Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дополненные линии как модель интрогрессии чужеродного материала S. Lycopersicoides в геном культурного томата

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Дополненные линии как модель интрогрессии чужеродного материала S. Lycopersicoides в геном культурного томата"

/

0030В0013

На правах руклписи

КНЯЗЕВ АНДРЕИ НИКОЛАЕВИЧ

ДОПОЛНЕННЫЕ ЛИНИИ КАК МОДЕЛЬ ИНТРОГРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОГО МАТЕРИАЛА 5. ЬУСОРЕШСОЮЕЯ В ГЕНОМ КУЛЬТУРНОГО ТОМАТА

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 \т 2007

Москва-2007

003060013

Работа выполнена на кафедре генетики Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева

Научный руководитель:

доктор биологических наук, академик РАН, академик РАСХН, профессор Александр Александрович Жученко

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук Светлана Ильинична Игнатова кандидат биологических наук Роман Александрович Комахин

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур РАСХН

Защита состоится «20» июня 2007 г в ^заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К А Тимирязева по адресу 127550, г Москва, ул Тимирязевская, 49 Факс (495)-976-0894

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени НИ ЖелезноваРГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан « > мая 2007 г и размещен на сайте http //www timacad ru

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Использование дикорастущих видов -сородичей культурных - является необходимым вследствие эрозии генетического материала возделываемых видов Адаптации к абиотическим и биотическим факторам внешней среды, возникшие у диких видов в процессе эволюции, являются мощным резервом для улучшения культурных видов растений В то же время интрогрессия чужеродного генетического материала зачастую затруднена вследствие стерильности гибридов Подобная проблема существует и при использовании вида Solanum lycopersicoides, обладающего рядом ценных признаков -толерантностью к пониженным температурам, устойчивостью к возбудителям некоторых болезней (Botrytis cinerea, Phytophtora parasítica, вирусу мозаики огурца (CMV), Xanthomonas campestris pv vesicatoria, Fusarium oxysporum f sp radicis-lycopersici) (Rick, Yoder, 1988, Rick et al, 1995) Одним из возможных путей интрогрессии являются моносомно дополненные линии с добавлениями отдельных хромосом этого вида (Chetelat, 1998) Важным критерием оценки интрогрессии может служить конъюгация хромосом и цитогенетическая стабильность мейотического деления у данных линий

Цели и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлась оценка возможности интрогрессии генетического материала S lycopersicoides в геном культурного томата с использованием моносомно дополненных линий Исходя из цели, были поставлены следующие задачи

• Идентифицировать дополненные линии культурного томата с хромосомами S lycopersicoides

• Оценить степень гомо- и гомеологии хромосом S lycopersicoides и культурного томата

• Определить частоту передачи хромосом S lycopersicoides в потомстве дополненных линий

• Выявить влияние дополненной хромосомы на мейотическое

• Оценить влияние дополненной хромосомы на мейотическую рекомбинацию

• Определить возможность применения ПЦР-анализа для идентификации чужеродного генетического материала

Научная новизна и практическая значимость. Выполнен цитогенетический анализ пяти моносомно дополненных линий томата с хромосомами Solanum lycopersicoides Анализ мейотического деления показал, что дополнительные хромосомы в целом вызывают нарушения мейотического деления Впервые показано, что разные хромосомы S lycopersicoides обладают специфическими эффектами на конъюгацию хромосом Так, хромосомы II и IV S lycopersicoides могут вступать в хромосомные ассоциации в виде тривалентов с хромосомами томата, тогда как хромосома XI представлена во всех клетках только в унивалентном

деление

состоянии Наличие конъюгации хромосом свидетельствует о гомологии хромосом и возможности интрогрессии генов 5 ¡усорегяюлЛея в культурный томат Пахитенный анализ позволил установить особенности конъюгации хромосом гомеологичной группы II Применение молекулярных маркеров позволило ускорить идентификацию интрогрессий генетического материала 5 ¡усоретсспйез

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научной конференции «Памяти Грегора Менделя» (Москва, 2001), Х1Л Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2003), на 2-й конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), на научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева (Москва, 2005), на научной конференции молодых ученых по агрономии в г Чачак (Сербия, 2005), на научной конференции молодых ученых Ломоносов-2006 (Москва, 2006)

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 работ

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена

на_страницах, включает таблиц,_приложений Состоит из введения,

обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и_предложений

Список использованных литературных источников содержит_источников,

в том числе_иностранных

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал. Материалом для исследований служили расщепляющиеся популяции растений моносомно дополненных линий (МДЛ) с хромосомами II, IV, V, X, XI 5 1усорег51со1йез, любезно предоставленные Р Четелатом из центра генетических ресурсов томата (США, Калифорнийский Университет)

Методы. Семена расщепляющихся популяций проращивали в чашках Петри при температуре 28°С Проростки высаживали в кассеты (6 х 12) объемом 50 см3 Опытные растения выращивали в сосудах объемом 7 л в закрытом грунте при естественном освещении

Дополненные растения из расщепляющихся популяций выделяли подсчетом числа хромосом в меристемах корешков молодых растений Фиксацию материала проводили в утренние часы в уксусном алкоголе Препараты готовили методом распластывания клеток и окрашиванием красителем Гимза (Пухальский и др , 2004)

Для изучения мейотического деления у томата использовали небольшие (0,1-0,25 мм) бутоны Отобранные бутоны фиксировали в уксусном алкоголе (3 1) и хранили в холодильнике при +4°С Исследования мейоза проводили на временных препаратах пыльников, окрашенных ацетокармином

Пахитенный анализ выполняли на постоянных препаратах, приготовленных методом распластывания клеток В качестве стандарта

использовали стандартную пахитенную карту культурного томата (Жученко, 1978)

При работе с расщепляющимися популяциями с дополненными хромосомами II, X и XI для выявления чужеродного генетического материала использовали CAPS-маркеры TG91, TG361, СТ240, СТ203, СТ113 и SCAR-маркер TG608 (Bai et al, 2004, Alpert et al, 1996, Canady et al, 2005) (табл 1)

Выделение ДНК осуществляли из молодых листьев сеянцев томата по стандартной методике (Fulton et al, 1995) Для амплификации использовали праймеры, представленные в таблице 1

Таблица 1

Молекулярные маркеры для идентификации интрогрессий_

Маркер Хромосома Последовательность праймера 5'-3' Размер ампликонов, п H Рестриктаз a

TG91 II tgcagagctgtaatatttagac cggtctcagttgcaactcaa 400 Dra I

TG361 II gtacaggagtcctctgagatgatc caacgacaagcattccagtc 600 Аро I

TG608 II gaagctttcttaagcaggttgttg tcattagtgttaggcaagtggaag 1000 (1200 57 )* —

СТ240 X atcccaagtaccctcgcattagt agccttctttgtcccatcag 850 НаеШ

СТ203 X tagaatatgggaagcgaaatgga gaggaggcgtaatagg 650 НаеШ

СТ113 XI acaacgggcaacagacgcaacc agctcgaggatggccgcacttt 352 Mbo II, BstENII

♦Примечание 1200 пн размер ампликона у S lycopersicoides

Условия ПЦР денатурация при температуре 94°С - 1 минута, отжиг праймеров - 50°С 1 минута, синтез - 72°С 2 минуты Рестрикцию ампликонов осуществляли с использованием рестриктаз - Dra I, Аро I, Mbo I (Bai et al, 2004, Alpert et al, 1996, Canady et al, 2005) Электрофорез проводили в 2% агарозном геле (Alpert et al , 1996)

Результаты исследований и обсуждение 1, Числа хромосом как прямой метод идентификации растений с дополненными хромосомами

Основным методом идентификации моносомно дополненных линий является подсчет числа хромосом в метафазе митоза или мейоза Проведение этой работы требует достаточно много времени, особенно при анализе больших по численности популяций Необходимость постоянного цитологического анализа моносомно дополненных линий существенно ограничивает их использование Однако именно этот метод является самым надежным при выделении дополненных линий

з

Анализ числа хромосом в расщепляющихся популяциях показал сходный процент моносомно дополненных растений. Доля растений с числом хромосом 2п=25 (рис. I) составила около 10% по хромосомам II и XI, что значительно ниже теоретически ожидаемой. Это может быть обусловлено пониженной жизнеспособностью мужских гамет с дополнительной хромосомой п=12+1. Однако появление растений с числом хромосом 2п=26 свидетельствует о том, что эти гаметы могут быть жизнеспособны.

Рис. I- Метафазная пластинка растения с дополненной хромосомой II (МДЛ II), 2п=25.

Для доказательства того, что дополнительная хромосома действительно принадлежит другому виду, была проведена геномная гибридизация in situ, которая показала, что речь идет именно О хромосоме этого вида. Для второй хромосомы томата, ядрышкообразующей, возможна визуализация ядрышко организующего региона методом флуоресцентной гибридизации in situ - FISH. Сочетание этого метода с геномной гибридизацией in situ показало, что дополнительная хромосома является хромосомой II S. lycopersicoides (Соловьев и др., 2001),

2. Пахитенныи анализ как метод идентификации хромосом S. lycopersicoides

Пахитенныи анализ, несмотря на его трудоемкость, является эффективным инструментом идентификации хромосом, особенно видов с небольшим числом морфологически сходных метафазных хромосом. Для томата этот метод успешно применяется и в настоящее время.

Выполненный на моносомно дополненных растениях пахитенный анализ позволил провести идентификацию хромосом, а также установить факт конъюгации между хромосомами культурного томата и S. lycopersicoides. На рис. 2 представлены хромосомы моносомно дополненного растения на стадии пахитены и схемы хромосомы II обоих видов.

Отмеченная конъюгация между длинными плечами хромосомы II свидетельствует о наличии гомологии между ними и о возможности интрогрессии генетического материала S. lycopersicoides в хромосому культурного томата в результате рекомбинации между гомеологичными

хромосомами.

Пахитенный анализ выявил морфологические различия коротких плеч хромосомы II культурного томата и 5. 1усорепко1с1еБ. Так, короткое плечо хромосомы культурного томата содержит гетерохроматиновый регион значительно большего размера в сравнении с хромосомой 5. \ycopersicoides (рис. 2).

Рис. 2. Хромосома II культурного томата и S. lycopersicoides в стадии пахитены у м он ос ом но дополненного растения, а - пахитена мо носомно дополненного растения, б -схемы хромосомы II культурного томата (справа) и S. lycopersicoides (слева).

3. Молекулярные маркеры для идентификации интрогрессий и чужеродных хромосом

Молекулярные маркеры, специфические для хромосом определенного вида, могут быть использованы для выявления дополнений чужеродных хромосом. Применение маркеров значительно сокращает затраты времени и труда на идентификацию растений с чужеродным генетическим материалом. Совместное использование маркеров и цитологического анализа значительно сокращает объем цитологических исследований.

При использовании маркера Ct 113, локализованного в коротком плече хромосомы X!, показан полиморфизм по наличию сайта рестрикции у культурного томата и дикорастущих видов (Bai et al., 2004), Анализ исходных форм и расщепляющейся по хромосоме XI популяции показал, что маркер Ct 113 может быть использован для выявления растений с генетическим материалом хромосомы XI S. lycopersicoides. На рисунке 36 видно, что у образца 2 (Х-3-37) помимо двух рестрикциинных фрагментов присутствует и нерестрицированный ампликон. Это свидетельствует о присутствии у данного растения хромосомы S. lycopersicoides. Цитологический анализ этого растения подтвердил ее наличие.

По локусам TG91 получен фрагмент длиной 400 п.н. (рис. 4), Рестрикция продуктов амплификации этого маркера рестриктазой Dral не выявила различий между культурным томатом и видом S. lycopersicoides по этому локусу. Так же было установлено отсутствие полиморфизма по локусу TG608.

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 б Рис. 3. Электрофореграмма локуса СИ 13. а) ампликоны: 1 - Х1-1-25; 2 - Х1-1-2; 3 - Х1-3-37; 4 - Х1-3-13; 5 - XI-1-7; 6 - маркер молекулярных размеров 100 Ьр; 7 - XI-1-8; 8-Х1-3-4; б) после рестрикции- 1 - XI-1-5; 2 - XI-3-31; 3 - XI-1-11; 4 - XI-3-47; 5 - XI-3-34; 6 -маркер молекулярного размера 100 Ьр.

12 3 4 5 Рис. 4. Электрофоре грамм а локуса ТС91, I - ампликон культурного томата \<Т36, 2 -после рестрикции культурного томата, 3 - ампликон 5. К'еорггисойе.ч, 4 - после рестрикции 5. ¡усоретсоШех, 5 - маркер молекулярного размера 100 Ьр.

Анализ локуса Т0361 выявил различия между культурным томатом и \ycopers¡соМез. У дикорастущего вша сайт рестрикции отсутствовал (рис. 5), что свидетельствует о возможности применения этого маркера для идентификации генетического материала хромосомы II в культурном томате. Анализ расщепляющейся популяции по хромосоме II показал, что у всех проанализированных растений данный маркер отсутствует. Это может свидетельствовать как об отсутствии хромосомы II 51 1усорег$юо14ез, так и о возможной рекомбинантной природе этой хромосомы у анализируемых растений. Об этом свидетельствуют и результаты пахитенного анализа дополненных растений, показавшие конъюгацию длинных плеч хромосом культурного томата и 5. \ycopersicoides. Это может служить основой появления рекомбинантных хромосом.

I 23 4 56789 10 И 12 13 Рис, 5, Электрофореграмма л о куса ТОЗб I I - 6 - растения популяции МДЛ-Н; 7,8-культурный томат; 9, 10-5. 1усорег$коШе$\ 11. 12 - растение популяции МДЛ-П (нечетные - амиликоны, четные - реорикты), маркер молекулярного размера ] 00 Ьр.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Рис. 6, Электрофореграмма локуса СТ203. Ампликоны: 1 -5, 1усорег51со1с1е5, 2 -культурный томат, 3 — 7 - растения популяции МДЛ-Х. Рестрикты: 8-5 1ус0рег$!с01с!ез, 9 - культурный томат, 10 - 14 — растения популяции МДЛ-Х, 15 -маркер молекулярного размера ).-Вте 181.

Для локуса СТ203, локализованного в хромосоме X, показан полиморфизм для дикорастущих видов томата. В то же время не установлено различий между культурным томатом и 5. 1усорег$1с01(1ез, что делает невозможным применение этого маркера для выявления дополнений данной хромосомы (рис. 6).

а) 6)

12 3 4 12 3 4

Рис 7. Электрофореграмма локуса СТ240. а) после амплификации: I - S, lycopersicoides, 2, 3 - культурный томат, 4 - маркер молекулярного размера 100 Ьр. 6) после рестрикции: 1 -S. lycopersicoides, 2,3 - культурный томат, 4 - маркер молекулярного размера 100 Ьр.

Маркер СТ240 показал наличие полиморфизма между культурным томатом и S. lycopersicoides, который заключается в наличии сайта рестрикции у последнего. На электрофореграмме (рис. 7} 1 фрагмент (длиной 850 п.н.) у культурного томата и 2 фрагмента (200 п,н. и 650 п.н.) у 5. lycopersicoides. Это свидетельствует о возможности применения

7

данного маркера для выявления генетического материала хромосомы X, что и было осуществлено в данном исследовании

4 Конъюгация хромосом в профазе I - метафазе I как критерий оценки интрогрессии чужеродного генетического материала

Доказательство конъюгации между хромосомами томата и 5 1усорег51сснс1е8 имеет важное значение для объяснения частоты интрогрессии и прогноза вероятности интрогрессии генетического материала 5 ¡усорегвгсо^ев в геном культурного томата Выполненные исследования первого мейотического деления на линиях с дополнениями хромосом II, IV и XI 5 ¡усорегягсокЗез свидетельствуют, что разные хромосомы 5 1усорег51со1с1е8 обладают разной степенью гомологии с хромосомами культурного томата и обладают разным влиянием на поведение других хромосом в мейозе

Формирование тривалентов в метафазе I свидетельствует о наличии гомологичных участков у хромосом культурного томата и 5 lycopersicoid.es, что показано для хромосом II и IV Частоты клеток с тривалентами у линий с дополнениями хромосом II и IV оказались сходными - 27,9 и 23,0% соответственно В то же время установлено влияние этих хромосом на конъюгацию других Так, в случае хромосомы II на стадии метафазы I отмечены клетки с 3 унивалентами (12,0%), с 5 унивалентами (2,2%), а так же с тривалентом и двумя унивалентами (3,8%) Это свидетельствует, что хромосома II может не только участвовать в образовании тривалентов, но и вызывать нарушения конъюгации других хромосом, что согласуется с преждевременным расхождением хромосом у этих растений

У растений с дополнением хромосомы IV 5 \ycopersicoides выявлено, что она представлена либо в унивалентном состоянии, либо ассоциирована в тривалент - 23,0% и 73,0% соответственно Появление дополнительных унивалентов у этих образцов сравнительно редко - лишь 4 % МКП имели 3 унивалента

Особенно показательны результаты, полученные на дополненных растениях с хромосомой XI, у которых триваленты не образуются Хромосома XI 5 1усорег51со^е5 не вступает в конъюгацию с хромосомами томата В то же время она вызывает нарушения конъюгации хромосом культурного томата у 21,6% МКП, у которых выявлено присутствие 3 унивалентов

5. Особенности мейотического деления у дополненных растений

Моносомно дополненные растения отличаются пониженной фертильностью пыльцы, что обусловлено нарушениями мейотического деления Характер этих нарушений для форм томата с хромосомами 51 ¡усоретсогёез практически не известен Цитологический анализ моносомно дополненных растений с хромосомами II, IV, V, XI выявил, что разные хромосомы обладают разными эффектами на ход

мейотического деления

Преждевременное расхождение хромосом на стадии метафазы I в большей степени отмечено у МДЛ-И - более 60% (табл 2) В то же время, для дополненных растений с хромосомами V и XI этот показатель был значительно ниже - 8,8 и 15,4% соответственно

Таблица 2

Характеристика метафазы I моносомно дополненных растений

Образец Клетки"-.....-................... в метафазе I МДЛ-П МДЛ-У МДЛ-Х1

Норма, шт 38 93 110

с нарушениями, шт % 70 64,8% ± 9,2% 9 8,8% (4,1%-15,1%) 20 15,4% (9,8%-22%)

Всего, шт 108 102 130

Во время анафазы I дополнительная хромосома в большинстве случаев вызывает отставания хромосом и образование мостов (табл 3) Доля всех клеток с нарушениями составила 41,4% Преимущественно встречались клетки с нарушениями в виде отставаний хромосом

Таблица 3

Характеристика анафазы I моносомно дополненной формы МДЛ-Н

Проанализировано клеток,всего Клеток с нормальным делением Клеток с отставанием хромосом Клеток с мостами

шт шт % шт % шт %

130 76 58,6 53 40,65 1 0,75

В метафазе II у 15% клеток отмечено нерасхождение одной хромосомы (табл 4) У моносомно дополненной линии с хромосомой V в метафазе-П 16,19% МКП имели нарушения

Таблица 4

Характеристика метафазы II моносомно дополненной формы МДЛ-П

Проанализировано клеток, всего Клеток с расхождением хромосом 12--13 Клеток с расхождением хромосом 12- -12- -1

шт шт % шт %

20 17 85 3 15

Анафаза второго деления, где хроматиды расходятся к полюсам, протекает в целом нормально, 18,3% клеток имеют нарушения в виде отставаний как одной, так и нескольких (рис 8, табл 5)

Таблица 5

Проанализировано клеток,всего Клеток с нормальным делением Клеток с отставанием,

шт шт % шт %

109 89 81,7 20 18,3 (11,7-26)

а)

б)

в)

J

Рис 8 Нарушения во втором делении мейоза а) - отставания хртмо^бТГГанафазеТХГб}*-отсгавания хромосом в анафазе II в двух клетках в) - отдельно лежащая хромосома в телофазе II

В телофазе II моносомно дополненной линии с хромосомой II выявлена отдельно лежащая хромосома (рис 8, в), других нарушений не обнаружено. На стадии тетрад в 10,8% случаях отмечено образование пентад (табл 6, рис 9) При этом не обнаружено клеток с микроядрами, что обычно часто встречается у отдаленных гибридов

Таблица 6

Всего Количество тетрад Количество пентад

шт шт % шт %

111 99 89,2 12 10,8 (7,9-14,1)

> >

к1**/

1 \

#

ф

К

б)-

4 «Ч

1 Г-*

/ **.

Рис 9 Тетрада (а) и пентада (б) у моносомно дополненного растения с хромосомой II

6. Частота рекомбинации у дополненных линий с хромосомой II 5.1усорег$1со1(1е$

Для оценки влияния хромосомы II 5 lycopersicoid.es на частоту рекомбинации использовали гибриды между дополненным растением с хромосомой II и маркерной формой Мо755 (с мутациями аа — отсутствие антоциана, d — карликовый рост, ууу - желтая пятнистость, локализованными во второй хромосоме) Анализ расщепления и Ра по маркерным признакам показал существенные различия частот рекомбинации у диплоидных и дополненных линий по всем изученным парам признаков Выявлено значительное увеличение показателя тГ у моносомно дополненных растений в сравнении с контролем - гибридами между диплоидными растениями Значение этого показателя у дисомно дополненных было близко к значению у гибридов между диплоидными растениями (табл 7)

Таблица 7

Частота гГ у диплоидных растений, моносомно и дисомно дополненных

линий

ДЛ МДЛ ДДЛ

■ип> — аа 4,3 31,2 5,6

aa-d 24,5 24,8 28,5

d — wv 24,7 43,5 30

Примечание ДЛ - диплоидные линии, МДЛ - моносомно дополненные линии, ДДЛ -дисомно дополненные линии

Эти изменения являются следствием как конъюгации хромосомы II 5 1усорегх1со1Лех с гомеологами культурного томата, так и наблюдаемых нарушений во время всего мейотического деления

Выводы

1 Характер конъюгации хромосом в профазе I - метафазе I может служить критерием для оценки возможности интрогрессии генетического материала 5 \ycopersicoides в геном культурного томата

2 Хромосомы 5 \ycopersicoides имеют разную степень гомеологии с хромосомами культурного томата, что проявляется в характере конъюгации Хромосомы II и IV частично гомологичны, между хромосомами XI культурного томата и 5 \ycopersicoides гомология недостаточна для образования тривалентов

3 Дополненные хромосомы 5 \ycopersicoides вызывают нарушения конъюгации негомологичных хромосом культурного томата

5 Дополненные хромосомы 5 \ycopersicoides вызывают нарушения мейотического деления, которые проявляются на всех стадиях от профазы I до тетрад

6 Изменения частоты рекомбинации между маркерными признаками могут быть обусловлены как влиянием дополнительных хромосом на конъюгацию, так и на мейотическое деление в целом

7 Использование ГЩР-анализа для идентификации чужеродного генетического материала позволяет значительно сократить время на выделение дополненных форм из расщепляющейся популяции

Список опубликованных работ

1 Кирюхова О Б , Локтионов А Н, Князев А Н Характеристика моносомно дополненных форм культурного томата с хромосомами Solanum lycopersicoides II Материалы научной конференции "Памяти Грегора Менделя" -М,2001 -С 48-49

2 Князев А Н, Соловьев А А Моносомно дополненные линии томата с хромосомами Solanum lycopersicoides и возможности их использования // Сборник студенческих научных работ, выпуск 9 -М,2003 -С 16-20

3 Князев А Н, Соловьев А А Характеристика мейотического деления моносомно дополненной линии культурного томата со 2-й хромосомой Solanum lycopersicoides II Материалы 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им НИ Вавилова «Актуальные проблемы генетики» - М , 2003 - Т 2 - С 289-290

4Князев АН Моносомно дополненные линии томата с хромосомами Solanum lycopersicoides возможности использования // Материалы XLI Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" - Новосибирск, 2003 - Серия биология - С 21

5 Князев А Н , Александров О С Особенности мейотического деления моносомно дополненных линий томата с хромосомами IV и XI Solanum lycopersicoides (Features meiosis division of monosomic alien addition lines of tomato with chromosomes IV and XI from Solanum lycopersicoides И Review of scientific papers of the students of agronomy - Cacak, 2005, - P 23 (на английском языке)

6 Князев А Н, Александров О С Характеристика мейоза моносомно дополненных линий томата с хромосомами Solanum lycopersicoides II Материалы международной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева -М,2006 -С 366-371

7 Александров О С , Князев А Н Цитогенетическая характеристика мейоза дополненных линий как модель интрогрессии генетического материала Solanum lycopersicoides в геном культурного томата // Тезисы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006» -М.2006 - С 10

8 Соловьев А А, Князев А Н, Александров О С Цитогенетическая характеристика дополненных форм культурного томата с хромосомами Solanum lycopersicoides Dun II Генетика -M.2007 -T 43 -С 1-5

0,75 печ л.

Зак 468

Тир 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Князев, Андрей Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологические и морфологические особенности.

I.2. Биосистематика томата.

1.3 Использование анеуплоидов.

1.3.1. Замещенные и дополненные линии.

1.3.2. Краткая характеристика дополненных линий.

1.3.3. Методы идентификации дополненных линий.

1.3.4. Частота передачи чужеродных хромосом.

1.4. Дополненные линии томата с хромосомами S. lycopersicoides.

1.5. Мейоз у отдаленных гибридов и анеуплоидов.

1.6. Пахитенный анализ.

1.7. Характеристика пахитенных хромосом культурного томата.

I.7.1. Характеристика пахитенных хромосом видов - сородичей культурного томата.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II. 1. Материал.

II.2. Методы

11.2.1. Приготовление временных и постоянных препаратов.

11.2.2. Молекулярные маркеры.

II.2.2.1. Выделение ДНК.

11.2.2.2. Амплификация, рестрикция и детекция результатов.

11.2.3. Морфологическое описание растений.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

111.1. Числа хромосом как прямой метод идентификации растений с дополненными хромосомами.

111.2. Пахитенный анализ как метод идентификации хромосом

S. lycopersicoides в дополнепных растениях.

111.3. Молекулярные маркеры для идентификации интрогрессий и чужеродных хромосом.

111.4. Конъюгация хромосом в профазе I - метафазе I как критерий оценки интрогрессии чужеродного генетического материала.

111.5. Особенности мейотического деления у дополненных растений.

111.6. Морфологическая характеристика расщепляющихся популяций дополненных растений.

111.7. Частота рекомбинации у дополненных линий с хромосомой II

S. lycopersicoides.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дополненные линии как модель интрогрессии чужеродного материала S. Lycopersicoides в геном культурного томата"

Актуальность темы. Использование дикорастущих видов - сородичей, культурных - является необходимым вследствие эрозии генетического материала возделываемых видов. Адаптации к абиотическим и биотическим факторам внешней среды, возникшие у диких видов в процессе эволюции, являются мощным резервом для улучшения культурных видов растений. В то же время интрогрессия чужеродного генетического материала зачастую затруднена вследствие стерильности гибридов. Подобная проблема существует и при использовании вида Solanum lycopersicoides, обладающего рядом ценных признаков - толерантностью к пониженным температурам, устойчивостью к возбудителям некоторых болезней (Botrytis cinerea, Phytophtora parasitica, вирусу мозаики огурца (CMV), Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici) (Rick, Yoder, 1988, Rick et al., 1995). Одним из возможных путей интрогрессии являются моносомно дополненные линии с добавлениями отдельных хромосом этого вида (Chetelat, 1998). Важным критерием оценки интрогрессии может служить конъюгация хромосом и цитогенетическая стабильность мейотического деления у данных (Ji Y et al., 2003).

Цели и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлась оценка возможности интрогрессии генетического материала S. lycopersicoides в геном культурного томата с использованием моносомно дополненных линий. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

• Идентифицировать дополненные линии культурного томата с хромосомами S. lycopersicoides.

• Оценить степень гомо- и гомеологии хромосом S. lycopersicoides и культурного томата.

• Выявить влияние дополненной хромосомы на мейотическое деление.

• Оценить влияние дополненной хромосомы на мейотическую рекомбинацию.

• Определить возможность применения ПЦР-анализа для идентификации чужеродного генетического материала.

Научная новизна и практическая значимость. Выполнен цитогенетический анализ пяти моносомно дополненных линий томата с хромосомами Solarium lycopersicoides. Анализ мейотического деления показал, что дополнительные хромосомы в целом вызывают нарушения мейотического деления. Впервые показано, что разные хромосомы S. lycopersicoides обладают специфическими эффектами на конъюгацию хромосом. Так, хромосомы II и IV S. lycopersicoides могут вступать в хромосомные ассоциации в виде тривалентов с хромосомами томата, тогда как хромосома XI представлена во всех клетках только в унивалентном состоянии. Наличие конъюгации хромосом свидетельствует о гомологии хромосом и возможности интрогрессии генов S. lycopersicoides в культурный томат. Пахитенный анализ позволил установить особенности конъюгации хромосом гомеологичной группы И. Применение молекулярных маркеров позволило ускорить идентификацию интрогрессий генетического материала S. lycopersicoides.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научной конференции «Памяти Грегора Менделя» (Москва, 2001), XLI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2003), на 2-й конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), на научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2005), на научной конференции

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 работ:

1.Кирюхова О.Б., Локтионов А.Н., Князев А.Н. Характеристика моносомно дополненных форм культурного томата с хромосомами Solarium lycopersicoides II Материалы научной конференции "Памяти Грегора Менделя". - М., 2001. - С. 48-49.

2.Князев А.Н., Соловьев А.А. Моносомно дополненные линии томата с хромосомами Solarium lycopersicoides и возможности их использования // Сборник студенческих научных работ, выпуск 9. - М., 2003. - С. 16-20.

3.Князев А.Н., Соловьев А.А. Характеристика мейотического деления моносомно дополненной линии культурного томата со 2-й хромосомой Solarium lycopersicoides II Материалы 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» / Т. 2 - М., 2003. - С. 289-290.

4.Князев А.Н. Моносомно дополненные линии томата с хромосомами Solarium lycopersicoides: возможности использования // Материалы XLI Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". - Новосибирск, 2003. - Серия биология. - С. 21.

5.Князев А.Н., Александров О.С. Особенности мейотического деления моносомно дополненных линий томата с хромосомами IV и XI Solarium lycopersicoides (Features meiosis division of monosomic alien addition lines of tomato with chromosomes IV and XI from Solarium lycopersicoides II Review of scientific papers of the students of agronomy. - Cacak, 2005, - P.23. (на английском языке).

6.Князев А.Н., Александров О.С. Характеристика мейоза моносомно дополненных линий томата с хромосомами Solatium lycopersicoides II Материалы международной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. - М., 2006. -С. 366-371.

7.Александров О.С., Князев А.Н. Цитогенетическая характеристика мейоза дополненных линий как модель интрогрессии генетического материала Solatium lycopersicoides в геном культурного томата // Тезисы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006». - М., 2006. - С. 10

8.Соловьев А.А., Князев А.Н., Александров О.С. Цитогенетическая характеристика дополненных форм культурного томата с хромосомами Solatium lycopersicoides Dun 11 Генетика. - M., 2007. - Т. 43. - С. 1-5.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Князев, Андрей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Характер конъюгации хромосом в профазе I - метафазе I может служить критерием для оценки возможности интрогрессии генетического материала S. lycopersicoides в геном культурного томата.

2. Хромосомы S. lycopersicoides имеют разную степень гомеологии с хромосомами культурного томата, что проявляется в характере конъюгации. Хромосомы II и IV частично гомологичны, между хромосомами XI культурного томата и S. lycopersicoides гомология недостаточна для образования тривалентов.

3. Дополненные хромосомы S. lycopersicoides вызывают нарушения конъюгации негомологичных хромосом культурного томата.

4. Дополненные хромосомы S. lycopersicoides вызывают нарушения мейотического деления, которые проявляются на всех стадиях от профазы I до тетрад.

5. Изменения частоты рекомбинации между маркерными признаками могут быть обусловлены как влиянием дополнительных хромосом на конъюгацию, так и на мейотическое деление в целом.

6. Использование ПЦР-анализа для идентификации чужеродного генетического материала позволяет значительно сократить время на выделение дополненных форм из расщепляющейся популяции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Князев, Андрей Николаевич, Москва

1. Бочарникова Н.И., Козлова В.М. Мутантные формы томатов // Кишинев, Штииница, 1992;

2. Брежнев Д.Д. Томаты. Л., 1964.

3. Вавилов Н.И. Значение межвидовой и межродовой гибридизации в селекции и эволюции // Известия АН СССР. 1938: 543-560.

4. Гавриленко Т. А. Межродовая, межвидовая, внутривидовая гибридизация пасленовых на примере родов Solanum и Lycopeisicon (генетические и биотехнологические аспекты). Автореф. на соискание, д.б.н.-СПб, 1999.

5. Гареев М.Э. Индуцированные геномные мутации томата // Изв. А.Н. Киргиз. ССР, 1971,5.

6. Генетика культурных растений: Зерновые культуры. Л.: Агропромиздат, 1986.

7. Гуляев Г.В. Генетика. М., 1984.

8. Гуляев Г.В., Мальченко В.В. Словарь терминов по генетике, цитологии, селекции, семеноводству и семеноведению.— М.: Россельхозиздат, 1975.

9. Делоне Л.Н. Применение кариологического анализа к решению вопросов специальной систематики. // Сб. им. С.Г. Навашина. М., 1928.

10. Жимулев И. Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск, 2002.

11. Жиров Е. Г., Терновская Т. К., Иванов Г. И. Геномно-замещенные формы пшеницы // Селекция и генетика пшеницы: сб. научн. тр. Краснодарского НИИ сельского хозяйства им. П. П. Лукьяненко. / Отв. ред. Г. А. Романенко. Краснодар, КНИИСХ, - 1985. - С. 84-102.

12. Жученко А.А. Адаптивная система селекции растений // М. Изд-во Российского университета дружбы народов. 2001. 1 и 2 т.

13. Жученко А.А. Генетика томатов. Кишинев: Штиинца, 1973.

14. Жученко А.А., Андрющенко В.К., Балашова Н.Н., Король М.М., Грати В.Г., Сокова С.А., Анюховская Г.А. Комплексная оценка генофонда рода Lycopersicon Tourn. в условиях орошаемого земеледелия Молдавии. // Кишинев: Картя Молдовеняскэ, 1973. 308 с.

15. Комахин Р.А., Соловьев А.А. Выделение и идентификация дополненных форм культурного томата со 2-й хромосомой Solanum lycopersicoides Dun. Сборник студенческих научных работ. М.: МСХА, 2001, вып. 7, с. 48-50.

16. Левитский Г.А. Морфология хромосом. // в кн.: «Классики советской генетики». Л.: Наука., 1968.

17. Мамонов Е.В. Сортовой каталог. Овощные культуры // М.: Изд-во ЭКСМО-Пресс, Издательство Лик пресс. 2001 496 стр.

18. Мюнтцинг А. Генетика // М: Мир.- 1967. 612 стр.

19. Орлова И.Н., Ригин Б.В. Пшенично-ржаные амфидиплоиды. М.: Колос. -1977.-277 с.

20. Паушева З.П. Практикум по цитологии. М, 1988.

21. Похмельных Г.А. Полиморфизм по гетерохроматическим узелковым районам хромосом кукурузы (коллекция сортообразцов) // Цитогенетика сельскохозяйственных растений Новосибирск, 1989.-е. 194-228.

22. Пухальский В.А., Соловьев А.А., Юрцев В.Н. Цитология и цитогенетика растений // Учебное пособие. М.: Изд-во МСХА. 2004.

23. Станкевич А.К. Ревизия рода Lycopersicon Mill. 2003. Санкт-Петербург, Издательство «Тесса».

24. Хрусталева Л.И. Молекулярная цитогенетика в селекции растений // Известия ТСХА. 2007. - Вып. 1. - С. 61-65.

25. Шкутина Ф.М. Цитогенетическая нестабильность тритикале: Обзор // С.-х. биология. 1982. - Т. 17, №3. - С. 347 - 351.

26. Ячевская Г.Л., Иванова С.В., Наумов А.А. Особенности мейоза при отдаленной гибридизации. М., 1990.

27. Ali SNH, Ramanna MS, Jacobsen Е, Visser RGF. Establishment of a complete series of monosomic tomato chromosome addition lines in the cultivated potato using RFLP and GISH analyses // Theor Applied Genet. 2001.103: 687 695.

28. Alpert K.B, Tanksley S.D. High-resolution mapping and isolation of a yeast artificial chromosome contig containing Jw2.2: A major fruit weight quantitative trait locus in tomato // Plant Biology. 1996. 93. pp 15503-15507.

29. Anthony J. F. Grifiths, Jeffrey H. Miller, David T. Suzuki, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart. An introduction to genetic analysis. New York, 1997.

30. Bai Y, Feng X, van der Hulst R, Lindhout P. A set of simple PCR markers converted from sequence specific RFLP markers on tomato chromosomes 9 to 12 // Molecular Breeding. 2004. 13: 281-287.

31. Barthes L, Ricroch A: Interspecific chromosomal rearrangements in monosomic addition lines of Allium. Genome. 2001. 44: 929-935.

32. Brown S.W. The structure and meiotic behavior of the differentiated chromosomes of tomato. // Genetics. 1949. - v.344.

33. Canady M.A., Meglic V., Chetelat R.T. A library of Solanum lycopersicoides introgression lines in cultivated tomato // Genome.- 2005.- 48: 685-697.

34. Chetelat T, Cisneros P., Stamova L, Rick C.M. A male-fertile Lycopersicon esculentum x Solanum lycopersicoides hybrid enables direct backcrossing to tomato at the diploid level // Euphytica.- 1997.- Volume 95. # 1.

35. Chetelat R.T., Rick C.M., Cisneros P., Alpert K.B., DeVerna J.W. Identification, transmission, and cytological behavior of Solanum lycopersicoides Dun. monosomic alien addition lines in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) // Genome. 1998. 41: 40-50.

36. De Verna J.W., Rick C.M., Chetelat R.T., Lanini B.J., Alpert K.B. Sexual hybridization of Lycopersicon esculentum and Solanum rickii by means of a sesquidiploid bridging hybrid. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - 87. -9490-9496.

37. Dong F, McGrath JM, Helgeson JP, Jiang J: The genetic identity of alien chromosomes in potato breeding lines revealed by sequential GISH and FISH analyses using chromosome-specific cytogenetic DNA markers // Genome 2001.44: 729-734.

38. Friebe B, Qi LL, Nasuda S, Zhang P, Tuleen NA, Gill BS. Development of a complete set of Triticam aestivum Aegilops speltoides chromosome addition lines I I Teor Applied Genet. 2000. 101: 51 - 58.

39. Fulton, T.M., Chunwongse, J., and Tanksley, S.D. Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants // Plant Mol Biol. Rep. 1995. 13: 207-209.

40. Gao D, Guo D, Jung C: Monosomic addition lines oiBeta corolliflora Zoss in sugar beet: cytological and molecular-marker analysis // Theor Applied Genet 2001. 103: 240-247.

41. Gavrilenko T.A., Thieme R, Rokka V.-M. Cytogenetic analisis of Lycopersicon esculentum (+) Solanum etuberosum somatic hybrids and their androgenetic regenerants. Genetics, 2001,103, 213, 231-239.

42. Gottschalk W. Die Chromosomenstruktur der Solanaceae unter Beriiksichtigung phylogenetischer Fragestellungen // Chromosoma. 1954. -5.

43. Gottschalk W. Uber die Anwendung cytologisher Methoden fur die Bearbeitung phylogenetischer Fragestellungen bei den Solanaceen. // Zeitschrift fur Pflansenziichtung. 1958. -39.- 1.

44. Haider Ali S.N, Ramanna M.S., Jacobsen E, Visser R. Alien chromosome addition indicate taxonomic distance in Solanaceae. // Solanaceae V. Advances in Taxonomy and Utilization. -Nijmegen University Press, 2001. 209-215.

45. Hernandez P, Dorado G, Cabrera A, Laurie DA, Snape J W, Martin A: Rapid verification of wheat Hordeum introgressions by direct staining of SCAR, STS, and SSR amplicons. Genome. 2002. 45:198-203.

46. Jena KK, Khush GS. Monosomic alien addition lines of rice: production, morphology, cytology, and breeding behaviour // Genome. 1989. 32: 449-455.

47. Ji Y, Chetelat RT: Homoeologous pairing and recombination in Solanum lycopersicoides monosomic addition and substitution lines of tomato. Theor Applied Genet. 2003. 106: 979-989.

48. Jia J, Zhou R, Li P, Zhao M, Dong Y, Jia JZ, Zhou RH, Li P, Zhao ML, Dong YS: Identifying the alien chromosomes in wheat Leymus multicaulis derivatives using GISH and RFLP techniques. Euphytica. 2002 127:201-207.

49. Jorgensen RB, Chen BY, Cheng BF, Heneen WK, Simonsen V: Random amplified polymorphic DNA markers of the Brassica alboglabra chromosome of a B. campestris alboglabra addition line. Chrom Res. 1996. 4:111-114.

50. Kaneko Y, Bang SW, Matsuzawa Y: Early-bolting trait and RAPD markers in the specific monosomic addition line of radish carrying the e-chromosome of Brassica oleracea. Plant Breeding. 2000. 119: 137-140.

51. Kaneko Y, Yano H, Bang SW, Matsuzawa Y: Genetic stability and maintenance of Raphanus sativus lines with an added Brassica rapa chromosome. Plant Breeding. 2003. 122:239-243.

52. Khush GS: Cytogenetics of aneuploids // Academic Press, New York, London. 1973. pp 258.

53. Khush, G.S., and Rick, C.M. Meiosis in hybrids between Lycopersicon esculentum and Solanum pennellii II Genetica.- 1963.- 33: 167-183.

54. Khush GS, Rick CM. Cytogenetic analysis of the tomato genome by means of induced deficiencies. Chromosoma, 1968, №4: 23.

55. King J, Armstead IP, Donnison IS, Thomas HM, Jones RN, Kearsey MJ, Roberts LA, Thomas A, Morgan WG, King IP: Physical and genetic mapping in the grasses Lolium perenne and Festuca pratensis. Genetics. 2002. 161: 315324.

56. Leighty CE, Taylor J W: "Hairy neck" wheat segregates from whear-rye hybrids // J Agr Res. 1924. 28: 567-576.

57. Lesley MM, Lesley JW. Heteromorfphic A-chromosomes of the tomato differing in satellite size // Genetics. 1935. 20. 6.

58. Li LJ, Arumuganathan K, Rines H W, Phillips RL, Riera Lizarazu O, Sandhu D, Zhou Y, Gill KS: Flow cy tometrie sorting of maize chromosome 9 from an oat-maize chromosome addition line // Theor Applied Genet. 2001. 102: 658663.

59. Lindstrom E.W. A fertile tetraploid tomato // Heredity. 1932. № 4. 23

60. Lindstrom E.W. A haploid mutant in the tomato // Heredity. 1929. 20.

61. Luckwill L.C. The genus Lycopersicon. Historical, biological and taxonomic survey of the wild and cultivated tomatoes. - Aberd. Univ. Stud., 1943

62. Malysheva L, Sjakste T, Matzk F, Roder M, Ganal M: Molecular cytogenetic analysis of wheat-barley hybrids using genomic in situ hybridization and barley microsatellite markers. Genome. 2003. 46:314-322.

63. Melchers G., Sachistan M.D., Holder A.A. Somatic hybrid plants from potato and tomato regenerated from fused protoplasts. // Carlsberg Res. Commun. -1978.-43.-203-218.

64. Menzel, Margaret Y. Pachytene chromosomes of the hybrid L. esculentum x S. lycopersicoides. 1962 http://probe.nalusola.gov.8000/otherdocs/tgs/voll 1/vl lpl5b.html

65. Mesbah M, De Bock TSM, Sandbrink JM, Klein Lankhorst RM, Lange W: Molecular and morphological characterization of monosomic additions in Beta vulgaris, carrying extra chromosomes of B. procumbens or B. patellaris II Mol Breed. 1997.3:147-157

66. Muehlbauer GJ, Riera Lizarazu 0, Kynast RG, Martin D, Phillips RL, Rines HW: A maize chromosome 3 addition line of oat exhibits expression of the maize homeobox gene liguleless-3 and alteration of cell fates. Genome 2000 43:1055-1064.

67. O'Mara JG: Cytogenetic studies on Triticinae. I. A method for determining the effect of individual Secale chromosomes on Trititcum // Genetics. 1940. 25: 401-408.

68. Peralta, I.E. & D.M. Spooner. Classification of wild tomatoes: a review.-Kurtziana.- 2000.- 28: 45 54.

69. Raina SN, Rani V: GISH technology in plant genome research // Methods in Cell Science. 2001.23: 83-104.

70. Ramanna MS, Prakken R. Structure and homology between pachytene and somatic metaphase chromosome of the tomato // Genetica. 1967. 38. 2.

71. Rick C.M. A survey of cytogenetic causes of unfruitfulness in the tomato // Genetics. 1945. 4. 30.

72. Rick C.M. Controlled introgression of chromosomes of Solanum pennellii into Lycopersicon esculentum: segregation and recombination. // Genetics. 1969. -62.-753-768.

73. Rick C.M., Chetelat R.T. Utilization of related wild species for tomato improvement // Acta Hort. 1995. 412: 21-38.

74. Rick C.M., Khush G.S. Cytogenetics of the tomato. Genet. Lect. 1969. v. I, Corvallis, Ore.

75. Rick C.M, Yoder J.I. Classical and molecular genetics of tomato; highlights and perspective // Ann. Rev. Genet. 1988. 22: 281-300.

76. Riera-Lizarazu O, Rines H W, Phillips RL: Cytological and molecular characterization of oat X maize partial hybrids // Theor Applied Genet. 1996. 93:123-135.

77. Reamon Ramos SM, Wricke G: A full set of monosomic addition lines in Beta vulgaris from Beta webbiana: morphology and isozyme markers. Theor Applied Genet 84: 411-418 (1992).

78. Robinson, R.W. and B.R. Phills. Solanum lycopersicoides: A source of tolerance to low temperatures // Tomato Genetics Cooperative. 1977. No. 28.

79. Schubert I, Fransz PF, Fuchs J, de Jong JH: Chromosome painting in plants // Methods in Cell Science 2001 23: 57-69.

80. Schwarzacher T, Leitch AR, Bennett MD, Heslop-Harrison JS: In situ hybridization of parental genomes in a wide hybrid. Ann Botany 64: 315-324 (1989).

81. Spooner D.M., Anderson G.J., Jansen R.K. Chloroplast DNA evidence for the interrelationships of tomatoes, potatoes and pepinos (Solanaceae) // American Journal of Botany.- 1993.- 80: 676-688.

82. Spooner D.M., Peralta I.E. & S. Knapp. AFLP phylogeny of wild tomatoes Solanum L. section Lycopersicon (Mill.) Wettst. subsection Lycopersicon. // Taxon, 2005.

83. Sybenga J: Cytogenetics in plant breeding // Monographs on theoretical and applied genetics. Springer Verlag. 1992. pp 469.

84. Weeden N.F., Tongue M. and Boone W.F. "Mapping coding sequences in pea by PCR". Pisum Genetics. 1999. 31: 30-32.

85. Winkler H. Zft. Bot. 1910.2:1-38.

86. Zhong XB, Fransz PF, Wennekes-Eden J, Ramanna MS, van Kammen A, Zabel P, Hans de Jong J. FISH studies reveal the molecular and chromosomal organization of individual telomere domains in tomato // Plant J. 1998. 13(4):507-17.99