Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Динамика распределения и накопления вируса мозаики сои и активность пероксидазы и карбогидраз в различных по устойчивости сортах сои

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Динамика распределения и накопления вируса мозаики сои и активность пероксидазы и карбогидраз в различных по устойчивости сортах сои"

На правах рукописи

АНДРЕЕВА Ирина Валентиновна

ДИНАМИКА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСА МОЗАИКИ СОИ И АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ И КАРБОГИДРАЗ В РАЗЛИЧНЫХ ПО УСТОЙЧИВОСТИ СОРТАХ СОИ

06.01.11 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена в лаборатории физиологии растений Биолого-почвенного института ДВО РАН, Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова, Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН

Научный руководитель кандидат биологических наук

М. Е. Ладыгина

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

А. В. Реунов

кандидат биологических наук 3. Н. Козловская

Ведущая организация Дальневосточный

государственный университет

Защита диссертации состоится 24 декабря 2004 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.005.03 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

Автореферат разослан ноября 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета __ ^ . Недашковская

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одна из ценнейших сельскохозяйственных культур в мире - соя подвержена многим вирусным заболеваниям [Irvin, Schultz, 1981]. Наиболее вредоносным для неё является вирус мозаики сои (ВМС). Снижение урожая при поражении ВМС составляет от 30 до 90 % [Поливанова, 1980; Крылов, 1992]. Ситуация осложняется отсутствием сортов, иммунных к вирусу [Рейфман и др., 1975; Iwai, Wakimoto, 1990].

Общепризнанно, что для разработки мер борьбы с вирозами необходимо изучение взаимоотношений вирусов с растениями. Поэтому актуально всестороннее изучение механизмов взаимодействия вирусов и растений, так как именно при их взаимодействии проявляются такие важнейшие свойства растений, как устойчивость, иммунитет, способность локализовать инфекцию и др. [Реунов, 1999; Малиновский, 2002].

В ответ на внедрение патогенов в растениях происходят различные изменения, в том числе индуцируются так называемые PR-белки ('pathogenesis-related proteins') [Datta, Muthurishnam, 1999], которые в большинстве своем являются ферментами. Установлена физиологическая роль отдельных из них при грибной инфекции. 1—З-З-Р-Э-Глюканаза (PR2), как полисахаридгидролаза способна выщеплять из гиф грибов олигосахарины ( -глюканы), обуславливающие синтез абиотических веществ - фитоалексинов, токсичных для грибов [Albersheim et al., 1992; Озерецковская, Роменская, 1996]. Также 1—>3-ß-D глюканаза при в совместном действии с хитиназой, другим PR-белком, способны полностью гидролизовать клеточные стенки грибов. В то же время в работах на модельной системе ВТМ-табак показано подавление инфекционности вируса табачной мозаики различными олигосахаридами, продуктами ферментативного ( 1—»З-р-О-глюканазой) гидролиза полисахаридов [Елякова и др., 1994; Коваленко 1996; Reunov et al., 1996; Реунов и др., 2000; Коваленко 2001].

Роль другого PR-белка - пероксидазы (PR9) в вирусном патогенезе связывают с синтезом лигнина при образовании некрозов в случае гиперчувствительного ответа растений. Однако нет четкого представления о роли этого полифункционального фермента при вирусном патогенезе [Van Loon, 1997; Chit-tur et al, 1999].

Индуцибельные PR-белки - большей частью кислые белки, секретируют-ся при вирусном патогенезе в межклеточное пространство, апопласт. Полагают, что в первой линии защиты участвуют белки клеточных стенок [Datta, Muthur-

ishnam, 1999]. Кроме того, динамичт с^^^Ц^^щуц^очной стенки и рас-

СИБЛНОТЕКЛ |

тения в целом в стресс-адаптивных реакциях растений обусловлена среди многих реакций и усилением катаболических процессов, осуществляемых гликози-дазами [Bolanos et al., 1984; Munos et al., 1993; Тарчевский, 2000]. Согласно литературным данным, в метаболизме гликоконъюгатов клеточных стенок принимают участие многие олигосахаридгидролазы, например, такие, как -D-глюкозидаза, P-D-галактозидаза и a-D-маннозидаза [Bagaharia, Chanda, 1998].

Большинство работ по изучению белков, связанных с патогенезом при вирусных инфекциях, выполнены на табаке и томатах. Исследования по изучению метаболических процессов сои при вирусном патогенезе в литературе представлены слабо, что объясняется сложностью работы с растениями сои и высокой лабильностью самого вируса [Lim, 1985; Iwai, Wakimoto, 1990; Ward, Sukla, 1991].

Продуктивным подходом при изучении защитных механизмов растений является сравнение особенностей протекания инфекции, направленности биохимических реакций близкородственных растений, по-разному реагирующих на заражение одним и тем же вирусом [Журавлев, 1979; Малиновский, 1998].

Цель и задачи исследований. Целью исследования было изучение особенностей распределения инфекционности и антигена среднепатогенного штамма вируса мозаики сои в растениях сои с различной реакцией на заражение и сравнение ответных реакций сои, выражающихся в изменении активности перокси-дазы, 1—>3-|3-D-глюканазы и трех гликозидаз ( P-D-глюкозидазы, {J-D-галактозидазы и a-D-маннозидазы), как ферментов, участвующих в метаболизме, связанном с защитными процессами растений. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг образцов мировой коллекции дикорастущей сои Glycine Willd и сортов культурной сои Glycine max [L.] (Merrill), дифференциаторов штаммов вируса мозаики сои, а также различных сортов сои с целью подбора растений с одинаковыми фазами развития, но различающихся по устойчивости к ВМС.

2. Изучить распределение инфекционности и антигена среднепатогенного штамма вируса мозаики сои в растениях сои с разной реакцией на заражение.

3. Изучить участие в инфекционном процессе различных по устойчивости сортов пероксидазы и 1—>3-ртО-глюканазы - ферментов, связанных с патогенезом и метаболизмом углеводов и фенольных соединений.

4. Сравнить ответные реакции сортов сои на ВМС выражающихся в изменении активности Р^-глюкозидазы, Р^-галактозидазы, и а^-маннозидазы.

Научная новизна.

Впервые изучено количественное распределение антигена вируса мозаики сои в растениях сои с разной устойчивостью к вирусу методом электрофореза антигена осажденного из сока листьев высокоспецифичной антисывороткой. Выявлено, что антиген вируса может транспортироваться в крайне устойчивых растениях сои сорта Dewamusume, но уровень накопления его очень низок (от 0,02 до 0,23мкг/см2 листа). Установлено, что со временем происходит деструкция антигена. Изучено влияние вируса мозаики сои на активность пероксидазы и ферментов углеводного обмена в листьях крайне устойчивого (Dewamusume) и восприимчивого (Приморская 529) сортов сои в вегетативной стадии роста. Показана, наибольшая метаболическая активность пероксидазы по сравнению с другими ферментами. Впервые показано, что активирование фермента перок-сидазы при вирусном заражении восприимчивого сорта сои обусловлено вкладом кислого (р1 4,0) и щелочного (р1 8,9) изоферментов. Установлено, что крайне устойчивый сорт сои характеризуется более высоким уровнем активности 1-»3-р-Б-глюканазы и отличным от восприимчивого сорта набором изо-форм пероксидазы.

Практическая значимость работы:

Выявленные большая урожайность сорта сои Dewamusume, по сравнению с урожайным сортом-стандартом Приморская 529, обусловленная высокой степенью ветвления и большим количеством бобов в пересчете на одно растение, а так же устойчивость к вирусу мозаики сои, позволяют рекомендовать его для использования в селекционной практике с целью выведения урожайных и устойчивых к ВМС сортов. Сорт Dewamusume можно использовать как дополнительный дифференциатор ВМС, так как первичные листья этого сорта в юве-нильной стадии роста после инфицирования вирусом мозаики сои реагируют образованием единичных локальных некрозов. По результатам распределения инфекционности и антигена ВМС в восприимчивом сорте Приморская 529 рекомендуются оптимальные сроки сбора листьев для выделения вируса. Это критический лист, на котором образуются первые симптомы заболевания, и листья выше формирующихся узлов через 2-3 недели после заражения или через 1-2 недели после проявления симптомов заболевания, вместо 35-40 дней, как было принято ранее [Поливанова, 1975; Пинкевич, 1977; Какарека, 1995]. Реко-

мендуется для определения инфекционности вируса мозаики сои на листьях индикаторного растения фасоли обыкновенной сорта Top Crop использовать первичные листья растения-индикатора до раскрытия 1-го тройчатого листа. Подсчет некрозов проводить после высушивания листьев индикатора в гербарии, при этом некрозы становятся выпуклыми, а артефакты повреждения после механической инокуляции нивелируются, что облегчает подсчет и увеличивает достоверность результатов.

Апробация работы:

Результаты исследований были представлены на конференциях молодых ученых (МГУ, Москва, 1984; ТГУ, Тбилиси, 1985; ИФР, Москва, 1986); VIII Всесоюзном совещании "Теория и практика использования иммунитета с.-х. культур к вирусным болезням" (Вильнюс, 1984); международных конгрессах XIV биохимическом (Praha, Czechoslovakia, 1988) и XVI ботаническом (Missouri, USA, 1999) и 10-й международной конференции вирусологов растений (Praha, Czechoslovakia, 1989); IV съезде ВОФР (С.-Петербург, 1999); региональной конференции к 70-летию ВИР (Владивосток, 1999); Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2000); конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2000); международном симпозиуме "Сознание и наука: взгляд в будущее" (Владивосток, 2001); международной конференции "Bioresourses and viruses" (Kiev, Ukraine, 2001).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 127 страницах, содержит 15 таблиц, иллюстрирована 13 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Список литературы представлен 257 работами, из которых 192 зарубежных авторов.

II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований были: среднепатогенный штамм вируса мозаики сои (ВМС), образцы мировой коллекции дикорастущей сои рода Glycine Willd и многие сорта культурной сои (Glycine max [L.] Merrill), дифференциаторы штаммов вируса мозаики сои, и сорта сои с различной устойчивостью к ВМС

[Поливанова, 1980]. Вирус мозаики сои размножали и накапливали в восприимчивых растениях сои сорта Приморская 529 [Поливанова, 1980]. Вирус табачной мозаики (ВТМ) размножали и накапливали в растениях табака сорта Самсун [Sela, 1981]. Опыты по определению антивирусной активности сока листьев сои проводили на растениях табака Nicotiana tabacum L. сорта Ксанти нк, сверхчувствительных к ВТМ [Малиновский, 1998]. Растения выращивали в почвенной культуре в теплице в весенние-летние периоды года.

Инфекционность ВМС определяли на отделенных листьях фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris) сорта Top crop во влажной камере в термостати-руемом помещении при температуре 31±0.2°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами дневного света (освещенность 3000 лк) [Milbrath, Soong, 1916]. Опыты на отделенных листьях растений табака сорта Ксанти нк проводили аналогично в том же помещении при 25±0,2°С [Малиновский, 1998].

Препараты ВМС получали по методу Hisachi и Wakimoto [1985] с поэтапной обработкой ультразвуком. Препараты ВТМ получали осаждением полиэти-ленгликолем (мМ 6000) с последующими тремя циклами дифференциального центрифугирования [Boedtker, Simmons, 1968]. Концентрацию вирусов а препаратах определяли спектрофотометрически [Irvin, Schultz 1981; Purcifull, Hiebert, 1982]. Гомогенность препаратов контролировали методом электрофореза в в полиакриламидном геле [Laemmli, 1910].

Для электронной микроскопии препараты вирусов контрастировали на подложках 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислотой (рН 6,4) и просматривали в микроскопе ЭВМ-100 Л [Развязкина, 1968].

Количественное определение антигена ВМС в соке листьев сои проводили по методу Сапоцкого с сотр. [Сапоцкий и др., 2001]. Высокоспецифичная антисыворотка к ВМС была любезно представлена Н. Н. Какарека.

Активность карбогидраз и пероксидазы определяли в экстрактах, полученных из листьев каждого узла. Из объединенных листьев соответствующего узла (от 5-6 растений) готовили навески (2 биологические повторности, по 0,51,0 г). Для приготовления растительных экстрактов листья механически гомогенизировали в 0,05 М сукцинатном буфере, рН 5,4 (1:10 вес/объем) при добавлении Dawex 1x8 (0,1 г) для связывания фенольных соединений. Гомогенат осветляли центрифугированием при 10 000 об/мин, 20мин. Супернатант использовали в работе.

Активность пероксидазы определяли по окислению субстрата гваякола в присутствии Н2О2 [Sessa, Anderson, 1981]. Увеличение поглощения продукта реакции тетрогваякола измеряли на Specord UV VIS при длине волны 410 нм.

Изоэлектрофокусирование проводили на приборе Multifor-2117 фирмы LKB (Швеция), используя готовые ПААГ-пластинки с амфолинами, рН 3,5-9,5. Окрашивание изоферментов пероксидазы проводили бензидином в присутствии Н2О2 [Гавриленко и др., 1975]. Сканирование окрашенных полос изоформ пероксидазы в геле проводили на регистрирующем Микрофотометре ИФО-451 (Россия) при длине волны 490нм.

Активность 1-»3-р-0-глюканаз оценивали по нарастанию количества восстанавливающих Сахаров после гидролиза ламинарана бурой водоросли Laminaria cichorioides ( 1—>3-р-0-глюкана) по методу Нельсона [Nelson, 1944].

Активность гликозидаз (P-D-глюкозидазы, p-D-галакгозидазы и a-D-маннозидазы) определяли с р-нитрофенил производными соответствующих сахаров (р-нитрофенил p-D-глюкопиранозидом, р-нитрофенил P-D-галактопира-нозидом, р-нитрофенил a-D-маннопиранозидом). Поглощение высвободившегося р-нитрофенола измеряли при 405 нм [Zvyagintseva et al., 1997].

Фенольные соединения экстрагировали кипящим 80% этиловым спиртом (трижды) [Ferraris et al., 1987]. Количественное определение проводили с реагентом Фолина-Дениса [Запрометов, 1974], используя хлорогеновую кислоту в качестве стандарта.

На рисунках и в таблицах представлены средние арифметические величины, полученные из 2-6 опытов в 2-кратной биологической и 3-кратной аналитической повторностях. Результаты достоверны при критерии значимости Р<0,05.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На основании результатов визуального и иммунологического отбора (на основе реакции сока листьев с антисывороткой) после искусственного заражения вирусом мозаики сои коллекции различных сортов, сортообразцов и видов сои ДВ опытной станции ВИР для работы были отобраны контрастные по устойчивости к ВМС сорта: системно поражаемый сорт сои Приморская 529 (известный как высокоурожайный сорт-стандарт) и устойчивый сорт японской селекции - Dewamusume. Сорта, кроме того, подходили друг к другу по фенотипу и фазам развития. Относительно урожайного, но поражаемого ВМС сорта-стандарта Приморская 529 и скороспелого сорта Ходсон устойчивый сорт Dewamusume охарактеризован как наиболее урожайный.

Изучение накопления и распространения ВМС по растениям сои проводили в вегетативной стадии роста до цветения в течение 3-х и более недель после механической инокуляции первичных листьев ювенильных растений (2-х недельных проростков) с периодичностью в одну неделю, что совпадало с формированием нового узла и тройчатого листа в нем.

Динамика распределения и накопления вируса мозаики сои. После механического заражения первичных листьев восприимчивого сорта достоверно

Таблица 1

Распределение инфекционности ВМС и развитие симптомов в листьях сои Приморская 529 в вегетативной фазе роста.

(число некрозов на1/2листа индикатора)

Узел Листа Дни после инфицирования

1 3 7 10 14 21 28

6 тройчатый лист л.н. л н. л.н. л.н. л.н. л.н. 461+52 Roll, Stu

5 тройчатый лист л.н. л н. л.н. л.н. л.н. л.н. 711 ±76 M, Roll, Stu

4 тройчатый лист л.н. л.н. л.н. л.н. л.н. 435+44 M,Dis 437+40 M, Roll

3 тройчатый лист л.н. лн. л.н. л.н. 677+76 M,Dis 202+16 Dis, Roll 281+40 Roll

2 тройчатый лист л.н. л н. 3±0,6 123+27 М, Vc 302+43 CISp 202+39 CISp н.о. CISp, NVe

1 тройчатый лист 0 0 0 0 0 0 2-4 н.о.

0* первичный лист 0 0 1±0,5 24+10 56+10 CISp 32+13 CISp 63+4 CISp

Условные обозначения: 0* - первичный лист, который инфицировали ВМС; 1-6 узлы -тройчатых листьев, расположенных выше первичного листа (отсчет снизу); 0 - инфекционность ВМС не обнаружили; н.о. - инфекционность ВМС не определяли; л.н. - лист не развит; л.р.с. - лист развит слабо, доли тройчатого листа не больше 1-1,5 см. М- мозаичные симптомы; Vc — посвет-ление жилок; CISp - хлоротичные пятна; NVe - некроз жилок; Dis - деформация листовой пластины; Roll - скручивание листовой пластины; Stu — задержка роста.

значимые количества инфекционных частиц ВМС определяли в первичных ино-кулированных листьях и в тройчатых листьях 2-го узла через 7-10 дней (табл. 1). При выборе этих сроков мы основывались на данных Хунста и Толина [Hunst, Tolin, 1983], которые продемонстрировали появление специфических цилин-дричских, розетковидных включений (pinwheels) и цитоплазматических тяжей в вакуолях клеток инфицированных ВМС листьев сои на 9-10-й дни после заражения. Появление инфекционных частиц вируса в листьях 2-го узла совпадает, по нашим наблюдениям, с образованием мозаичных симптомов, что согласуется с фактом приуроченности мозаичных симптомов к местам усиленного синтеза вирусов [Журавлев, 1979; Matthews, 1981]. Подобная картина распределения вируса сохраняется и через 21 день после заражения: в листьях верхнего узла содержание ВМС выше, чем в ниже расположенных листьях.

Учитывая вариабельность биометода и высокую лабильность ВМС, на основании полученных данных нельзя достоверно судить о количественном распределении ВМС в растениях поражаемого сорта сои. Но, опираясь на данные других авторов и теорию движения ассимилятов в растении, можно интерпретировать полученные результаты таким образом, что в течение раннего вегетационного периода роста сои после латентного периода (7-10 дней) ВМС перемещается по проводящим сосудам флоэмы с током ассимилятов в молодые отрастающие листья, обладающие наивысшей аттрагирующей способностью.

Аналогичную картину распределения 2-х штаммов ВМС в молодых отрастающих листьях сои и высокий уровень инфекционности в них получили и японские исследователи, хотя они проводили заражение более взрослых растений в стадии раскрытия тройчатого листа 3-го узла [Iwai, Wakimoto, 1990]. Наивысшую инфекционность другого потивируса так же определяли в листьях верхнего яруса дурмана (Datura stramonium L.) пораженного разными штаммами Х-вируса картофеля (ХВК) [Андреева и др., 1977].

Устойчивый сорт Dewamusume не реагирует на инфицирование среднепа-тогенным штаммом ВМС. Иногда через 7-10 дней на первичных листьях, которые были механически инокулированы ВМС, образуются единичные ржаво-коричневые ВМС-индуцированные некрозы (не более 1-3). Гомогенат из этих листьев не вызывал образования некрозов на листьях индикаторного растения. Во всех тройчатых листьях формирующихся выше верхних узлов не было выявлено инфекционных частиц ВМС. При стимуляции инфекции ВМС в сое сорта Dewamusume после инфицирования первичных листьев путем переноса растений в камеру с температурой +32°С и последующего (через неделю) тестирования

сока первичных листьев и тройчатых листьев 1-и 2-го узлов на растении-индикаторе не выявлено симптомов ВМС. Передать инфекцию с растений устойчивого сорта путем реинокуляции на восприимчивые сорта сои не удалось. Таким образом, используемый в работе сорт сои Dewamusume обладает крайней устойчивостью к среднепатогенному штамму ВМС. Появление отдельных ржаво-коричневых некрозов на инфицируемых первичных листьях сои этого сорта в ювенильной фазе роста можно использовать как дополнительный тест при диагностике ВМС.

С помощью разработанного М.В.Сапоцким с сотр. [2001] высоко чувствительного количественного метода определения антигена вируса, осажденного из сока листьев высокоспецифичной антисывороткой, установлена аналогичная закономерность распределения ВМС: распространение вируса после латентного периода и медленного ближнего транспорта зависит от аттрагирующей способности развивающегося органа, в данном случае листа формирующегося узла. Действительно при инфицировании первичных листьев у чувствительных растений в стадии развертывания первого тройчатого листа антиген ВМС первоначально обнаруживали в инокулированных листьях и в раскрывающихся листьях 2-го узла. При заражении растений на стадии развертывания 2-го тройчатого листа антиген первоначально регистрировали в первичных листьях, которые инокулировали, и в тройчатом листе 3-го узла. На протяжении 4-х недель не обнаруживали антиген в листе 1-го узла. Определение антигена ВМС в листе 1-го узла через 5 недель эксперимента можно объяснить сменой донорно-акцепторных отношений: завершением вегетативной стадии роста растений сои вверх и переходом в генеративную фазу роста - этапу цветения. Именно в 1-ом узле сои образуются первые цветы и дополнительные боковые ветви [Чуб, Бурцева, 1976; Чайлахян, 1982; БеИг, 1971].

Распределение антигена ВМС в растениях сорта Ходсон, имеющего слабые симптомы, было аналогичным с распределением в растениях восприимчивого сорта Приморская 529, но его обнаруживали в 1-ом тройчатом листе уже на третьей неделе после инокуляции (табл. 2), что, вероятно, объясняется высоким потенциалом роста этого скороспелого сорта и ранним переходом в генеративную стадию. Идентичность распределения и накопления антигена ВМС у сортов Приморская 529 и Ходсон, видимо, свидетельствует о том что, в этих сортах существуют одинаковые условия для репликации вируса, его ближнего и дальнего транспорта. На листьях инфицированных чувствительных растений сильно поражаемого сорта сои Приморская 529 образуются яркие мозаичные симптомы, тогда как на листьях сорта Ходсон симптомы менее выражены.

Таблица 2

Распределение антигена ВМС в листьях растений двух сортов сои, различающихся по поражаемости

(мкг антигена/см2 листовой поверхности)

Сорт Узел Время после инокуляции, недели

листа 1 2 3

Приморская 5 - - 1,40 ± 0,01

529 4 - 1,68 ±0,01 1,83 ±0,02

3 - 2,24 ± 0,03 1,29 ±0,01

2 0,48 ± 0,01 2,63 ±0,04 2,56 ±0,03

1 0 0 0

первичный лист 0,07 ±0,01 1,18 ±0,01 2,17 ±0,03

Ходсон 5 - - 0,63 ±0,01

4 - 2,67 ±0,02 0,48 ±0,01

3 - 1,83 ±0,02 1,04 ±0,02

2 0,06 ±0,01 2,54 ±0,03 1,90 ±0,02

1 0 0 0,97 ±0,01

первичный лист 0,02 ±0,01 0,97 ±0,01 1,95 ±0,02

Условные обозначения: "-" - даный лист отсутствует,

0 - вирусный антиген не обнаружен.

Неожиданным оказался факт обнаружения капсидного белка ВМС в листьях устойчивого сорта Dewamusume, хотя количество его было очень небольшим (от 0,02 до 0,23 мкг на лист), тем не менее, антиген выявлялся на электрофореграммах первичных и тройчатых листьев 2-4 узлов (рис. 1, табл. 3). Наши данные свидетельствуют о том, что антиген ВМС может транспортироваться в крайне устойчивых растениях сои, но уровень накопления его в листьях этих растений очень низок. Со временем, видимо, происходит деструкция антигена, поэтому в более поздние сроки определения вирусный антиген не выявлялся в ранее инфицированных листьях. Считается, что в крайне устойчивых растениях вирусы размножаются в первично инфицированных клетках, но не транспортируются растению [Коваленко, 1983; Arroyo et al., 1996; Hinrichs et

Рис. 1. Электрофореграмма антигена вируса мозаики сои из листьев восприимчивого (Приморская 529) и крайне-устойчивого (Dewamusume) сортов сои через 6 недель после инокуляции.

Столбцы 1-4: листья 6, 5, 4, 3-го узлов восприимчивых растений; 5-контроль (сок здорового растения); столбцы 6-9: листья 6, 5,4,3-го узлов крайне устойчивых растений. Стрелками указано: старт- положение линии старта, ВМС — положение зон структурного белка ВМС.

al.,1995; Hinrichs et al., 1998]. В настоящее время сформулировано три критерия для определения крайней устойчивости растений к вирусам: локализация вируса в местах первичного инфицирования, ограничение вирусной репродукции и отсутствие или очень слабое проявление симптомов заболевания [Barker, 1996; Valkonen, 1994]. Развитие вирусной инфекции в течение длительного времени без образования зрелых вирусных частиц обнаружено для некоторых других комбинаций растение-вирус (пшеница-ВТМ, пшеница-ХВК, картофель-МВК) [Дорохов и др., 1984; Дорохов, 1985; Шмыгля, 1987]. Такой тип инфекционного процесса называют незавершенным. Полагают, что ингибирование (подавление) образования зрелых вирусных частиц обусловлено внутренними защитными механизмами рас гений на нескольких уровнях, одними из которых являются PR-белки и фенольные соединения. [Datta, Muthurishnam, 1999; Дьяков и др., 2001]. Однако, по уровню содержания фенольных соединений в спиртовых экстрактах листьев, мы не выявили статистически значимых отличий между сортами. С развитием мозаичных симптомов содержание фенольных соединений в листьях восприимчивого сорта изменяется незначительно. В то же время в опытах на модельной системе ВТМ-табак установлен больший ингибирую-щий инфекционность ВТМ эффект соком листьев крайне устойчивого сорта сои (92±1), чем восприимчивого (78±4). Выявленная закономерность сохраняется и при десятикратном разведении сока.

Таблица 3

Распределение антигена ВМС в листьях растений чувствительного и крайне устойчивого сортов сои

(мкг антигена/см2 листовой поверхности)

Узел Время после инокуляции, недели

листа 1 2 3 4 5 6

сорт Приморская 529

6 - - - - - 3,89 ±0,03

5 - - - - 2,92 ±0,03 4,03 ±0,05

4 - - 2,49 ± 0,02 1,92 ±0,02 2,92 ±0,03 2,94 ± 0,02

3 - 2,88 ± 0,02 1,88 ±0,01 2,02 ± 0,02 1,72 ±0,01 0,63 + 0,01

2 1.43 ±0.01 2.72 ± 0.02 2.74 ± 0.02 2.60 ± 0.03 1.97 ±0.02 1.97 ±0.02

1 0 0 0 0 0,63 ±0,01 0

Первичный лист 1,29 ±0,01 0,73 ±0,01 0,86 ±0,01 0,63 ±0,01 - -

сорт Dewamusume

6 - - - - - 0

5 - - - - + 0,23 ±0,01

4 - - + 0 0 0

3 - 0 + 0 0 0

2 0 + + 0 0

1 0 0 0 0 0 0

Первичный лист 0 + 0,07+0,01 0 - -

Условные обозначения: " + " - вирусный антиген присутствует в следовых количествах (менее 0.02 мкг/см2), остальные обозначения, как в таблице 2.

Сравнительная характеристика активности ферментов. Исследуемые нами ферменты пероксидаза и 1—>3-р- Б-глюканаза, Являющиеся РЯ-белками, а также три гликозидазы очень различались по уровню проявления активности, а, следовательно, и вкладу в метаболизм сои. Независимо от сорта ферменты могут быть расположены в порядке уменьшения удельной активности следующим

Рис. 2. Активность пероксидазы и карбогидраз в листьях второго узла здоровых (контроль) и инфицированных (ВМС) растений сои сортов Dewamusume (Б) и Приморская 529 (Пр) на 21-й день опыта.

Цифрами указаны единицы активности ферментов в мкМ/мин/г сырого веса ткани

образом: пероксидаза > 1—»3-P-D-глюканаза > a-D-маннозидаза > p-D-галак-тозидаза > P-D-глюкозидаза (рис. 2). Наиболее метаболически активными были пероксидаза и 1-г>3-Р-1)-глюканаза. Можно предположить также, что in vivo активность пероксидазы будет ещё выше, так как для определения активности in vitro в работе использовали синтетический субстарат гваякол с низким сродством к ферменту; аналогичные предположения резонны и для 1—>3-P-D глюканазы. По сравнению с восприимчивым сортом установлен значительно больший (примерно в 2 раза) уровень активности -глюканазы как в

первичных, так и тройчатых листьях любого узла крайне устойчивого сорта сои (рис. 2, табл. 4).

Заражение вирусом устойчивого сорта сои не вызывает достоверных изменений в уровне активности 1—>3-Р-0-глюканазы, в том числе и в первичных листьях, на которых развивались единичные некрозы. Высокий уровень активности фермента в первичных листьях, вероятно, обусловлен ответной реакцией листа на механическую инокуляцию, так как известно об участии 1—>3-P-D

глюканазы в процессах репарации клеточных оболочек при поранении [Leub-ner-Metzger, Meins, 1999].

Напротив, заражение ВМС восприимчивого сорта приводит к резкому возрастанию (в 2 раза) удельной активности 1—>3-Р-0-глюканазы в листе 2-го узла, что совпадает с развитием симптомов первичной мозаики. В этом же листе зафиксировано высокое содержание антигена ВМС и инфекционности (табл. 1, 2). Аналогичная закономерность увеличения активности этой полисахарид-гидролазы в листьях формирующихся выше узлов одновременно с распространением вируса приводят нас к выводу о взаимосвязи роста активности 1-»3-р-D-глюканазы с распространением и накоплением ВМС в листьях системно поражаемого сорта. Рост активности ферментов относящихся к PR-белкам в вос-примчивом сорте сои одновременно с распространением ВМС, возможно, является отражением замедленной ответной реакции пораженного растения, направленной на стабилизацию метаболизма, вследствие вынужденного сосуществования с патогеном.

Высокий исходный уровень активности 1-»3-р-0-глюканазы а листьях сои устойчивого сорта Dewamusume, вероятно, является проявлением одной из составляющих его конституционного иммунитета. По видимому, в этом сорте синтезируются другие, чем в восприимчивом сорте, изоформы глюканазы. Гибриды полученные от скрещивания Nicotiana glutinosa и N. deb-neyi, экспрессирующие конститутивно PR-белки, проявляли высокую устойчивость к ВТМ [Ahl, Gianinazzy, 1982]. Кроме того, трансгенные (по гену 1—>3-Р-D-глюканазы) растения табака, проявляющие высокий уровень активности этого фермента в листьях, обладали устойчивостью к грибной инфекции [Lusso, Kuc, 1996]. Как пишет Риалс с сотрудниками, конституционная экспрессия индивидуальных PR-белков в трансгенных растениях может приводить к уменьшению роста патогенов и снижать интенсивность проявления симптомов, эту же роль выполняют PR белки и при проявлении приобретенной устойчивости [Ryals et al., 1994].

По уровню активности пероксидазы не было установлено различий между сортами. (табл. 4). Активирование полифункционального фермента перокси-дазы в листьях растений сои восприимчивого сорта, происходит также в полном соответствии с распространением антигена и инфекционности ВМС, т.е. одновременно с обнаружением инфекционности и антигена наблюдается и увеличение активности пероксидазы (табл. 1,3,4). После заражения мы не выявили изменения активности фермента в листе 1-го узла, в который вирус не проникает в первые, после заражения, 3-4 недели опыта.

Обнаруженная корреляция между ростом листа и ростом активностей 1—»-Зр-Б-глюканазы и пероксидазы, независимо от сорта, указывает на возрастающую потребность активно фотосинтезирующих листьев сои в этих ферментах. Это согласуется с данными других авторов о роли 1—»ЗР-Б-глюканазы и пероксидазы, как PR-белков, в процессе нормальной жизнедеятельности растений в течение всего онтогенеза [Gaspar et al., 1982; Penel et al., 1992; Hrraova et al., 1995] и, как полагают, обуславливает возрастную устойчивость растений к патогенам [Van Loon, 1999].

Рис. 3. Изоэлектрофореграмма изоферментов пероксидазы листьев сои различных по устойчивости сортов.

1,3- Приморская 529, 2,4 - Dewamusume; 1,2- растворимая фракция фермента, 3,4 - связанная фракция фермента; р1 4,0 - 8,9 значения изоэлектрических точек изоформ пероксидазы.

Сопоставлением спектров изопероксидаз контрастных по устойчивости сортов был выявлен полиморфизм этого фермента (рис. 3). Спектр растворимой фракции пероксидазы листьев сои Приморская 529 представлен 10 изоформа-ми, локализующимися при изоэлектрофокусировании в интервале рН от 4.0 до 8,9, а у Dewamusume обнаружено 9 изоферментов пероксидазы в этом же интервале рН. В листьях устойчивого сорта отсутствовал изофермент с р1 4,6. Этот же изофермент отсутствовал и в спектре изоформ связанной пероксидазы листьев устойчивого сорта. Не было выявлено появления дополнительных изо-форм фермента в ответ на вирусную инфекцию (рис. 4), что характерно для

других комбинаций растение-вирус, например дурман-ХВК [Апёгееуа, 1991], красный клевер-ВМКК (вирус мозаики красного клевера) [Магсшеа, 1970].

Увеличение активности фермента у сои при вирусном патогенезе осуществляется, по-видимому, за счет двух изоферментов: кислого с р1 4.0 и щелочного с р1 8,9 (рис. 4). В соответствии с современными представлениями, в опосредованных вирусом изменениях метаболизма растений принимают участие кислые изоформы пероксидазы, локализующиеся в клеточной стенке и апопла-сте ^айа, МиШикшИпап, 1999]. Доказано участие кислых изопероксидаз в метаболизме фенольных соединений и лигнификации клеточной стенки [Уе е! а1., 1990]. Напротив, щелочные изоформы считают ферментами внутриклеточного

Рис. 4. Изоэлектрофореграмма изоферметов пероксидазы листьев второго узла сои Приморская 529 растворимой (1, 2, 5, 6) и связанной (3,4, 7, 8) фракций через 2 (1-4) и 3 (5-8) недели после инфицирования ВМС (1, 3,5,7 - контрольные; 2,4,6, 8 - инфицированные растения).

матрикса и вакуолей [Репе1 е! а1.,1992]. В то же время электронномикроскопи-ческими исследованиями ультраструктуры клеток пораженного вирусом растения сои показано образование специфических цилиндрических включений и тяжей, пронизывающих вакуоль, и, как полагают, содержащих частицы ингиби-рованного вируса [Ниш!, То1ш, 1983;Rodriguez-Cerezo, 1997]. Прослеживается

Рис. 5 Денситограммы изоэлектрофоретических спектров пероксидазы сортов сои - дифференциаторов ВМС (Tokashinagaha, Shiromane, Harasoy, Ou 13), различных по устойчивости к вирусу (Peking, Nemashirazu, Norin 2, Norin 4, Kariutakiya, Ou 3, Dewamusume, Приморская 494, Приморская 529) и дикорастущей сои (G. ussuriensis).

положительная корреляция между активированием щелочного изофермента сои (р1 8,9) и образованием тяжей. По-видимому, можно предположить непосредственное участие щелочного изофермента пероксидазы в защитных процессах инфицированного ВМС сорта сои, ингибировании частиц вируса.

Изоферментный спектр пероксидазы может быть использован в качестве маркерного признака устойчивости при селекции [Репе1 й а1., 1992]. Выявленный полиморфизм по количеству изоферментов пероксидазы сортов Dewamusume и Приморской 529, казалось бы, давал основание предполагать связь его с устойчивостью. Мы расширили поиск до 13 сортов и дикорастущего вида сои, положительной корреляции полиморфизма пероксидазы с устойчивостью сортов сои к вирусу не было установлено (рис. 5).

Исследуемые три гликозидазы, способные трансформировать метаболиты клеточных стенок листьев сои, проявляли значительно меньший уровень активности по сравнению с пероксидазой и 1—>3-Р-0-глюканазой (рис. 2, табл. 4).

Среди гликозидаз наименьшей активностью обладает Р^-глюкозидаза: от 0,02 до 0,18 мкМ/мин/1г сырого веса ткани. По уровню активности Р^-галактозидаза занимает промежуточное положение среди тестируемых гликозидаз: от 0,02 до 0,40 мкМ/мин/г сырого веса ткани. Эти гликозидазы, согласно литературным данным, могут принимать участие в синтезе лигнина, и есть работы об опосредованном участии их в инфекционном процессе через фитоалек-сины [Машига й а1., 1995]. Наивысшую удельную активность среди гликозидаз имеет а^-маннозидаза: от 0,23 до 0,78 мкМ/мин/1г сырого веса ткани (рис. 2, табл. 4). Можно отметить, что в раскрывающихся тройчатых листьях любого узла удельная активность а^-маннозидазы была сопоставима с удельными активностями 1-»3-Р-В-глюканазы и пероксидазы или даже превосходила их.

Для (З^-глюкозидазы и Р^-галактозидазы наблюдается обратная, в сравнении с -глюканазой и пероксидазой, закономерность изменения

активности с ростом листа (табл. 4). В течение 4-х недель опыта активность этих ферментов в сформированных листьях уменьшается вдвое и больше. Выявленная закономерность изменения активности р^-глюкозидазы и Р^-галактозидазы позволяет предположить, что исследуемые олигосахаридгидро-лазы участвут в процессах роста и развития листьев сои, когда активно идут процессы деления и роста клеток растяжением, синтетические процессы метаболизма с образованием структурных компонентов клеточных стенок - субстратов данных ферментов: пектиновых веществ, гемицеллюлозы, каллозы, гликопротеинов, гликозидов флавоноидов и др. Литический потенциал в растущих тканях растений значительно выше, чем в сформированных, что

Таблица 4

Изменение удельной активности* пероксидазы и гликозидаз листьев 2-го узла различных по устойчивости сортов сои после инфицирования ВМС

Ферменты Время после инокуляции ВМС (дни)

7 14 21 28

сорт Приморская 529

пероксидаза 0,26 ±0,03 0,42 ± 0,05 1,92 ±0,10

0,28 ±0,01 2,01 ±0,19 4,93 ±0,17 -

1-»з-р-о 0,25 ± 0,05 0,35 ± 0,06 0,60 ± 0,07 0,89 ±0,07

глюканаза 0,27 ±0,06 1,51 ±0,08 1,69 ±0,08 1,91 ±0,08

р-Э- 0,12 ±0,02 0,07 ±0,01 0,04 ± 0,01 0,05 ±0,02

глюкозидаза 0,10 ±0,01 0,09 ± 0,02 0,05 ±0,01 0,05 ±0,01

р-э- 0,27 ±0,04 0,16 + 0,03 0,14 ±0,02 0,11 ±0,02

галактозидаза 0,25 ±0,03 0,17 ±0,01 0,13 ±0,03 0,11 ±0,01

а-Б- 0,50 ±0,09 0,38 ±0,08 0,33 ±0,05 0,45 ±0,04

маннозидаза 0,44 ± 0,06 0,30 ±0,08 0,43 ±0,07 0,38 ±0,05

сорт Эе^атиште

пероксидаза 0,29 ±0,01 0,41 ±0,07 1,88 ±0,10

0,31 ±0,01 0,44 ±0,08 1,95 ±0,12 -

0,36 ± 0,05 1,00 ±0,08 1,38 ±0,11 1,56 ±0,05

глюканаза 0,38 ±0,07 1,00 ±0,07 1,45 ±0,09 1,69 ±0,08

р-э- 0,08 ±0,1 0,06 ± 0,01 0,04 ±0,03 0,05 ±0,02

глюкозидаза 0,09 ±0,01 0,07 ±0,01 0,05 ±0,01 0,05 ±0,01

р-э- 0,31 ±0,03 0,17 ±0,03 0,09 ±0,02 0,07 ±0,01

галактозидаза 0,31 ±0,03 0,19 ±0,04 0,10 ±0,03 0,08 ±0,01

а-Б- 0,43 ±0,06 0,39 ± 0,06 0,42 ±0,09 0,45 ±0,05

маннозидаза 0,45 ±0,08 0,35 ± 0,05 0,44 ±0,04 0,44 ±0,07

Условные обозначения: * - удельную активность фермента выражали в мкМ продуктов реакции/ми/г сырого веса ткани, "-" - не определяли; значения удельной активности ферментов листьев здоровых и инфицированных растений представлены в числителе и знаменателе, соответственно.

отражается в высоком уровне активности различных гидролитических ферментов таких как РНКаза, протеаза, кислая фосфатаза [Реунов и др., 1985, Лапшина

и др. 1991]. Повышенный уровень активности Р-Б-глюкозидазы и Р-Б-галактозидазы в раскрывающихся листьях, возможно, также отражает высокий уровень литических процессов в активно делящихся и растущих клетках молодых растений сои.

Относительно высокий уровень активности а-Б-маннозидазы среди тестируемых гликозидаз может указывать на постояннную потребность в этом ферменте клеток и тканей сои независимо от сорта. Согласно литературным данным, гликопротеины, в том числе ферменты клеточных стенок, 1—»З-р-В-глю-каназа и пероксидаза являются маннопротеидами. В регулировании их биологической функции и встраивании в клеточную стенку, возможно, участвует именно а-Б-маннозидаза, уровень активности которой остается постоянным и достаточно высоким в течение опыта (4 недели), в процессе с роста листа.

Активирование катаболических процессов, осуществляемых, в частности, и гликозидазами, присуще многим типам адаптивных реакций растений [Сагрйа й а1., 1996; Заботин и др., 1998; Тарчевский, 2000]. Кроме того, предполагают участие гликозидаз сои в регулировании размера плазмодесм [Сагрйа й а1., 1996], а именно по плазмодесмам осуществляется транспорт вирусных частиц [Matthews, 1981]. Однако нами не выявлено связи между активностью изученных гликозидаз и зараженностью сои ВМС.

Повышение активности пероксидазы и -глюканазы, как белков

связанных с патогенезом и активирующихся в ответ на различные стрессы, вероятно, обусловлено изменением в зараженных вирусной инфекцией тканях метаболизма и структуры клеток восприимчивого растения и направлено на адаптацию больного растения к сосуществованию с внутриклеточным патогеном - вирусом.

Возможно, обнаруженный нами высокий уровень активности глюканазы является одной из составляющих крайней устойчивости сорта сои Dewamusume ко многим патогенам и к ВМС, в частности.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что антиген вируса мозаики сои может транспортироваться в крайне устойчивых растениях сои сорта Dewamusume, но уровень накопления его очень низок (от 0,02 до 0,23мкг/см2 листа). Со временем происходит деструкция антигена.

2. Распространение антигена вируса мозаики сои и накопление инфекцион-ности в листьх чувствительных сортов сои в вегетативной стадии роста происходит после латентного периода (7 и более дней) в соответствии с аттра-гирующей способностью развивающегося органа.

3. Изучено влияние вируса мозаики сои на активность пероксидазы и ферментов углеводног'о обмена листьев сои устойчивого (Dewamusume) и восприимчивого (Приморская 529) сортов в вегетативной стадии роста. Независимо от сорта ферменты могут быть расположены в порядке увеличения удельной активности следующим образом: ß-D-глюкозидаза < ß-D-галак-тозидаза < a-D-маннозидаза < 1->3-р-0-глюканаза < пероксидаза.

4. Увеличение активности 1—»З-Р-Б-глюканазы и пероксидазы в листьях поражаемого сорта происходит в соответствии с распространением и накоплением ВМС.

5. Увеличение активности пероксидазы восприимчивого сорта сои Приморская 529 при инфицировании ВМС обусловлено вкладом кислого (pI 4,0) и щелочного (pI 8,9) изоферментов.

6. Выявленный полиморфизм по изоферментному спектру пероксидаз 13 сортов и дикорастущей сои не дает оснований связывать его с устойчивостью к вирусу.

7. Крайне устойчивый сорт сои Dewamusume характеризуется повышенным (более чем в 2 раза) уровнем активности -глюканазы в листьях по сравнению с восприимчивым сортом Приморская 529.

8. Показано, что первичные листья сои сорта Dewamusume в ювенильной стадии роста реагируют на заражение среднепатогенным штаммом ВМС образованием единичных локальных некрозов (1-3 на лист). Это позволяет использовать данный сорт в качестве дополнительного дифференциатора ВМС.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Андреева И.В. Изучение свойств пероксидазы сои в связи с действием вируса мозаики сои // Молодые ученые и основные направления современной биологии: Тр. 15 науч. конф. молодых ученых МГУ. М: МГУ. 1984. Т. 1. С. 179181.

2. Ладыгина М.Е., Максимова Н.И., Андреева И.В. Микроклональное размножение сои для оздоравливания от ВМС и физиолого-биохимическая диагностика устойчивости // Теория и практика использования иммунитета с.-х. культур к вирусным болезням: Матер. VI11 Всесоюзн. совещ. Вильнюс. 1984. С. 139-141.

3. Рейфман В.Г., Седова Т. С., Андреева И.В. Поражение сои вирусом мозаики сои (ВМС) в Приморье и селекция на устойчивость. Ibidem. С. 145-147.

4. Андреева И.В., Ладыгина М.Е. Изучение свойств пероксидазы сои при действии вируса мозаики сои // Биология клетки: Тр. IV межуниверситетской конф. Тбилиси. 1985. Т. 1. С. 20-22.

5. Андреева И.В. Влияние вирусной инфекции на содержание АТФ и активность пероксидазы сои // Физиология растительной клетки: Тез. 2-й Всесоюзн. конф. молодых ученых. М. 1986. С. 103.

6. Andreeva I.V. The ATP content in resistant and susceptibal soybean cultivar infected by virus // Proceedins of the 14th International Congress of Biochemistry. Prague. 1988. P. 32.

7. Андреева И.В. Проницаемость мембран и активность пероксидазы разных по устойчивости к вирусу мозаики сортов сои // Физиология растений. 1989. Т. 36. Вып. 4. С. 810-817.

8. Andreeva I.V. Effect of soybean mosaic virus (SMV) on the ATP content peroxidase activity and membrane permeability in soybean leaves // Plant Virology. Proceedings of 10th Confer. Praha. 1989. P.49.

9. Ладыгина М.Е., Андреева И.В. Влияние вирусной инфекции на содержание АТФ в устойчивом и неустойчивом сортах сои // С.-х. биология. 1990. № 3. С. 195-198.

10. Андреева И.В. Скрининг сортов сои по их устойчивости к среднепатогенному штамму вируса мозаики сои // Итоги и перспективы использования мировой коллекции ВИРа в развитии с/х производства Дальнего Востока: Матер.

конф., посвященной 70-летию Дальневосточной опытной станции ВИР. Владивосток. 1999. С. 137-139.

11. Andreeva I.V., Sapotsky M.V., Kakareka N.N., Malinovskiy V.I. Detection of soybean mosaic virus in leaves of extremely resistant soybean plants. // Proceedings ofthe XVI International Botanical Congress. Missuri. 1999. P. 890.

12. Сапоцкий М.В., Андреева И.В., Какарека Н.Н., Малиновский В.И. Вирус мозаики сои в растениях восприимчивого и крайне устойчивого сортов сои // Физиология растений: - наука III тысячелетия: Тр. IV Съезда общества физиологов растений России. Санкт-Петербург. 1999. С. 240.

13. Сапоцкий М.В., Романова С.А., Андреева И.В., Малиновский В.И. Являются ли PR-белки маркерами устойчивости растений к вирусам? Ibidem. C.247.

14. Волков Ю.Г., Какарека Н.Н., Андреева И.В., Сапоцкий М.В., Малиновский

B.И. Растения и фитовирусы (современное состояние, перспективы исследований) // Сознание и наука: взгляд в будущее: Матер. междунар. симпозиума. Владивосток. 2000. С. 167-176.

15. Андреева И.В., Моисеенко Л.И. Распределение среднепатогенного штамма вируса мозаики сои в растениях сои с разной устойчивостью // Биологические исследования на Горнотаежной станции ДВО РАН. Владивосток. 2001. Вып. 7. С. 169-179.

16. Андреева И.В., Бурцева Ю.В., Сова В.В., Звягинцева Т.Н., Малиновский В.И. Ферменты углеводного обмена сои различных по устойчивости сортов // Химия и технология растительных веществ: Тез. Всерос. конф. Сыктывкар. 2000.

C. 20.

17. Андреева И.В., Бурцева Ю.В., Малиновский В.И., Звягинцева Т.Н. Изменчивость активности карбогидраз различных по устойчивости сортов сои в процессе инфицирования и роста // Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока: Матер. науч. конф. ТИБОХ ДВО РАН. Владивосток. 2001. С. 5-7.

18. Сапоцкий М.В., Андреева И.В., Какарека Н.Н., Полякова А.И., Малиновский В.И. Распределение антигена мозаики сои в листьях растений сои с различной устойчивостью к вирусному поражению // Bioresourses and viruses: Proceedings ofIII International Conferense. Kiev. Ukraine. 2001. P. 97.

19. Сапоцкий М.В., Андреева И.В., Какарека Н.Н., Полякова А.И., Малиновский В.И. Распределение антигена вируса мозаики сои в листьях молодых расте-

ний сои с разной реакцией на вирусное поражение // Микробиол. ж. 2002. Т.64. № 3. С. 32-38.

20. Andreeva I.V., Yu.V.Burtseva, V.I. Malinovsky, T. N. Zvyagintseva.The effect of soybean mosaic virus on the activity of carbohydrases in leaves of sensitive and resistant soybean plants // Acta Phytopathol. Entomol. Hungarica. 2002. Vol. 34. No. 4. Р. 335-345.

Андреева Ирина Валентиновна

ДИНАМИКА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСА МОЗАИКИ СОИ И АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ И КАРБОГИДРАЗ В РАЗЛИЧНЫХ

ПО УСТОЙЧИВОСТИ СОРТАХ СОИ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1,1 уч.изд.л. Формат 60x8 1/16

Тираж 100 экз. Заказ № /и

Отпечатано в типографии ИПК МГУ им. адм. Г. И. Невельского 690059, г.Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а

»24 237

315

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андреева, Ирина Валентиновна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Фитовирусы и устойчивость растений.

1.1.1 Типы вирусных инфекций растений.

1.1.2 Вирус мозаики сои.

1.2 Метаболизм растений при патогенезе.

1.2.1 Белки растений связанные с патогенезом (PR-белки).

1.2.2 Локализация и свойства PR-белков.

1.2.3 Классификация PR-белков.

1.2.4 Биологические свойства PR-белков.

1.3 Пероксидаза.

1.3.1 Характеристика фермента пероксидазы.

1.3.2 Активность пероксидазы в связи с устойчивостью.

1.3.3 Изоферменты пероксидазы.

1.4 1 -»3-Р-0-Глюканазы растений.

1.4.1 Свойства, специфичность и структура 1->3-р-0-глюканаз.

1.4.2 Биологическая функция 1->3-(3-0-глюканаз.

1.5 Гликозидазы растений.

1.6 Фенольные соединения при патогенезе растений.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы.

2.2 Методы работы с вирусами.

2.2.1 Инфицирование растений вирусами.

2.2.2 Выделение вируса мозаики сои.

2.2.3 Электронная микроскопия.

2.2.4 Выделение вируса табачной мозаики.

2.2.5 Спектрофотометрическая характеристика вирусов.

2.2.6 Электрофорез капсидных белков вируса мозаики сои.

2.2.7 Минигель-электрофорез антигена вируса мозаики сои.

2.2.8 Определение вирус-ингибирующей активности гомогенатов листьев сои.

2.2.9 Определение инфекционности вируса мозаики сои.

2.3 Энзиматические методы исследования.

2.3.1 Приготовление растительных экстрактов.

2.3.2 Определение активности пероксидазы.

2.3.3 Изоэлектрофокусирование пероксидаз.

2.3.4 Идентификация изоферментов пероксидазы.

2.3.5 Определение изоэлектричесих точек изопероксидаз.

2.3.6 Сканирование гелей.

2.3.7 Определение активности 1-»3-[3-0-глюканазы.

2.3.8 Жидкостная хроматография продуктов гидролиза ламина-рана 1->3-Р-0-глюканазой сои.

2.3.9 Определение влияния групп-специфических реагентов и природных эффекторов на 1-»3-р-0-глюканазу сои.

2.3.10 Определение активности гликозидаз (p-D-глюкозидазы, p-D-галактозидазы и a-D-маннозидазы).

2.3.11 Выделение и определение фенольных соединений.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Характеристика вируса мозаики сои.

3.2 Скрининг сортов сои на устойчивость к вирусу мозаики сои и их биологическая характеристика.

3.3 Изучение распределения инфекционности вируса мозаики сои по сортам сои с различной устойчивостью.

3.4 Распределение антигена вируса мозаики сои в сортах сои с различной устойчивостью.

3.5 Изучение вирус-ингибирующей активности экстрактов листьев сои Приморская 529 и Dewamusume.

3.6 Сравнительная характеристика активности ферментов.

3.7 Пероксидаза различных по устойчивости сортов сои.

3.8 Определение изоферментного спектра пероксидаз.

3.9 Сравнение активности 1->3-Р-0-глюканазы сортов сои.

3.10 Влияние ингибиторов на активность 1—>-3-р-В-глюканазы сои.

3.11 Гликозидазы сортов сои.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Динамика распределения и накопления вируса мозаики сои и активность пероксидазы и карбогидраз в различных по устойчивости сортах сои"

Одна из ценнейших сельскохозяйственных культур в мире — соя подвержена многим вирусным заболеваниям [Irvin, Schultz, 1981]. Наиболее вредоносным для неё является вирус мозаики сои (ВМС). Снижение урожая при поражении ВМС составляет от 30 до 90 % [Крылов, 1992]. Главным фактором повсеместного распространения ВМС является передача вируса семенами, с последующим распространением тлями [Дьяконов, 2002]. Ситуация осложняется отсутствием сортов, иммунных к вирусу [Рейфман и сотр., 1975; Iwai, Wakimoto, 1990; Гнутова и др., 1996].

Необходимость изучения взаимоотношений фитовирусов с растениями с целью снижения наносимого этими заболеваниями урона очевидна как с практической, так и теоретической точек зрения, поскольку именно в ходе взаимодействия проявляются такие важные свойства растений как устойчивость, иммунитет, способность локализовать инфекцию и т.д. [Малиновский, 2002; Реунов, 1999].

В растениях одними из первых на внедрение патогенов реагируют PR белки [Van Loon, 1999], которые в большинстве своем являются ферментами. Установлена физиологическая роль отдельных из них при грибной инвазии . 1->3-Р-Б-Глюканаза (PR-2 белок), как полисахаридгидролаза, способна вы-щеплять из гифов грибов олигосахарины (1->3-р-0-глюкоолиго- и полисаха-рины), обуславливающие синтез абиотических веществ - фитоалексинов, токсичных для грибов [Albersheim et al., 1992; Озерецковская, Роменская, 1996]. Также 1 -»3-p-D-глюканаза в совместном действии с хитиназой, друI гим PR-белком, способны полностью гидролизовать клеточные стенки грибов. В работах на модельной системе ВТМ-табак доказано мощное подавление инфекционности ВТМ различными олигосахаридами, продуктами ферментативного (1-»3-р-0-глюканазой) гидролиза полисахаридов [Коваленко 1996; Реунов, и др., 1999]. Роль другого PR белка - пероксидазы (PR-8 белок) при вирусном патогенезе связывают с синтезом лигнина в образовании некрозов при гиперчувствительном ответе растений. В то же время нет четкого представления о роли этих ферментов при вирусных инфекциях растений [Van Loon, 1997; Chittur et al., 1999]. Полагают, что в первой линии защиты растений участвуют белки клеточных стенок [Data, Muthurishnan, 1999]. Динамичность метаболизма клеточной стенки и клетки в целом в стресс-адапивных реакциях растений обусловлена также и усилением ката-болических процессов осуществляемых гликозидазами [Тарчевский, 1993; Тарчевский, 2001; Bolanos et al., 1984; Munos et al., 1993]. Согласно литературным данным, в метаболизме гликоконьюгатов клеточных стенок принимают участие многие олигосахаридгидролазы, например, такие, как p-D-глюкозидаза, p-D-галактозидаза и a-D-маннозидаза [Hori, Elbein, 1983; Sue et al., 2000(a); Sue et al., 2000(b)], их еще называют разрыхлителями клеточных стенок [Bagaharia, Chanda, 1998]. Кроме того, гликозидазы сои участвуют в реакциях синтеза (или процессинга) из изофлавоновых гликозидов фитоалек-синов — антибиотиков растений [Matsuura et al., 1995; Esaki et al., 1999].

Недостаточность знаний о роли индуцибельных белков при вирусной инфекции обусловлена многообразием комбинаций растение-вирус и множеством типов вирусов поражающих растения. Большинство работ по изучению роли PR белков при вирусном патогенезе выполнены на системе ВТМ-табак с гиперчувствительной ответной реакцией, на втором месте стоят томаты. Работы по изучению метаболических процессов сои при вирусном патогенезе в литературе практически отсутствуют, что объясняется сложностью работы с растениями сои и высокой лабильностью самого вируса [Lim, 1985; Iwai, Wakimoto, 1990; Ward, Sukla, 1991].

Одним из подходов при изучении защитных механизмов растений является сравнение особенностей протекания инфицирования и направленности биохимических реакций близкородственных растений, по-разному реагирующих на заражение одним и тем же вирусом [Журавлев, 1979; Малиновский, 1998]. Изучив распространение вируса в растениях с различным типом устойчивостии и изменения метаболизма растений, например, уровень активности ферментов связанных с патогенезом, можно судить не только об эффективности защитных реакций, но и о роли исследуемых ферментов в метаболизме поражаемого и устойчивого растения и, возможно, выявить факторы блокирующие инфекционный процесс. С целью изучения возможных механизмов устойчивости сои, одной из ценных сельскохозяйственных культур к вирусу мозаики и была предпринята данная работа.

Цель настоящей работы — изучение особенностей распределения ин-фекционности и антигена вируса мозаики сои в растениях сои с различной реакцией на заражение и сравнение ответных реакций сои на примере перок-сидазы, 1 ->3-Р-Б-глюканазы и Зх гликозидаз (P-D-глюкозидаза, P-D-галак-тозидаза и a-D-маннозидаза), как ферментов участвующих в метаболизме связанном с защитными процессами растений.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Андреева, Ирина Валентиновна

выводы

1. Показано, что антиген вируса мозаики сои может транспортироваться в крайне устойчивых растениях сои сорта Dewamusume, но уровень накопления его очень низок (от 0,02 до 0,23мкг/см листа). Со временем происходит деструкция антигена.

Распространение антигена вируса мозаики сои и накопление инфекционности в листьх чувствительных сортов сои в вегетативной стадии роста происходит после латентного периода (7 и более дней) в соответствии с аттрагирующей способностью развивающегося органа.

Изучено влияние вируса мозаики сои на активность пероксидазы и ферментов углеводного обмена листьев сои устойчивого (Dewamusume) и восприимчивого (Приморская 529) сортов в вегетативной стадии роста. Независимо от сорта ферменты могут быть расположены в порядке увеличения удельной активности следующим образом: p-D-глюкозидаза < р-D-галактозидаза < a-D-маннозидаза < 1—>3-р-0-глюканаза < пероксидаза.

Увеличение активности 1—>3-P-D-глюканазы и пероксидазы в листьях поражаемого сорта происходит в соответствии с распространением и накоплением ВМС. Увеличение активности пероксидазы восприимчивого сорта сои Приморская 529 при инфицировании ВМС обусловлено вкладом кислого (pi 4,0) и щелочного (pi 8,9) изоферментов. Выявленный полиморфизм по изоферментному спектру пероксидаз 13 сортов и дикорастущей сои не дает оснований связывать его с устойчивостью к вирусу.

7. Крайне устойчивый сорт сои Dewamusume характеризуется повышенным более чем в 2 раза) уровнем активности 1->3-Р-0-глюканазы в листьях по сравнению с восприимчивым сортом Приморская 529.

8. Показано, что первичные листья сои сорта Dewamusume в ювенильной стадии роста реагируют на заражение среднепатогенным штаммом ВМС образованием единичных локальных некрозов (1-3 на лист). Это позволяет использовать данный сорт в качестве дополнительного дифференциатора ВМС.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Андреева, Ирина Валентиновна, Владивосток

1. Александрова Н.М., Дорохов Ю.Л., Атабеков К.И., Атабеков И.Г. Особенности инфекции вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля в устойчивом хозяине (пшенице) // Молекулярная биология. 1985. Т. 19. № 5. С. 1206-1215.

2. Андреева В.А. Пероксидазы растений. М.: Наука. 1988. 128 с.

3. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. Фотосинтез. Дыхание. М.: Высшая школа. 1975.392 с.

4. Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовирусологии. М.: Наука. 1985. 183с. С.65-69.

5. Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. М.: Наука. 1993.301 с.

6. Гнутова Р.В., Волков Ю.Г., Люй Вэньцин. Фитовирусы Дальнего Востока России и Китая // Проблемы вирусологии на Дальнем Востоке. Владивосток: Дальнаука. 1996. С. 5-20.

7. Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.JL, Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология // М.: Общество фитопатологов. 2001. С. 301.i

8. Дьяконов К.П. Итоги изучения насекомых-переносчиков вирусов растений Дальнего Востока России // Становление и развитие фитови-русологии на Дальнем Востоке России. 2002. Владивосток: Дальнаука. С. 155-174.

9. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1982. Том. 2. 806 с.

10. Дмитриев А.П. Сигнальные молекулы растений для активации защитных реакций в ответ на биотический стресс // Физиология растений. 2003. Т. 50. № 4. С. 465-474.

11. Дорохов Ю.Т. Транспорт вирусной инфекции и устойчивость растений к вирусам (обзор) // С.-х. биология. 1985. № 11. С. 30-38.

12. Дорохов Ю.Л., Мирошниченко Н.А., Александрова Н.М. и др. Вирус-специфические информосомы в клетках табака инфицированного ВТМ // Молек. биология. 1984. Т. 18. Вып. 1. С. 88-91.

13. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высшая школа. 1974. 214 с.

14. Запрометов М.Н. Фенольные соединения. М.: Наука. 1993. 110с.

15. Едрева А., Чолакова Н. Некоторые ошибки при определении белковых веществ методом Лоури // Физиология растений. 1975. Т. 22. Вып. 1. С. 204-208.

16. Елякова Л.Г. Регуляция Р-1,3; 1,6-глюканами растительного и животного иммунитетов. Энзиматический синтез новых иммуностимуляторов // Вестник ДВО РАН. 1995. № . С. 74-85.

17. Ермакова С.П. Белки бурых водорослей ингибиторы l-»3-P-D-глюканаз морских моллюсков // Дисс. . канд. биол. наук. Владивосток. 2002. 87 с.

18. Журавлев Ю.Н. Фитовирусы в целом растении и модельных системах. М.: Наука. 1979. 246 с.

19. Заботин А.И., Барышева О.А., Заботина И.А. и др. Вовлеченность мат-рикса клеточной стенки в процессе низкотемпературной адаптации озимой пшеницы // Физиология растений. 1998. Т. 45. № 3. С.425-432.

20. Какарека Н.Н. Сравнительная антигенная характеристика кансидных белков потивирусов (дальневосточные изоляты) и их иммунодиагностика// Дисс. канд. биол. наук. Владивосток. 1995. 137 с.

21. Коваленко А.Г. Природные механизмы ограничения вирусных инфекций у растений и пути их практического использования // Итоги науки и техники. Сер. Защита растений. М.: ВИНИТИ. 1983. Т. 3. С. 91-167.

22. Коваленко О.Г. Молекулярно-бюлопчш аспекта природно1 та шдукованно1 стшкост1 рослин до BipyciB // Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Кшв. 1996. 49 с.

23. Константинова Т.Н., Аксенова Н.П., Сергеева Л.И. Изучение пероксидазы у фотопериодически нейтрального табака в процессе его генеративного развития // Физиология растений. 1982. Т. 29. № 4. С. 639-643.

24. Крылов А.В. Вирусы растений Дальнего Востока. Идентификация, особенности биологии, классификация. М.: Наука. 1992. 110 с.

25. Ксендзова Э.Г. Простой метод экстракции и количественного определения фенольных соединений // Бюллетень ВНИИ защиты растений. М. 1971. №20. С. 55-58.

26. Конарев А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений // С.-х. биология. 1998. № 5. С. 3-25.

27. Ладыгина Е.А., Князев В.А., Липсиц Д.В. Изменение белково-фер-ментного комплекса при заражении растений вирусами Y и X // Иммунитет и покой растений. М.: Наука. 1972. С. 121-141.

28. Лапшина Л.А., Реунов А.В., Полякова A.M., Нагорская В.П. Активность гидролаз и накопление вируса в листьях растений различного возраста // Докл. АН СССР. 1991. Т. 319. С. 1278-1280.

29. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кемпбелл Э. Общая вирусология. М.: Мир. 1981. 680 с.

30. Малиновский В.И., Варфоломеева Л.А., Селецкая Л.Д., Гнутова Р.В. Накопление и транспорт двух штаммов ВТМ (ОМ и 412) в растениях табака// Фитовирусы Дальнего Востока. 1993. Владивосток. С. 58-72.

31. Малиновский В.И. Механизмы устойчивости сверхчувствительных растений табака к вирусу табачной мозаики // Автореф. дисс. . д-ра. биол. наук. Владивосток. 1998. 46 с.

32. Малиновский В.И. Исследование физиологии больного растения на Дальнем Востоке России // Становление и развитие фитовирусологии на Дальнем Востоке России. 2002. Владивосток: Дальнаука. С. 59-79.

33. Минибаева Ф.В., Гордон JI.X. Продукция сунероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе // Физиология растений. 2003. Т. 50. № 4. с. 459-464.

34. Моисеенко Л.И. Изучение физико-химических особенностей потексви-русов, поражающих растения семейств Brassiacae, Comelinaceae и Fa-baceae на Дальнем Востоке // Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Владивосток. 1998. 20 с.

35. Мэтьюз Р. Вирусы растений. М.: Мир. 1973. 600 с.

36. Носов A.M. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro // Физиология растений. 1994. Том. 41. № 5. С. 767-771.

37. Озерецковская О.Л., Роменская И.Г. Олигосахарины как регуляторные молекулы растений // Физиология растений. 1996. Т. 43. № 5. С. 743-752.

38. Орлова М.А., Чубарь Т.А. и др., Газарян И.Г. Конформационные различия реактивной и рекомбинантной форм пероксидазы, вявленные методом тритиевой планеграфии // Биохимия. 2003. Том. 68. № 11. С. 15221529.

39. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука. 1983.304 с.

40. Пинкевич Е.В., Крылов А.В. Выделение и некоторые физиологические свойства вируса мозаики сои // Биологические науки. 1977. № 11. С. 2031.

41. Поливанова Т.А. Вирусные болезни сои // Болезни и вредители сои на юге Дальнего Востока и меры борьбы с ними. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1971. С. 104-144.

42. Поливанова Т.А., Зайцева Н.М., Слепухина Л.П., Степаненко В.И. Вирус мозаики сои и его штаммы // Штаммы вирусов растений. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1977. С. 204-211.

43. Поливанова Т.А. Возбудители вирусных болезней сои // Возбудители болезней сельскохозяйственных растений Дальнего Востока. 1980. С. 51-69.

44. Поливанова Т.А., Крылов А.В. Вирусы идентифицированные на зернобобовых культурах в Приморье // Взаимоотношения вирусов с клетками растения-хозяина. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1985. С. 87-93.

45. Развязкина Г.М., Полякова Т.А., Штейн-Марголина В.А. Упрощенный метод обнаружения в электронном микроскопе частиц из сока больных растений // Вопросы вирусологии. 1968. № 5. С. 633-634.

46. Рейфман В.Г., Поливанова Т.А., Зайцева Н.М. Штаммы вируса мозаики сои и их распространение в СССР // Вирусологические исследования на Дальнем Востоке. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1975. С. 142-145.

47. Реунов А.В., Лапшина Л.А. Локализация кислой фосфатазы в клетках мезофила Datura stramonium системно инфицированных Х-вирусом картофеля // Цитология. 1985. № 66. С. 588-593.

48. Реунов А.В. Цитопатология пораженной вирусами (ВТМ, ХВК) растительной клетки и проблемма устойчивости растений // Автореф. дисс. . д-ра. биол. наук. Киев. 1989. 36 с.

49. Реунов А.В. Вирусный патогенез и защитные механизмы растений. Владивосток.: Дальнаука. 1999. 174 с.

50. Сапоцкий М.В, Какарека Н.Н, Полякова A.M. Простой вариант метода иммунопреципитации для диагностики фитопатогенных вирусов // С.-х. биология. 2001. № 5. С. 113-116.

51. Сергеева Л.И, Умнова A.M., Аксенова Н.П, Константинова Т.Н., Чай-лахян М.Х. Изменение содержания ауксина у фотопериодически нейтрального табака в связи с регуляцией цветения // Докл. АН СССР. 1986. Т. 287. №2. С. 509-512.

52. Сибирякова И.И, Гнутова Р.В, Толкач В.Ф. и др. Биологические свойства местного изолята некроза табака и получение специфических антисывороток// С.-х. биология. 1987. №. 5. С. 55-60.

53. Сова В.В, Звягинцева Т.Н., Светашева Т.Г. и др. Сравнительное изучение особенностей реакции гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых 1,3-Р-глюканазами из различных источников // Биохимия. 1997. Т. 62. N 12. С. 1300-1306.

54. Тарчевский И.А. Элиситор -индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 2. С. 321-331.

55. Тулегенов Т.А. Специфические и неспецифические реакции в механизмах адаптации растительных организмов при потивирусных инфекциях // Автореф. дисс. . д-ра. биол. наук. Алма-ата. 1992. 43 с.

56. Чуб А.И., Бурцева Р.А. Сахара фотосинтезирующих и проводящих тканей у сои // Физиология и биохимия культурных растений. 1976. Т. 8. № 5. С. 519-523.

57. Шерепитько В.В. Межсортовые различия сои по холодоустойчивости в период прорастания семян // С.-х. биология. 1999. №. 5. С. 66-69.

58. Шмыгля В.А. Типы инфекционного процесса вируса табачной мозаики и диагностика зараженности растительного материала// Биол. науки. 1987. № 6. С. 22-28.

59. Элберсхейм П., Дарвилл А.Г. Олигосахарины // В мире науки. 1985. № 11. С. 16-23.

60. Abu-Jawdah J., Kummer J. Effect of aliette on AMV-infection of bean leaves and on the resultant alteration in the patterns of proteins on peroxidase // Phy-topath. Z. 1983. Bd. 108. H 4. S. 294-298.

61. Ahl P., Gianinazzi S. b-Protein as a constitutive component in highly (TMV) resistant interspecific hybrids of Nicotiana glutinosa x Nicotiana debneyi II Plant Sci. Lett. 1982. Vol. 26. P. 173-181.

62. Albersheim P., Darvill A., Augur C., et al. Oligosaccharins Oligosaccaride Regulatory Molecules // Acc. Res. 1992. Vol. 25. P. 77-83.

63. Alexander D., Goodman R.M., Gut-Rella M. et al. Increased tolerance to two oomicete pathogens in transgenic tobacco expressing-related protein la // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. N 90. P. 7327-7331.

64. Ammar E.D., Rodrigues-Cerezo E., Shaw J.G., Pirone T.P. Association of virions and coat proteins of tobacco vein mottling potyvirus with cylindrical inclusions in tobacco cells //Phytopathology. 1994. Vol. 84. N. 5.P. 520-524.

65. Andreeva V.A. Involvement of peroxidase in the protective plant mechanism // Lobarzewski J., Greppin H., Penel C., Gaspar Th. et al. Biochemical, Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases. Univ. Geniva. 1991. P. 433-442.

66. Arroyo., Soto M.J. Martinez-Zapater J.M., Ponz F., Impaird cell-to-cell movement of poteato virus Y in pepper plants earring the ya(pr2!) resistance gene // Mol. Plant Microbe Interact. 1996. Vol. 9. P. 314-318.

67. Atabekov J.G., Dorokhov Y.L. Plant virus-specific transport function and resistance of plants to viruses // Adv. Virus Res. 1984. Vol. 29. P. 313-363.

68. Atabekov J.G., Taliansky M.E. Expression of a plant virus-coded transport function by different viral genomes // Adv. Virus Res. 1990. Vol. 38. P. 201248.

69. Bagatharia S.B., Chanda S.V.: Glycosidases and acid-invertase activities are not correlated with Phaseolus hypocotil growth // Acta Physiol. Plantarum. 1998. Vol. 20. № 4. P. 431-436.

70. Barker H. Inheritance of resistance to potato virus Y and A in progeny obtained from potato cultivars containing gene Ry: evidence for a new gene for extreme resistance to PVA// Theor. Appl. Genet. 1996. Vol. 93. P. 710-716.

71. Beffa R.S., Hofer R.M., Thomas M. and Meins F.Jr. Decreased susceptibility to viral disease of P-l,3-glucanase deficient plants generated by antisense transformation//Plant Cell. 1996. Vol. 8. № 6. P. 1001-1011.

72. Beffa M., Meins F., Jr. Pathogenesis-related functions of plant beta-1,3-glucanase investigated by antisense transformation // Gene. 1996. Vol. 179. № i.p. 97-103.

73. Boedtker H., Simmons N.S. The preparation and charcterization of essentially uniform tobacco mosaic virus particles // J. Amer. Chem. Soc. 1958. Vol. 80. N 10. P. 2550-2556.

74. Bol J.F., Buchel A.S., Knoester M., Baladin L.C. et al. Regulation of the expression of plant defence genes // Plant Growth Regulation. 1996. Vol. 18. N 1-2. P. 87-91.

75. Bolanos J.A., Longstreth D.J. Salinity effect on watter potential components and bulk elastic modulus of Alternanthera philoxeroidesr (Mast.) Griseb // Plant. Physiol. 1984. Vol. 75. P. 281-284.

76. Bos L. Soybean Mosaic Virus // Description. 1972. N 93. 12 p.

77. Brederode F., Linthorst H., Bol J. Differential induction of acquired resistance and PR gene expression in tobacco by virus infection, ethefon treatment, UV light and wounding//Plant Mol. Biol. 1997. Vol. 17. P. 1117-11121.

78. Broekart W.F., Terras F.R.G. Cammue B.P.A. et al. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system // Plant Physiology. 1995. Vol. 108. P. 1353-1358.

79. Bucciaglia P. A., Smith A.G. Cloning and characterization of Tag I, a tobacco anther (3-1,3-glucanase expressed during tetrad dissolution // Plant Mol. Biol., 1994. Vol. 24. P. 903-910.

80. Carpita N.C., McCann M., Griffing L.R. The plant extracellular matrix: News form the cell's frotier // Plant Cell. 1996. N 8. P. 1451-1463.

81. Carrao-Panizzi M.C., Bordingnon J.R. Activity of beta-glucosidase and levels of isoflavone glucosides in soybean cultivars affected by the environment // Pesquisa Agropecuaria Brasileira. 2000. Vol. 35. N 5. P. 873-878.

82. Chen P., Buss G.R., Tolin S. A. Inheritance of reaction to streins G5 and Ge of soybean mosaic virus (SMV) in differential soybean cultivars // Soybean Genetics Newsletter. 1988(a). Vol. 15. N4. P. 130-134.

83. Chen P., Buss G.R., Roane C.W. and Tolin S.A. Genetics of reaction to type strain (Gi) of soybean mosaic virus (SMV) in six differental soybean cultivars // Soybean Genetics Newsletter. 1988(b). Vol. 15. N 4. P 135-139.

84. Cheong Y.H., Kim C.Y., Chun H.J., Moon B.C., et al. Molecular cloning of class III P-l,3-glucanase gene that is regulated both developmentally and in infection // Plant Sci. 2000. N 154. P.71-81.

85. Cheyet-Marel J.C., Rome S., Salducci A., Wery J. Host-specific regulation of nodulation mediated by flavonoid compounds present in plant // Acta Botan. Gallica. 1996. Vol. 143. N 6. P. 521-529.

86. Cho E.K., Goodman. Strain of soybean mosaic virus: Classification based on virulence in reistant cultivars // Phytopathology. 1979. Vol. 69. P. 467-470.

87. Daniel O., Schletter M.S., Frisahknecht J.P. Selected phenolic compounds in cultivated plants: Ecologic functions, health implications, and modulation by pesticides // Environ. Health. Perspect. 1999. Vol. 107. N 1. P. 109-114.

88. Datta S.K., Muthurishnam S. Pathogenesis-related proteins in plants // CRC Press Boca Raton. London. New York, Washington D. C. 1999. 572 p.

89. Dixon R.A., Harrison M.J. Activation, structure, and organization of genes involved in microbial defense in plant // Adv. Genetics. 1990. Vol. 28. N 1. 165-171.

90. Dong J.Z., Dunstsn D.I. Endochitinase and p-l,3-glucanase genes are devel-opmentally regulated during somatic embriogenrsis in Picea glauca I I Planta. 1997. Vol. 201. P. 189-193.

91. Dopico В., Nicolas G., Labrador E. Cell Wall localisation of the natural substrate of a p-galactosidase, the main enzyme responsible for the autolitic process of Cicer arientinum epicotil cell walls // Phisiol Plant. 1990. N 80. P. 636-641.

92. Doucet J.P., Murphy B.J., Tuana D.S. Modification of discontinuous and hy-gly porous sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel system for minigel electroforesis// Annal. Biochem. 1990. Vol. 190. N 1. P. 209-214.

93. Edreva A.M. Induction of "pathogenesis-related" proteins in tabacca leaves by physiological (non-pathogenic) disorders // J. Exp. Bot. 1990. Vol. 41. P.701-707.

94. Ernst D., Schraudner M., Langebartels C., Sandermann Jr.H. Ozone induced changes of MRNA levels of P-l,3-glucanase and "pathogenesis-related" protein lb in tobacco plants // Plant. Mol. Biol. 1992. Vol. 20. P. 673-682.

95. Edwards M., Bowman Y.J.L., Dea I.S.M., Reid J.S. P-Galactosidase from nasturtium {Tropaeolum majus L.) cotiledons. Purification, properties and demonstration that xyloglucan is natural substrate // J. Biol. Chem. 1988. N 263. P. 4333-4337.

96. Edwardson J.R., Christe R.G. Cylindrical inclussions // Monogrraph. Series. Florida Agricultural Experiment Station. 1996.

97. Ernst D., Bodemann A., Schraudner M. et al. P-1,3-Glucanase mRNA is locally, but not systemically induced in Nicotiana tabacum L. cv. BEL W3 after ozone fumigation // J. Plant Physiol. 1996. Vol. 148. P. 215-218.

98. Espelie K.E., Franceschi V.R., Kolattudy P.E. Immunocytochemical localization and time course of appearance of an anionic peroxidase associated with suberization in wound-healing potato tuber tissue // Plant. Physiol. 1986. Vol. 87. 487-471.

99. Eyal Y. and Fluhr R. Cellular and molecular biology of pathogenesis related proteins // Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology. 1991. Vol. 7. P. 223-254.

100. Fehr W.R., Caviness C.E., Pennington J.S. Stage of development descriptions for soybeans Glycine max. L. Merrill I I Crop. Sci. 1971. Vol. 11. P. 929-931.

101. Ferraris L., Abbatista-Gentile I., Matta A. // Variations of Phenolic Concentration as a Consequence of Stress that Induce Resistance to Fusariun Wilt of Tomato //J. Plant. Dis. Protect. 1987. V.94. P. 624-629.

102. Francki R.I.B., Milne R.G., Hatta T. Atlas of Plant Viruses // Boca Ration: CRC Press. 1985. Vol. I and II.

103. Fraser R.S.S. Are 'pathogenesis-related' proteins involved in acquired systemic resistance of tobacco plants to tobacco mosaic virus? // J. Gen.l Virol. 1982. Vol. 58. P. 305-313.

104. Gaspar Т., Penel C,Thorpe T, Greppin H. Peroxidases: A survey of their biochemical and phisiological roles in higer plants // University of Geneva Press, Geneva. 1982. 324 p.

105. Gera T, Tolin A. Tracing soybean mosaic virus movement by immunoassay of leaf imprints // Phytopatology. 1994. Vol. 84. N 5. P. 240.

106. Gianinazzi S, Ahl P. The genetic and molecular basis of b-proteins in the genus Nicotiana // Neth. J. Plant Pathol.л 1983.Vol. 89. P. 275-281.

107. Greyer RJ, Kokubun T. Plant-fungal interactions: the search for phytoalexins and other antifungal compounds from higher plants // Phytochemistry. 2001. Vol. 56. N3. P. 253-263.

108. Heino P, Sandaman G, Land V. et al. Abscisic acid deficiency prevents development of freezing tolerance in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., И Theor. Appl. Genet. 1990. N 79. P. 801-806.

109. Helleboid S, Bauw G, Belingheri L. et al. Extracellular P-l-3-glucanases are induced early somatic embryogenesis in Cichorium II Planta. 1998. Vol. 205. P. 56-58.

110. Hill J.H, Benner H.I. Properties of soybean mosaic virus and its isolated protein // Phytopathol. Z. 1980. Vol. 97. P. 272-281.

111. Hincha D.K, Meins F, Schmitt J.M. 1,3-P-D-Glucanase is cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during cold accumulation // Plant Physiol. 1997. Vol. 114. P. 1077-1081.

112. Hinrichs J., Berger S., Bushenauer H. Extreme resistance to potato virus Y based on the Ry-gen is not expressed in potato protoplasts // Z. Pflanzenk-rankheiten u. Pflanzenschutz. 1995. Bd. 102. S. 243-248.

113. Hinrichs J., Berger S., Shaw J.G. A hypersensitive response-like mechanism is involved in resistance of potato plants bearing the Ryst0 gene to the potyvi-ruses potato virus Y and tobacco etch virus // J. Gen. Virol. 1998. Vol. 79. №1.P. 167-176.

114. Hollings M., Brant A.A. Potivirus group // CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. 1981(a). № 245. 4 p.

115. Hollings M., Brant A.A. Poxviruses. In Handbook of Plant Virus Infections: Comparative Diagnosis // Edited by E.Kurstak. Amsterdam: Elsevier / Norh-Holland. 1981(b). P. 731-807.

116. Hori H., Elbein A.D. Processing of N-linked oligosaccarides in soybean cultured cell // Arch. Biochem. Biophys. 1983. Vol. 220. N 2. P. 415-425.

117. Hunst P., Tolin S. Ultrastructural citology of soybean infected with mild and severe strains of soybean mosaic virus // Phytopathology. 1983. Vol. 73. N 4. P. 615-619.

118. Hull R. The pathogenesis of cauliflower mosaic virus // Genetics and Plant Patogenesis, edP.R. Day, G.J. Jellis. 1986. P. 25-32.

119. Iglesias V.A., Meins F.Jr. Movement of plant viruses is delayed in a beta-1,3-glucanase deficient mutant showing showing a reduced plasmodesmatal size exclusion limit and enchanced callose deposition // Planta J. 2000. Vol. 21. N2. P. 157-166.

120. Irvin M.E., Schultz G.A. Soybean mosaic virus // FAO Plant protection Bulletin. 1981. Vol. 29. N3/4. 6 p.

121. Iserbands J., Larson P.R. Anatomic changes during leaf ontogeny in Populus detoides//Amer. J. Bot. 1973. Vol. 60. P. 199-208.

122. Ishikawa M., Matsumoto S., Nagasawa T. et al. A new soybean variety "Dewamusume"//Bull. Thoku Stl. Agric. Exp. Sth. 1979. Vol. 59. P. 71-86.

123. Iwai H., Ito Т., Sato K., Wakimoto S. Distribution patterns of soybean mosaic virus strains В and D in soybean seeds at different growth stages // Ann. Phy-topath. Soc. Japan. 1985. Vol. 51, N 4. P. 475-481.

124. Iwai H., Wakimoto S. An improved method for purification of soybean mosaic virus // Ann. Phytopath. Soc. Japan. 1985. Vol. 51. N 4. P. 465-475.

125. Iwai H., Wakimoto S. 1990: Multiplication, translocation and inactivation patters of soybean mosaic virus В and D in soybean plants // Ann. Phytopath. Soc. Japan. 1990. Vol. 56. N 2. P. 177-184.

126. Jongedij K., Tigelaar H., Van Roekel J.S.C. et al. Sinergistic activity of chiti-nases and 1,3-P-glucanases and enchances fungal resistance in transgenic tomato plants // Eufitica. 1995. N 85. P. 173-180.

127. Kassanis В., Gianinazzi S. and White R.F. A possible explanation of the resistance of virus-infected tobacco to second infection // J. Gen. Virol. 1974. N 23. P. 11-16.

128. Kassanis В., White R.F. Effect of poliacrilic acid and b proteins on TMV multiplication in tobacco protoplasts // Phytopath. Z. 1978. Bd. 91. H. 4. S. 269-291.

129. Kauffmann S., Legrand M., Geoffroy P. and Fritig B. Biological function of "pathogenesis-related" proteins of tobacco have 1,3-glucanase activity // EMBO J. 1987. N 6. P. 3209-3212.

130. Kawalleck P., Schelzer E., Hahlbrock K., et al. Two pathogen-responsive genes in parsley encode a tyrosine-rich hydroxyproline-rich glycoprotein

131. HPRG) and an anionc peroxidase // Mol. Gen. Genet. 1995. Vol. 247. P. 444449.

132. Kearney C.M., Wu J.H. P-l,3-glucanase and the spread of tobacco mosaic virus in Nicotiana and Phaseolus II Can. J. Bot. 1984. Vol. 62. N 10. P. 19841988.

133. Kennedy M.J., Niblank T.L., Kriahman H.B. Infection by Heterodera glycines elevates isoflavonoid prodaction and influences soybean nodulation // J. Nematol. 1999. Vol. 31. N3. P. 341-347.

134. Kerby K., Somerville S.C. Purification of an infection-related, extracellular peroxidase from barley // Plant Physiol. 1992. Vol. 100. P. 397-402.

135. Kessmann H., Staub Т., Ligon J. et al. Activation of systemic acquired disease resistance in plants // Eur. J. Plant Pathol. 1994. Vol. 100. P. 359-369.

136. King G.J., Hussey C.E., Turner V.A. A protein induced by NaCL in suspension cultures of Nicotiana tabacum accumulates in whole plant roots // Plant Mol., Biol. 1986. Vol.7. P. 441-449.

137. Kim Y.J., Hwang D.K. Isolation of basic 34 kDa beta-1,3-glucanase with inhibitory activity against Phytophthora capsici from pepper stems // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1997. Vol. 50. N 2. P. 103-115.

138. Konno H., Katoh K. An extracellular P-galactosidase secreted from cell suspension culture of carrot. Its purification and involvement in cell wall polysaccharide hydrolysis // Physiol. Plant. 1992. N 85. P. 507-514.

139. Kopp M., Rouster J., Fritig В., Darvill A., Albersheim P. Host-pathogen interactions XXXII. A fungal glucan preparation protects Nicotiana against infection by viruses // Plant Physiol. 1989. Vol. 90. N 1. P. 208-216.

140. Krabel D., Eschrich W., Wolf G. Callose-(l,3-p-D-glucanase) activity during spring reactivation in deciduous trees // Plant Sci. 1993. Vol. 93. P. 19-21.

141. Kristensen В. K., Brandt J., Bojsen K., Thordal-Christensen H., et al. Expression of a defense-related intercellular barley peroxidase in transgenic tobacco //Plant Sci. 1997. Vol. 122. P. 173-177.

142. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly the head of bacteriophage T 4 //Nature. 1970. V. 227. N 5259. P. 680-685.

143. Lasarowitz S.G., Beachy R. N. Viral movement proteins as probes for intracellular and intercellular trafficking in plants // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 535-548.

144. Lawton K., Uknes S. et al. The molecular biology of systemic acquired resistance // In: Fritig B. and Legrand M.(eds) Mechanisms of Plant Defense Responses. 1993. P. 422-432.

145. Leubner-Metzger G., Frundt C., Vogeli-Lange R. et al Class I p-1,3-Glucanases in the Endosperm of Tobacco during Germination // Plant Physiol. 1995. Vol. 109. P. 751-759.

146. Lim S.M. Resistance to soybean mosaic vims in soybeans // Phytopatology. 1985. Vol. 75. N. 2. P. 199-201.

147. Linthost H.J.M. Pathogenesis-related proteins of plants // Crit. Rev. Plant Sci. 1991. N 10. P. 123-150.

148. Liu D., Raghothama K.G., Hasegawa P.M. and Bressan R.A. Osmotin over-expression in potato delays delays of disease symptoms // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. N91. P. 1888-1892.

149. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Fatt A.U., Randall R.I. Protein measurement the Folin-phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. N 1. P. 265.

150. Lusso M., Kuc J. The effect of sense and antisense expression of the PR-N gene for beta-l,3-glucanase on disease on disease resistance of tobacco to fungi and viruses // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1996. Vol. 49. N 4. P. 267283.

151. Marcinka К. Chages in peroxidase isosymes in bean leaves following infection with red clever mottles virus // Biologia. 1970. Vol. 25. N 9. P. 599-602.

152. Matsuura M, Sasaki J, Murao S. Studies on P-glucosidases from soybeansthat hydrolyze daidzin and genestin: isolation and characteriszation of an isozyme // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. Vol. 59. N 9. P. 1623-1617.

153. Matthews R.I.F. Plant Virology. Third edithion // Academic Press, San Diego. 1981. 897 p.

154. Matthews R.I.F. Classification and nomenclature of viruses: Third report of the Internternational Committee on Taxony of Viruses. Intervirology. 1982. V. 17. N 1-3. 179 p.

155. Mauch F. and Staehelin L.A. Functional implications of the subcellular localization of ethylene-induced chitinase and 1,3-glucanase in bean leaves // Plant Cell. 1989. N 1. P. 447-457.

156. Mauiy Y, Bossennec J.M., Boudazin G. and Duby C. The potential of ELISA in testing soybean seed for soybean mosaic virus // Seed Sci. Technol. 1983. Vol. 11.N3. P. 491-503.

157. Maury Y, Duby C, Bossennec J.M, and Boudazin G. Group analisis using ELISA: determination of the level of transmission of Soybean Mosaic Virusin soybean seed//Agronomic. 1985. Vol. 5. N 5. P. 405-415.

158. Mega T, Matsushima Y. Affinity chromatography of glucosidases // Planta. 1976. Vol. 79. N 1. P. 185-94.

159. Meikle P.J, Boning I, Hoogenraad N.J. et al. The location of (l-3)-P-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata a (l-3)-P-glucan-specific monoclanal antibody // Planta. 1991. Vol. 185. N 1. P. 1-4.

160. Milbrath G.M, Soong Meei-Meei. A local lession assay for soybean mosaic virus using Phaseolus vulgaris L. cv. Top crop // Phytopath. Z. 1976. Bd. 87. P. 255-259.

161. Mohamed M.A, Lerryo K.A., Prestwic G.D. Poly aery 1 amide gel miniaturization improves protein visualization and autoradiographic detection // Anal. Biohem. 1989. Vol. 177. N 2. P. 209-211.

162. Mohaparta S.S. Poole R.J. and Dhindsa R.S. Abscisic acid regulated gene expression in relation to freezing tolerance in alfalfa // Plant Physiology. 1988. N. 87. P. 468-473.

163. Morris P.F., Bone E., Tyler B.M. Chemotropic and contact responses of Phy-tophthora sojae hyphae to soybean isoflavanoids and artificial substrates // Plant Physiology. Vol. 117. N 4. P. 1171-1178.

164. Muniruzzaman S., Pan Y.T., Zeng Y., Atkins В., Izumori K., Elbein A.D. Ingibition of glycoprotein processing by L-fructose and L-xylulose // Glyco-biology. 1996. Vol. 6. N 8. P. 795-803.

165. Munoz F.J., Labrador E., Dopico B. Effect of osmotic stress on the growth of epicotils of Cicer arientum in relation to changes in the autolitic process and glycanhydrolic cell wall enzymes // Physiol. Plant. 1993. Vol. 87. P. 544-551.

166. Murphy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L. et al. The classification and nomenclature of viruses // Virus Taxonomy. VI Report of International Com-mitee on Taxonomy of Viruses. Wien N.Y. Springer Verlag. 1995. 586 p.

167. Nelson N.A. Photometric adaptation of Somogy method for the determination of glucose. J. //Biol. Chem. 1944. Vol. 453. P. 375-381.

168. Neuhaus J.M., Ahl-Goy P., Flores S. and Meins F.J. High-level expression of a tobacco chitinase gene in Nicotiana sylvestris: susceptibility of transgenic plants to Cercospora nicotianae infection. // Plant Mol. Biol. 1991. N 16. P. 141-151.

169. Okinaka Y., Mimori K., Takeo S., et al.,Yoshikawa,M. A structural model for the mechanisms of elicitor release from fungal cell walls by plant P-1,3-endoglucanase//Plant Physiol. 1995. Vol. 109. P. 839-845.

170. Omar R.A., Mehiar F.F., Zayed E.A., Deif A.A. Biological studies on some seed-borne viruses and their effect on vegetative grouwth and yield component of the host plants // Acta Phytopathol. Acad. Sci. Hung. 1985. Vol. 20. N 1-2. P. 59-78.

171. Ouchterlony O. Antigen antibody reaction in gels // Acta Pathol. Microbiol. 1948-1949. Vol. 25. P. 186-207.

172. Penel C., Gaspar Th., Greppin H., et al. Plant Peroxidases 1980-1990, Topics and Detalied Literature on Molecular, Biochemical, and Physiological Aspects. Univ. Geneva. 1992. P. 295.

173. Pennazio S., Redolfi P., Sapetti C. Callose Formation and permeability changes during the party localised reaction of Gomphrena globosa to potato virus X//Phytopathol. Z. 1981. Bd. 100. H. 2. S. 172-181.

174. Ponstein A.S., Bres-Vloemans S.A., Sela-Buurlage M.B. et al. A novel pathogen- and would-inducible tobacco (Nicotiana tabacum) protein with antifungal activity // Plant Physiol. 1994. N 104. P 109-118.

175. Pressey R. p-Galactosidase in ripening tomatoes // Plant Phisiol. 1983. N 71. P. 132-135.

176. Purcifull D., Hiebert E. Tobacco etch virus // CMI/ABB, Description of Plant Viruses. 1982. N258. 4 p.

177. Ralph J., McKay J.J., Hatfield R.D., et al. Abnormal lignin in a loblolly pine mutant // Science. 1997. Vol. 277. P. 235-239.

178. Rask L., Anderson В., Ekbom В., Eriksson S., et al. Mirosinase: gene family evolution and herbivore defense in Brassicaceae II Plant molecular biology. 2000. Vol. 42. N 1. P. 93-113.

179. Reichmann J.L., Lains S., Garcia J.A. Highlights and prospects of potyvirus molecular biology II J. Gen. Virol. 1992. Vol. 73. P. 1-16.

180. Reunov A.V., Lapshina L.A., Nagorskaya V.P., Elakova L.A. Effect of l,3;l,6-(3-glucan on infection of detached tobacco leaves with tobacco mosaic virus // J. Phytopathol. 1996. Vol. 144. N 1. P. 247-249.

181. Reimers P.J., Leach J.E. Race-specific resistance to Xathomonas orizae pv. Orizae conferred by bacterial blaight resistance in host tissues // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1991. Vol. 38. P. 39-44.

182. Reimers P.J., Guo A., Leach J.E. Increased activity of a cationic peroxidase associated with an incompatible interaction between Xanthomonas oryzae and rice (iOriza sativa) // Plant Physiol. 1992. Vol. 99. P. 1044-1049.

183. Roberts I.M., Wang D., Findlay K., Maule A.J. // Ultrastructural and temporal Г observations of the potyvirus cylindrical inclusions (CIS) show that the CIprotein acts transiently in aiding virus movement // Virology. 1994. Vol. 245. P. 173-181.

184. Rodriguez-Cerezo E., Findlay K., Shaw J.G., Lomonossoff G.P., Risco C. The coat and cylindrical inclusion proteins of a potyvirus are associated with connections between plant cells // Virology. 1997. Vol. 236. P. 296-306.

185. Rouhier P., Kopp M., Begot V., Bruneteau M., Fritig B. Structural features of fungal P-D-glucans for efficient inhibition of the initiation of virus infectionon Nicotiana tabacum II Phytochemistry. 1995. Vol. 39. N 1. P. 57-62.

186. Rouleau M., Smith R.J., Bancroft J.B., Mackie G.A. Subcellular immunolo-calization of the protein of two potexviruses in infected Chenopodium quinoa II Virology. 1995. V. 214. N 1. P. 314-318.

187. Ryals J.A., Uknes S. and Ward E. Systemic Acquired resistance //Plant Physiol. 1994. N104. P. 1109-1112.

188. Ryals J.A., Neuenschwander U. H., Willis M.G. et al. Systemic acquired resistance //Plant Cell. 1996. N 8. P. 1809-1819.

189. Sakuta M. Transcriptinal control syntase by environmental stimuli // J. Plant

190. Res. (Japan). 2000. Vol. 113. N 1111. P. 327-333.

191. Salzwedel J.L., Dazzo F.B. pSym nod gene influence on elicitation of peroxidase activity from white clover and pea roots by rhizobial and their cell-free supernatants //Mol. Plant-Microbe Interact. 1993. N 6. P. 127-131.

192. Schlumbaum A.F., Mauch F., Vogeli U. and Boiler T. Plant chitinases are potent inhibitors of fungal growth // Nature. 1986. N. 324. P. 365-367.

193. Sessa D.J., Anderson R.Z. Soybean peroxidases: purification and same properties // J. Food Chem. 1981. Vol. 29. N 5. P. 960-965.

194. Sherf B.A., Bajar A.M., Kolattukudy P.E. Abolition of an inducible highlyan-ionic peroxidase activity in transgenic tomato //Plant Physiol. 1993. Vol. 101. P. 201-205.

195. Shimomura T. Effects of born on the formation of local lesions and accumulation of callose in French bean and Samsung NN tobacco leaves inoculated with tobacco mosaic virus // Physiol. Plant Pathol. 1982. Vol. 20. N 2. P. 257289.

196. Shirley B.F. Flavonoid biosynthesis: 'New' functions for an 'old' pathway // Trands Plant Sci. 1996. Vol. 11. N 11. P. 377-382.

197. Shukla D.D., Strike P.M., Tracy S.L., Gough K.H.< Ward C.W. The N and С termini of the coat proteins potyviruses are surface located and the N terminus contains the virus-specific epitopes // Virology. 1988. Vol. 69. P. 14971508.

198. Shukla D.D., Julka I., Tosic M., Ford R.E. A novel approach to the serology of poxviruses involving affinity purified polyclonal antibodies directed towards virus specific N-termini of coat proteins // J. Gen. Virology. 1989. V. 70. P. 13-23.

199. Simon P. Diversity and conservation of plant peroxidases // Plant Peroxidase. Newsletter. (International Working Group on Plant Peroxidases). 1993. N 1. P. 4-23.

200. Skriver К. and Mundy J. Gene expression in response to abscisic acid and osmotic stress // Plant Cell. 1990. N 2. P. 503-512.

201. Smith J.A., Fulbright D.W., Hammerschmidt R. // Rapid induction of systemic resistance in cucmber by Pseudomonas syringae pv. syringae. Physiol. Mol. Plant Pathol. 1991. Vol. 38. P. 223-227.

202. Sova V.V., Svetasheva T.G., Elyakova L.A. Potato P-1,3-Glucanases Probably Participate in Protection of the Planta Pathogens // Biochemistry (Moscow). 1996. Vol. 61. N 3. P. 380-387.

203. Srisomsap C., Svasti J., Surarit R., et al. Isolation and characterization of an enzyme with P-glucosidase and P-fucosidase activities from Dalberia cochin-chinensis Pierre. // J. Biochem. 1996. Vol. 119. P. 585-590.

204. Stermer В., Hammerschmidt. Heat shock induces resistance to Cladosporium cucumerium and enchances peroxidase activity in cucumber // Physiol Plant. Pathol. 1984. Vol. 25. 239-243.

205. Sticher L., Hinz U., Meyer A. D., Meins F.Jr. Intracellular transport and processing of a tobacco vacuolar P-l,3-glucanase // Planta. 1992. Vol. 188. P. 559562.

206. Stintzi A., Heitz Т.К., Kauffmann S. et al Identification of a basic pathogenesis-related, thaumatin-like protein of virus-induced tobacco as osmotin // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1991. Vol. 38. N 1. P. 137-140.

207. Stintzi A., Heitz Т., Prasad V. et al. Plant «pathogenesis-related» proteins and their role in defense against pathogens // Biochimie. 1993. N 75. P. 687-706.

208. Street P., Robb J., Ellis B.E. Secretion of vascular coating components by xy-lem parenhyma cells infected with Verticillum albo-atrum II Protoplasma. 1986. Vol. 132. N 1. P.l-9.

209. Sue A.U., Ishihara A., Iwamura H. Purification and characterisation of a beta-glucosidas from rue (Secale cereale L.) seedlings // Planta. 2000(a). Vol. 155. N 1. P. 67-74.

210. Sue A.U, Ishihara A, Iwamura H. Purification and characterization of a hy-droxamic acid glucoside beta-glucosidase from wheat {Triticum aestivum L.) seedlings // Planta. 2000(b). Vol. 210. N 3. P. 432-438.

211. Sulzinski M.A, Zaitlin, M. Tobacco mosaic virus replication in resistant and susceptible plants: In some resistant species virus is confined to a small number of initially infection cells // Virology. 1982. Vol. 121. P. 12-19.

212. Swanson A.F, Kuo C.C. The characterization of lectin-binding proteins of Chlamydia trachomatis as glicoproteins // Microb. Pathog. 1991. Vol. 10. N 6. P. 465-473.

213. Thalmair M, Bauw G, Theil S. et al. Osone and ultraviolet В effects on the ^ defense-related proteins (3-1,3-glucanase and chitinase in tobacco // J. Plant

214. Physiol. 1996. Vol. 148. P. 222-225.

215. Tigier H.A, de Forchetti S.M, Medina M.I., Valpuesta V., Quesada M.A. Isoperoxidases from soybean and alfalfa to peach and tomato // Plant Peroxidases. Newsletter. Internetional Working Group on Plant Peroxidases. 1994. Vol. 3. N 2. P.3-6.

216. Tokahashi К, Tanaka T, Iida W, Tsuda Y. Strains of soybean mosaic virus in Japan // Bull. Tohoku Nat. Agr. Exp. Sta. 1970. Vol. 62. P. 1-130.

217. Turgeon R, Webb J.A. Leaf development and phloem transport in Cucurbitapero: translation from import to export // Planta. 1973. Bd. 113. S. 179-195.

218. Uknes S, Kessmann H. and Ryals J. Salicylic acid is not the translocated signal responsible for inducing systemic acquired resistance but is required in signal transduction // Plant Cell. 1992. N 6. P. 959-965.

219. Valconen J.P. Natural genes and mechanisms for resistance to viruses in cultivated and wild potato species {Solarium spp.) II Plant Breed. 1994. Vol. 112. N l.P. 1-16.

220. Vance V.B, Beachy R.N. Translation of soybean mosaic virus RNA in vitro: Evidence of protein processing // Virology. 1984(a). Vol. 132. N. 2. P. 271281.

221. Vance V.B., Beachy R.N. Detection of genomic-length soybean mosaic virus on polyribosomes of infected soybean leaves // Virology. 1984(b). Vol. 138. N. l.P. 26-36.

222. Van den Elsen P J.M., Jongedijk E., Melchers L.S. and Cornelissen В J.C. Virus and fungal resistance: from laboratory to field // Philosoph. Transact. Royal Soc. London B. 1993. N 342. P. 271-278.

223. Van Loon L.C. Pathogenesis-related proteins // Plant Mol. Biol. 1985. Vol. 4. P. 111-116.

224. Van Loon L.C. Stress proteins in infected plants // In: Kosuge T. and Nester E.W. (eds) Plant-Microbe Interactions, Molecular and Genetic Perspectives MacGraw-Hill Publ. Сотр., New York, USA. 1989. Vol. 3. P. 198-237.

225. Van Loon L.C. Induced resistance in plants and role of pathogenesis-related proteins // Eur. J. Plant Pathol. 1997. N 103. P. 753-765.

226. Vogeli-Lange R., Friindt C., Hart C.M., et al. Evidence for a role of p-1,3-glucanase in dicotyledon seed germination // Plant J. 1994. Vol. 5. P. 273-276.

227. Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants 11 Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 1991. Vol. 42. P. 579-620.

228. Vigers A.J., Wiederma S., Roberts W. et al. Taumatin-like pathogenesis-related proteins are antifungal // Plant Sci. 1992. N 83. P. 155-161.

229. Ward C.W., Sukla D.D. Taxonomy of potyviruses: current problems and save solutions // Intervirology. 1991. Vol. 32. P. 269-296.

230. Ward E.R., Uknes S.J., Williams S.C. et al. Coordinate gene activity in response to agents that induce systemic acquired resistance. // Plant Cell. 1991. N3. P. 1085-1094.

231. Ward E.R., Payne G.B., Moyer M.B., et al. Differential regulation of p-1,3-glucanase messenger RNAs in response to pathogen infection // Plant Physiol. 1991. Vol. 96. P. 390-393.

232. Worrall D., Hird D.L., Hodge R., et al. Premature dissolution of the mi-croaporocyte callose wall causes male sterility in transgenic tobacco // Plant Cell. 1992. N4. P. 759-765.

233. Wu J.H., Dimitman J.E. Increased resistance to the spread of tobacco mosaic virus in Pinto bean leaves caused by sugar and light // Phytopathol. Z. 1984. Bd. 110. H. l.S. 37-48.

234. Yermakova S.P., Sova V.V., Zvygintseva T.N. Brown seaweed protein as inhibitor of marine mollusk endo-(l->3)-P-D glucanases // Carbohydr. Res. 2002. Vol. 337. P.229-237.

235. Young S.A., Guo A., Guikema J.A. et al. Rice cationic peroxidase accumulates in xylems vessels during incompatible interactions with Xanthomonas oeisaepv. orisae II Plant Physiol., 1995. Vol. 107. 1333-1337.

236. Zaitlin, M., Hull.R. Plant virus-host interactions // Ann. Rev. Plant. Physiol. 1987. Vol.38. P. 291-315.

237. Zhu B.L., Chen T.H.H., Li P.H. Analysis Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for an osmotin-like protein // Planta. 1996. N 198. P. 70-77.

238. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B. Isakov V.V., Scobun A.S., Sunducova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbohydr. Res. 1997. Vol. 322. P. 32-39.