля

4.1. Материалы и методы

Материалом для опытов были сеянцы -от самоопыления картофеля (с. Домодедовский),. полученные от. здоровых и зараженных МВК растений, .а также растения клубневых репродукций межвидовых гибридов Solanum gourlayixSo-lanum tuberosurn — гибриды первого поколения (Fi) и Solanum megistacrolobüinxSolanum tuberosurn i— беккроссы 6-го поколения (B6). Сравнивали между собой результаты КСМ, ЛТ, АБВ и ИФА при анализе, одних и тех же клонов, а также трансплантацию ткани на "растения томата. Иммунодиагностику проводили капельным серологическим методом с использованием антисыворотки к МВК с гомологичным титром —"1:1024," а также латекс — тест, используя для. сенсибилизации ту же сыворотку. Анализ МВК методом виробактериалыюй агглютинации (АБВ) проводили по методике Чиркова С. Н. и др. i(1982). Лиофилизиро-ваниая бактериальная суспензия Staphyllococcus aureus и антисыворотка к МВК были получены на кафедре вирусологии МГУ. Иммунофермептный анализ проводился по методике Clark М., Adams А. (1977). Диагностические препа-

раты для ИФА были получены из отдела вирусологии НИИ картофельного хозяйства Росагропрома. Биологическую диагностику МВК — трансплантацию черешка листа картофеля проводили методом «в пазуху листа», в боковые побеги растений томата сорта Невский. Через 20 дней после трансплантации растения томата анализировали капельным методом на зараженность ЛШК.

4.2. Результаты и их обсуждение

Таблица б

Результаты сравнения иммунологических методов и трансплантации на томат при диагностике МВК в сеянцах картофеля от самоопыления с. Домодедовский (% положительных результатов)

, +

Иммунодиагностика н. я

Возраст « 3 3 2

Материал растений 5 « В я

(а <у ком ЛТ ЛБВ ИФА Г Я"?

К о.

Сеянцы нз семян от 2 мес. 50 0 0 0 0 0

здоровых растений 5 мес. 50 0 0 0 0 X

Сеянцы из семян от 2 мес. 50 0 0 0 4 98

зараженных МВК рас- 5 мес. 50 0 0 0 12 X

тений

Результаты показывают, что несмотря на практически полную "зараженность (98% положительных результатов трансплантации на томат).сеянцев картофеля из семян, зараженных МВК, вирус в них не обнаруживается КСМ, ЛТ и АБВ, лишь наиболее чувствительный из испытанных методов ИФА дал 12% положительных результатов в конце вегетации при полном отсутствии визуальных признаков заражения.

Результаты диагностики МВК в растениях межвидовых гибридов картофеля за три года (1983—'1985) в трех последовательных клубневых репродукциях представлены в таблице 7.

-Данные таблицы 7 показывают, что в то время как результаты ■биологического тестирования (трансплантация на томат) практически не меняются по годам, капельный метод диагностики показывает совершенно иную картину. Колебания результатов по КСМ но годам значительны, но не позволяют выявить никакой закономерности.

Существенные различия •„•■ между результатами КСМ и трансплантации на томат можно объяснить тем, что резуль-

' г-*.- Результаты диагностики МВКГв растениях межвидовых гибридов • картофеля двумя : методами , в трех последовательных клубневых: •• репродукциях (% положительных результатов)

: Матерная i Кол-во • клонов 1983 1984 . 1985-

ДСМ трансплантация на то- "I мат+KGM 1 кем трансплан- -тацня на то-мат+КСМ ДСМ « о tí í» S í sí « ¡=f 5 !-• fr- A

1) S. mefjistacrolobumX - ... .

XS. tuberosum. (В8, Л*'... . - о

"*"" .клубневая г- репродук- --

- пня) 152 46 ' 71 64,4 73,6 38., 1 69,7

2)-S. "gourlaiviXS. -tu-

у berosum "«(Fi." клубне- .... ..

вая репродукция) .48 41,6 58,3 20,8 58,3' -24 - 54,1

• таты . первого_ метода зависят от концентрации вируса (вирусного антигена)" в соке, в то время как ,рёзультатыТвто: poro метода практически не зависят;от нее. : --"-Мы "попытались выяснить, возможно ли полное выявле-- ниё МВК . в ^'гибридном, материале с; помощью чувствительных иммунологических: методов (ЛТ; А'БВ^ ИФЛ) н провели сравнительную оценку^результатов этих анализов""с"ре-■".:,зультатами. трансплантации на.томат. ' . . ^ .

"" - * -Таблица 8

Результаты сравнения иммунологических методов ... и трансплантации на томат при диагностике МВК в' ыеквндовых гибридах ( % ■ положительных результатов) ■ -

Материал ' *- i О а Иммунодиагностика - S A»-* S «aÄ S * + СЧ SB то ,a.äs f— - -

К КОМ лт АБВ ИФА"

1. Si megistacrolobumXS.. - tuberosum (Be, клубневая . реяро- .;|дукцдя) . ~ . ..... - • 2.:S. gourlayixS.tuberosum . (Fi. клубневая , репродукция) . ■ -152 ' 48" 46 47,1 47,3 41,7 47,3 41,7 59,2* : 50,0 '71*" 58,3

■ ' Из таблицы'8'видно, чтб ЛТ и АБВ показали.резуль-таты на уровне.*КСМ, результаты были выше ИФА*"соответ-ственно* на'Л2 ;и- 8%, : но - значительно ;ниже результатов трансплантации на.:томат. Таким образом,: ни. один' из" ис-

ла • ■ '

пытанных иммунологических методов не обеспечивает полного выявления зараженности МВК в образцах с относительной устойчивостью к этому вирусу, что крайне затрудняет выделение форм с крайней устойчивостью к МВК в селекции картофеля. Это вызывает необходимость разработки приемов повышения достоверности иммунодиагностики МВК.

5. Испытание приемов, повышающих достоверность диагностики МВК в сеянцах и межвидовых гибридах картофеля

5.1. Материалы и методы. Материалом для исследований были сеянцы от самоопыления картофеля (с. Домодедовский), полученные от зараженных МВК растений — 400 штук и межвидовые гибриды S. gourlayixS. tuberosum и S. megistacrolobumxS. tuberosum, показавшие положительные реакции на iMBK в предшествующей репродукции — 136 номеров. Растения в возрасте 6—8 листьев проверяли капельным методом (К'СМ) и в опыте использовали растения, показавшие отрицательные результаты КСМ и ИФА (сеянцы — 400 штук и 85 номеров межвидовых гибридов).

Схема опыта:

1. Контроль. Интактные растения.

2. Декапитация растений.

3.-Механическая инокуляция растений обычным, штаммом >ВТМ.

4. Декапитация растений + инокуляция ВТМ.

Декапитацию проводили, отсекая стерильным лезвием

верхушки растений на 4—5 см. Циркулировали растения гомогенатом листьев растений табака контактно зараженных обычным штаммом ВТМ. Анализы КСМ и' ИФА проводили через 25 дней после декапитации и инокуляции ВТМ сеянцев и межвидовых гибридов картофеля. Результаты анализов, проведенные через"25 дней после наложения испытуемых факторов, представлены на рис. '1. Из результатов, представленных на рисунке 1, следует, что после декапитации часть растений .(25 и 20%) показала низкие значения A49o (0—0,2 о.е.), остальные растения дали положительную реакцию ИФА и у некоторых (31 и 47%) МВК был обнаружен: и капельным методом. У растений, иноку-лированных ,ВТМ, результатов в зоне 0—0,2 о. е. не оказалось, "но получен высокий процент '(67 и 60%) значений выше 0,5 о. е., что говорит о высокой концентрации вирусного антигена. Таким образом, процент положительных реак-

ций (выше' 0,2 о. е.).; составил . для ИФА ~ 100%;. гв том числе для КСМ г— • больше! половины исследуемых г образцов., .При совместному воздействии декапитации.. и : циркуляции . ВТМ количество? положительных iреакций КСМ. ¿увеличилось И: составило ;(72 Ги:68%), при. полном отсутствии-их в;:"контроле. • У межвидовых .гибридов в контроле 47.%": растений показали положительные реакции только ИФА.-. Из полученных результатов* следует, что испытанные t ; методы воздействия^ стим^фовали :11акопление антигенно-активного МВК в растениях ¿картофеля и повысили достоверность обоих применявшихся методов диагностики, приводя к полному выявлению 'зараженности материала. У'^-'j тЕ-С Учитывая ' приведенные-'выше результаты, мы проверили все"имеющиеся у нас клоны 'межвидовых гибридов; на.:зараженность" МВК с применением инокуляции ВТМ. " L- По* одному растению ;из~каждого клопа инокулировали ВТМ: и через 25 дней проанализировали КСМ и ИФА^От растений," показавших ^отрицательные результаты обоих-"методов,/были отобраньКк^^ весной: следующего года; в теплице.--Развившиеся из' них растения анализировали три раза за вегетацию КСМ и ИФА.

■ - * Т а б л и ц а ' 9

Результаты диагностики'МВК в растениях межвидовых гибридов ., картофеля с применением инокуляция ВТМ __ _; „ .7

■Материал Г: л*."-. - -1984 . г. - -(через 25 дн." .после инокул. . .ВТМ) 1985!К" , "' (3-кратный диализ)-----

кол-во растен. (клонов) кем ИФА « ■кем L^ic ИФА - .%;

S.-.- megistacrolobuinxS. -tube" .irosum ......______ 2;:S;'* gourlayiXS; "tuberosum. 137; -■43: 65,7 ,44,2 17,5 27,9 23 12 ~ 0" о; Г*? -' — -"о > ;; о*

Всего 180 . ^60,5 20,0 35 Жг

, Из, таблицы .;9 видно, что .инокуляция растений картофеля IВТМ обеспечила: полное выявление зараженности г МВК образцовое отаюсительной устойчивостью : к этому , вирусу. По-видимому, у/ растений, картофеля {„клубневых репродукций,!; как и суЛсеянцев .картофеля, инокуляция ВТМ ^действует- как фактор; стимулирующий накопление вирусного антигена МВК; - _ \ >. .. . - - "

6. Испытание приемов, повышающих производительность труда при ИФА в серийной диагностике

Из числа иммуноднагностических методов первое место по чувствительности занимает иммуноферментный 'анализ (ИФА). Однако метод довольно трудоемок, при этом, затраты труда на подготовку и нанесение испытуемых образцов составляют около 40%.

¡Marco S., Cohen S. в 1979 году предложили вариант методики ИФА при котором вместо осветленных экстрактов использовались высечки (диски) диаметром 6 мм из листьев испытуемых растений, помещенные в лунки палеток с экстрагирующим буфером.

Материалом для исследований были восемь растений картофеля (с. Домодедовский), в том числе четыре — контактно зараженные МВК и четыре — заведомо здоровые. При постановке опыта в качестве контролей были использованы препараты сока из восьми подопытных растений, которые готовили и наносили согласно общепринятой методике ИФА. В опытных вариантах использовали диски (в количестве-от 1 до 6) тех же восьми растений, которые помещали "в" лунки палетки, предварительно заполненные экстрагирующим буфером (по 100 мкл). Далее анализ проводили, как описано в разделе 3.1. и по несколько измененной методике — инкубация образца в течение ночи при :+4°С. •

■ Таблица 10

Сравнение затрат труда на проведение анализа .. . .. по двум вариантам методики ИФА

Варианты методики ИФА Количество операций по приго-товл. образца ' Необходимое количество человек на приготовлен, образцов Затраты труда на приготовление 1000 образцов

чел./час

Общепринятый, с использованием осветленного сока ил» го-могената......... 6 4 16 100

С ; использованием дисков из пластинок листьев ..... 3 2 10 62,5

Результаты?анализов показали, что достоверность диагностики совпадает со стандартной методикой при условии, если для анализа берется по 5—6 дисков на 100 мкл экстрагирующего буфера и инкубация, растений проводится

в тёчёяиё.:ночи - (18 . часов) .\'Еслн:,учёсть; Что на' подготовку и :внесениелЛ ОООобразцов .', по .'-.общепринятой ¡методике требуется для работы 4 человека,^ которые должны выполнить 61-операций ;погприготовлёнию]образца,- то в варианте 'с "использованием ^дисков из -пластинок ^ листьев-/ потребуется' 2-человёка^а;-количество г операций»' сокращается до трех. Количество "чел./час" на-приготовление"; 1000 образцов сни-жется^на; 4. а этр значит, что^в'гпредлагаемом нами вари-.-а^^тге^^т^^ст1ьXIрое'сл!"от^^я 'На увеличение общей ' п^должйтельн^ :на 37%" *" • * "'

проверенную на системно --инфицированных МВК'" и;" здоровых расуениях. картофеля,. мы, испытали- также- в диагностике." семённои:;йнфекции -ВТМ'"вгпроростках ;и" растениях 'томата. ~ -т?" — Г-'" ~,т~—Г " " ' ......-

^ \ _________ I «1. V. - _____Таблица

Результаты:сравнения двух:вариантов ИФА при диагностике — I.. семенной инфекции ВТМ на-томатах (с. Пионерский) Г

/, .. - Материал..

; Общелри-... пятая схема ИФА .< А«м'(о. е.)

ИФА "

"(6 дисков, инкубация

18 чае.) А«м (o.e.)

1ф

1. 'Проростки из семянчот за.ра-, женных рас те кий .•..,. . .

.2; Взрослые 'растения из зараженных семян ; (цветение . 1 кисти) . .

3. • - Взрослые - растения заражен-

- ~ ные - ВТЛ1 (цветение -1 - кисти)

20X6

I 20'.

V, 20

0,30 ±0,020

0,41 ± 0,013 1,32±0,100

Мо.и=2,01

0,28 ±0,018

0,40+0,010 1,30±0,093

5 . \.

0,54'

0,32 0,27

! Данные .таблицы г12 показывают, что использование для диагностики.:: дисков ¿из! . листьев" позволяет обнаружить се-:'Мённую'^ййфекци^;ВТА1-гв::грастениях;- томата,; выращенных из-заражейных 'семянгг с той же достоверностью,;"как - и при-использовании гомогената. .. . -; . .-:•;

; 7. Заключение и выводы. Даётся :обобщение~2крезульта-'. : тов-проделанной работы. - '» —

: 1.: Проведено сравнительное ;изучение, достоверности: методов диагностики :-ВТМ (капельного,. латекс —теста,- имму-нофермейтного, инокуляции семядольных листьев огурца), при ¡контактной .семенной ¡инфекции^томата' и »табака, МВК .(капельного^- латекс — теста, 4 виробактериальной: агглютнна-. ции,-трансплантации,;на томат)!;пригконтактной, семенной: и клубневой ¡инфекции'картофеля. « . .*•

2. Показано, что достоверность иммунодиагностики втм и МВК в большой мере зависит от путей инфицирования исследуемого материала, определяющих ход инфекционного процесса, концентрацию и свойства вирусов, в частности I— инфекционность и антигенную активность. -

3. Методы иммунодиагностики вирусов: капельный, лаг текс — тест, виробактериальная агглютинация не обнаруживают семенной инфекции ВТМ у томата и табака и МВК — у картофеля.

4. Метод иммуноферментного анализа может быть рекомендован для определения зараженности семян томата и табака ВТМ,' независимо от их поверхностной обработки н сроков хранения.

5. 'Иммуврферментный анализ не обеспечивает полного выявления-птрй семенной передаче и в -образцах с относительной устойчивостью к этому вирусу.

6. Достоверность иммунодиагностики МВК в растениях картофеля может быть повышена '(до 100%) путем декапи-тации растений и инокуляции их ВТМ.

7. Использование дисков из листьев вместо сока или экстракта позволяет снизить затраты труда на проведение иммуноферментного анализа на 37% без снижения достоверности результатов.

Рекомендации для практики

Для выявления ВТМ в растениях томата и табака и МВК в растениях картофеля может быть рекомендовано:

1. Применение иммуноферментного анализа для выявления ВТМ в семенах томата и табака.

2. Декапнтация растений и инокуляция их ВТМ в целях повышения достоверности иммунологической диагностики МВК в селекционных образцах картофеля, которые следует проводить за 25 дней до анализов.

3. Использование дисков из листьев вместо сока или экстракта в целях снижения затрат труда при проведении иммуноферментного анализа.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. В, А. Шмыгля, С. Ш. Макаев, С. Актаа, О. И. Нико-колаева. О типах инфекционного процесса и свойствах вируса табачной мозаики. — Сельскохозяйственная биология, 1985, •№ 11, с. 43—47.

2. Николаева О/И., Актаа С., Шмыгля В. А. Иммуно-"ферментная диагностика семенной инфекции вируса табач-

. ной мозаики у томата я табака. — Известия ТСХА, 1986, вып. 1, с. 134—137. .,

I3. О. Й. ; Николаева.: Повышение достоверности опрёде ления вируса * М картофеля.:.— Плодоовощное хозяйство," 1986, № 1, с. 44—45. ■ с : :

- 4. О. И. Николаева;,С. Актаа, В. А. Шмыгля. Определение зараженности семян: томата ВТМ. — Защита растений, 1986, №Л, с. 55.

Л-89415, 28/1У:86 г. ;с1':ОбъемЛ1/4-п.-л., ... Заказ 1242., 'Мираж¡100

... . Типография-Московской с.-х. академии им." К. А. Тимирязева " _

.127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44- •* --■ -

Бесплатно