Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ДНК-диагностика вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "ДНК-диагностика вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота"
На пратлх рукописи
ГЛАДЫРЬ Елена Александровна
ДНКДИАГНОСТИКА ВАРИАНТОВ ГЕНОВ КАППА-КАЗЕИНА И 6ЕТА-ЛАКТ0ГЛ0БУЛИНА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
03.00.23 - Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Дубровицы - 2001
Работе выполнена во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства (ВИЖ).
Научим» : ! доктор биологических наук/ Н. А. Зиновьева;
руководители: доктор биологических наук, профессор Н.С. Марэаиоа
Официальны* оппоненты: доктор биогюгичесхих наук, профессор Н.И. С«рг*еа;
кандидат биологических наук, доцент Л.Ф. Новикове.
предприятие: Московская государственная академия ветеринарной \ ' Медицины и ботехнологии имени К.И. Скрябина
■ " .(МГАВМБ) . 'V , '. :
Защита диссертации состоится •■^июиж 2001 года в 10 часов на заседании диссертационного совет» Д. 006.013.01 ео всероссийском государственном научно-исследовательском института животноводства (ВИЖ). -
Адрес института: 142132, Московская область. Подольский район, пос.
.."" ;.''Л ,Дубровицы, ВИЖ;- .. ...
■ ("ЧГг -• -
, / . тг:-
С диссертацией можно о • й библиотеке -.та.
■. Автореферат разослан '^ад, 2Сг; • : ~ , ; |
ИОННОГО^ ^
Ученый секретарь диссертационное ■ ¿у(-■ у,} т ] ^
кандидат биологических наук } . Губаном
... . ]>'\ ' "
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ :... V
является мобилизация. ^ науки « ; хозяйственно : ценными ^ признаю ми р^скоД федерации и Првгидиума РАСХН от .. Российск ^^ , 1|в
295/892; 111) В; ЭТОЙ связи :
хозяйственно : ценными л^^о™™™. ^ Федерации м Прегидиу^
. Российской ФвдерацИ«. М,™ - ГТ*»Гпол«ны*
ЗО декабря 1999 г. Нв 295/392/111)^3 за ^«впвиив хозяйственн^полмны* ; ' маркерных установления закономерны* связей
- V признаков, и «х анализ с цельюи Маркерным« генами, - п - междулокусэмиколичественныхуценка по группам , ^ Народу с к Ф^^^^^ов распространение получают
: полиморфным.-.система* «^^^Р^р^,« "аллелей, .««аняыж х
"'" мопекупярно-генетические маркеры. Выявление мэр ^нк.диагностмкэ>, позволит
' желХьиым« хозяйственно-полезными ШИрОКО» и. использование
- родить секцию животных » косном итоге .повьет
V '■■:■ ■1 в качеств маркеров гриэна^оа^ продумиеност ^ ^ днк-диагностики перед
" ' Спели большого раэиоиык"'
ПИК
• • • Среди большого разнообразия имеющиеся ^ ку у ^^ квотных по
. • . ■ анализа иаследстегнного материала, и "^.„едет.«« ег0 высокой
■ генотигту предпочтение отдается поосто ты исполнения.
• - ГвстГтельиости,точности.еажней) иаркерам«,
; . • Аллельные варианты геноа 1оейегтапп Н.. 19801. В связи с.
^ГГныГл^^ , , •,V
Цепь и мдачи "«Лвдовани^ й " проведение. ДНК-диагностики
? - ■
: ■ г.о™м»>ир=»«» »"«"«^^^"^„Лом.«.«»ПЦР-пдго. , , _
'.-■'.л скота. ■" .'■ . ^ ',.»/■■■. ■
.1 •V ТРАЛЬНАЯ ■
. НАУ ГЕКА
Мск» ЛъОЧ ' .*н<ододим
''. а;--.-; : ,
Имв. ■ ——'—-1 , ~
. • ч Научная новизна и лрлетическая значимость ра^гы, • - • • • " * , '
.. ^Впервые'разработаны методики определения шести аллельных вариантов гена Ч;"'';
■Г ."капла-казеина, и, четырех - аллельных, вариантов . гена • бета-лактоглобулина крупного^: :
■ ;рогатого скота. Изучено'генетическое разнообразие четырех пород"крупкогорогзтого''' - ; У*;- скота '.Российской Федерации.по исследуемымг генам.' Изучено;влияние аллельных ' , .вариантов ,'-генов-каппа-казеина ! и бета-лэетоглобулина .у на признаки" молочной .л-.; ч," продуктивности - крупного .рогатого'' скота.'/Даны,': рекомендации по ''возможному .
. *; ^ использованию данных маркеров в селекции животных при лроьедении' популяционно^ ; : '"7
генетических исследований.„ ; . -
■ ^'-Л^,:"*; * у- Апробация работы.у, г':' - - > V - .Л'^ ■■}; ; *. ' I " '\: , V ~ ^ ^
' ¡ Материалы диссертационной работы были доложены иобсуждены ",*• : ; -
■ V.г' % конференции аспирантов и молоды* учены*, ВИЖ,' п.Дубровицы,- 2000; ' . '' ■'.;'■"-. Г • . научно-практической конфере^и^Г';^ «Повышение конкурентоспособности/'
■■ „ V 'лвктоглобулина {А, В, С; Р).': "V; -1: - .. ._____,,. , ... ,
. ■.. . • Показано, чточастоты. встречаемости' аллелей1 и 'генотипов исследуемых .генов *'; ■ »V:- - ;'■*.' различаются азаеисимости от породы крупного рогатого скота:р: ■ ' .' / > * ■ ' . * • ^Установлены ^ тенденции влияния;'! аллелей : генов каппа-казеина *и бета- - •
';.■'."■'.-!. _______к_______^..._________________.„„....„я______________________... - ■ ■•
г ; Структура и объем работы.
у:.' /V-'- • -Диссертация изложена на 103 страница*,-содержит-18'таблиц.•• 14 рисунков^ •*. ; {•'"■ состоит; из; введения,обзсра литературы,,^материалов • и;*методов,' результатов^,.' /
Экспериментальные исследования, проводились в > лаборатории молекулярной "Л; "■генетики и цитогенетики.животных в 1999-2000 fr..e соответствии с планом наууно^ ' ,'V;- исследовательской работы отдела биотехнологии 8ИЖа. . 1 '^.¿vv-^i ^ i.-r Î,
. ' . : ' 1 .' UlvrUrtrtMhue МЛЙЛПЫПЦ П1*1 rv*ki* ППАПЛТпЙПАииЛй U9 ЛиП/UÉf* i ' *"
'■■'Vît * .—.. -1 '■ 'Г-*"- *■»"■ IV ' '■'"Г-'"-, -'■'Wi" * '■'-.-■ *■ ' -■'■¡V:-- Л .
■г-;-..;.---.; ■ Л..' ^ ■ \ • ' ' С ■ .. "■V ' '.■■■■ v-- '■ ■"' -'* - V -V'"': ■„: .
/СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ <
' ■<г -' V : - Ръсуно* } '
ПОРОДЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Красная гврбатевскэя, ; ГУЛ "Зим!ииГ , Владимирской «Сластм'
п
, I Ч«рво-п«трав,.
ГУПвПИОПойна* Москомкой обл. {а-27}
X
; ЯКУТМСвЯ,*; Республика С*и
< : Шемаха (молочный тип),. -! ■; *■. АО "Пригороде":. Счажвсков «йластн ' л"
Риработка и Ц|>лпфн1лцня ивлмдсларнр-ггиеппгскнз . ^ методов «цинга илельпых вариакгоп геноа: -
пгаи-ктш),
; ■ Вмтис обращав кровн,"ПсаЯ» ■ ио-киса, счгрцы
т
,-ткани, I : -,,1 ..'' '
;; беп-л"» кюглобулчн
Рестрактапг; ИМ III, . ТяИ,.
Ара1, < ХЪ«1.
Виэелсмде ДНК.
-: * счтаг п&прщкцяя *'. « Кмюки ' " ■ твгрхлрритищ
Провм«иве ПЦР. Полйор (лщнфИ'искях «лвгокумеА'пины! "* - праймгроввоктимЮаипярежимов«(чплифнь-яинии " "
Рестриктцш М V
Рестрик-циоиный «налез амплифнняроваянмх фрагментов '
. л ■■ < -
варианти
Э-»ктр0ф0[1«1 Д1ГК в агврозвом - г ,'
ГС
ыриант
......................... к
, | '. ; ,ч .'."■' Сгатяоическда обраДотк» Полунины! ляняих ' .' ^ ,
В опыте были использованы животные следующих пород: •* ■ ^
■ 1. Красная горбатовская (па 187). ГУП «Зименки» Владимирской области;
■ . 2."Швицкая, молочный тип (п*72), АО «Пригорское» Смоленской области; -. ; *
■ ■■ 3. Якутская (п«33), Республика Сака (Якутия); \ .-.• -1 '■ :-WV-v-
.; 4. Черно-пестрая (п»27), ГУП «ПНО Пойма» Московской области. ■/.'.;'■; у ' ■ ^..; >
. От опытных животных отбирали пробы крови, Ткани (ушные еыщипы), молока или■"'■■, ■' ■■ * - спермы. Пробы крови консервировали путем добавления кислого цитратного раствора' ÍACD), в соотношении в :1 [Gustavsori S. et al., 1987J Пробы ткани, молока, спермы . непосредственно после их взятия замораживали при -20"С и хранили а таком вид« до ;■
■ ■ момента использования.". 'Л.;.''j.¡.. V.-" ? ■ } ' ■."' ■■'
-г Взятые образцы крови, ткани тестировали по € аллелям гена каппа-казеина и 4 ""'-...'■■■ аллелям гена бета-лактоглоВупина методом ПЦР-ПДРФ по методике, разработанной в* ; . ,- ходе выполнения диссертационной работы (Гладырь Е А и др.. 2001]. 1 ' V* 1 '
. - Выделение ДНК проводили посредством солевой экстракции (Miller S.A.,t98B), . : r ■ лизиса в буфере Кавасаки ;или перклораТным методом [Johns7 et at., 19в9) с нашими ','■ :-¿-, ; модификациями [Зиновьева Н.А- и др., 1998; Гладырь ЕЛ, и др., 2001J. Концентрацию :
ДНК и степень ее очистки определяли, как описано в методических рекомендациях НА ; ; Л Зиновьевой с соавторами [1908]. \■;■'".,- ■■■ '■ : "■/ '-
. •; Амплификацию исследуемых фрагментов ДНК генов каппа-казеина и бета-. , лактоглобулина проводили стандартным методом ПЦР анализа [Saikí R.K,, et al., 1038]. : После начальной' денатурации ■ при 95*С в течение 5 минут выполняли 35 циклов /амплификации в следующем температурно-временном режиме; Э4°С — 1 мин,'37°С (для ■'-.''' каппа-казеина) и 60 С (для бета-лактоглобулина) -1 мин, 72°С - 1 мин. Температуру -
отжига праймеров расчитывали, учитывая их температуру плавления. ■л ; 1 ''С'.'.:.
Реакции проводили в конечном объеме 50 мкл (для каппа-казеина) и 25 мкл (для : бета-лакгоглобулина) с 1*ПЦРбуфером(16.6 MM<NHt¿SO/.67(7 мМ Трис-HCt, рН=8,8, 0,1% (v/v) Tween 20), 1,5 мМ MgCb, 200 мкМ диоксинуклеозидтрифосфатов, 30 пмолъ каждого из праймеров и 1 Ед Тад-лолимеразы. . - " ■ : . - .
'" Полиморфизм анализируемых генов устанавливали при помощи метода ПДРФ ■'.'.',. ■ ■:*:.' ; анализа (Leveziel et а!„ 1088; Medrarlo J, F- ,Agutar-Gordo va E.,1990; Schlieben S. , et al,, :
■ 1991; Sapersteln D.A., et al., 1991; Schtee p„ Rottmann O.,; 1992], Рестрицирующйе . эндонукпеазы 1 выбирали, ■'■..' исходя, из последовательностиамплифицируемых
■ фрагментов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина. ^ : -
Анализ', вмплифицированных фрагментов ДНК и- продуктов, рестрикции осуществляли посредством электрофореза: при 130Ва 1,8-2%. згяроэном ten* в " буфере ТАЕ с добавлением бромистого димидия до конечной концентрации 30 нг/мл.¡','•■■ визуализацию; продуктов ПЦР-ПДРФ анализа- выполняли под ультрафиолетовым 1 светом. Для обработки и документации результатов использовали программу BioTest. : '. .
:: Статистическую обработку данных проводили' по стандартным методикам : Су '-' [Плохинский НА,11976; Меркурьева Е.К., Шангин-Березовский Г,И., 1963]. . ' . v . j
. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ - . ; '
' , 3.1. Оптимизация мвтодааыделения ДНК из крови, ткани, молока, спермы с ' ''^использованием перхлората натрия ; 'С.'-'- -У С ■ !'■i ■■ i',-'"' i
. ■■■■;,. Для выделения ДНК из крови, ткани, молока, спермы наряду с методами солевой. '. , íэкстракций,.Кавасаки, щелочного лизиса [Зиновьева Н.А.'и др.; 1998J. нами было
предложено использование •/ модифицированного метода экстракции с помощью перхлората натрия. ~ ~ . '-U-'/-'^- гТ" ■
С этой целью к 300 мкл консервированной крови добавляли 1,2 мл реагента А' . / (10 мМ ТриС-HCI, рН=8.0; 320 мМ сахароза; 6 ц«М MgCl; 1% Тритон Х-100. хранить при :: :тщательно перемешивали и центрифугировали, 2 мим при 7500 об/мин. После '.удаления надосадочной жидкости процедуру очистки клеточных шариков- от '..:... гемоглобина повторяли. Молоко (1,5 мл) ■ помещали < в 1,5 ' мл пробирки и 4 центрифугировали 5 мин при: 3500 об/мин. Жидкую фракцию « жир удалили, после чего ■ ,
промывали осадок т соматическихL клеток реагентом А. Сперму (100 мкл) . 'г центрифугировали 2 мин при 7500 oGi/мин. Осадок тщательно перемешивали с 400 мкп Í - реагента А. центрифугкроса ли 2 мин при 7600 об/мин. супернатанТ сливали, к осадку : добавляли 13 мкл IM OTT. Кусочек ткани (2-3 мм1), сперму; осадок лейкоцитов крови , ' или. соматических клеток молока помещали в 1,6 мл пробирки, добавляли 150 мкл .;-'
реагента В (400 мМ Трис-HCl, pH«ft,0; 60 мМ ЭДТА, рН=8.0,150 мМ NaCI; 1% SDS. . хранить при комнатной температуре), 5 мкп протеииазы К (20 мг/мл) и инкубировали ; при 60°С в течении 5-12 часов или на ночь. К клеточному лиэату добавляли 1/3 об. (50 I мкп) 5 М раствора Na-перхлората и 5-7 мин хорошо перемешиаали. Затем добавляли
< V, 1,5 об. (300 мкл) CtA'(24 об. хлороформа + 1 об., нзоамнлевогр спирта), интенсивно
смешивали 3-5 мин и центрифугировали 5 мин при-15000 о&мин. ' Верхнюю ДНК- • .. содержащую фазу переносили.в .чистую пробирку и при необходимости.проводили.*;'
< 1 повторную очистку. CIA.'ДНК из раствораосаждали 2 об/ (600 мкл) 100% этилового ^Тспирта. Tip*; отсутствии шарика ДНК (в случае «деградированной ДНК) пробы
центрифугировали 2-3 мин при 15000 лб/мин^ Затем ДНК инкубировали 5-10 мин в 0,5-'* 1,0 мл; 70% этанола (охлажденного до -2Ü°C).. После - удаления спирта шарик ■ высушивали в течение 20-30 мин при комнатной температуре. Содержимое пробирки ' V реоуспеидиро&али в 50-100 мкл бидистиллироаанной воды или буфера ТЕ. ;.;'.
- Модифицированный' нами метод повышает эффективность выделения ДНК до , ■'. ■92,0-100% и отлично подходит для получения ДНК из деградированных, образцов крови,.. ; ткани, а также молока н спермы. Выделенная ДНК является высокомолекулярной и / - может быть непосредственно использована для ПЦР анализа или храниться при -íCC..
неограниченноевремя.'- v ■■■"■''■ '''i'," '.'-.i'.' ■
• . 3.2. Оптимизация методе ПЦР-ЛДРФ анализа ганх калпа-каэеина крупного 'рогатого скота ■■ : ' Л:\ jVr:. ■ ■'■■ , ■; i.'; V
8 1 настоящее время а большинстве научно-исследовательских лабораторий ■ ^ России при определении полиморфизма гена каппа-казеина выявляются только два- " •. основных аялеля: А и. В. Разработанная нами методика позволяет, осуществлять , J диагностику шести из десяти известных в настоящее время вариантов каппа'кааеина.
Исходя из - наличия и локализации толковых - мутаций, определяющих -."■;■ -' принадлежность к различным аплельным вариантам, - нами были, выбраны два ',"■ олигонуклеотидных праймера (EM 8LX14908 Х14326): VAR5 (ATA GCC AAA TAT АТС CCA ATT CAG Т. позиции 4906-4991) и VAR3 (ТТТ ATT ААТ AAG ТСС ATG ААТ СТТ G, . позиции 5473-5408). • '.-;■;...",' - "' .'--V; ' ■ ,"-■: ■"'
-Выбранные,граймеры амплифицируют фрагмент экзона IV. гена каппа-казеина длиной 532 п.о... содержащий "внутри; себя соответствующие гочковыэ мутации. 8 X;. таблице 1 суммированы данные о толковых мутациях в экзоне IV гена каппа-казеина ■ . ' хрупного рогатого скота с указанием их позиций, наличием рестрикционных сайтов, а так же аминокислотных заменах, обусловленных мутациями. _ ■' ''.. . ■ " ..;;■ • / .
^Л----'.:..: '< ■ ■ .'■;'..'.■: \ К' ■ '. - ■•'■.Л Лу;" ■ 7 у' ■"/■ ' Таблице 1:1-;
..Точке вые мутации в экзонв IV гена каппа-казеина крупного рогатого скота и обусловленные ими аминокиспотмыв.' г у. замены: 'у ■; ''- '7. '"¡"...'V-'' У '■-' 7 ■ у;.-> ».;■ * 77;- ■ г 7--1 ■■■'■■'"--.
, Вариант ■ и '-■■ На ЕМВ1.1 '.:■■■'■ ' ' ■■■ --:•* ' ■.'■'■: - Позиция ■ ■ '■'.'■' -т - 1 ■■■- ■ '' ■■'■■:'."■■' -■'<
АК- ДНК ' •• ' АК ДНК АК Днк ~ - АК ДНК . ■ АК1 днк ■
97 ' 1 ■ < 5191,-2,-3,7 (ты» 97,.. 5191.-2.-3 ■ 145 5337 (ХЬа/) 148 5345 {НШЩ; ' ■ • р- 155 5365 {Ара!} ; ■
А 084250 Агд' ССАССТСА'' А^. : ССАССТСА ТЪг. АСТСТАСА -А. ■ -. "V Аер ААСАТТСТ- • Бег- АСАССССА
В Х14326 Агд7 ССАССТСА '. • ~ А ■■■ Агд .7 ССАССТСА ТЪг АСТСТАСА . . * А1а V , ■ ААССТТСТ ~ ...А , . ' Зет; АСАССССА;
Не СЮ ССАСАССА Йв> 00 ССАСАССА Т* АСТПТАГ5А А1а О . АТЕИСТ Йег; АСАССССА '
Е АР041482 Агд" вСАСвТСА .. --к ' Агд ССАССТСА ТЬг АСТСТАСА Авр ААСАТТСТ • Оу .. 0 • •• АСтСБСС СА
' . .А ; ■ ' . к ■ !
Р АП23250 Агд ССАССТСА : —~А •' Агд £ ССАССТС/. Ч ТЬг-". '"' в'". "" АСС СТАСА • ААСАТТСТ ; Бег. АСАССССА ,
САН23251 Суз О . . ССАТСТСА ;; Су$ ¿СДЕдСА £ ТЬг'- АГТ^АОА • ААСАТТСТ 5ег АСАССССА • " - ..'V -
7, "''Показаны участки последовательности ДНК вобласти тйчковыхыутзций (выделеныжирмым шрифтом): у 7:■'"'■■■
' Участки уэнзйния ресфи1щионными эн^мзми подчеркнуты. > КСАТСУ>гдеК*СилиА;У3СилиТ ' 7 ' '•
^ ' 0 - муткруемый нухлеотед: А - место разрезания цегН ДНК рестрикциониымакзимом. :'."•.'• . . 7-
чКак-следует ;из данных таблицы 1, вариант Э калла-казеинг» отличается от .варианта- ' А аминокислотной : заменой : Aspw'-*A!a, вызванной ^соответствуощеЯ Точковой мутацией в позиции 5345 (А-»С) (выявляются рестрикцией по ИМЩ. -Вариант Е отличгется от вариантов А, 3, С, F и G заменой Ser,í!-*Gty. обусловленной точковой мутацией А-»С а позиции 5365 (выявляются рестрикцией по Ара!). Вариант' С, который при деухаллепьной Диагностике ошибочно диагностируется как вариант В. отличается мутациями двух нуклеотидои а позициях 5192 и 5193 (GT—»АС), приводящих к замене Arg~»Hi» (выявляется рестрикцией, гто Tai/). BapHeHT'G. который может присутствовать среди вариантов А. отличается оталлеля А в позиции 5191, в которой в результате мутации С—>Т происходит замена Агди—Суз (выявляется рестрикцией по Те/О 'Отличи« варианта С от О может быть установлено в позиции 5191, а которой мутация первого, основания в ¿триплете" (С-*Т) Приводит к аминокислотной замене *
- Arg"—>Cys (выявляется рестрикцией no Nspf), Мутация в (позиции 5337 (Т—.G) -'обуславливает образование' варианта F, который' может-.присутствовать среди . вариантов А (выявляется рестрикцией по Xbaf) . ;.*.. -
.. Таким образом, предложенный нами; метод ПЦР-ПДРФ анализа фрагмента -экзона IV гена каппа-казеина крупного рогатого скота о использованием пяти различных рестриктаз позволяет диагностировать Ыесть его вариантов • А, В, С, Е, F и G. .-.*..■ Для,объективной оценки . результатов при постановке каждой ПЦР.нами были использованы два контроляположительный, в качестве которого выступала ДНК крупного рогатого- скота с известнойконцентрацией, и отрицательный, в качестве которого * выступала реакционная. смесь с добавлением вместо ДНК бидистиллированкой воды до конечного объема реакции. " :
По завершении ПЦР ЕМО мкл реакционной смеси: наносили в агарозный гель с < целью контроля амплификации,- а также проверки контролеЙ. В .случае успешной. . амплификации остаэшуюся реакционную смесь разделяли на 4 аликвоты по 10 мкл и гидролйзовали рестрикциоиныМи энзимами Hindltl, Tail, Xbai и Apal в количестве 2-3 Ед ' на реакцию. Смеси инкубировали в течение 2,5 -5ч при оптимальной для каждого
- фермента температуре. По окончании инкубации проводили их электрофоретичеекое ■' " разделение а 1,в-2% агарозиом геле а буфере ТАЕ (130 V) Р добавлением бромистого димидия до'конечной-концентрации 30 иг/мл и-визуализировали фрагменты под ультрафиолетовым светом.. Для отличия .вариантов G и С каппа-казеина (только для генотипов АС или BG) проводили дополнительный гидролиз рестриктазой Nspl
- В таблице 2 суммированы результаты рестрикции исследуемого фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скоте в зависимости от генотипа.-'■■''.-'>-.■ ■.-'■■,'■■■'-. *''■.■'■ '■■''"■ Таблица Z
I ... Длины рвстрмкционных фрагментов гена: крупного рогатого скота в зависимости от генотипа * ^ - - ...*■■■..
} - Наличие +) или отсутствие (- i рестрикции и длины фрагментов (п. о.)
-- Tail * Nspl - - Xbal Hindi» Apal
А + 228 304 532 + 372 150- • 632 532 -
В 22в 304 -- 532 + 372 . 150 + 377 155 532
С - 532 . 532 + 372 150 + 377 155 - ■ 532
Е" 228 304 - 532 + 372- 150 - 532 ■ + 403 129
F + 228 -304 - : • 532 - 532 • 532 - 532
в -■532 + 227 305 + 372 150- 532 532-
На рисунке 2 схематично представлены результаты ПЦР анализа вариантов гена • калла-казеина крупного рогатого скота по предложенной нами методике. '■'.■* ,. ; л -
. ■-.''-"'■'■:.'*;'. Рисутж2
СХЕМА ПЦР-ПДРФ АНАЛИЗА ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА.КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
/До рестрикции ; 1 2 3 4 5 б
'Шил.
гг
1 2 3 А 5 е
После рйтритш ыдон&мэяши
___. ... .
В ■' ■ с
12 3 4 S 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
я теш Ï3ÎDJ). m ':.'.;. —132пд>.
ага 'oes 377 П.С. овпвап 304 по. III П ' •ш
□ о • о а — ISSn.o. □ aDDDO. ~228П.0, ■ □□ " .о
AS ВВ АА АА ВВ ВВ с с Е Е i .. ЕЕ
Hindia Tait Apal
—Я2пА.
_ 532л«.
Xbâl
" "■» г'. ■ • Как показано на рос. 2А, при рестрикции по Hlrrdlll аллель А (э так же Е, F, G) не -V"'.-."'",.' подвергается гидролизу и представлен фрагментом 532 п.о, Аллель В.(а так же С)
- ' расщепляется данной рестриктазой с образованием двух фрагментов длиной по 377 н -.
155 п.о.Таким образом, при использовании рестриктазы могут быть четко
- : визуализированы генотипы АА (дорожки 3,4), АВ (дорожка 1)'и ВВ (дорожки 2.5, 6).
г ; : Рестриктаза Tail позволяет выявить наличие аллелей. В , и С (pue, 2В). . . Отсутствие рестрикции по данному ферменту обусловлено наличием аллеля С среди . презумптивных генотипов АВ и ВВ и аллеля Q среди генотипов АА и Ав (дорожки 1,5). . , " :, Для - дифференциации." генотипов : АС и BG "необходимо использование ■ ' рестриктазы Wspf. В случае наличия аллеля G, использование данной рестриктазы приводит к образованию двух рестрикционных фрашентов.Аплель С характеризуется' ■ ;■; отсутствием гидролиза по Nspl. '■■'■■у. у /.у ■ у -Уу- . ■
.-.; " , ' . . Гидролиз продуктов рЦР ферментом Лра/ позволяет идентифицировать алпель Е калла-казеина крупного рогатого скота (рис. 2Ç), при наличии которого образуется - два рестрикционных фрагмента длимой 403 и 129 п.о. (дорожки 2.3 и 6). ">■*"■ ¡.У, ; г Нерестрицироаанный фрагмент, образующийся при гидролизе с ислол(.зованием эндонуклеаэы.Хйа/ Ípuc. 20),.является редким для большинства пород аллелем f ' ■■- ,'уу (дорожка 3). у-; ,.-Уг- . '■'.;■■"■■■■■■■', Г'-.-, -у' .у -.'У Л i'y ■■
■'■"... Предложенная методика может быть несколько модифицирована посредством . исключения традиционного гидролиза по; Hindlll и заменой его рестрикцией всех ' образцов по Тед/. В этом случае для выявления шести генотипов каппа-казеина будет - ■ У достаточно так же пяти рестрикционных ферментов; Taît/Apsl, ХЬаК Nspl* Taql,
3.3. Разработка метода ПЦР-ПДРФ для идентификации вариантов гена бета; лактоглобулина крупного рогатого скота . ■ - ■. Х'-У"У,;-'. ууу
. У. Диагностика.. четыре* наиболее часто встречающихся аплепя. гена • бета- -
; лактоглобулина крупного рогатого скота - А, В, С и D основана на:определении , --аллелеслецифически* точковых . мутаций посредством , соответствующих ; рестрикционных ферментов. • .у у: у. 'У*' К :у'т-у ' ".'' ■ ■"' - ■,- ; ... у - Исследованием ' последовательностей 'аллвльных вариантов гена' бета-1 ■ лактоглобулина крупного рогатого скота, было установлено, что его полиморфизм ■
. обусловлен Тучковыми мутациями ; (базовыми заменами) в позициях 2206 а экзоне I, а . ■ также; в позициях 3065 и 3109 экзона I) (Gene Bank Access № Х14710). В результате ': зтого редкий вариант D отличается от вариантов А..В и С аминокислотной заменой Glu-»Gin в позиции 45. Отличие варианта В выявляется в позиции 64; где в результате '. ""■. '^мутации второго основания триплета GAT-+GGT происходит замена Asp-»Gly, Вариант С характеризуется заменой последнего основания а триплете CAG на CAÇ, что влечет 'У за собой образование His вместо Gin в.позиции 59 бета-лактоглобулина; , * У Нами ; были подобраны. лраймеры, ' вмплифицирующие фрагмент гена . бета- -;
лактоглобулина длиной 1248 п.о.включающий толковые мутации, обуславливающие У его полиморфизм: tG5a ÍCTA TTG ТСС TCG TAG AGG AAG С, позиции 2031-2052) и LÙ3a (AGA AAG CCC TGG ATA AGC AGC С, позиции 3257-3278). у у ^
■ , Продукты ПЦР,разделяли на две аликвоты и срабатывали ферментами Pvutt* Pstl: Рестриктаза Pvull позволяет идентифицировать варианты А, В и D гена бета. лактоглобулина, в то время как обработка рестриктазой Pstl выявляет вариант С.' . ■' .-" Амплифицируемый фрагмент гена бета-лактоглобулина с указанием, наличия.,
рестрикционных сайтов. PvuH. и длин-образующихся ' рестрикционных фрагментов
- схематично представлен на рисунке 3. v .--У." ,
■ ■ Рисунок 3
. Схема ПЦР-ГЩРФ анализа гена 6втв-л »кто глобулина крупного рогатого скота (EMBL Х14710) с использованием рестриктаэы PvuH
124В п. о.
А
В, С D
2207/2108 2S04/2503 aoemoss
1 1 1
.1 -■-. f. : t з:
Pvull Pvull " PvuH
t 474 п о. ■ 774 n.O.
1Т7п.о. 297 п.о. 774 ПЛ.
. Í77 п.о. 297 П.о, , 563 п.о. 311 п.о.
Как видно из представленной схемы (рцс. наличие двух специфических фрагментов рестрикции по Pvull длиной .774 и 474 п.о, соответствует аллелю А. Точковая мутация в нуклеотцдной; последовательности варианта 8 обуславливает образование дополнительного сайта рестрикции Pvull и приводит к наличию трек специфических для аллеля 8 фрагментов длиной 774, 297 и 177 п.о. Результатом Нуклеотидной замены в аллеле D гена бета-лактоглобулина является образование еще одного специфического для' PvuH сайта и. как следствие, - появление четырех рвстрикционных фрагментов длиной 563,.297, 211 и 177 л.о. -/
Рестрикция с использованием эндонуклеазы Pstt позволяет диагностировать аллель С генабета-лактоглобулина (рос. 4). f: ■
■S нукпеотидной последовательности варианта С {рис. 4) имеется лишь один общий для всех аллелей сайт узнавания Pstt, в то время как в вариантах А, 8 и D присутствует дополнительный рестрикционный сайт для эндонуклеазы Pstt. При , гидролизе ло Pstt последовательности варианта С в геле визуализируются два фрагмента длиной 182 п.о, и 1066 п о., в то время как при гидролизе аллелей А, В и О помимо общего-фрагмента длиной 162 п о. образуются два специфических фрагмента длиной 893 и 170 л.о. .
' Рисунок 4 ..
Схема ГЩР-ПДРФ анализа гена бета-лактоглобулнна крупного рогатого скота (EMBL. Х14710) с использованием рестриктазм Pstt --
1148 п.о.
2031
2212/2213
I
♦
Р«Н 182 п.о,.
jOQ8 №,а,
| 182 п.о. Ч
Э108/310Э
Pstt
3278
ЙЭ6 п.о.
170 П О.
На рисунка б представлен ПЦР анализ гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота с указанием длин образующихся фра центов в зависимости от генотипа животных (оригиналы фотографий даны .в диссертационной работе).
Рисунок 5
Схематическое изображение образующихся рестрикций иных фрагментов в зависимости от генотипа по бвта-лактогяобулииу
На рисунке 5А показан а модифицированный фрагмент гена бета-лактоглобулина до рестрикции. После рестрикции по Pvttí (рос. $6) могут быть четко идентифицированы фрагменты длиной 474 п.о.. соответствующие аллелю А {дорожка Т. 3), и 297 п о, и 177 п.о., соответствующие аллелю В (С) (дорожки 1-5), а так же общий для обоих аллелей фрагмент длиной 774 п.о, (дорожки 1-5). Следует отметить, что при исследовании животных различных популяций ни а одном случае не было установлено наличие аллеля О гена бета-лактоглобулина, которому соответствуют фрагменты длиной 563 п.о, и 211 п о.
Гидролиз по Pstt позволяет дифференцировать аллели В и С (варианты В и С имеют идентичные сайты узнавания рестриктазой Pvult. и поэтому редкий аллель С может быть ошибочно диагностирован как В). О том, что животное имеет аллель С говорит наличие Psff-фрагмента длиной 1066 п.о. (рис. 5С. дорожка 2), в то время как - вариантам А, В и D соответствуют фрагменты длиной 995 п.о. и сдвоенный фрагмент длиной 182-170 п.о. (дорожки J-б). Нанесенная на дорожку 2 (рис. 5С) проба ПЦР-ПДРФ анализа, генотип которой по рестриктаэе PvuH был предварительно диагностирован как ВВ, имеют фактический генотип ВС.
Для облегчения идентификации фрагментов а качестве положительного контроля при постановке каждой ПЦР может быть рекомендовано использование ДНК : животных с гетерозиготным генотипом по бета-лактоглобулину - АВ.
Предложенные нами методы диагностики полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина на основе анализа ПЦР-ПДРФ просты в исполнении, достоверны и отличаются хорошей воспроизводимостью результатов. Они могут быть с успехом
. использованы для тестирования крупного - рогатого скота в рамка* полуляционно-' генеглчеосих исследований.'дпч сохранения генетического разнообразия, а так же в -качестве возможны* маркеров яокусов количественных признаков. "'■■■■ *■' /
3.4. Полулячионно-генетичеекий анализ гене к*пп«-каэ»ина у различных пород крупного рогатого скота Российской Федерации
'Многочисленными исследователями показано положительное влияние аллеля 8 г каппа-казеина на содержание белка в молоке, а также на сыродельные характеристики молока [Mareiali A.S., Ng-Kwa) Hang К.F., .1986;. Mclean D.M.," 1087; Hansen H.. 1690; Jersay Journal, 1990; Borza Dohy,J,; 1993; Ron M., et at., 1994; Иолчиев B.C., 1994; ГлазкоВ.И.; 1097; Зиновьева HAi И Др., 1999; Попов A.M., и др., 1998; романосова ЁГ., ■ 19081.:- i : ■■■■:. : Л--:'.;;
Породы и популяции крупного рогатого скота Российской Федерации мало изучены 'с точкц зрения !лол(ШОрф^зма генакаппа-казеина и взаимосвязи - его аппельных вариантов с . признаками молочной продуктивности. Результаты проведенных полупяционно-генетических исследований суммированы в таблице 3.;
- ^V^y ■ Vr Таблица 3
ь Частоты яллелай и генотило|» ген* мпп»-кмеица у~иселедованных пород '
IAM ПЛГЙТПГЛ ГWrtTft -1 - . ' i ' - L-' ' ■ ' L - *
' Частоты аллелей ■■■■>-■ ■ Частоты генотипов
А |В IE IF ]с jo АА [ AB I BS I АЕ I BE EE IBF IBC 1 AC 1 AO
- красная горб*тоеск*я порода, ГУП «Зименки», Владими рекой области (л»187)
п 69 67 30 17 I В V в 2 • т
% 52,41 38,24 7,21 1,81 0.5з( • ' t9,95 35, ВЗ 16,04 9,09[ 4,28 0,53 3,21 1,07
Швицкая порода, молочный тип, АО «Пригорское», Смоленской области (л»72)
л .... . 7 28 I 32 I - - 1 1 -а- г
% 31,25 es.sii - 0,69 г,0£ 0.69 9.72 " — I 3e.e9j44.44l ' - I 1.39 1.39 2. Tei 1.39
■ Якутская порода, Республика Саха Якутия (л«331
п,- I" 7 I 23 3 - I-.-
» 58,00 43.94 ' ш'г- 21.2^69.70 9. od'
тг~ ■ - Черно-лест рая порода, ГУЛ «ПНО Поймав .Московской области (п=27> •
- • I' 18 I 7 * 0 2- ■ „1:.
% 83,33 12,96 3,70 . | . 66.67125.92 0 7,41 ■,
" Как 'следует из - .данных таблицы^ наибольшая .'-частота встречаемости предпочтительного генотипа ВВ, была отмечена у животных молочного типа швицкой породы (44,44%), что в 5 раз больше, чем в черно-лвстрой породе. Частота вллеля В в : данной популяции так.же была наивысшей среди исследованных групп и равнялась Ч8«65,2в%/ Красная горбатовская порола характеризовалась Более низкой частотой: встречаемости аллеля В и генотипа ВВ (соответственно, 38,24% и 16,04%). .
.Заметно отличается от шаицкой и красной горбатоэской пород популяция якутского скота. При относительно высокой Частоте встречаемости аллеля В (чВ*43,94%) доля . ' гомозиготных генотипов ВВ составила лишь 9,09%. . V -" '-: -
Наименьшая частота • встречаемости предпочтительного аллеля В':". была установлена в черно-лестрой породе (дВ=»12,Й6%),* Гомозиготных генотипов ВВ е 1 данной популяции обнаружено не было.. ■.■■■' ■■..—
Интересным является тот факт, - что V животных красной горбатоеской и ' молочного типа швицкой пород частота встречаемости гетерозиготного генотипа АВ . была приблизительно одинаковой и составляла, соответственно, 35.6% и 38.8%, В якутской породе частота встречаемости гетерозиготного генотипа АВ была примерно а два раза выше (69,7%). Минимальная частота встречаемости генотипа АВ была отмечена у коров черно-пестрой породы - 25,9%.
Наибольшее количество аллелей-выявлено у животных красной горбатоеской и молочного типа швицкой пород - пять аллелей из шести диагностируемых. В обеих популяциях были определены как основные аллели А (соответственно, цА=52.41% и 31,25 %) и В (соответственно, чВ»38,24% и 65,28%), так и достаточно редкие аллели Г - (соответственно, <)Р=1,61% и 0,69%) и С (соответственно, чС =0,53% и 2.08%).
Аллель Е был выявлен в красной горбатоеской породе с относительно высокой частотой встречаемости равной 7,21%.-Из двадцати шести животных одно имело -, гомозиготный генотип ЕЕ (0,53%), семнадцать - АЕ (9,09%) и восемь • ВЁ (4,28%). В черно-пестрой: породе этот аллельный вариант встречался с частотой сдЕ равной ; 3,70%, а частота АЕ генотипа составила 7,41%.
/Среди семидесяти двух голов швицкой породы, молочного типа у одного животного был установлен генотип Ай. что соответствует частоте встречаемости редкого аллеля О равной 0,69%.
Наиболее гомогенной из исследованных групп животных оказалась популяция якутского скота. В ней был^ выявлены только два аллеля - А и В.
Определено, что процент ошибочно интерпретируемых результатов при двуаплельной диагностике составляет: 6,94% (швицкзя порода, молочный тип), 7,41% (черно-пестрая порода), 18,34% (красная торбатовская порода).
Анализ.-генетической структуры популяций показал сохранение генного равновесия по генотипам каппа-каэеина в популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой и молочного типа швицкой пород (Р=0,05).
3.6. Связь генотипов каппа-казеина с молочной продуктивностью у исследованных пород крупного рогатого скота
Нами были изучены взаимосвязи мехеду различными генотипами локуса каппа-казеина и признаками молочной продуктивности у исследованных пород: Результаты анализа представлены в таблице 4. Для расчетов были использованы данные только тех животных, по которым имелась продуктивность за 305 дней первой лактации.
Анализируя данные таблицы 4 по красной горбатоеской породе, можно предположить, что наиболее желательными по удою являются животные, несущие в своем генотипе аллель Е кал па-казеина, причем генотип ВЕ возможно является более благоприятным по сравнению с генотипом АЕ. От животных с генотипом ВЕ было . получено больше молока и молочного жира при приблизительно одинаковом процентном содержании жира в молоке. Наименьший удой зафиксирован у коров с < генотипом ОГ каппа-казеина, что вероятно говорит о негативном влиянии аллеля Р на . молочную продуктивность в целом. Недостаточное число животных с генотипом ВС не позволяет сделать определенных выводы о влиянии аллеля С на удой и содержание жира в молоке крупного рогатого скота.
' , Данные по продуктивности животных швицкой породы показывают оределенное преимущество аллеля В по сравнению с аллелем А как по удою, так и по содержанию жира и белка в молоке, От коров с генотипом В8 получено на 27% больше молока, чем от гомозигот АА при прибпизительно одинаковом содержании жира и белка. Аллель б, диагностированный у одного животного, оказывает, вероятно, неблагоприятное
влияние на молочную продуктивность и содержание жира и белка в молоке, хотя по : одному животному сделать конкретный вывод не представляется возможным.. ,
'Ч •'.' " . ■,':'■ "■ ■ V V.'.* ■.. Таблица 4 ■
Порода* Генотип Кол-во' ЖИВОТНЫХ. ' п Удой за . 305 дней,, кг Жир, % Молочный - жир, % ■'"." Бепок, Молочный белок. •
Красная горбато-всхая . ^ \ ■■..! * ' ■ ^ 7 г' АА 1 40 • ' 2962 ± 94 • 4.22 10,03 125,1 ±3,9 . - ,.
А0 • 41- ■ 3106 * 109 4,20 ±0.03 130,6 ±4.6 ■ ' : ■'
ВВ 20- 3019 ±140 4,20 ± 0.04 126,9 ± 5,6 • ' - ■".;
ЛЕ- 14 3424 ±213 4,10 ± 0t06 140,5 ± 8.3 ■
ВЕ •1 71 * ■ ■ 3589 ±324 4,2в±0.13 153.0 ±15.9 ' V '"--. ' ■ ■ ■■ I.-.'.-.-
ВР 3 ■■■ 2854 ± 520 4.26 ±0.10 121.9 ±16.4 ;
ее 1 3575 4.00 143.0 ' ■: - 1 ■ ■
Швицяа», лопочный ТИП" АА - е 3937 i 462 3,64 ± 0,06 151,0 ±18,3 3,29±0,02 129,7± 15,8
АВ - 20 4445 ± 235 3,79 ± 0.02 168,5 ±9.1 3,32±0,01 147.6А 7,98
ВВ - 28 5002 ± 227 3.86 i 0,02 193,1 ± 8,7 3,36 ±0.01 167,в±13,65
Ав - ' 1 3463 3.65 127.1 3.31 115,29
;.."'■ Анализ продуктивности животных красной горбатовской породы в зависимости от ; генотипа показал отсутствие достоверной разницы по удою, жиру и молочному жиру среди коров с разными генотипами (табл.5).\'. ^ ;
\ '■■.:■'■ ." '-■1 > »V Таблица 5 ■
Соотношение генотипов гена каппа-казеина в зависимости от п*Р»м»троэ
Параметр ■ Порода: ; ; Соотношение генотипов - Разница <D) : ' Td P.
■ 1 ■ ■ • з ■' ■ 4 ■ ----- - 5 "' .. . в ' -
Удой, кг 1 - -( . р -* . ■ . . Красная горбатовская -' У'" '' У'' V'« : '■■"*Ч5 - ■ .■■ ' АЕ>АВ>АА • АЕ>А8 АЕ>АА + 318 + 462 1,32 v-53 1.965' V>=52 ; <0,95 <0.95 "V
8E»88>8F , BE>BS „'.. BE>BF - + 570 . + 725 1,61*5 v »25 1.16 : v «25 <0.95 • «0.95
Удой, кг Швицкая, молочный тип ' 8В»А8»АА~-В8»А8 • ■ ~В8>ААК' + 557 --* + 1065 ' 1,705 'y»4§ 2,059" V=32~ ' <0,95
Молочный жир, кг ; ■ V Л- ■ * ■ Красная горбатовская: ■ , ■ - ■ р ' ■ '. ' V 8E>88>BF . ВЕ>ВВ + 26.1 ' 1.55 v =25 <0.95
BE >BF - - + 31.1 , 1,36 v =3 <0.95
Швицкая, - . .-'■*!■>. молочный ТИП '■■': ВВ»АВ>АА ■■.'-' ВВ>А8 ' 'ВО >АА 7 • + 24 в 1.95 V=40 2.078 v =32 <0,95 >0.95 "
i' -r ' ' ь г-
• ■■ •• 3 • в
Жир, % Красная . ■ / - , горбатовская АА>АЕ ■ ♦ 0,12 1,79 v «52 <0,95
Шеицкая. . молочный тип ВВ>АВ + 0.07 у 2,47 v -46 >0,95 ..
Белок. % Шеицкая,. '■ ." ^ молочный тип ВВ>АВ>АА ; - ;'вв>Ав - + 0,04 ; 2.857 v«46 .>0.99 "
ВВ >АА • + 0,07 3.12Й" v»32 >0,99
Молочный Шаицкая. ВВ>АВ>АА :
CefioK, kr. молочный тип ' ' ■■ ■ ■ V V " : вв>ав +20.2 1,278 v »46 ,<0.95
80>АА + 38,1 1,825 v-32 <0.95
* У животных - молочного липа шйицхой породы, в ■ результате. статистической .' ■V 'обработки полученных данных, была установлена достоверная разница между 8В и АА М'у генотипами'долла-казеина то удою (+1005 кг, Р>0,95) и молочному жиру (+42,1 кг,. " " Р>О,05); между ВВ. * Ав - по жиру- {+0,07%, Р>0,65) и между ВВ и АВ.:ВВ и АА ' .генотипами по процентному содержанию белка (+0,04% и +0,07% соответственно; Р»0,99). , .у '■. ■■."■■./.:■"*- ■ - у- ;•;.
\ ■ . З.С. ропуляционно-генетический анализ гена ■ бата-лакто глобулина , у : \ ' . различны« рород крупного рогатого скота Российской Федерации у ;
В настоящее* время ; частоты встречаемости генотипов и аллелей бета-" ; :' | лактоглобулчна,' а также слияние отдельных аллельных вариантов данного гена на -.-.. молочную продуктивность различных пород . крупного : рогатого скота - российской '. Федерации довольно слабо изучены. '■.■ ■■¡■' у ■■
.' В исследованных породах было выявлено три аллеля гена бета-лактогпобулина . ■ - А. В и С из четырех диагностируемых нами {,табл.$). - i i.-.
': АЛлели А и В были выявлены у всех пород, при этом частота встречаемости . • данных аллелей у исследованных животных, кроме краснойгорбатовской породы, была , приблизительно одинаковой и составляла, соответственно, в.швицкой породе 40,625% , и 63,125%; в пхутской породе - 51,56% и 48,44% И & черно-пестрой породе 46,0% и 50,0%. Частота генотипа" АА, коррелирующего,., как-, иэеес1ж»,.. с . повышенным . : *. .- содержанием белка а молоке [Mg-Kwai Hang K.F., 1993]. была наивысшей у якутского -, .скота (1В,75%). У/животных .черно-пестрой, игшвицкой пород эта величина; была несколько ниже и составляла, соответственно," 16,0% и , 12,5%. Частота встречаемости L . гомозиготного генотипа ВВ была максимальной в швицкой (31 <25%), а минимальной в якутской (15,62%) породах. ' Черно-пестрая порода характеризовалась средним рокаэателем частоты генотипа Et) равным 20,0%. : ''. .: . : ч , -
ß трех породах крупного рогатого скота среди В вариантов был выявлен С - аллель гена бета-лактогпобулина. Его аллель ные частоты колебались от qC>= 0,4% у -красной горбатовской до qC= 6,25% у молочного типа швицкой пород. Черно-пестрая ■ ' " порода занимала промежуточное1 положение : (qC» '2,0%). В .красной горбатовской "" . а . породе аллель С встречался в сочетании с аллелем в и частота генотипа ВС ' " составила 0,8%: Среди животных черно-пестрой породы и молочного типа швицкого
скота аллель С всегда встречался в сочетании с А аллелем, и частота генотипа АС .■=■.''■ находилась е пределах4,0 -12,5% соответственно. . ••• •• - ''■*■:-.■ - 'А" :
" ' - • ' • Таблица 5
Частоты «ллвпей и генотипов гена бета-тхтоглобулина у исследованных
" Частоты аллелей Частоты генотипов •
А В I' С о- АА АВ вв ' ее АС
"Красная горбатовскап порода, ГУЛ «Эименки», Владимирской области (п*132) ".
5 55 71 • 1 '
% * 24.6 75.0 1 . 04 ' | .3.8 ■■ 41.7 53.6 08 ■ ■ '. „
Швицкая порода, молочный тип, АО «Пригорское», Смоленской области (п*16)
п _ ,.1 : '>-чГ'- ■1 2 - " 7 ■ ■■ 5
40.625 53.125 6 25 12,50 > 43.75 31.25 12.60
Якутский скот, Республика Саха (Якутия) (л=32) : " "
е 21 •5
% ■ 51.66 I "48.44- .... 18.75 65 63 -15.62
. > Нерно-лветрах порода, ГУЛ «ПнО Поймав, Московской области (п»25) •
: о . - -г *.. V- 1 4 .,г15 - 5 ■.■ ■'
• % 48.0- - 50.0' 20 1 16 00 60.00 20.00 4.0 0-
.'* ; Популяция скота якутской породы оказалась наиболее однородной, с наличием . . ■ , ' двух основных аллелей гена бета-пактоглобулика и с преобладающим количеством АВ .< ' '■; ; гетероэигот (АВ=65.63%). Аллель С в данной популяции выявлен не был.- ''-^Ч-^-
'л'.- ^г!1;-- У всех протестированных животных различных пород крупного рогатого скота > ■" России отсутствовал редкий аллель О. образующий после гидролиза ферментом Ри/1/ :. 'У; : :."', помимо общих фрагментов - 297 и 177 п.о., фрагменты длиной 563 и 211 п.о. ' ч
;■' Анализ распределения генотипов показал сохранение генного равновесия по/...,. локусу бета-лактоглобулина (Р*0.05) у исследованных пород. , " , , ■ ;
Исходя из 1 полученных результатов.. можно заключить, что использование предложенной' нами методики ПЦР-ПДРФ анализа позволяет - исключить ошибочную '". ' интерпретацию результатов. Как было установлено, процент ошибок при двуаллельной ' . 'диагностике составлял в зависимости от породы 0,76,: 4,0 и12,5% (соответственно, ; :
■ красная горбатовская, черно-пестрая и шеицкая породы). ;- л - \ . ■.' . '■,■
. 3.7.;Связь генотипов и «ллелвй гена бвта-лактоглобулина с молочной ... продуктивностью;' . ■ с.-' ^"■', у..';;.: ,
8 таблице б представлен сравнительный. анализ . параметров молочной : :- •
■ .продуктивности коров исследованных пород в зависимости от генотипа по гену бета; " лактоглобулина, ■ . '-у ■■'.; /....о.-- -;, ■/.■',,..-...';, -Д;.;-....:'■'<:■' Т.''",.
'.<'■■ Приведенные в таблице.6 данные выявляют тенденцию по превосходству , ■V животных с гомозиготным АА генотипом красной горбатовской породы как по удою, так
и по жиру над особями с генотипами АВ и ВВ по гену: бета-лактоглобулина., При ..'■■;*
■ анализе процентного «удержания жира в Молоке1 исследованных; коров выявлено ■
. преимущество, гомозиготных генотипов над гетерозиготным.. А8 гетерозиготц имели '■*■ V
минимальный процент жира, равный 4,16%. - -■■.-■'.:'■:"■ ■ >'■ >'••■ ■.
; ' Полученные результаты по продуктивности животных молочного типа "швицкой;'■■.-■■ породы. указывают : на возможное преимущество коров - с' АА генотипом бета- . - >4' лактогпобулинв над А8 и ВВ го удою, хотя АС гетерозиготы показывают наивысшую ;' ■ " '
продуктивность по первой лактации. Имея минимальное процентное содержание жира среди двух исследованных пород, а так же самый низкий процент балка, животные с этим генотипом в тоже время дали максимальное количество молочного жира (213.6 кг). и молочного белка (189,9 кг). .*>" ■ ■■■'„V-V-.'-7 • ■""
;.■■■>='/■■■".' И '■■■■■■:.';■■ ■' г .'■ ■'."-■•'■' ■ . ■ *■ ■: - Таблица 6
Порода Генотип , Коп-во животных, п Удой за 305 дней, "--л кг ■ Жир, % " Молочный ' жир, , ■ % : Белок, Молочный ■'..белок.
Красная горбатовская АА ■ . ,■ -А " 3001 * 254 4,29 * 0.02 131,2*10.3: ' - - .-;„ .
АВ ■,-,:. 34 2950 * 99 4,16 * 0.03 123,2*0,03 ■ ■ ■■■ - ;■. ■' ■
ВВ 4в :'V 2957 ± 84 4,2010,03 124.1±3,12 - ■ г.
Швицкця, молочный тип- АА : ■ 2 5543 * 396 3,87 ± 0.01 214,6*15,9 3,33*0,01 184.5±12.бЗ
АВ 7 ■■■■ ■ 5247 ±317 3,91 ± 0,03 205,2*12,8 3,33*0,03 174,8*11.62
ВВ 5 " - 5399 * 120 4,06 ± 0,15 219,1*13,6 3,39*0,04 183.0*6,08
АС ■■ ■■■ 2 ■■■■■ 5703 ± 363 3.85 ± 0.14 219,6±е,01 3.31*0.03 188,9±13,71
'.-■■.,. Коровы шаицкой породы, молочного типа, с генотипом ВВ бета-лаетоглобулина 'СО средним удоем 5399 против 5703 кг у животных с генотипом АС имеют наивысшее : процентов содержание жира и белка в молоке — 4,08 и 3,39 % соответственно, что' согласуется с данными Ron М. et el. (1994]. . ' , ' ' ' ' ^ ^ ■ •
.; ..Анализ молочной продуктивности животных в зависимости от генотипа., представлен а таблице 7. ■.-.'■ * у '■/;■'■ .Г",'1. Г';: V " '■" i' '■'*
i:: V" ■ ■■.■. v /. ■ '■,■'.■■.■ f .• ■ ■ v* Таблица 7 ■
1' Соотношение ' генотипов гена бета-лактоглобупнна ■ зависимостиот. параметров молочной продуктивности у исследованных пород крупного рогатого скота 1 ■'■■■■■■■'" ■■'■„' '
Параметр ; Порода Соотношение генотипов Разница (D) ■ 10 У P '
■ \ .. 2 ■'.■ ' 4 ■ - 6 -
Удой, кг ■ Красная -горбатовская ■ ' ' i.' • с V ' ' ДА>АВ>£В АА>АВ АА>В8 + 102 + 104 0,374 V »36 0,389 V=48 <0.95 • <0.95
Шеицкая, ■ ■ молочный тип ' АА>АВ + 296' 0.584 V*7 <0.95
АС>АВ + 456 ■ \ 0.946 v=7 <0,95
Жир, % Красная . горбатовская , АА>АВ + 0,13 -- 3,61 ; v-36 >0,999 ■
АА>ВВ ■■■■■■■■■• + 0.09 2.5 " V=48 >0,95
В В >АВ + 0,04 0,85 v»78 <0,95
Шеицкая,; . молочный тип ВВ>АВ>АА ..... ВВ>АВ : ВВ>АА ■ + 0,15 + 0,19 0,88 : -v»10 1.267 v =5 <0.95 Г".' <0,95
АВ>АА + 0.04 ; 1.25 v-7 <0,95
1в ; • ^-г хл -'.у'
1 2 | ■ * ь-- - ■« ■..-.■ - в < . в ■
Молочный Красная. .,■-„<-.'■■■ горбатовскач^ . АА>АВ | + 8 0,774 V »36 <0.95
жир, кг АА>ВЭ.' - : + 7,1... : 0,658 .у=4Й <0.95 ■. :
Швицкая, • • ' молочный тип ас>ав ; у ♦ 14,4 1.018 V "7 <0.95 , ■
Белок, % Ч !,. Шаицкая, . •-молочный тип ' - ВВ>АВ>АА; ВВ>АВ"! В8 >АА ■ +0,06 1 + 0.03 1,2. V »10 1.463 - у »5 <0.95 : <0.95
: ";■'■■;■.; У жирст^ых . красной" горбатоеской " породы, при 'статистической обработке ■ * л полученных дэнчых, была установлена высоко вероятная достоверность вычисленных "V показателей по процентному содержанию жира а молоке,между генотипами АА.АВ и "-■■ : 1 ■■;■' ВВ.' разница" между А^у и АО генотипами бета-пактоглобулина равнялась+0,13%, что У. X соответствует третьему порогу достоверности <Р*О,900). и ДА больше ВВ на 0,09% ; -. (Р*0,95) что .соответствует первому порогу достоверности.-По удою и; количеству л У ' ^ у ' ; молочногожура достоверных различима щученной городе выявлено ке было. у "
•• ■■ В отличив ет красной горбатовской породы, у коров швицкой породы не быро , • , V выявлено достоверной {разницы по всём исследованным параметрам. Одной из причин _ • -■ < этого может быть'малое количество животных в выборке. ' > • ' . '*'■■. „'
> . . Для ~ того чтобы сделать окончательный вывод 'об отсутствии или наличии • ■'"'■ корреляций между - доследуемыми генотипами бета-паеторпобулина и признаками .
^ молочной продуктивности коров, необходимо проведение исследований на болыцем .; .""..■ погоповь«животных. -Л-';; '-; * ■ :у-";■■■/,*■ V '
р^ОДЫ.^;-^^ .:/
. 1, Создан банк ДИК крупного рогатого скота красной горбатовской породы (п»187),
молочного типа швицкого породы (п»72), якутской породы (п*33), черно-пестрой _ ' ; . > - - породы (п*27), который может быть использован для : проведения различных . ■.■'■■молекулярно-генетических исследований. 1 V;
.:■■' 2, Оптимизирована методика выделения ДНК И» крови <П"60). ткани (г1=56), спермы ■ - . .. - - Дп»20), Молока (л»30) КРС. Эффективность выделения высоко молекулярной ДНК,"-" .'■..; пригодной .для ПЦР-ПДРО анализа фрагментов, длиной более 1 т.п о, составила : ; ■/> - 92.6-100% ло сравнению с 70,6% при использовании стандартного солевого метода ' \. ."",. ; : ";■" . экстракции. '.. •./."• ¥■ ■'■'-, V!".':'. ■:'; V ' \ .',>'■;'..."; ":..','"- ' ^ ■■'.".■' ■
3. Модифицирована . и усовершенствована методика ЛЦР-ОДРф; анализа,;. .: позволяющая выявлять б полиморфных.аллелей гена калла-казеина крупного '■..-;.'/ ; г "рогатого скота - А, В; С, Е,Т, в.-Установлено, что рри стандартной двуаллельной -. диагностике процент ошибок в зависимости от породы составляет: 6,94 % (швицкая, . - у" молочный тип), 7,41% (черно-пестрая), 18,34% (красная горбатовская). 7 V-).7;
.4. Разработав .новый метод выявления 4-х ; полиморфных аплелей гена*" бета-. "Ч лактоглобулина крупного рогатого скота "■; на ■ основе ПЦР-ЛДР© анализа. • Установлено, что. процент' : ошибочно. интерпретируемых генотипов при " . _ ' . двуаплельной диагностике в зависимости от исследуемой породы составляет 0,76% . (красная горбачевская), 4% (черно-пестрая), 12,5% (швицкая, молочный тип).
. 5. Показано, что частоты • встречаемости аллелей каппа-казеина различались ; в -- зависимости от породы. Частота предпочтительного для сыроделия аплепя В быпа '■
г
: tö'
, »• .минимальной (12,96%) у чёрио-пестрой породы, и максимальной у швицкой порода
1»} ; > ~ Г'; (65,28%).• Наряду с основными аллелями.калла-казеина А и'В в трех из четырех . Г ■ исследованных породах выявлены редкие вплели С.В, Р..Соотносительно высокая "
■ ':."/'.частота встречаемости аллеля Е (7,21%) была: установлена у Животных красной
.". : 'горбатовской^'породы."'-,"Наибольшее число различных V генотипов было.'
> диагностировано у животных красной торбатоеской- 8 (АА, АЭ, ВВ, АЕ, ВЕ, ЕЕ,ВР, ВС) и швицкой пород - 7 (АА| АЭ, ВВ, ВО, АС, АО): Наименьшим генетическим, разнообразием (по три генотипа) характеризовались коровы черно-пестрой ;(АА, А В, АЕ) и якутской пород {АА, АВ, ВВ),, . -« ;,..'.. • '' • --'Г
. Уборов швицкой породы, молочного типа.выявлена тенденция, указывающая на
связь генотипа ВВ с-исследованными параметрами ^молочной' продуктивности:,'' ' . ^ (8В>АА,, + 10в5«\ Р*0,95),- ,-молочным Ж^ром (ВВ>АА,; +42,1 кг,.Р=0,95'),:-:
; V ' ' " /процентным содержанием жира <8В >Ав, +0,07%, Р=0.Э5) и белка (ВВ=»АВ,,+0.04%.; V ;У:Р»0,99; и,? ВВ>АА, +9.07%,: Р«0,99)." Наблюдается г тенденция положительного - ■' .' /' • влияния аллеля Е и отрицательного влияния аллелей <3 И Р гаиа каппа-казеина на < удой. - с
■■; «---' * "6*- Установлено, ; что частоты , встречаемости аллелей --и генотиповгена.. бета- -"Т",-V '-" г*: >' лактоглобулина' являются породоетецифичными. В , трех 'исследованных породах -; " ' *" ' (красная горбатовскзя. шеицкэя, черно-пестрая) было выявлено три еппепя - А, В,:
■ Л Г
■С, с частотой встречаемости редкого аллеля Cot 0,4 (красная горбатовская порода)
, пактогпобулииа у коров красной горбатовской породы Установлена'превосходство г . .чжмвоткых с генотипом ; АА над животными с генотипами АВ и ВВ по содержанию-?
молоке (соответственно, +0,13%, Р«0,999 и + 0.09%,Р* 0,в5).Л; *-, 'Л,'-
^■■¿^¿Г -прахтическиепредпожения' ■;^^ Г;.*}' у
' • Лабораториям, занимающимся ДНК-диагностикой, для повышения достоверности, " ■ и .анализа г генов , каппа-казеинаи ; бета-лактоглобулина -^ крупного ^рогатого : скота, ; рекомендуемиспользовать * лредложенные,: в данной ' диссертационной - работе."..-. • . . 7 методики:- . • • ' V
• •.. : опубликованныерасоты■:^^ -!
> . '*;"■: 1. Гладырь Е.А-, Зиновьева НЛ ;! Марзанов Н.С.. Букароэ Н.Г. 'ПЦР анализ вариантов --■* "лг- ' Г каппа-казеина у:" крупногог- рогатого ; скота; // Материалы научно-практической о'} конференции «Повышение\ (конкурентноспособности* животноводства и задачи
кадрового обеспечения», - Быково. • 2000. - с, 34-35. 7 ;;;, ~■;>!*'
; :- ' . . ,2.*.ГлаДырь E.A., Зиновьева H.A.', Марзанов Н.С.'.'брем Г. Использование генов Е
V. i Ч.Спвктотобупина и наппа-казеина в качестве генетических маркеров дпя г крупного ; .
■> ' - - рогатого скота // Материалы ,ll Международной . научной , конференции -
г; : *Биотехнология в растениеводстве, жиеотноеодстве и ветеринарии»/- Москва.,-'
- вниисхе,-2000.-С.86-88. • CV^V'^i^^V^^iJ^^'^^'i-i.V^'
; j I : 3. Гладырь Е.А., : Зиновьева H.A.," Попов А Н., Марзанов Н.С.',; Эрнст Л.К., ■ Врём Г. ' , ; Методические . рекомендации по определению-вариантов каппа-казеина-, и бета- ~
■ 'V ; :; .у пактогпобулима крупного рогатого скота методом ПЦР-ПДРФ анализа Я Дубровицы.,/ > '• • - . -2001.-1Sс. ■ p^v;—
, л-.-v
Тип.. 1НИИ НПО "Л/*" г.ПадолЮК М.О. -
. л . . • . : ' ' -.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гладырь, Елена Александровна
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Маркер-зависимая селекция
1.2. Молоко коров и его свойства
1.3. Полиморфизм генов белков молока крупного рогатого 13 скота,
1.3.1. Полимеразная цепная реакция (ПНР)
1.3.2. Молекулярно-биохимический полиморфизм казеина молока
1.3.3. Молекулярно-биохимический полиморфизм сывороточных 22 белков молока
1.3.4. Полиморфизм генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина и 29 связь с хозяйственно-ценными признаками у крупного рогатого скота
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы исследований
2.1.1. Животные
2.1.2. Оборудование
2.1.3. Реактивы
2.2. Методика исследований
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Оптимизация метода выделения ДНК из крови, ткани, 42 молока, спермы с использованием перхлората натрия
3.2. Оптимизация метода ПЦР-ПДРФ для анализа гена каппа- 43 казеина крупного рогатого скота
3.3. Разработка метода ПЦР-ПДРФ для идентификации 50 вариантов гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота
3.4. Популяционно-генетический анализ гена каппа-казеина у 57 различных пород крупного рогатого скота Российской Федерации
3.5. Связь генотипов каппа-казеина с молочной 65 продуктивностью у исследованных пород крупного рогатого скота
3.6. Популяционно-генетический анализ гена бета- 71 лактоглобулина у различных пород крупного рогатого скота Российской Федерации
3.7. Связь генотипов и аллелей гена бета-лактоглобулина с 74 молочной продуктивностью
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Введение Диссертация по биологии, на тему "ДНК-диагностика вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота"
Актуальность темы.
Одним из приоритетных направлений развития науки и техники до 2005 г. является мобилизация, сохранение и использование генофонда животных с хозяйственно ценными признаками (приказ Министерства науки и технологии Российской Федерации, Минсельхоза Российской Федерации и Президиума РАСХН от 30 декабря 1999 г. № 295/892/111). В этой связи актуальной становится задача выявления маркерных генов, ответственных за проявление хозяйственно-полезных признаков, и их анализ с целью последующего установления закономерных связей между локусами количественных признаков (QTL) и маркерными генами.
Наряду с биохимическими и физиологическими маркерами (оценка по группам крови, полиморфным системам белков) [Марзанов Н.С., 1994] широкое распространение получают молекулярно-генетические маркеры. Выявление маркерных аллелей, связанных с желательными хозяйственно-полезными признаками (ДНК-диагностика), позволит проводить селекцию животных на уровне ДНК (генотипа), а широкое их использование в качестве маркеров признаков продуктивности в конечном итоге повысит эффективность ведения селекционной работы. Преимущество ДНК-диагностики перед оценкой признаков по их фенотипическому проявлению объясняется тем, что она базируется непосредственно на анализе наследственной информации, лежащей в основе того или иного признака [Зиновьева Н.А. и др., 1998].
Среди большого разнообразия имеющихся молекулярно-генетических методов анализа наследственного материала, и в частности ДНК, при оценке животных по генотипу предпочтение отдается методу ПЦР-ПДРФ анализа, вследствие его высокой чувствительности, точности, быстроты и известной простоты исполнения.
Аллельные варианты генов белков молока являются важнейшими маркерами молочной продуктивности крупного рогатого скота [Geldermann Н., 1989]. В связи с возросшими требованиями рынка к качеству молочной продукции, в частности к количеству и составу молочного белка, а так же к сыродельным характеристикам молока, возникает насущная необходимость в выявлении и использовании в селекции генетических маркеров, напрямую или косвенно связанных с качественными и количественными признаками молочной продуктивности.
Цель и задачи исследования.
Целью диссертационной работы являлось проведение ДНК-диагностики вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у различных пород крупного рогатого скота Российской Федерации.
Для достижения цели диссертационной работы были поставлены и решены следующие задачи:
1. Создать банк ДНК различных пород крупного рогатого скота.
2. Оптимизировать методику определения полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина крупного рогатого скота на основе анализа ПЦР-ПДРФ.
3. Выявить полиморфизм генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у различных пород крупного рогатого скота.
4. Изучить генетическую структуру популяций по исследуемым генам.
5. Установить взаимосвязи между аллелями генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина и показателями молочной продуктивности крупного рогатого скота.
Научная новизна.
Впервые разработаны методики определения шести аллельных вариантов гена каппа-казеина и четырех аллельных вариантов гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота. Изучено генетическое разнообразие четырех пород крупного рогатого скота Российской Федерации по исследуемым генам. Изучено влияние аллельных вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина на признаки молочной продуктивности крупного рогатого скота.
Практическая ценность работы.
Создан банк ДНК крупного рогатого скота четырех различных пород, который может быть использован для выявления полиморфизма других генов-кандидатов локусов количественных признаков.
Разработаны оптимальные методики выявления аллельных вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина, пригодные для проведения широкомасштабных популяционно-генетических исследований.
Исследовано влияние аллельных вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина на признаки молочной продуктивности крупного рогатого скота и даны рекомендации по возможному использованию данных маркеров в селекции.
Основные положения, выносимые на защиту.
• Создан банк ДНК четырех пород крупного рогатого скота Российской Федерации;
• Предложен новый метод выявления 6-и полиморфных аллелей гена каппа-казеина (А, В, С, Е, F, G);
• Предложен новый метод выявления 4-х полиморфных аллелей гена бета-лактоглобулина (А, В, С, D);
• Показано, что частоты встречаемости аллелей и генотипов исследуемых генов различаются в зависимости от породы крупного рогатого скота;
• Установлены тенденции влияния аллелей генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина на отдельные признаки молочной продуктивности коров.
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на:
• конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п. Дубровицы, 2000;
• научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2000;
• II Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСХБ, 2000;
• научных отчетах ВИЖа 1999-2000;
• научной конференции отдела биотехнологии, ВИЖ, п. Дубровицы, 2001.
Публикации.
В ходе выполнения диссертационной работы автором было опубликовано 3 научные работы, в том числе 1 методические рекомендации.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 18 таблиц, 14 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы, который включает 190 источников, в том числе 133 на иностранных языках.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гладырь, Елена Александровна
ВЫВОДЫ
1. Создан банк ДНК крупного рогатого скота красной горбатовской породы (0=187), молочного типа швицкого породы (п=72), якутской породы (п=33), черно-пестрой породы (п=27), который может быть использован для проведения различных молекулярно-генетических исследований.
2. Оптимизирована методика выделения ДНК из крови (п=60), ткани (п=56), спермы (п=20), молока (n=30) КРС. Эффективность выделения высоко молекулярной ДНК, пригодной для ПЦР-ПДРФ анализа фрагментов, длиной более 1 т.п.о., составила 92,6-100% по сравнению с 10,6% при использовании стандартного солевого метода экстракции.
3. Модифицирована и усовершенствована методика ПЦР-ПДРФ анализа, позволяющая выявлять 6 полиморфных аллелей гена каппа-казеина крупного рогатого скота - А, В, С, Е, F, G. Установлено, что при стандартной двуаллельной диагностике процент ошибок в зависимости от породы составляет: 6,94 % (швицкая, молочный тип), 7,41% (черно-пестрая), 18,34% (красная горбатовская).
4. Разработан новый метод выявления 4-х полиморфных аллелей гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота на основе ПЦР-ПДРФ анализа. Установлено, что процент ошибочно интерпретируемых генотипов при двуаллельной диагностике в зависимости от исследуемой породы составляет 0,76%) (красная горбатовская), 4% (черно-пестрая), 12,5% (швицкая, молочный тип).
5. Показано, что частоты встречаемости аллелей каппа-казеина различались в зависимости от породы. Частота предпочтительного для сыроделия аллеля В была минимальной (12,96%) у черно-пестрой породы, и максимальной у швицкой породы (65,28%о). Наряду с основными аллелями каппа-казеина А и В в трех из четырех исследованных породах выявлены редкие аллели С, Е, F, G. Относительно высокая частота встречаемости аллеля Е (7,21%) была установлена у животных красной горбатовской породы. Наибольшее число различных генотипов было диагностировано у животных красной горбатовской - 8 (АА, АВ, ВВ, АЕ, BE, ЕЕ, BF, ВС) и швицкой пород - 7 (АА, АВ, ВВ, BF, ВС, AC, AG). Наименьшим генетическим разнообразием (по три генотипа) характеризовались коровы черно-пестрой (АА, АВ, АЕ) и якутской пород (АА, АВ, ВВ).
У коров швицкой породы, молочного типа выявлена тенденция, указывающая на связь генотипа ВВ с исследованными параметрами молочной продуктивности: удоем (ВВ>АА, +1065кг, Р>0,95), молочным жиром (ВВ>АА, +42,1кг, Р>0,95), процентным содержанием жира (ВВ>АВ, +0,07%, Р>0,95) и белка (ВВ>АВ, +0,04%, Р>0,99 и ВВ>АА, +0,07%, Р>0,99). Наблюдается тенденция положительного влияния аллеля Е и отрицательного влияния аллелей G и F гена каппа-казеина на удой.
6. Установлено, что частоты встречаемости аллелей и генотипов гена бета-лактоглобулина являются породоспецифичными. В трех исследованных породах (красная горбатовская, швицкая, черно-пестрая) было выявлено три аллеля - А, В, С, с частотой встречаемости редкого аллеля С от 0,4 (красная горбатовская порода) до 6,25% (молочный тип швицкой породы). Редкий аллель D у исследованных животных отсутствовал.
Выявлены достоверные различия в проявлении генетических вариантов гена бета-лактоглобулина у коров красной горбатовской породы. Установлено превосходство животных с генотипом АА над животными с генотипами АВ и ВВ по содержанию жира в молоке (соответственно, +0,13%, Р>0,999 и + 0,09%, Р>0,95).
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Лабораториям, занимающимся ДНК-диагностикой, для повышения достоверности анализа генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина крупного рогатого скота, рекомендуем использовать предложенные в данной диссертационной работе методики.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гладырь, Елена Александровна, Дубровицы
1. Алиев А.А. Обмен веществ у жвачных животных. М.: НИЦ «Инженер». -1997.-420 с.
2. Бадагуева Ю.Н., Сулимова Т.Е., Удина И.Г. Исследование полиморфизма гена каппа-казеина у крупного рогатого скота и родственных видов // Молекулярно-генетические маркеры животных: Тез. докл. II Международной конф. Киев. - 1996. - С.5.
3. Барабанщиков Н.В. Молочное дело // М.: Колос. 1983.-413 с.
4. Баранова B.C., Валова JI.B., Курдуманов О.И. Электрофоретическое разделение белков молока // М. 1987. - 16 с.
5. Бисенов У.К. Выделение и клонирование кДНК гена бета-лактоглобулина овец // Бюл. науч. работ / ВИЖ. 1992. - № 106. - С. 78-80.
6. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве // М. РАСХН. - 1995. - 326 с.
7. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная биология. 1991. - Том 25. - № 4. - С. 926-936.
8. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных // М.: Агропромиздат. 1990. - 510 с.
9. П.Глазко И.И. ДНК-технологии животных // под ред. А.А.Созинова. Киев. - 1997.- 173 с.
10. Н.Голиков А.Н., Баранова Н.У., Кожебеков З.К. Физиология сельскохозяйственных животных // М.: Агропромиздат. 1991. - 432 с.
11. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов // М.: "Легкая и пищевая промышленность" . 1988. - 344 с.
12. Гроклод Ф. Полиморфизм белков молока, некоторые биохимические и генетические аспекты // Материалы XXVI Международной конференции по группам крови и биохимическому полиморфизму животных. Л. -1979.-Т. 1.-С. 55-94.
13. Дерюшева С.Е. Определение генотипа каппа-казеина у коров бестужевской породы методом полимеразной цепной реакции // Бюллетень ВНИИРГЖ. С-Петербург. - 1993. - Вып. 137. - С. 36-39.
14. Ефремов И.А. Исследование аллельного полиморфизма микро- и минисателлитных локусов генома человека методом амплификации ДНК // Автореф. дис. канд. биол. наук.: Москва. 1996. - 20 с.
15. Жебровский JI.C., Митютько В.Е. Использование полиморфных белковых систем // М.: Колос. 1979. -182 с.
16. Журавель Е.В., Глазко В.И. Распределение аллельных и генотипических частот по локусу каппа-казеина у различных пород крупного рогатого скота // Генетика. 1997. - Т. 33. - № 12.
17. Зиновьева Н.А., Васичек Д., Айгнер Б., Попов А.Н., Брем Г. Диагностика различных аллельных вариантов ДНК "single tube" методом аллелеспецифической полимеразной цепной реакции // Биотехнология. -1996.-№6.-С. 45-49.
18. Зиновьева Н.А. Молекулярно-генетические аспекты в решении задач современного животноводства // Автореф. докт. дисс. Дубровицы. -1998а.-36 с.
19. Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Эрнст Л.К., Марзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве // Дубровицы. -1998b.-47 с.
20. Иолчиев Б.С. Эффективность использования быков производителей черно-пестрой породы разного племенного достоинства // Автореф. канд. с.-х. наук. Дубровицы. - 1994. - 24 с.
21. Калашникова JI.A., Дунин И.М., Глазко В.И., Рыжова Н.В., Голубина Е.П. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных // Лесные Поляны.-1999.- 148 с.
22. Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий // Лесные Поляны. 2000. - 31 с.
23. Карликов Д.В., Зыскунова Р.Н. Полиморфизм белков молока черно-пестрого скота при голштинизации // Труды научной конференции ТСХА, 1987.-С. 1064-1079.
24. Кленовицкий П.М., Моисейкина Л.Г., Марзанов Н.С. Цитогенетика сельскохозяйственных животных// Элиста. 1999. - 142 с.
25. Кривенцов Ю.М., Щербакова Г.В. Молочная продуктивность, физико-химический состав и технологическое свойство молока черно-пестрого скота различных генотипов // Вестник с. -х. науки. 1991. С. 100-104.
26. Кугенев П.В. Барабанщиков Н.В. Практикум по молочному делу. М.: Агропромиздат. - 1988. - 223 с.
27. Марзанов Н.С. Физиологические маркеры крови овец и коз: теоретические и прикладные аспекты их применения // Дисс. докт. биол. наук. Дубровицы. - 1994. - 348 с.
28. Маринчук Г.Е. Сопряженность молочной продуктивности крупного рогатого скота с комплексов локусов сцепленного блока казеинов и (3-лактоглобулина // Цитология и генетика. 1992. - Т. 26. - № 5. - С. 48-53.
29. Маркин Ю.В. Физиологическое обоснование методов повышения энергетической и протеиновой обеспеченности лактирующих коров имолодняка крупного рогатого скота // Автореф. дис. докт. биол. наук. -1997.-38 с.
30. Меркурьева Е.К., Шангин-Березовский Г.Н. Генетика с основами биометрии. М.: Колос. - 1983. - 400 с.
31. Меркурьевой Е.К., Абрамова З.В., Бакай А.В., Кочиш И.И. Генетика. -М.: Агропромиздат. 1991. - 444 с.
32. Овчинников А.И., Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. JI. -1974. - 259 с.
33. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Издательство Московского Университета. - 1970. - 366 с.
34. Погоняло Д.И. Наследственный полиморфизм белков молока сельскохозяйственных животных и его практическое значение в селекции: Автореф. дис. канд. с. -х. наук. -Минск. 1975. - 17 с.
35. Сайки Р. Анализ генома // Методы. М. - Мир. - 1990. - 400 с.
36. Сапунов А.Г., Подшибякин А.Е., Чеботарев И.И., Головской И.П. Биологическая полноценность молозива и молока овцематок и жизнеспособность новорожденных ягнят // Ветеринария. 1986. - № 9. -С. 65-66.
37. Сингер М., Берг П. Гены и геномы / В 2-х томах // М.: Мир. 1998.
38. Сипко Т.П., Удина И.Г., Бодагуева Ю.Н., Сулимова Г.Е. Сравнительная характеристика полиморфизма ДНК гена каппа-казеина у крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции // Генетика. -1991.-27.-№ 12.-С. 2053-2062.
39. Сулимова Г.Е., Чайхаев Г.О., Берберов Э.М. Генотипирование локуса каппа-казеина у крупного рогатого скота с помощью ПЦР // Генетика. -1991. Т.27. - № 12. - С. 2053-2062.
40. Сулимова Г.Е., Соколова С.С., Семикозова О.П. и др. Агализ полиморфизма ДНК кластерных генов у крупного рогатого скота: гены казеинов и главного комплекса гистосовместимости (BOLA) // Цитология и генетика. 1992. - Т. 26. - № 5. - С. 18-26.
41. Тепел А. Химия и физика молока. -М.: "Пищевая промышленность". -1979.-624 с.
42. Томме А.А. Генетический полиморфизм |3-Lg и казеинов и возможности его использования в селекции пород крупного рогатого скота в Эстонской ССР// Автореф. дис. канд. с. -х. наук. Тарту. - 1972. - 27 с.
43. Хаертдинов Р.А. Влияние генотипа коров по казеину на количественное содержание молочных белков // Генетика. 1989. - Т. 25. - № 8. - С. 1462-1472.
44. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов. // Методы. Молекулярная клиническая диагностика. -М.: Мир. -1999. С.395-428.
45. Ясуи В., Ито X., Тахара Е. Анализ ДНК в архивных образцах и его применение для изучение патогенеза опухолей. // Методы. Молекулярная клиническая диагностика. М.: Мир. -1999. - С.395-428.
46. Alanpri С., Buttazoni S.G., Scaneiden the effectes of milk componentes and chees-producins abulity // J. Dairy Sc. 1990. - P. 241.
47. Aleksander L.J., Stewart A.F., Mackinlay A.G., Kapelinskaya T.V., Tkach T.M., Gorodetsky S.I. Isolation and characterisation of the bovine kappa-casein gene // Eur. J. Biochem. 1988. - V. 178. - № 2. - P. -.395-401.
48. Aleksander L.J., Hayes G., Bawden W., Stewart A.F., Mackinlay A.G. Complete nucleotide sequence of bovine fMactoglobulin gene // Animal Biotechnology. 1993. -V. 4. - P. 1-10.
49. AH S., Clark A.J. Characterisation of the gene encoding ovine beta-lactoglobulin. Similarity to the genes for retinol binding protein and other secretory proteins // J. Mol. Biol. 1988. - V. 199. - P. 415-426.
50. Archibald A.L., McClenaghan M., Hornsey V., Simons J.P., Clark A.J. High-level expression of biologically active human alpha 1 -antitrypsin in the milk of transgenic mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 5178-5182.
51. Axelsson I., Jacobsson I., Lindberg Т., Benidiktsson B. Bovine B-lactoglobulin in the human milk. A longitudinal study during the whole lactation period // Asts Peadiatr. Scand. 1986. - V. 75. - P. 702-707.
52. Banaszak L., Winter N., Xu Z., Bernlohr D.A., Cowan S., Jones T.A. Lipid-binding proteins: A family of fatty acid and retinoid transport proteins // Adv. Protein Chem. 1994. - V. 45. - P. 89-151.
53. Banyko J., Borze Z. Detection of kappa-casein genotypes in bulls of cattle breeds by restrction fragment length polymorphism (RFLP) // Vet. Med. -1995. V. 40. -No 6.- P. 165-169.
54. Barroso A., Dunner S., Canon J. Technical note: Detection of bovine kappa-kasein variants А, В, C, and E by means of polymerase chain reaction- single strand conformation polymorphism ( PCR-SSCP) // J. Anim, Sci. 1998. - V. 76.-№6. P. 1535-1538.
55. Barroso A., Dunner S., Canon J. A multiplex PCR-SSCP test to genotype bovine beta-casein alleles Al, A2, A3, В and C// Anim. Genet.- 1999. V. 30. - № 4. - P. 322-323.
56. Beckmann J.S., Soller M. Restriction fragment length polymorphisms in genetic improvement: Methodologies mapping and costs // Theor. and Appl. Genet. 1983. - V. 67. - P. 35-43.
57. Bell K., McKenzie H.A., Shaw D.C. Amino acid composition and peptide maps of (3-lactoglobulin variants // Biochim. Biophis. Acta. 1968. - V. 154. - P. 284-294.
58. Bernback S., Hernell O., Blackberg L. Bovine pregastric lipase: a model for the human enzyme with respekt to properties relevant to its site of action // Biohim. Biophys. Acta. 1987. - V. 3. - P. 2303-2308.
59. Blumberg B.S., Tombs M.P. Possible polymorphism of bovine p-lactalbumin // Nature. 1958.-V. 181.-P. 683.
60. Borze Z., Dohy J. Improvement of the quality of milk protein by new biotechnological methods // Hungarian Agricultural Research. 1993. - V. 2. -№ l.-P. 26-29.
61. Bovenhuis H., Van Arendock J.A.M., Korver S. Associations between milk protein polymorphisms and milk productions traits // J. Dairy Sci. 1992. - V. 75.-P. 2549.
62. Braunitzer G., Chen R., Schrank В., Stangl A. Automatische Sequenzanalyse eines Proteins ((3-Lactoglobulin AB) // Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. -1972.-V. 353.-P. 832-834.
63. Braunitzer G., Chen R., Schrank В., Stangl A. Die Sequenzanalyse des p-Lactoglobulins // Hoppe-Seyler s Z. Physiol. Chem. 1973. -V. 354. - P. 876878.
64. Braunschweig M., Stranzinger G., Puhan Z. A PvuII PCR-RFLP test for the bovine J3-lactoglobulin D allele // Animal Genetics. 1999. - V. 30. - P. 76.
65. Cauvin E., Conti A., Liberatori J. Comparative structursl studies on (3-lactoglobulins. The N-terminal seqense of sheep, goat and buffalo (3-lactoglobulins // Milchwiss. 1977. - V. 32. - P. 459-460.
66. Chikuni K., Kageyama S., Koshkawa Т., Kato S. Identification of bovine ae-casein genotypes using polymerase chain reaction metod // J. Zootechn. Sci. -1991.-V. 62.-№7.-654-659.
67. Cowan C.M., Dentine M.R., Colye T. Chromosome substitution effects associated with kappa-casein and beta-lactoglobulin in Holstein cattle // J. Dairy Sci. 1992. - V. 75. - P. 1097.
68. Jeffreys A. et al. // Nature 316. 1985. - P. 76.
69. De Frutos M., Cifuentes A., Amigo L., Ramos M., Diez-Masa J.C.Rapid analysis of whey proteins from different animal species by reversed-phase high-performance liquid chromatography // Lebensmittelunters. und Forsch. -1992.-№ 195.-S. 326-331.
70. De Jong N., Visser S., Oliemann C. Determinatin of milk proteins by capillary electrophoresis // Chromotogr. 1993. -652. - P. 207-213.
71. Denicourt D., Sabour M.P., Mc Alister A.J. Detection of bovine к-casein genomic variants by the polymerase chain reaction method // Anim. Genet. -1990.-V 21.-P. 215-216.
72. Diaz de Villegas M.C., Oria R., Sala F.J., Calvo M. Lipid binding by 6-lactoglobulin of cow milk // Milchwiss. 1987. - V. 42. - P. 357-358.
73. Di Stasio L., Merlin P. Polimorphysmo biochimici del latte nella razza bovina Grigio Alpina // Rivista Zootechia e Veterinaria. 1979. - V. 2. - P. 64-67.
74. Ebner K., Schambacher F.// Lactation (Eds.: LarsonB., Smith V.). -1974. № 2.-P. 77-113.
75. Ehrmann S. Milchproteine: Mit dem Muster auch die Leistung verbessern? // Der Tierzuchter. 1993. - № 3. - S. 44-47.
76. Eigel W.N., Butler J.E, Ernstrom C.A, Farrell Jr. H.M., Harwalkal V.R., Jenness R., Whitney R. Mc.L. Nomenclature of proteins of cow's milk: fifth revision.// J. Dairy Sci., Champaign, III.- 1984. V. 67. - P. 1599-1631.
77. Erhardt G. Kappa-casein in bovine milk. Evidence of a futher allele (kappa-casein E) in different breeds // J. Animal Breeding and Genetics. 1989. - V. 106.-P. 225-231.
78. Erhardt G., Broad Т.Е., Hill D., Pearce P. Present status of the ovine gene map (Ovies aries); comparison with the bovine map (Bos taurus) // Mamm. Genome. 1996. - № 5. -P. 324 -332.
79. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction // Sc. 1989. - P. 1643-1650.
80. Flekna G., Zinovieva N., Mtiller M., Brem G. A teim and cost effective method for kappa-casein genotyping of breeding bulls // Reprod. Dom. Anim. 1997 . -V. 32.-P. 171-173.
81. Flower D.R. The lipocalin protein famely: a role in cell regulation // FEBS Lett. 1994.-V. 354.-P. 7-11.
82. Frank G., Braunitzer G. Milchwissenschaft. -1967. V. 20. - P. 361-365.
83. Fraser D.L., Orskov E.R., Whitelaw E.G., MacLeod N.A. The effeciency of casein n utilization in dairy cows // Livestock Prod. Sci. 1990. - V. 25. - P. 67-78.
84. Freier R., Kletter В., Gery I., Lebenthal E., Geifman M. Intolerance to milk protein // J. Pediatr. 1969. - V. 75. - P. 623-631.
85. Fries R., Ruddle F.H. Gene mapping in domestic animals // Proc. 10th Beltsville Symposium in Agricultural Reserarch. 1986. - V. 10. - P. 19-37.
86. Fugate R.D., Song P.S. Spectroscopic characterization of B-lactoglobulin-retnol complex // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V. 625. - P. 28-42.
87. Gallangher D., Schelling C., Groenen M. et al. Confirmation that the casein gene cluster resides on cattle chromosome 6 // Mamm.Genome. 1994. - V. 5. -P. 524.
88. Geldermann H. Gentechnologie in der Tierzucht, neue Forschungsansatze am Beispiel der Milchprotein-Gene beim Rind // Dt. Tieraryl. W. 1989. - V.96. -S. 52-55.
89. Godovac-Zimmermann J. The structural motif of (3-lactoglobulin and retinol-binding protein: a basis franework for binding and trancport f small hydrophobic molecules? // TIBS. 1988. - V. 13. - P. 64-66.
90. Godovac-Zimmermann J., Krause I., Buchberger J. A novel wild-type (3-lactoglobulin W and its primary sequence // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1990. V. 371. P. 255-260.
91. Gonyon D.S., Mather R.E., Hines H.C., Haenlein G.F.W., Arave C.W., Gaunt S.N. Associations of bovine blood and milk polymorphisms with lactation traits Holsteins // J. Dairy Sci. 1987. -V. 70. - P. 2585-2598.
92. Graml R.J., Buchberger H., Kirchmeier O., Kirchmeier F., Pirchner F. Genfrequenzschatzung bei Milchproteinen des bauyerischen Fleckviehs // Ziichtungskunde. 1984. - V. 56. - S. 73-87.
93. Graml R.J., Buchberger H., Klostermeyer H., Pirchner F. Pleiotrope Wirkungen von (3-Lactoglobulin- und Caseingenotypen auf Milchinhaltsstoffe des bayerischen Fleckviehs und Braunviehs // Z. Tierzuchtg. Ziichtungsbiol. -1985.-V. 102.-S. 355-370.
94. Graml R.J., Buchberger H., Klostermeyer H., Pirchner F. Markerassoziierte und polygene Korrelation zwischen Casein-, Molkeneiweiss- und Fettgehaltund -mengen bei Fleckvieh und Braunvieh // J. Anim. Breed. Genet. 1989. -V. 106.-P. 96-109.
95. Han S.K., Shin Y.C., Byun H.D. Biochemical, molecular and physiological characterisation of a new beta-casein variant detected in Korean cattle // Animal Genetic. 2000. - V. 31. - № 1. - P. 49-51.
96. Hansen H. The advantages of using Brown Swiss bloodlines // The Cow International. 1990. - № 9. - P. 31.
97. Ikonen Т., Ruottinen O., Erhardt G., Ojala M. Allele frequencies of the major milk proteins in the Finnish Ayrshire and detection of a new kappa-casein variant // Anim. Genet. 1996. - № 27. - P. 179-181.
98. Jeness R. Inter-species comparison of milk proteins // Applied Science Publishers. 1982. - London. - P. 87-114.
99. Jersay Journal //Another Jersay breed advantage revealed. 1990. - V. 63. -Desember.
100. Johns W.K., Yu-Lee L.-Y., Clift S.M., Brown T.L., Rosen J.M. The rat casein multigene family. Fine structure and the evolution of the fi-casein gene // Biol. Chem. -1989.
101. Kaminski S. Zastosowanie wynikow badan polimorfismu odcinkow restrycyjnych DNA do okreslenia genotypu kappa-kazeiny u duhajow // Pr. I mater. Zootechn. 1994. - zesz. Spec. 3. - P. 99-101.
102. Kawamoto Y., Naticava Т., Adachi A., et al. A population genetic study on yaks cattle and their hybrids in Nepal using milk protein variants // Animal. Sci. Technol. Japan. - 1992. - V. 63. - № 6. - P. -563-575.
103. Kolde H.J., Braunitzer G. The prymety structure of ovine (3-lactoglobulin. Isolation of the peptides and sequences // Milchwiss. 1983a. - V. 38. - P. 1820.
104. Li H., Chui X., Arnheim N. Direct electrophoretic detection of the allalic state of single DNA molecules in human sperm by using the polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V.87. - P. 4580-4584.
105. Liberatoti J. (3-lactoglobulins. Chemical and structural studies // Folia Vet. Lat. 1977. - V. 7. - P. 205-222.
106. Litwenzuk A. Polymorphism of milk proteins in blak and whit cowes Crosses whit different share of Holstein-Friesian cattle blood // Anim. Sci. Rep. and Repst. -1991. -№ 7. P.37-41.
107. Macha J. Genetika analza kappa-kazeinu v mlece skotu // Zivoc vyroba. -1992. -V. 37. № 8. - C. 645-651.
108. Makinen-Kiljunen S. Detection and characterisation of atopic allergens // Ann.Med. 1994. - V. 26. - P. 283-288.
109. Marziali A.S., Ng-Kwai Hang K.F. Effects of milk composition and genetic polymorphism on coagulation properties of milk // J. Dairy Sci. 1986a. -V.69. -P.l 193-1201.
110. Marziali A.S., Ng-Kwai Hang K.F. Relationship between milk protein polymorphisms and cheese yielding capacity // J. Dairy Sci. 1986b. -V.69. -P. 1793-1798.
111. Mayer H., Foissy H. Phanotypisierung genetischer Milchproteinvarianten bei osterreichischem Braun- und Fleckvieh./ Forschungsprojekt Endbericht.- 1992.
112. Mazhar K., Savva D., Skidmor C.J. Analysis of polymorphisms of the bovine .3-lactoglobulingene by PCR//Anim. Genet. 1992. - V.23. Suppl. 1. - P. 65.
113. Mckenzie H.A., Sawyer W.H. Effect of pH on a-lactoglobulins // Na. 1967. -V.214.-P. 1101-1104.
114. Mclean D.M., Graham E.R.B., Ponzoni R.W., Mckenzie H.A. Effect of milk protein genetic variants and composition on heat stability of milk // J. Dairy Res.-1984a. -V. 51.-P. 219-235.
115. Mclean D.M., Graham E.R.B., Ponzoni R.W., Mckenzie H.A Effect of milk protein genetic variants of milk yield and composition // J. Dairy Res. -1984b. -V. 54.-P. 534-546.
116. Mclean D.M. Influence of milk protein genetic on composition, yield and cheesemaking propepties // Animal Genet. -1987. Suppl. 1. - P. 100-102.
117. Medrano J.F., Aguilar-Gordova E. Genotyping of bovine kappa-casein ioci following DNA sequence amplification // Biotechnology. 1990. - № 8. - P. 144-146.
118. Mehrens H.A., Reimerdes E.H. Definition der milchproteine. In: Lebensmittelchemische Gesellschaft (Hrsg.): Milchproteine. Berg's Verlag. -1991.-Hamburg.-S. 17-27.
119. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16. -№3. P. 1215.
120. Miranda G., Anglade P., Mahe M., Erhardt G. Biochemical characterization of the bovine genetic kappa-casein С and E variants // Anim. Genet. 1993. - № 24. -P27-31.
121. Monaco H.L., Zanotti G., Spadon P., Bolgnesi P., Sawyer L., Eliopoulos E.E. Crystal structure of the trigonal form of bovine betta-lactoglobulin and its complex with retinol at 2,5 A resolution // J. Mol. Biol. 1987. - V. 197. - P. 695-706.
122. Nakamura Y., Leppert M., O'Connell P., Wolff R., Culver M., et al. Sciens.-1987.-V. 235.-P. 1616.
123. Nebola M., Dvorak J., Hradil R., Havillek Z. The distribution of kappa-Cn alleles А, В and E in cattle // Anim/ Genet. 1994. - V. 25. - Suppl. 2. - P. 15.
124. Newstead D.F., Sanderson W.B., Conaghan E.F. Influence of whey proteins, preheat treatment and concentration on the heat stability of milk // Proc. 20th Int. Dairy Congr. 1978. - Vol. E. - P. 252-253.
125. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J.C., Markharm A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) // Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 2503 - 2516.
126. Ng-Kwai Hang K.F., Hayes J.F., Moxley J.E., Monardes H.G. Association of genetic variantsof casein and milk, fet and protein production bei dairy cattle // J. Dairy Sci. Champaign. - 1984. -V. 67. - № 3. - P. 835-840.
127. Ng-Kwai Hang K.F., Hayes J.F., Moxley J.E., Monardes H.G. Relatioship between milk protein polymorphism and major milk constituents in Holsttein-Friesian cow // J. Dairy Sci. 1986. - V. 69. - P. 22.
128. Ng-Kwai Hang K.F., Hayes J.F., Moxley J.E., Monardes H.G. Variation in milk protein concentrations associated with genetic polymorphism and environmental factors // J. Dairy Sci. Champaign. - 1987. - V. 70. - № 3. - P. 563-570.
129. Ng-Kwai Hang K.F. Genetic variants of milk proteins and cheese yield // IDF Seminar Cheese yekd and factors affecting its cjntrol. Cork. - 1993.- P. 160166.
130. Palmer A.H. The preparation of a cystalline globulin from the albumin fraction of cow^s milk // J. Biol. Chem. -1934. V. 104. - P. 359-373.
131. Papiz M.Z., Sawyer L., Eliopoulos E.E., North A.C.T., Findlay J.B.C., Sivaprasadarao R., Jones T.A., Newcomer M.E., Kraulis P.J. The structure of 13-Iactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein // Na. -1986.-V. 324. -P. 383-385.
132. Pearce R.J. Heat stability in concentrated and non-concentrated milk the effect of urea and J3-lactoglobulin levels and the influence of preheating // J. Dairy Res. - 1979. - V. 46. - P. 385-386.
133. Perez M.D., Sanchez L., Aranda P., Ena J.M., Oria R., Calvo M. Effect of 13-lactoglobulin on the activity of pregastric lipase. A possible role for this protein in ruminant milk//Biochim. Blophys. Acta. 1992.-V. 1123. - P. 151-155.
134. Perez M.D., Diaz de Villegas C., Sanchez L., Aranda P., Ena J.M., Oria R., Calvo M. Interaction of fatty acids with B-lactoglobulin and albumin from ruminant milk // J. Biochem. 1989. - V. 106. - P. 1094-1097.
135. Perez M.D., Puyol P., Ena J.M., Calvo M. Comparison of the ability to bind lipids of 13-lactoglobulin and serum albumin of milk from ruminant and non-ruminant species // J. Dairy Res. 1993. - V. 60. - P. 55-63.
136. Pervaiz S., Brew K. Homology of a-lactoglobulin, serum retinol-binding protein and protein HC // Science. 1985. - V. 228. - P. 335-337.
137. Pierce A.E. B-lactoglobulins in the urine of the newborn suckled calf // Na. -1960.-V. 188.-P. 940-941.
138. Pinder S.J., Perry B.N., Skidmore C.J., Savva D. Analysis of polymorphism in the bovine casein genes by use of the polymerase chain reaction // Anim. Genet.-1991.-V. 22. № l.-P. 11-20.
139. Poli M.A, Antonini A.G. Genetic structure of milk proteins in Argentinian Holstein and Argentinian crolecattle // Hereditas. -1991. № 2. - P. 177-182.
140. Puyol P., Perez M.D., Ena J.M., Calvo M. Interaction of bovine 13-lactoglobulin and other bovine and human whey proteins with retinol and fatty acids // Agric. Biol. Chem. 1991. -V. 55. - P. 2515-2520.
141. Reddy I.M., Kella N.K.D., Kinsella J.E. Structural and conformational basis of the resistance of B-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion // J. Agric. Food Chem. 1988. - V. 36. - P. 737-741.
142. Robitaille G. Influence of ae-casein and (3-lactoglobulin genetic variants on the heat stability of milk // J. Dairy Res. 1995. - V. 62. - № 4. - P. 593-600.
143. Ron M., Yoffe O., Ezra E., Medrano., Weller J. Determination of effects of milk protein genotype on production traits of Izraeli Holsteins // J. Dairy Sci. -1994.-V. 77.-P. 1106-1113.
144. Rottmann O., Schlee P. Analyse der Milchproteingene mit PCR/RFLP und PASA // Arch. Tierz., Dummerstorf. 1992. - V. 35. - № 14. S. 65-76.
145. Sabour M.P., Lin C.Y., Keongh A., Mechanda S.M., Lu A.J. Effects of selection practiced on the freuquencies of эг-casein and B-lactoglobulingenotipes in Canadian artificial insemination bulls // J. Dairy Sc. 1993. - V. 76.-№ l.-P. 274-280.
146. Saiki R.K, Scharf S.J, Faloona F, Mullis K.M, Horn G.T, Erlich H.A, Arnheim N. Enzymatic amplification of B-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985. -V. 230.-P. 1350-1354.
147. Saiki R.K, Gelfand D, Staffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplication of with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. - V. 239.-P. 487-491.
148. Sansom C.E, North A.C.T, Sawyer L. Structural analysis and classification of lipocalins and related proteins using a profile-search method // Biochim. Biophys. Acta. -1994. V. 1208. - P. 247-255.
149. Saperstein D.A, Nickerson J.M. Restriction fragment length polymorphism analysis using PCR coupled tomrestriction digest // Bio. Techniques. —1991. — V.10.-P. 488-489.
150. Sawyer L, Kontopidis G. The core lipocalin, bovine beta-lactoglobulin // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Oct. 18. - P. 136-148.
151. Schaar J. Effect of k-casein genetic variants and lactation number on the renneting properties of individual milks // J. Dairy Res. 1984. - V. 51. - P. 97-106.
152. Schaar J, Hansson B, Pettersson H. Effects of genetic variants of kappa-casein and beta-lactoglobulin on cheesmaking // J. Dajri Res.- 1985. V. 52. -P. 429-437.
153. Schlee P, Rottmann O, Buchberger J, Graml R, Aumann J, Binser R, Pirchner F. Die Milchproteingene des Fleckviehbullen "Haxl" und dessen Einfluss auf die Allelfrequenzen // Zuchtungskunde. 1992. - V. 64. - № 5. -S. 312-322.
154. Schlieben S., Erhardt G., Senft B. Genotyping of bovine kappa-casein (kappa CnA, -CnB, -Cnc, -CnE) folloving DNA sequence amplification and direct sequenting of kappa Cn-E PCR product // Anim. Genet. 1991. - V. 22. - P. 333-342.
155. Schmidt D.C., Boht P., Koning P.J. Fractiostion and some properies of ae-Cn variants // Dairy Sci. -1966. V. 49. - P. 776-779.
156. Skidmore C.J., Pinder S.J., Perry B.N., Savva O. Genotyping the эз-casein locus in cattlusing PCR // Proc. 4-the World cong. Genet. 1990;
157. Smith L.M., Fantozzi P., Creveling R.K. Study of tryglicerid-protein interaction using a microemulsion-filtration method // J. Am. Chem. Oil Soc. -1983.-V. 60.-P. 691-714.
158. Sorensen R.U., Moore C. Immunology in the pediatrician's office // Pediatr. Clin. North Am. 1994. - V. 41. - P. 691-714.
159. Spector A.A., Fletcher J.C. Binding of long chain fatty acids to 13-lactoglobulin // Lipids. 1970. - V. 41. - P. 403-411.
160. Tejedor Т./, Alfarriba J., Zarazaga J. Estimacion del efecto de arrastre en loci de proteinas lacteas estudio en genado Holstein-Friesian explotado en Espana // «Arch, zootecn». 1987. - № 135. - P. 121-136.
161. Thompson M.P., Kiddy C.A., Pepper L., Zittle C.A. Casein variants in the milk from individual sows // J. Dairy Sci. 1962. - V. 45. - P. 650.
162. Uhrin P., Chrenek P., Vasivek D., Bauerova M., Bulla J. Genotyping of B-lactoglobulin gene in different breeds of cattle in Slovakia // Zivoc. vyroba. -1995.-V. 40.-№2.-P. 49-52.
163. Vasicek D., Ukrin P., Chtnek P., et al. Genotyping of kappa-casein in different cattle breeds in Slovakia // Zivocisna Vyroba. 1995.- № 6. - V. 40. - P. 241244.
164. Velmala R., Mantysaari E.A., Maki-Tanila A. Molecular genetic polymorflsm at the kappa-casein and beta-lactoglobulin loci in Finnish dairy buls // Agr. Sci. Finl. 1993. - V. 2. - № 5. - P. 431-435.
165. Waugh D.F. Formation and structure of casein micelles // In: Milk proteins chemisrty and molecular biologe (ed.: McKenzie H.A.). Acad. Press. - NY. -1971.-P. 3-85.
166. Wilkins R.J., Kuys Y.M. Rapid fi-lactoglobulin genotyping of cattle using the polymerase chain reaction // Anim. Genet. 1992. - V. 23. - P. 175-178.
167. Wu D.Y., Uggozzoli L., Pal B.K., Wallace R.B. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 2757-2760.
168. Zadworny D., Kuhlein U. The identification of the kappa-casein genotype in the Holstein dairy cattle using the polymerase chain reaction // Theor. and Appl. Genet.- 1990.-V. 80. P. 631-634.
169. Zwierzchowski L. Zastosowanie Metody RFLPdo badan nad polimorfizmem genetycznym kazein u budla // Pr. I mater. Zootechn. 1994. - Zest. Spec. 3. -P. 95-97.
-
Гладырь, Елена Александровна
-
кандидата биологических наук
-
Дубровицы, 2001
-
ВАК 03.00.23
- Молочная продуктивность и технологические свойства молока коров с различными генотипами Каппа-Казеина и бета-лактоглобулина
- Генотипирование чёрно-пёстрого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и BLAD-мутации методами ДНК-технологии
- Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казеина, бета лактоглобулина и мутации BLAD
- Эффективность использования молекулярно-генетических маркеров в селекции коров черно-пестрой породы по молочной продуктивности и устойчивости к маститам
- Тестирование племенного крупного рогатого скота по ДНК-маркерам молочной продуктивности
