Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Доменная и структурная организация тромбоцитарного интегрина GPIIbIIIa

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Доменная и структурная организация тромбоцитарного интегрина GPIIbIIIa"

Р Г 6 ОД НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

10 ФЕВ 1997 1НС™ТУТ БЮХТМІЇ імені о.в.палладіна

На правах рукопису

Якубенко Валентин Петрович

Доменна і структурна організація тромбоцитарного Іїітегрнну СРІІьШа

03.00.04. - Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1996

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури і функцій білка Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна Національної академії наук України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук

Макогоненко Євген Митрофанович

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович доктор біологічних наук, ст. наук, співр.

Тугай Василь Андрійович

Провідна установа - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

Захист відбудеться 24 лютого 1997 року о 14 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.84.01 в Інституті біохімії

ім.О.В. Палладіна НАН України (252601, Кшв-30, вул.Леонтовича,9)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії НАН України.

Автореферат розісланий 24 січня 1997 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

О.В.Кірсенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ Підтримка гемостазу в нормі - важлива функція зрганізму. Участь тромбоцитів в підтримці гемостазу багато в чому пов'язана з функціонуванням рецепторів, які розташовані на іх поверхні

Найважливішим рецептором, який знаходиться на поверхні тромбоцитів, є .їнкопротешовий комплекс СРП.,Ш„ Він шдіграс важливу роль в системі зсідання крові гав дяки здатності специфічно зв’язувати фібриноген, фібронектин, фактор Віллібранда та деякі шші битки плазми крові. Захисні реакції, які воттекакп ь ііш час пошкодження судинної птнки, а саме, адгезія і агрегація тромбоцитів, а також утворення фібринового згустка на поверхні тромбоцитів, відбуваються завдяки зв’язуванню білків з СіРПьІІІ, Загалом, функції рецепторного комплексу СРІІьШа включають розпізнавання ліганду, передачу фансмембранного сигналу, індукцію і контроль за формою тромбоцитів, участь у взаємодії громбоцит-тромбопйт і тромбоцит-судинна стінка.

Великий інтерес представляє ОРІІ(ЛН3 як тиловий представник родини Інтегритпп ■ білкових гетеродичерннх рецепторів з подібною структурою, які вбудовані в мембрану багатьох клітин різноманітних організмів їх вивчення ускладнюється матого кількістю цих лікопротешів в організмі та складністю при виділенні цих рецепторів ОРІІі-ІПі е зручною моделлю дтя дослідження структури штегринів

Молекулярна маса ОРІОНІ, - 240 ООО Да Иь та 111., субодиниш взаємодіють між :обою завдяки наявності іонів Са2 . ОРІІь складається з двох ланцюгів, які з’єднані 8-8 ж’язком Молекулярна маса більшого ланцюга 125 ООО Да, меншого 23 000 Да ОРЛІ* -жноланцюговий білок з молекулярною масою 95 000 Да.

Безумовно, такий великий і багатофункціональний глікопротеїновий комплекс и ас складну структуру Ряд авторів вивчали структуру ОРПіДІЬ за допомогою різноманітних легодів - електронної мікроскопії [Сапеїі І'Ї.А., 1985, \Veisel 7 \\т, 1992], лазерної соредяшшюі спектроскопи [Натрап ЯК. 1994], обмеженого протеолізу [СаК-еЮ 11 , 1992] \ле до цього часу структура вРИьШа однозначно і остаточно не з’ясована.

Таким чином, ОРПьІИа є важливим об'єктом для вивчення як рецептор, який іриймає участь в зсіданні крові, як трансмембранний комплекс - представник родини нтегрішіз, і як мозаїчний білок, модульна і доменна структура якого дозволяє поширити :нання про будову білкових молекул

МЕТА РОБОТИ ТА ЗАДАЧІ ДОСЛІДЖЕННЯ. Метою роботи було вивчення структури і доменної організації тромбоцитарного інтегрину ОРІІьІНа методами спекгрофлуориметрії та диференціальної скануючої калориметрії. Для досягнення цієї мети були поставлені такі експериментальні завдання:

1. Розробити швидкий і зручний метод виділення ОРІІЬІІІ» з високим виходом

комплексу.

2. Розділити ОРІІьШ, на активну і неактивну форми і вивчити їх доменну

структуру.

3. Отримати фрагменти ОРІІьІИ*, визначити їх локалізацію і дослідити структуру цих ділянок білка.

4. Дослідити вплив Саг+ і ЯОТ>-петида, який моделює сайт взаємодії з лігандом, на структуру ОРІІьШа.

НАУКОВА НОВИЗНА ТА ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМІСТЬ РОБОТИ. В результаті проведених досліджень розроблена нова модифікація методу виділення ОРІІ^ІГІа, яка дозволяє шляхом послідовних хроматографія на конканавалін А-сефарозі і ПЕАЕ - сефацелі виділити 2.0 - 2.5 мг висохоочшценого ОРЛьДІ* з однієї тромбоцитарної одиниці. Були виділені і очищені у неденатуруючих умовах хімотрипсинові фрагменти ОРІІьШ, з молекулярними масами 66 кДа, 27 кДа та 6 кДа. Встановлено, що фрагмент 66 кДа є частиною ОРНІ, субодиниці. 27 кДа фрагмент утворений двома Са2* зв’язуючими ділянками вРПь, а фрагмент 6 кДа походить з трансмембранної і цитоплазматичної ділянок ОРІІь-

Методом диференціальної скануючої калориметрії було визначено, шо ОР1ІьІІІа складається не менш ніж з 8 доменів, що згортаються незалежно. При pH 8.5 в структурі ОРІІьШа визначається два денатураційних піки: перший в діапазоні 45-60°С і другий широкотемпературнкй від 65 до 110°С. Досліди, проведені при pH 3.5, виявили три зони плавлення СРІІьІІІа в області 30°С, 67-105°С та 105-125°С. Калориметричні дослідження окремих фрагментів виявили, що у фрагменті 27 кДа знаходиться один домен, який належить до першого термолабільного переходу, а у фрагменті 66 кДа плавиться не менше 4 доменів другого широкотемпературкого переходу. Порівняння активної і неактивної форми ОРІІьШ,, виявило, що під час активації відбувається зміна конформації в структурі ОРІІьІІІа.

Зв’язування комплексу з лігандом приводить до стабілізації GPIWIL на 3РС, а наявність Са* стабілізує ОРІІьІШ на 15°С.

Отримані результати е першими експериментальними даними про доменну організацію СіРІІьШа, вказують на зв’язок між функціями та структурою ОРІІьІП,. відкривають загальні характеристики доменної організації штегринів та визначають шляхи для подальшого вивчення структури ОРПьІП.,

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали дисертації були представлені на XII Міжнародному Кюфізнчному Конгресі (Амстердам, !9“t» рік) Також матеріал;' дисертації доповідались на наукових семінарах Інституте біохімії їм О.В.Палладіна НАН України.

СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертаційну роботу' викладено на 112 сторінках «ашинописного тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури (2 розділи), матеріалів та методів дослідження, результатів та обговорення (3 розділи), заключення, засновків та списку літератури (160 джерел). Робота містить 22 рисунки, 2 таблиці та ! схему

ОСОБИСТИЙ ВНЕСОК ЩІСЕРТАНТА. Експериментальна частина робо ги знконаиа дисертантом особисто Аналіз та обі-озореїшя проведені спільно з науковим керівником. Друковані праці підготовлені за безпосередньою участю автора

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ СРЇЇі.Ш^ виділяли з тромбоцитарної маси, яка зберігалася від 6 до 14 діб після

збору крові при температурі ’-4і С Для ферментативного розщеплення ОРИьШ» іяхористовували хімотрипсин фірми Calbiochem.

Гомогенність та молекулярну масу білків визначали за допомогою диск-яектрофореза в поліакрнламідному гелі з ДСН та (3-меркаптоетанолом за допомогою білків іаркерів фірми Pharrriacia

N-кінцеві амінокислотні послідовності биків і їх фрагментів визначали на lewlett-Packard G1000S амінокислотному сіквенаторі в лабораторії д-ра K.Ingham, American led Cross (США).

Хроматографічні дослідження проводили із застосуванням системи для швидкого озділення білків FPLC (Pharmacia).

KYGRGDSPK та GRGDSPK пептиди були синтезовані на MilliGen 9050 Pep

Synthesizer в лабораторії д-ра K.Ingham, American Red Cross (США). Пептида були очищені методом зворотньофазної хроматографії иа HPLC системі та ліофілізовані.

Синтез носія з аргінід-глідил-аспарагінова гаслота (RGD) пептидом проводили з використанням BrCN-сефарози (Pharmacia).

Розділення GPlIhllL на активну і неактивну фракції проводили шляхом афінної хроматографії на RGD-пептид - сефарозі, Нефракціонований GPIIblH, вносили в колонку, заповнену пептид-сефарозою. Зв’язування тривало протягом ночі при 5°С і постійному перемішуванні у буфері 50мМ Тріс pH 7.4 з 2мМ СаСЬ, ЮОмМ NaCb, 5 мМ октил глюкозида. Фракція, яка зв’язувалася з пептид-сефарозою, складала 10-20% від загальної кількості білка і елюювалася з колонки 3 мМ пептидом у буфері для нанесення. При повторному нанесенні цієї фракції на пептид-сефарозу з носієм зв’язувалося 70-80% від загальної кількості білка, а при повторному нанесенні незв’язаної фракції зв’язалося менше 2% Таким чином, фракцію, що зв’язалась з RGD-пептид - сефарозою, визначали як активну, а фракцію, що не зв’язалась з RGD-пептид - сефарозою - як неактивну.

Концентрацію білка визначали за величиною поглинання розчину білка при 280 нм у нейтральному середовшці на спектрофотометрі СФ-46. Коефіцієнт молярної екстинції 1% розчину GPIIJII, - 10.3. Коефіцієнт екстинціі фрагментів був розрахований за Edelhoch (1967) по формулі A=(5690W+1280Y+120 S-S)/(0.1m), де W, Y, S-S кількість триптофану, тірозину та дісульфідних зв’язків, відповідно, am- молекулярна маса, і складав 7.5 для 1% розчину 66 кДа фрагмента і 14 для для 1% розчину 27 кДа фрагмента,

СпектроФлуооиметричний метод використовували для дослідження теплової та хімічної денатурації GPIIbllIa. Хід денатурації білка реєстрували за зміною інтенсивності флуоресценції при 350 нм, або по зміні відношення інтенсивності флуоресценції при 350 нм до такої при 320 нм, при довжині хвилі збудження 280 нм. Ці досліди проводили на спектрофлуориметрі SLM-8000-C. Концентрація білка складала 0.04 мг/мл.

Титрування білків октил глюкозидом, сечовиною та гуанидин родонидом проводили при кімнатній температурі. Розчин речовин додавався до білку автоматично з шприца зі швидкістю 10 мкл/хв. Інтенсивність флуоресценції вимірювали як описано вище.

Калориметричні дослідження проводили на диференціальному скануючом> мікрокалориметрі ДАСМ-4 при швидкості прогріву 1 градус за хвилину в діапазоні від 1C до 130°С в 0.05 М гліцшювому буфері, pH 8.5 та pH 3.5, 0.15 М NaCl, 1 мМ СаСЬ, 5 мМ

октил глюкозиді. Концентрація ОРІ1ьШа та фрагментів складала від 0.8 мг/мл до 2 0 мг/мл Дсконволюцію функції надлишкового теплопоглинання та представлення результатів досліджень проводили за допомогою програм Microcalorimetric data analyzing program (R.Nakipov, V.Filimonov, S Potekbm), Microcai Origin 4.0 (Microcal Software) та Sigmaplot 1.0 (Jandei Scientific}

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Виділення глікопротеїнового KOMIUCKfJ" ОРП(,ТП,.

Виділення GPllbllla проводили за методом, що являв собою модифікацію метолів

Fitzgerald (1985) та Calvete (1994) Модифікація полягала в тому, що GPlIblll» був виділений із тритонового екстракту, отриманого з тромбоднтарних мембран двома послідовними хроматографіями на конканавалін А - сефарозі і DEAE-сефацелі.

Вилучення тромбоцитів з тромбоцитарного концентрату проводили за методом Fitzgerald (1985) Різниця полягала в -іому. шо ми додатково обробляли тромбошггарні мембрани ультразвуком > використовували дія екстракції 4% тритон Х-100

Супернатант тритонового екстракту поділяли за допомогою афінної хроматографії на конканавалін А - сефарозі у 20 мМ трис-НСІ буфері pH 7 4. що містив 150 мМ NaCi. 2 мМ СаСІ;. 0.2 % тритон X-100R Завдяки наявності вуглеводних компонентів, ОРНьШ,, зв'язувався з носієм. Швидкість нанесення матеріалу - 0 5-1 мд'хв>см'. Елюцію проводили цим хе буфером, що додатково містив 100 мМа-мегил мшшозида Швидкість елюші 1-2 мл хь-см" Разом з GPIWII,3 колонки елюювалось ще два білки - фібриноген (340 000 Да) та, як вважає Fitzgerald (1985), фрагмент тромбоспоїшіна (160 000 Да) (рис 1 , Л)

На другому етапі виділення ми застосовували іонно-обмінну хроматографію, де використовували носи DEAE-сефаром, мопо-Q, DEAE-сефацел. DEAE-сефацея виявився найбільш придатним носієм для виділення ОРПі,Ша. При його застосуванні було досягнуто максимальне очищення GPIiiJH, га найбільший вихід білка Для нанесення на DEAE-сефацел білковий розчин розводили в 5 разів 20 м.М трис-НСІ буфером pH 7 0, 1 мМ СаСЬ,

0.1% тритон X-100R з метою зменшення іонної сили буферу. Швидкість нанесення 1-2 мл/см2 Елюцію проводили градієнтом концентрації NaCl від 0 до 0.5 М у 20 мМ трис-НСІ буфері pH 7.0, що містив 1 мМ СаСЬ, 0.1% тритон X-100R. Профіль елюції білків з DEAE-сефацелу зображений на рис.2. Перший пік елюювався при іонній силі 0.05 і містив тільки

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Р1 *

м

123 4 5678 9 10 11 12

Рис.1 Електрофорезі! у ДСН/ПААГ А) Виділення ОрІІьШ,. (6% ПААГ): 1,12 Маркери (212 кДа, 170 кДа, 116 кДа, 76 кДа), 2. Маркери (92.5 кДа, 66.2 кДа), 4.Екстракт мембрани тромбоцитів 4% тритоном Х-100, 5.Фракція, що зв’язалася з Конканавалін-А сефарозого. Фракційонування (ЗрПЬІПа на колонці з ОЕАЕ-сефацел: 6. Фракція І (ОрІІьЩ,); 7.Фракція II (ОрІІьШ.,), 8. Фракція ІІІ(а), 9. Фракція ІІІ(в); 10. Фракція IV.

Б) Очищений СгрІІьШ, (8% ПААГ), 2. Відновлений [ОРІІі (великий ланцюг) М,=120 кДа, СРШі, Мг=95кДа], 3. не відновлений, 1,4. Маркери (92.5, 66.2,45, 31 кДа).

В) Гідроліз врЩІІ. хімотрипсином (12% ПААГ), 1. Маркери (92.5, 66.2, 45, 31, 21.5 та

14.4 кДа). Гідролізат (ЗрІїьІІІ» у відновлених умовах: 2. 0 хв. 3. 30 хв., 4. 60 хв., 5. 120 хв.,6. 240 хв.;7.зока розділу. Гідролізат СгрІІьШ, у невідновлених умовах: 8. 0 хв. 9. 30 хв., 10. 60 хв., 11. 120 хв.,12. 240 хв. .

ЗРИьШа Другий пік, який виходив у діапазоні іонної сили від 0 1 до 0 2, також містив

CjPIIj.nL. GPIIblll,, елюювався двома фракціями і при застосуванні mono-Q. Панашу думку,

u,e пов'язано з великим розміром комплекс) і з

різною конформацією GPIlt,IIIa на заряджених

носіях Отримані фракції не відрізнялися

електрофоретично і мати однакову

функціональну активність Приміст білки

знімешся іірн іотпй сипі вищій за 0 2 і

виходили в наступних фракціях після повного

виходу GPIIblJIa На рис 1,Б наведено

глекгрофоретнчну картину очищеного GPIIbIlIa.

N-кінцевий амінокислотний сіквенс показав

паяв ніс-т- трьох основних послідовностей в

■полярному відношенії! 1 ! 0 25, які

починаються j Glyt. Leui та Leus?j, що

аідповідаг N-кінцям 1І1а субодиниш та

важкого і легкого ланцюгів її, субодиниш. Рис 2 Профіль елюції білків з колонки з

DEAE-сефацелом градієнтом концентрації відповідно Загальна кількість отриманого NaCl від 0 до 0 5 у 20 NiM триС-НС1 буфері

GPIIblll. складала 2 0-2 5 мг на одку Р_Н 7 0,що містив ! м\1 СаС1;, 0 2»/о іритон

X-1 ООЇх

грочбоцитзрну одиницю, що значно більше,

ніж отримував Fitzgerald (0 3-0 4 мг з однієї тромбонитарної одиниці) [Fiu-.gerald, !9S5] Застосування конканаваліну А та DEAE-сефацелу значно скорочувало час виділення комплексу у порівнянні з методом Calvete, який при такому ж загальному виході білка виділяв ОРПьШа в три етапи, двома з яких була гель-фільтрація на сефакріл S-300 [Calvete, 1995]

Виділення та очигасіит фрагментів (rPllt.llІ,.

Для отримання фрагментів GPIIbIlIa використовувався хімоірипсіш. Дослідження кінетики гідролізу виявило, що для вилучення ранніх фрагментів GPIIblll» оптимальним часом гідролізу є 1 година при 37°С та співвідношенні фермент:субстрат - 1:50 за масою (рис.1,В). Препаративний гідроліз був проведений в 20 мМ трис-НСІ буфері pH 7.4 зі 150 мМ NaCl, 1 мМ СаСЬ та 0.1% тритоном X-100R. Реакцію гідролізу зупиняли додаванням до

Об'єм епкіци, мл

реакційного середовища ПМСФ до кінцевої концентраті 0.1 мМ та ДФФ до кінцевої концентрації 5мМ з наступною інкубацією гідролізату протягом 2 годин.

Фрагменти ОРІІьІІІ* виділяли з гідролізату шляхом гель-фільтрації із застосуванням БРЬС системи. На рис.З та 4 подано профіль елюції гідролізату ОРІІьШа з колонки ЗирегоБе

12. Розподіл проводили у 20 мМ трис-НСІ буфері pH 7.4, 150 мМ ЫаС1, 1 мМ СаСЬ, 0.1% тритон Х-ЮОЯ. Швидкість елюції 0.4 мл/хв. Перший пік містив ОРІІьШа, який не зазнав гідролізу Другий шк відповідав фрагменту з молекулярною масою 66 кДа, а четвертий -фрагменту з молекулярною масою 27 кДа.

Третій пік виходив у об’ємі, що відповідав молекулярній масі 45 кДа. N-кінцевий амінокислотний аналіз виявив одну Ім'-юнцеву амінокислоту &щ, яка походила з ОРІІь. Було зроблено припущення, що цю фракцію складає поліпептидний комплекс, утворений С-кінцевою ділянкою ОРІІь з молекулярною масою біля 6 кДа. Цей фрагмент містить трансмембранну ділянку ОРІІь, яка, можна припустити, має високу агрегаційну здатність. Ми вважаємо, що у розчині утворюються агрегати з 7 або В фрагментів, які виходять у об’ємі, що відповідає білкам з молекулярною масою 45 кДа. П’ята і шоста фракції складалися з низкомолекулярного пептидного матеріалу.

Електрофоретичний аналіз фракцій виявив, що гель-фільтрація не дає повної очистки фрагментів від домішків, і тому ми використовували рехроматографію, а для виділення 66 кДа фрагмента не одну, а декілька рехроматографій для звільнена від внсокомолекулярних фрагментів. Оскільки для дослідження структури білків і їх фрагментів ми використовували як детергент октил глюкозид, фрагменти треба було перевести в буфер з цим детергентом. Оптимальним методом для заміни детергенту виявилася хроматографія, бо тритон Х-100 не видалявся з буферу діалізом. БирегоБе 12 була врівноважена 20 мМ трис-НСІ буфером pH

7.4 з 150 мМ ЫаС1, 1 мМ СаСЬ і 5 мМ октил глюкозидом. Виявилось, що завдяки різній природі детергентів, домішки, які були нековалентно з’єднані з фрагментами, під час елюції в буфері з октил глюкозидом відділяються і проходить додаткова очистка білка. Таким чином, фрагмент, який хроматографічно в буфері з тритоном Х-ІООИ здавався гомогенним, після хроматографії в буфері з октил глюкозидом збувався значних домішок. На рис.З наведені етапи очистки фрагменту 66 кДа. На рис. З,А і

и

Рис З Ьтапч очистки 66 кДа фрагмента Ряс 4 Етапи очистки 27 кДа фрагмента

на Зирегозе 12 на 5ирегояе 12.

З,Б хроматографія і рехроматографія в буфері з тритоном Х-10(Ж, відповідно На рис З,В і

З,Г наведена доочистка в буфері з октил глюкозидом Як свідчить профіль елюції з рис З,В, основна частина 66 кДа фрагмента днмерізуєгься і очищений матеріад знаходиться у першому піку, у другому знаходиться фрагмент 66 кДа зі значними домішками (приблизно 50 %), а у третьому - тільки домішки. Рехроматогрзфія в буфері з октил глюкозидом приводить до повної очистки фрагмента (рис.З,Г) Це підтверджують і дані електрофорезу (рис 5,А)

Електрофоретично 66 кДа фрагмент у невідновленкх умовах представлений однією зоною, яка відповідає молекулярній масі 66 кДа, а у відновлених умовах -двома зонами з молекулярними масами 65 кДа та 17 кДа (рис. 5,А). Анато амінокислотної послідовності фрагмента виявив дві М-кінцеві амінокислоти Сіуі та Оуз-» ОРПІа. Таким чином, 66 кДа фрагмент є залишком ОРІІІ, субодиниці, який вміщує М-кінцевий пептид, багату на З-Б зв’язки ділянку, а також трансмембранну і цитоплазматичну область поліпептидкого ланшога. Те, що у відновлених умовах молекулярна маса більшого

Рис.5 На електрофореграмах представлені:

Маркери-92.5,66.2,45, 31, 21.5 та 14.4 кДа (1,4,5,8) Маркери - 92.5, 66.2,45 та 31 кДа (9,12) А) Фрагмент 66 кДа (12 % ПААГ) - невідновлений (2), відновлений (3). Б) Фрагмент 27 кДа (12 % ПААГ) - невідновлений (6), відновлений (7). В) GpIII, (8 % ПААГ) - невідновлений (11), відновлений (10),

ланцюга майже дорівнює молекулярній

масі всього невідновленого фрагмента,

незважаючи на відсутність (у

відновлених умовах) ділянки 17 кДа,

пов’язано з великою кількістю S-S

зв’язків, які відновлюються, і розміри

фрагмента значно збільшуються (Так

само, при відновленні GPUI*

молекулярна маса змінюється з 95 кДа

до 110 кДа). 66 кДа фрагмент описаний

в літературі [Beer J., 1989;

Niewiarowski S., 1989], але він не був

виділений в нативному стані. На рис.4 Рис 6 Схема будови (ЗрІІьШ. та очищених фрагменті

66 кДа та 27 кДа та GpIII, представлені стадії виділення 27 кДа межа фрагмента 66 кДа

фрагмента. Рис.4,А і 4,Б відображають мезка ФРагмента 27 кДа

хроматографію і рехроматографію фрагмента в буфері з тритоном X-100R, а рис. 4,В і 4,Г -додаткову очистку фрагмента в буфері з октил глюкозидом. Як свідчеті. ..рофіль елюції (рис.4,Б і 4,Г), майже чистий фрагмент при доочищенні в буфері з октил глюкозидом

юзбавляється значних домішків. Перший і другий піки - це домішки, і тільки в третьому (находиться 27 кДа фрагмент Його повна доочистка зображена на рис.4,Г. Електрофореграма очищеного 27 кДа фрашента представлена на рис.5.Б Фрагмент 27 кДа в і “відновлених умовах представлений однією зоною - 27 кДа, а у відновлених двома зонами 1? кДа та 16 кДа (рис.5,Б). Аналіз N-кшцєбоі амінокислотної послідовності фрагмента іияпив дві N-кінцеві амінокислоти G:m та S^. що вказує ка походження 27 к-Да фрагмента з За2* зв’язуючої області GPIIb і, швидше за все, він містить дві Са' зв’язуючі ділянки Цей фрагмент виділений вперше. На схемі будови GPiisid, на рис.б зображені області юзташування фрагментів.

Виділення ПІ» субодиниці GPIIblll,.

Для виділення субодиниць розроблені методи (Еігія,1986, Philips, 1992) з зикористанням HPLC системи та зонального центрифугування. Ми розробили метод, який зазуеться на властивостях субодиниць, що описані у Rivas, 1991. Встановлено, що при

<«щентрації вищій за 2 мг.'.мл, Ша суоодинішя утворює агрегат з декількох молекул, а

;творення агрегатів у П„ субодиниці відбувається при концентраті вищій за Smp'm.t

Зикористовуючи ню властивість

:убодишщь. ми намагалися при концентрації

симплексу 5-6 мг/мл (концентрації окремих

;убодиниць 2.5-3.0 мг'мл) отримати Ша як

пігомер. а ПЕ як мономер і розліпити їх за

допомогою гель-фільтрацп на сефакрілі S-

S00, що неможливо зробити для мономерних

))орм через недостатню різницю в іх

молекулярних масах Дисоціацію комплексу

м субодшшаі проводили за методом Phillips,

1992 Нарис 7 представлений профіль елюції

іисоційованого комплексу GPIIbUI, з

колонки з сефакрілом S-300. Перший пік Рис.7. Профіль елюції GpIIb та Gpll[a з колонки

сефакріл S-300. Розподіл проводили у 20 мМ

загадається з олігомерів ПІ, субодиниці, у .фИС.нС1 буфері pH 7.4, 150 мМ NaCl, 1 мМ

другому міститься суміш II, субодиниці, , 0.2Л тритон X-100R.

’0 ?С ЗС і З 50 60 ?С Р0 в1?

мономеру ІЦ, субодиниці і не розділеного комплексу ЄРИьШа Біля 20% білка залишалося у вигляді гетеродимеру. Вихід Ш, субодиниці за цими умовами складав 20% від загальної кількості білка. На рис.5,В зображена електрофореграма ИІа субодиниці.

Таким чином, ми розробили нову модифікацію методу виділення ЄРИьІИ,, яка дає високоочшцений препарат комплексу з високим виходом білка. Отримані хімотрипсимові фрагменти цього глікопротеїнового комплексу та його III, субодиниця в присутності детергенту в неденатурованих умовах. Було знайдено, то найбільш зручним методом розділення субодиниць і очистки фрагментів комплексу СРІІЬІІІд у присутності детергенту тритону Х-100 або октил глюкозиду є гель-фільтрація.

Температурна денатурація СРЩІІІ,.

Для отримання первинної інформації про процес термічної денатурації ОРІЬЛІ, використовували дані флуоресцентної спектроскопії та світлорозсіювання. Використання тритону Х-100 для структурних досліджень виявилося неможливим, і всі наступні експерименти на спектрофлуориметрі та диференціальному скануючому мікрокалориметрі проводилися у буфері з октил глюкозидом. Для подальших дослідів використовувалися буфери з концентрацією 5 мМ октил глюкозиду.

Зміна відношення інтенсивності флуоресценції при плавленні ОРІІьІІІа при різних pH, що ілюстроване на рис.8, дає один сигмоідальний перехід в залежності від величини pH. При зниженні pH цей перехід зникає при pH 3.0. Процес денатурації, як і очікувалося, для комплексу з молекулярною масою 240 кДа є незворотним, тобто під час охолодження при будь-якому pH відношення інтенсивності флуоресценції не повертається до початкового рівня. На рис.8 представлено відношення інтенсивності флуоресценції в процесі охолодження ОРІІьІІІа при pH 10.0 (пунктирна лінія). Процес денатурації ІЮВ-зв’язаної фракції представлений суцільною лінією, а ІїОО-незв ’язаної фракції - штриховою лінією. Цікаво, що при pH 10.0 виникає натяк на двофазність переходу, який більш виражений у ІЮО-незв’язаної фракції. Спектрофлуориметричні дослідження плавлення більшості білків виявляють сигмоїдальні переходи з підвищенням рівня відношення інтенсивностей флуоресценції, що вказує на перехід триптофану в більш полярне оточення, внаслідок чого зміщується максимум спектра флуоресценції білка в довгохвильову

область. Для того щоб з’ясувати природу сигмоідальних переходів з

о

пониженням рівня відношення р)

5

інтенсивності флуоресценції, які ми £

я

о

о

Си

0

1

г

виявили у даному випадку, були більш детально вивчені параметри флуоресценції при плавленні СРПьПІ, при pH 8.5. Вивилося, що максимум спектра флуоресценції ОРІІьПІ,

З

зміщується з 342 нм при кімнатній и температурі до 339 им при температурі 95°С (дані не наводяться).

Як відомо, у водному оточенні

в

&

а

я

.§

0

1 .В

б

Температура. С®

Рис." Термічна денатурація ОріІ;Л5, при різних максимум спектра флуоресценції зиачеКНЯХ pH. визначена у спектрофлуориметрі.

триптофану складає 352 нм, а КРИВІ ®>аВленн* КОО-зв‘язух>чо. фракції ОрВДЦ.

(суцільна лінія) та ІЮО-незв'язуючої фракції зміщення максимуму в (штрихова лінія).

короткохвильову область вказує на гідрофобне оточення триптофанів. Тому можна було припустити, що теплова денатурація до температури 95°С не веде до повної денатурації і розгортання поліпептидного ланцюга быка, тобто ОРІМИ» зберігав в своїй структурі термостабільні ділянки. Для того щоб перевірити це припущення, ми вивчили хімічну денатурацію ОРНьІІІ,

Хімічна денатурація СРПьШ»

Для руйнування третинної і вторинної структури білка часто використовують в спеїстрофлуоркметричних дослідженнях сечовину' і солі гуанідшу Тшрування ОРПьІПа сечовиною виявило сигмощальний перехід відношення інтенсивності флуоресценції, пов’язаний із зміщенням максимуму флуоресценції з 341 нм при 0 М сечовині до 346 нм в 8 М сечовині (рнс.9). Положення максимуму денатурації сечовиною вказує, що сечовина денатурує <ЗРІІьІ1І» більшою мірою, ніж нагрівання білка до 95°С, але ця денатурація виявилася ще не повною. Ми застосували більш сильний денатуруючий агент - ОтБСЫ, і, вже при концентрації 2.5 М, максимум флуоресценції СРІІьШ, змістився до 352 нм (рис.9),

що вказувало на повний вихід триптофанів у полярне оточення і, таким чином, иа повну денатурацію GPIIiJII». Це підтверджує, що GPIitJU. має в своїй структурі ділянки різної стабільності, які денатурують в декілька етапів, що свідчить про його мультидоменну структуру. Дня більш детального дослідження доменної структури GPlIblH, був використаний метод диференціальної скануючої мікрокалоркметрії.

Рис.9 Хімічна денатурація активного GpIItlll. визначена у спектрофлуориметрі.

А.Денатурація під дією сечовини. Б. Денатурація під дією GnSCN.

fGnSCN], м

Калориметричні дослідження СРІІїШ,.

Плавлення в калориметрі активної і неактивної фракцій бРИЛІ, виявило комплексні ендотерми, ям починалися біля 40°С (рис. 10). При цій температурі методом спектрофлуориметрі! фіксувався початок сигмоідального переходу. Обидві ендотерми мали два головних піки теплопоглинання: низькотемпературний в діапазоні 45-60°С та високотемпературний в діапазоні 65-105°С, що відображає плавлення більш

термостабільних структур, які не виявлялися флуоресцентним методом. Асиметричність і ширина високотемпературного переходу в обох фракціях показувала, що там денатурує більше одного незалежно згорненого домену. Центр мас цього піку у ІЮО-зв язуючої фракції СРІІьІІІ, був дещо зміщений у високотемпературну область, що вказувало на більшу стабільність окремих доменів в структурі активного ОРІІьПІ.. Цей факт свідчив про деякі конформаційні відмінності, шо мали місце у структурах активної і неактивної форм ОРІІьШ,.

Для визначення кількості доменів і їх стабільності ми провели детальний термодинамічний аналіз функції надлишкової теплоємності (ДСр.«с) в обох фракціях. Одна з головних проблем у такому аналізі - проведення базової лінії для визначення площини, яка

дповідає тотальній ентальпії процесу теплової денатурації. Для цього треба визначити

чат

зчаток і кінець процесу плавлення очаток плавлення легко визначається по ормі кривої Кінепь плавлення визначити абагато важче, тому що після 100 С ідотерма різко повертає вниз, що вказує на зявшеть екзотермічних процесів, таких ЯК ^2 ■реггцй або взаємодія денатурованого білка б стінкою калориметричної комірки Для )го шоб перевірити, що процес денатурації гзворотний, білок був проплавлений другий

із. Друге плавлення дає змогу визначити ункцію теплоємності денатурованого білка

. 1 ЧК?. Ч яитЧ?'-4ГН'Н'ї

аДЯИШКОБОї ТЄГіЛОЄМНОСТІ. Ці КТШВ1 В

to а » ю іо » » аз «9 169 tie «з

Tcinntprrypa. С*

апазоні температур до 60JC\ дооре Т'ис 10 Температурна залежність та аналіз

деконволїоції функції надлишкової

зрелюють з теоретичною кривою функції теплоємкості при п.ивлені в калориметрі

,- активної (А) та неактивної (Б) фракцій

■плоємносп денатурованого о.лка, яка ш шшл- цнфрою ,

врахована для лінійно розташованих позначена крива де зображено перший прогрів

білка, а цифрою 2 - другий прогрів білка

.іінокислатних залишків (Medved, 1995), але

дрізняютьск від неї при температура* вищих за 60°С Особливо після 105°С, де зчинаються екзоіермічш процеси. Розбіжності між кривими в області 60-105 С можуть дображати часткове повторне згортання деяких термостабільних ділянок білка, плавлення сих відбувається при другому прогріві Також ці розбіжності можуть бути пов язапі з зницею між теплоємністю денатурованого білка у воді і у оуфері Звичайно, значення ункцп теплоємності для розрахування Q, лси визначається у воді Зважаючи яз ці )збіжності, базова лінія була проведена між цими двома кривими - теоретичною і сспериментальною, як зображено на рис. 10 штриховою лінією.

Функція надлишкового теплопоглинаняя була визначена і результат аналізу їконволюції представлений на рис. 10 на нижніх кривих. Загальна ентальпія денатурації отадала 600-650 ккал/Мол для обох фракцій GPIIbUI» Аналіз виявив два переходи в

області першого денатураційного піку, де функція ДСр„с більш надійна. Ці переходи

відображають плавлення двох доменів, що згортаються незалежно. Аналіз

високотемпературної частини ендотерми показує наявність не менш ніж б переходів, ще

демонструється на рис. 10 на нижніх кривих. їх точна кількість не розрахована остаточно.

тому що кінець переходу однозначно не визначений. Це добре видно з деконволюціі

активного ЄРИьШі - останній перехід не закінчений. Стабільність двох термолабільних

доменів, які плавляться в двох першил

переходах, подібна в обох фракціях, в той

час як інші домени, що плавляться пр*

високій температурі, більш стабільні )

активного СРІІьПІа. Наявністі

екзотермічних процесів після 105°С заважає

дослідити процес денатурації СРІІьШ. пря

високих температурах і не дає можливості

визначити наявність структур, ще

плавляться у цій зоні. Для вирішення

питання про наявність інших

термостабільних структур, ми скористалися

відомим методичним підходом при вивченні

Рис. 11 Температурна залежність (А) та аналіз теплової денатурації білків методом

деконволюції (Б) функції надлишкової .

теплоємності ОРІІЬІІІа при pH 3.5. 1 - перший мі,ФокагіоРИ7і,етР11 ■ плавлення білка при

прогрів зразка, 2 - другий прогрів зразка. шшому рН Зважаючи на те> щ0 прИ рН 3.5

стабільність ОРІІьШ» найнижча (рис.9) і, таким чином, можливо, не тільки термолабільні, а і термостабільні переходи зміщені у низькотемпературну область, ми вибрали це pH для подальших дослідів. Плавлення вРНьШа у калориметрі при pH 3.5 виявило два піки, один в області 67-105°С, другий в області 105-125°С. Досліди у флуориметрі показали при цих же умовах наявність переходу при 30°С (рис.11). Калориметрично цей термолабільний перехід не зафіксувався . Це пов’язано з великим зсувом піку у низькотемпературну область, що, як відомо, приводить до значного уширення переходу і зниженням його максимуму. Таким чином, термолабільний пік розконцентрувався, і поріг чутливості калориметра не дав можливості його зафіксувати цим методом. В області після 125°С починаються екзотермічні

Температура, С

юцеси, як і при плавленні СРИьІН, при рН 8 5, але не так сильно виражені і зсунуті у більш рмостабільну зону. Деконволюційний аналіз виявив б піків - чотири в області 67-105°С і !а в області 105-І25°С, але агрегація не виключає наявності додаткових структур, які тавлхться при більш високій температурі. Таким чином, при рН 3.5 агрегація при іавленні в калориметрі починається при більш високій температурі, але ми не можемо азати нічого стосовно наявності нових переходів в порівнянні з калориметричними ишми, отриманими при рН 8 5, бо кількість переходів,що спостерігали, не збільшилась.

Для того щоб визначити локалізацію окремих переходів в структурі ОРІІьПІа, була клщжена теплова денатурація фрагментів комплексу.

Дослідження теплової денатурації 66 кДа фрагмента ЄРЩП..

Процес теплової денатурації 66 кДа фрагмента досліджували іектрофлуориметрично, реєструючи відношення інтенсивності флуоресценції при 350 нм і 320 нм (Ї350Д320) та світлорозсіюванні при 350 нм. При рН 8.5 в присутності 2 мМ Саг+ ззгмекг дгкопструс перехід, яхпй починається з 60°С. В той же час, пря пій температурі >чі:нак зростати пгтенсивність світлорозсіювання, шо вказус на початок агрегаті :натуроеаноі-о білка. Цей перехід краще виявляється, якщо побудувати графік заіежносп дносної інтенсивності флуоресценції при 350 нм від температури, прийнявши за одиницю личину інтенсивності флуоресценції

>и 20 С (рис. 12). На відміну від іавлення нативного ОРНьШ,,

яатуращшшм

перехід

2

якого X о

1.0

0.6

0.4

0.2

>чинасться при 40 С, у 66 кДа £

■ . & загмента перехід має місце при 0

мпературі нз 20°С вищій. Цей ^

:рехід співпадає за температурою з ічатком другого піку теплопоглинання їй плавленні ОРИьІІІ, у калориметрі. Температура. С°

ія більш детального вивчення Рис. 12. Зміни у флуоресценції та світлорозсіюванні

у 66 кДа фрагменті СрПьШ* при рН 8.5 (суцільна

руктури фрагмента 66 кДа ми лщщ) та рН 3.5 (штрихова лінія). Верхні криві

іслідили процес його теплової представляють відносну інтенсивність

флуоресценції при 350 нм, а нижні - зміни у світлорозсіюванні.

денатурашї у калориметрі. Як видно з рис 13,А, крива теллопоглинання починається, як і при спектрофлуориметричних дослідах, з 60°С. Процеси, які відбуваються після 100°С, пов’язані, як і у випадку з ендотермою нативного ОРІІьЩ,, або з агрегацією білка, або із взаємодією його з калориметричною коміркою. Перший термолабільний пік, який присутній в структурі ЄРИьШ», повністю відсутній у 66 кДа фрагмента і спостерігається тільки високотемпературний пік теллопоглинання у діапазоні 60-105°С. Базова лінія проводилась так само, як і для нативного ОР1Іь1І]а. Деконволюїхійний аналіз виявив 4 незалежних переходи, що вказують на наявність в структурі цього фрагмента не менш ніж 4 незалежних доменів Визначення загальної ентальпії денатурації 66 кДа фрагмента дало величину близьку 370 ккал/Мол.

Дослідження теплової денатурації 27 кДа фрагмента СРПьШ*

Плавлення в калориметрі 27 кДа фрагмента виявило ендотерму з класичним піком теплопоглинання (рис. 14). Пік починався в області 48°С і мав максимум при 56°С.

Температура, С°

Рис. 13 Температурна залежність (А) та аналіз деконволюції (Б) функції надлишкової теплоємності 66 кДа фрагмента. 1- перший прогрів зразка, 2 - другий прогрів зразка

Рис. 14 Температурна залежність (А) та аналіз деконволюції (Б) функції надлишкової теплоємності 27 кДа фрагмента. 1 - перший прогрів зразка,

2 - другий прогрів зразка.

•чевидно, ВІН ВІДНОСИВСЯ ДО термолабільного Піку кривої теплопоглиншшя ОРІІ{іІІІа Після 0°С спостерігали екзотермічні процеси, як і при плавлені інших зразків СРИьНЬ Базова інія проводилась без перешкод, і деконволюційний аналіз виявив наявній ь тільки одного вохстадійного переходу, шо вказувало на присутність у цьому фрагменті тільки одного змеяу, шо згортається незалежно. Загальна ентальпія денатурації цьою переход)1 складає 20 ккал'Мол 27 кДа фрагмент утворений двома С а' -зв'язуючими ділянками Можна рипустити, щоу другому термолабільному переході денатурує ще 2 Са‘ -зв'язуючі ділянки, іких 4. в структурі СіРПь).

Вплив Са2+ на процес теплової денату рації СРІІьШ..

Як відомо, Сагі-зв’язуючі ділянки знаходяться на Ш3 субодинипі і на 1ІВ «бодиниці, 4 ділянки з високого константою спорідненості до Са2+ знаходяться на ІІВ /■□одиниці і дві з них - у 27 кДа фрагменті, який плавиться в зоні, що відповідає початку ігмоідального переходу при тепловій денатурації йРНьШа в спектрофлуориметрі. Вплив а* вивчати спектрофлуоримегрично на нативному СРІІьІІІ.і. бо саме термолабільні С'а* -иежві переходи фіксуються, цим методом Теплова денатурація активної фракції С}Р1І>,Ш.і в ’сктрофлуорнметрі при pH 5 5 в присутності 2 м\І ЕДТА виявила сигмоідальний перехід з :редньою точкою 36°С Плавлення такої ж фракції в присутності 2 мМ Са" зафіксувало абшізащю переходу на 15°С (рис 15) Стабілізація такого ж самого плану зафіксована і при

4 10 0. де мав місце зсув бід 30°С до 45°С

Вплив НСО-псптиду на процес теплової денатурацГі ОРЛьІН,.

Дослідження впливу пептидів, що утримують КСІ) послідовність, на стабільність змплексу СРІІьНІа виявило, що 0І(008РК. пептид в присутності Са‘ стабілізує перехід на !С. У той же час, в присутності ЕДТА стабілізація пептидом не відбувалася. Цей ефект ікож був зафіксований при pH 8 5 та pH 10 0 (рис.15). Цей результат показує, шо ;рмолабільш домени стабілізуються і Са*', і пептидом, який містить ЯОІ) послідовність.і

о стабілізуючий ефект в більшій мірі пов’язаний з іонами Са‘

Порівняння денатураційних переходів у цілому СРПъШи га отриманих рашентах вказує на наявність ще декількох доменів, які належать до інших ділянок імплексу. Можна припустити, як ми казали вище, що другий термолабільний перехід шежить решті Са2+-зв’язуючих ділянок ОРІІь, а трансмембранна та цитоплазматична лянки ЄРІІь денатурують у термостабільному переході приблизно у діапазоні 70-85°С.

Таким чином, отримані експериментальні дані виявили, шо 2 Са5 - зв’язуюч ділянки GPlIb (243-254 амінокислотні залишки та 297-308 амінокислотні залишки) складають один домен, який належить до термолабільних структур GPIIiJII,.

Термостабільна частина кривої теплопоглинаиня відображає теплову денатурацію N-кінцевого фрагменту GPIII., великої, баїаіої на S-S зв'язки, області GPIII,, та трансмембранної і цитоплазматичної ділянок GPIIIa.

Рис і 5 Вплив лігандів на активний та неактивний GplIkIH,, визначений у спектрофлуориметрі при pH 8.5 та pH 10.5 (значення pH ліворуч під кривими) в присутності 2 мМ ЕДТА (суцільна лінія), 2 мМ Са2' (пунктирна лінія) та 2 мМ Са * і 1 мкМ RGD пептида (штрихова лінія).

ВИСНОВКИ

1. Запропонована нова модифікація методу виділення ОРНьШ, з використання* двох послідовних хроматографій на конканавалін А-сефарозі і ВЕАЕ-сефацелі, яка дозволя з меншою кількісно етапів та з меншою витратою часу отримувати 2.0-2.5 м високоочищеного СРІІьІПа з однієї тромбоцитарної одиниці.

2. Методом диференціальної скануючої калориметрії та ультрафіолетово

спектрофлуоримегрії встановлено, що ОРНьШ. є мультидоменним білковим комплексом який складається з 8 доменів, що плавляться в діапазонах температур 45-60°С, 60-110°С прі рН 8.5 і в області 30°С, 67-105°С та 105-125°С при рН 3.5. <

3. Вперше отримані в иеденатуруючих умовах високоочшцені фрагменти бРІІіДИ - 66 кДа, 27 кДа та 6 кДа. Фрагменти охарактеризовані і встановлена їх локалізація структурі комплексу.

CS

о

І

«©•

В

о

.1

А

Температура. С°

4. Показано, шо27 кДа фрагмент, який походить з Са2’-зв’язуючоі ділянки ОРІІь, кладагться з одного домену і плавиться в області термолабільного переходу ОРІІьШа з іаксимумом 56°С 66 кДа фрагмент - утворений К-кшцевим пептидом ОРІІІа, багатою на 5-

і зв'язки ділянкою ОРНІ, та трансмембранною і цитоплазматичною ділянками ОРІПа -кладається з чотирьох доменів і плавиться в області термостабільного переходу СРІІьПІа в .іалазот від 60 до 105°С

5. Знайдено відмінності в термодинамічних характеристиках активної та еаілтівпої форми ОРІІьІІІ,, що гказус па відмінність їх конформаші

6. Показано, що іони Са2+ та ЇЮП-пептид, який моделює активний центр ліганда ля ОРІІьШа, виявляють стабілізуючий ефект на структуру ОРПьІІІв.

ПЕРЕЛІК РОБІТ', ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Makogonenko Е М . Yakubenko V Р , Ingham К С , & Medved L V Thermal

lability of individual domains in platelet glycoprotein ИьШа. European Journal of

!iochernistrv(1996), \ 237. p.205-2! 1

2. Yakubenko V.P., Makogonenko E.M., Medved L.V., Ingham, K C. Studies of lermal stability platelet glycoprotein ІІьІП, Progress in Biophysics & Molecular Biology (1996),

65. s l,p 27

3. .Якуиенко В.ГІ, Макогоненко C.M. Виділеній тро.мооцятарного інтегрину

ІРПьІІІа та отримання ЙОГО хімотрипсинових фрагментів І ІІІа субодиниці. Український

юхімічтінй журнал (! 997), Том 69, N°3, стр. 16-20.

Yakubenko V,P. “Domain and structure organization platelet integrin GPllbUIa” (Manuscript)

The dissertation work for the degree of candidate of biological sciences (speciality; 03.00.04 - biochemistry). A.V.Palladin Institute of National Academy of Sciences, Kyiv, 1996.

The work deals with investigation of glycoprotein complex GPIIblll» New approach foi chromatographic purification of GPIIbIUa is suggested. New fragments were purified and characterized. Conformation difference of complex between activated and non-activated GPIIbllli as well as stabilizing effect on its structure of Ca2 ions and peptide mimetic to active site oi GPIIbIUa specific ligands were shown by differential scanning microcalonmetry anc spectrofluorimetry. It was found that GPIIJIL consists of not less than eight independent domains Study of fragments domain organization allowed to locate domains m complex structure.

Якубенко В.П. “Доменная и структурная организация тромбоцитарного интегринг GPIIblllj”. (Рукопись)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук пс специальности: 03.00.04.-биохимия. Институт биохимии им.А.В.Палладина НАН Украины Киев, 1996.

Работа посвящена изучению гликопротеинового комплекса GPIIbIUa- Е диссертации предложена новая комбинация хроматографических методов выделенш GPIIJHa. Впервые выделены в неденатурированном виде и охарактеризованы фрашенть комплекса. Методами дифференциальной сканирующей микрокалориметрии i спектрофлуориметрии обнаружены различия в конформации GPIIbIUa в активированном i неактивированном состоянии, показан стабилизирующий эффект на структуру GPIIblH ионов Са2+ и пептида, имитирующего активный центр специфических лигандов GPIIbIUa Исследования показали, что GPIIbIUa состоит не меньше чем из восьми независимы) доменов. Изучение доменной организации фрагментов позволило локализовать отдельны! домены в структуре комплекса.

Клгочов! слова: GPIIbIUa, нгтегрин, домен, м^крокалориметргя, спектрофлуориметрья.