Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамические свойства апобелков липопротеинов очень низкой плотности и регуляция активности липопротеинлиназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Динамические свойства апобелков липопротеинов очень низкой плотности и регуляция активности липопротеинлиназы"

российская академия медицинских наук кардиологический шачнып центр

на правах рукописи Ш 677.15.08

шуваев владимир ВЛАДИШХШЧ

"Динамические свойства впобелков лкпопротеинов очень низксй плотности и регуляция активности лшюпротвюшпгазы". (биохимия - 03.00.04)

автореферат дхссэртвцки на соискание учвноЯ степени кандидата биологически* наук

ыосква - 19э2

Работа выполнена в лаборатории лиггопрогеинов •Центра профилактической медицины КЗ России.

кандидат биологических наук А.Д.Дергунов

доктор медицинских наук, профессор Н.В.Перова

Научный руководитель -Научный консультант -

Социальные оппоненты -

кандидат химических наук Н.В.Проказова .

доктор физико-математических наук,

профессор

Г.Е.ДоСрецов

Ведущая организация

Институт биологической и медицинской химии РАМН.

Защита состоится "¡6 " декабря 1992 г. в "// " часов на заседании Специализированного совета К 001.22,02 в Кардиологическом научном центре РАМН по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КНЦ РАМН. Автореферат разослан "/3" ноября 1992 г.

Учений секротэрь

Сг.еии «хнзвропатюго совета,

кандидат биологических наук

Т.И.Венгерова.

'Г?':,

"''--Л Л." ;.; ... ОБЩАЯ ЕАРАКТЕТИСТИКА РАБОТЫ. Шалыюсть_ЩюСлемьк Интенсивное изучение метаболизма ипопротогаюв плазмы крови определяется важнейшей ролью нарушений истемы транспорта липидов в развитии таких тяжелых заболеваний эловэка, связанных с атеросклерозом, как ияэмическая оолэзиь эрдца и мозговой инсульт (Климов, 1972; Климов, 1974; Оогйоп, ЭТ2]. Одаиы из ключевых фермантов, осуществляющих о'мон ипопротеинов, является липопротеинлипаза (ЛИЛ), которая рвдставляет собой скорость-лимитирувдее звено в процессе клиренса лазменных липидов [СагХШкеХ, 1967; Вепеайоип» 1-ЭТ9).

ЛИЛ расщепляет триглицериди (ТГ) плазмы в составе ипопротеинов очень низкой плотности (ЛПОИП) и хиломикрои (ХМ), беспочивает практически все внешченочныэ ткани , наиболее $Фект1ГБШм энергоносителем и важным субстратом клеточного синтеза жирными кислотами. Работа Л11Л регулируется апооелкашми огагонеятами ЛЛОНП и ХК: апоС-П. апоС-Ш и шоЕ. Нпрумэш» егуляции штопротеинлиполиза приводит к избыточному накоплению ипидов в тканях или, наоборот, истощению тканей ;ю липидам.

Исследование регуляции процесса лкг.оцр^п-йштстс.лиза редставляется весьма актуалышм с точки 'зрения раскрытия оханнзноо нарушений обмена лилопротеинов, поиска подходов к озмемюй корректировке ляпидного спектра при даслиао.тсотошшмияг.

состоит в роскрипш мохшпгзмов рчгулишш ктипности ЛЛЛ апосолковшад компонентами Л101Ш и в '.«.иученик »ведения нмфиштичоских апооелкоп-регулятороп ЛЦ из шиерглости астицн ЛНОНП."

ОВД?!'« .исследования:

1. Изучить в модельной системе механизм действия на активность Л11Я наиболее вшкного ее регулятирного Оелка, апоС-П.

2. Исслодовать кинетические параметры гидролиза ТГ ЛПОНП липспротеинлилазой при различит модификациях частиц ЛПОШ и их зпобелкового состава.

3. Охарактеризовать поведение апобэлков на поверхности частиц ЛПОНП •• основного субстрата ЛПЛ.

Цг!АЦи.зд_новизна_исслейовашя^ В работе разработан новый метод определения активности ЛПЛ с помощью рН-шщикатора фенолового красного и техника модификации поверхности ЛПОНП с помощью обработки трипсином и поверхностно-актиЕным агентом твин-20. Это позволило получить данные по дифференциальному влиянию на процесс липолиза участков апобелнов, погруженных в лилидаый метрике липопротэина и экспсяшровоншх в водную Ф'1ЭУ. " •

В настоящий работе было установлено, что экспонированный в водную фазу фрагмент молекулы апоС-11 . обеспечивает связ'- МПЛ с поверхностью липоттрогеина, а фрагмент, погруженный в липидную фазу связан с активацией фермента.

При изучении динамических свойств апобелкоЕ ЛПОНП, отражающих юпимодоПстния с окружающими лшшдами и другими аполилопротеинами л стип.-'нь погруженности ъ липидную фазу частицы, а такта при я, !у«»,1ФНИИ досту1ИЮС1И апоболков на поверхности ЛП01С1 для ангитид С-ч.:о продлс-лскено, что на повзрхкосгя часта расположение

и апок носкт характер и/или они частично

'и::; ^'.гнк^.таЛ -шоЬ, что может окпзатьси шши;м для

При моделировании 1грпцосса липолиза обработкой ЛПОНЛ тьии-20, имитирующим действие поверхностно-активних лжюлитических продуктов - жирних кислот и лизофосфатидилхолина, обнаружено, что в п б рву в очередь от поверхности частиц диссоциирует ппо!:',, а затом апоС, при этом зависимость относительной доли апоС-П в сумморшх епоО от концентрации твин-20 имеет слоишА колоколоосризниП характер. Результата кинетических исследования гидролиза ЛШШ, обработанных твин-20, позволили заклшмть, что ингио;:торнсе действие апоС-Ш на активность Л11Л характеризуется бесконкурентным типом ингабирования.

Работа имеет как теорети ческое, так и практическое значение. Разработана новчя методика опредолония активности ЛЕЯ. позволяющая прослеживать вромошюй ход гидролиза субстрата и не требующая использовании радиочктиа'пЯ метки или предварительной экстракции люшдов. Эти методика мик^т бить использована в исследовательских работах, цапрьнлешил нв оценку эффективности гидролиза различных субстратов ЛИЛ, кинетических свойств ЛПЛ и других щелочных липа;», дойетвии нг. липолиз различных модуляторов активности. РазраОогашшй и:диод обработки ЛПОНЛ тыщ -20 позволяет получать препарьт Л'Л'ЛШ с измененным апоболковин составом, что мохот испольсюьаться для' изучения влияния апобелков на субстратный „чюЯстаи и ли

взаимодействие ЛПОШ с рецъпторвма.

Получении* данные, нредюлагаиуге влияние продуктов литатрячкгшшолиза на содержание в Л1!^НЛ ¡щоОи.'Ш^и-рогуллто^ла активности ЛТЛ, могут сш.'соостюннть сптму.тнроиашиг) поиске, препаратов. п;;цопг,труинчх продукта дииолиза и кссдидоашшв вд

ь

возможного благотворного воздействия на лшвдцшй обмен.

Лтаобащя работа_и_щШ^ацш^ Материалы работа долохены н; Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблем биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 1985). Всесоюзно! симпозиуме по медицинской внзимолопш (Махачкала, 1986) Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987), I1 Международной школе "Структура и функции биологически! мембран' (Варна, Болгария, 1987), III Международном симпозиуме го количественной люминесцентной спектроскопии в бшмедацинсюс науках (Тент, Бельгия, 1989), Международном конгресс» "Триглицериды. Роль в диабете и атеросклерозе" (Вена, Австрия 1990), 59 Конгрессе Европейских атеросклерстических оСщаст] (Ницца, Франция, 1992). Результаты проведенных исследований опубликованы в 7 научных работах. Диссертация -апробирована к; меклабораторноы коллоквиума Института экспериментально) кпрдиологп ЮЩ РАМН.

С'тр^кт^рэ_и_объ9м_работы;_ Диссертация состоит из раздело) "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результат! исследования", "Обсуждение результатов", "Заключение", "Вывода" i "Список литературы", включающего 258 работ отечественных ] зарубежных авторов. Работа изложена на 127 страницах, включает < таблиц и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕЗ-ОДЫ.

Плазму кропи человека получали от здоровых доноров из КН PAV.H и хранил; при 4°С не более суток с добав-чинием'<ШСФ и азид К:1. Коровье молоко для шдолония ЛГИ после д">"ки охлаждали во льд

в

и центрифугировали 15 мш; при 3000 об/шн.

Иммобилизацию гепарина, протеина А, аноЕ, апоС-11 и япоО-Ш на СНВг-актшжрованной софарозе 4В осуществляли по рбкомеидтшям фяр.си -производителя ГАГПпНу СЬг0ггя10£трМу, 1978).

ЛПЛ выделяли по метода (КЛппшоп, 1977] с использованием афЛшюй хроматографии на гепарин-сефарозо.

Активность ЛПЛ определяли разработанным нами м-э топом, , основанным на сгоктрофотометрической регистрации начальной скорости образования в ходе реакции II* с помощью рН-инди.чатори фенолового красного. Субстратом служил либо препарат ЛП0Ш1, либо эмульгированный гриолэин.

Препарата фракций ЛП01Ш и ЛПНП гшазмы крови чалоыжа получали о помощью ультраценгрифугирования по методу (H:\ve 1. . 19Ь5! в золевом градиенте плотности. ЛПОНП делипиднровали по мйтолу ШсСопагЬу, 1ЭТП.

Апобелки ДВДШ фракционировали по методу ШегЪмч, I у'.'З < гель-фильтрацией на сефарозо СЬ-6В. АпоЕ очищали по методу 1ау11н, 19821 с помощь» афХшшоЯ хроматографии на геплрин-сэ.^лрооо. !поОэлкн группы С разделяла ионооСмвшюЯ хроматогри^им I Й«г1,ч:1Ч; 1ЭТЗ). 1

Обработку препарата ЛП0Ш1 г вин-происдали и,018 4 раат».>;он цаторгеита при 20°С, а затем ошььд! линопротеинч о иомздг; ¡гльтрзцэитряфугаропония. Флотировавши фракции собирялн и знализиртьоли йй ипо<5«лкорцл состав с помощью злокгрощрчзч по [ЬаекаИ, 19701 й скстома о ДДО-На .

Обработку препарата ЛП01С1 тршкашсм гзувйспимт» при сснцентращс? нротепзи 1Ш мкг/мл в т<?чотм Ш юш. прг.т.чода.1,

остамвливали добавлением 10-кратного весового избытка ингибитора трипсина, препарат переводили в незаОуференную среду' диализом и использовали как субстрат для Ж1Л.

Белки метили флуоресцеинизотиоцианатом согласно СБ1е1лег, 19845.

Динамическое тушение триптофановой флуоресценции апобелков ЛПОШ и Л!!Ш проводили водорастворимыми тушителями акриламидом и анионами I- по 'методу СЛакович, 19861. Тушение флуоресценции пироном анализировали"в рамках модели гетерогенного распределения триптофэнмлов относительно границы раздала фаз вода-липад [ДоОрецов, '19813.

Статистическая обработка данных. Калибровочные -зависимости, данные кинетических и спектральных' измерений обсчитывались ло методу наименьших квадратов после соответствующих-представлений. -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Метод измерения липазкоЯ активности

В настоящей работе разработан новый метод определения активности ДТЛ, основанный • на регистрации начальных изменений концентрации К+ после добавления фермента с помощью кислотно-основного индикатора - фенолового красного, рК которого (7,Г<5) расположен в рН--оптимуме активации ДПЛ апобелком С-11 -8,0-2,5 [Вепд1заоп, 19831.

С^нодсклЛ красный иопольиовали в концентрации 125 мкМ, соответствукдеЯ началу плато нэ кривой зависимости активности ОДдедого от котгжтрзцкк индикатора. Саенскмосп ь активности ЛИЛ от коцц^лтрация лшпйнкЯ характер,- что сиик'тельствует

эО адекватности экспериментальных условий измерения ферментативной активности.

С помощью разработанного метода были изучены кинетические параметры гидролиза ЛПЛ искусственного субстрата эмульгированного триолеина. Анализ активности ЛПЛ проводили л рамках модели кинетики Михаэлиса-Ментен [ЗсЬгескег, 1979Ь

_Г>

полученное значение 1^=0,335x10 М согласуется со значением Км 2,5x10-3, полученным другим методом [Роапег,1983].

Исследование активирования липопротеинлиаазы апобелксм С-II при гидролизе искусствешюго субстрата

Кинетические параметры гидролиза триолеина ЛШ из коровьего ■далека получали- при • фиксированной концентрации апоС-11 и изменяющейся концентрации триолеина, эмульгированного в 0,01% Гритоне Х-100. Изменения кинетических параметров рассчитывали этносителыю контрольных значений в отсутствие апоС-П.

Данные типичного эксперимента в координатах Лайнушзера-Берка з присутствии и отсутствие апоС-П показаны на рис.1. Во всех злучаях данные соответствовали линейной зависимости (г>0,8). В гзОл. 1 представлены изменения кажущихся кинетических параметров ^пах и '^л05' Ферментативного гидролиза при различных концентрациях апобелка относительно контрольных значений. Гяблица 1. Кинетнческио параметры гидролиза триолеина ЛПЛ '

апоС-П мкг/мл К."?* /к!"* 7К01К " .........

' м(оттпт.) тл(контр.) пах(ошт. г шах(контр.

8,5 " очень мала 3,0

17,0 0,23 3,4

46,0 0,53 2,7

72,0 1,23 3,9

1/У, {ммапо Н*/мик/лг) 1

Рис.1. Типичные кинетические зависимости ферментативного гидролиз я ЛИЛ эмульгированного триолеина в • координатах ЛаЯнуивора-Берка в отсутствие и в присутствии рпоС-П в концентрации 72 мкг/мл.

К Я*'

Из п лученных даннпх ввдю, что значение в присутствии

апоболка в концентрации 8.5 мкг/мл увеличивалось в 3 ; эза и в 'дальнейшем ко наблюдалась какая-либо зависимость кажущейся ппкою-алыгай скорости реакции от концентрации апоС-11. Величина

К,1';0"' лр;| концентрациях опоол до 46 тг/ип Сшо значительно юта ':;)чт рольне Г: яоогкгелл прл усолпчуж.'и еноО-и до V::

■:;;•■/;,:.•; '•¡■•/•.■цг.'М К:;'1" ]'Г. :"'Ч"7ПЧ'.;;," . '^с '

1Г) II г;:;, :мг:,-'. о ' ' ,

!лиянио на липолиз экспонированных в водную фазу и лшшд-связанных гчастков апобелков в составе лшюпротеинов очень низкой плотности.

С целью возможной локализации участков в молекуле апоС-П, 1тв8тствеишх за обнаруженные кинетические эффекты, виделошшй из ишзмн крови человека препарат ЛПОНП подвергали действию тршюшю (о полного исчезновения полос апоС и апоЕ на электрофоре грамме.

На рис.2 представлены данные типичного эксперимента в юординатах Лайнуивера-Берка, где в качестве субстрата ЛИЛ грименяли натившэ (контроль) и обработанные трипсином (опит) шстици ЛПОНП. После проведения протеолиза при 30°С величина 'величивалась в 1,2 раза, а увеличивалась в 5,7 роз. В случае фоведешя протеолиза при 37°С, величина Утах увеличивалась п 1,2 заза, а Ц - в 6,7 раз-. Отсутствие различий в кажущихся величинах

(нмапо Н+/л"«/«г)-1хЮ®

80

- 4

1/77" Ьлг/мл\~

Рис.2. Кинетические зависимости ферментативного гидролиза липопротеинлипазой контрольных МЮ1Ш и ЛПОНП, обраСотаншх трипсином при ЗСГС и 37 С (в координатах Лайнуивера-Берка).

Г1

км 1',7тах после обработки трипсином при 30 и 37°С указывает ш достаточно глубокий протеолиз экспонированных в воду участко; тоОолков. Можно предположить, что экспонированный в воду участо! аноС-П удерживает молекулу ЛПЛ на поверхности субстрата, I ■гапшд-связанный участок апоС-П активирует фермент.

Изучение саморегуляции процесса липопротеинлиполиза.

В следуюцей серии экспериментов была ' предпринята погштк сопоставить кинетические зависимости, диссоциацию амфипатичвски апоовлков от поверхности частиц ЛПОНП при действии ЛПЛ накопления продуктов липолиза.

При добавлении к частицам ЛПОНП препарата ЛПЛ в отсутствие в присутствии пирена и в отсутствие акцептора жирных кислот альбумина - наблюдалось зависимое от времени тушение апобелково |^луоресцонции (рис.3, зависимости 2 и 3), что, возможно обусловлено выходом апобелков в водную фазу. Образование кирш кислот (зависимость 1 ) происходило быстрее, чем предполагаема диссоциация апобелков от поверхности (зависимости 2 и 3) Известно, что на позщас ' стадиях липолиза происходи мнцеллироваше продуктов реакщш [МиаПпег, 1987], чт ■сопровождалось в наших экспериментах увеличением рассеяш (зависимость 4). Можно предположить, что накопление продукте реакции липолиза приводит к высвобождению с поверхности ЛП01 ппо^елков, являющихся в том числе и регуляторами активности ЛГ (гнюС-Н, апоО-Ш и, возмокно, апоЕ).

Действие продуктов липолитической деградации оьи сшдэлпргжшга при изучешш влияния детергента тв;:н~20 1

Рис.3. Кинетика изменения содержания свободных жирных кислот (1), флуоресценции апобелков ЛПОНП (26,8 мкг белка/мл). в отсутствие (2) и в присутствии (3) 3,3 мкМ пирена и светорассеяния (4) после добавления ЛИЛ. Возбуждение флуоресценции - при 286 нм, регистрации при 345 нм. Регистрация светорассеяния - при 560 нм.

и ь

Е

£ н?

а

-8 ц

7?! 41 /.чг быка

'Рис.4. Влияние твина-20 на относительное содержание аноО 11 сщр суммарных С-опобежов (х) и кшетическио параметры (о) и (о) процесса гидролиза ЛИЛ частиц лшаш,

реизолированннх после действия детергента. Показан тшшпшЯ эксперимент.1

апоболковий состав частиц ЛПОНП и липаэную активность при использовании в качестве субстрата частиц ЛПОНП, реизолированных •после действия детергента (рис.4).

Зависимости изменения кажущихся кинетических параметров ферментативной реакции Км и от первоначального соотношения детергент/белок и зависимость относительного содержания апоС-п в общем пуле апоС характеризовались колоколообразными кривили, различающимися только точкой максимума. Данные корреляционного анализа взаимосвязи 'относительных изменений и К^"аж в

результате действия твин-20 показали, что связь мекду этими параметрами описывалась уравнением: у = 1,54х - 0,34 (г - 0,78), гш х - VKa3K /VKM • v - К.каж /vKax Fcira

предположить наличие прямой связи между величинами этих параметров и содержанием в частицах ЛПОНП anoC-III, то можно предположить бесконкурентный тип ингибирования активности ЛПЛ апоОелном . С—III [Крупянко, 1987]..Это означает, что апоС-Ш взаимодействует с комплексом апоС-П/ТГ/ЛГИ и таким образом снижает эффективность каталитического процесса.

Изучение тушения апобелков липопротеинов низкой и очень низкой плотностей водными туштеляии

Белковая флуоресценция частиц ЛПОНП, содержащих в своей составе япоЛП В, Е и группу С, характеризовалась максимумом спектра испускания при 332 нм и полушириной Sti ilv при возбуждения в полосе поглощения триптофана и тирозина (А-281 нм). При возДукдении только остатков триптофана (Я=29Ъ им) максимум спектра испускания находился при А.<235 им, з полуширина, спектра билз рэше

им. Спектр флуоресценции Л1ПП, включающих практически только )В, при возбуждении 281 им характеризовался максимумом при \=329 и полушириной 55 нм, а при "триптофаиоаом" возбуждении А.=295 нм ссимум смещался в область 332 им, а полуширина равнялось 51 нм.

Возможно, более длинноволновый сдвиг спектра флуоресценции )НП по сравнению с ЛПНП обусловлен наличием в ЛПОНП герхностных амфипатических апоЛП Е и С. Присутствие этих >белков приводит, видимо, также к более гетерогенному спектру 'оресценции Л10НП по сравнению с ЛПНП, проявляется в большей мчинэ полуширины спектров.

Динамическое поведение участков белковых молокул, содержащих лтофановые остатки, 'а также степень экспонированности птофанилов в водную фазу 'исследовали с помощью тушония . ■оресценции триптофзнилов частиц ЛИ акриламидом и анионами 1". 'личение константы тушения для обоих туиитолей в случае частиц )1Ш может отражать либо повышенную подвижность апобелкоь Е и/или I составе Л10НП по сравнению с апоВ ЛПНП, либо сниженную ;ровязкость частиц ЛПОНП по сравнению с ЛПНП.

Величина константы туаеш'я флуоресценции белков ЛПОНП иламидом превышала аналогичную величину для ЛПНП в среднем в .8 hii3a (Р<0,05), в то время как доступность флуорсфсров ЛПОНП акриламидэ была меньше в среднем нэ 8% (Р<0,.025) доступности орофоров ЛЕШ. Отличия параметров тушения для тусения I" .залиеь качественно сходнимя, но менее выраженными, тиетачески-знпчим-о снижение доступности триптофанилов белков в тяр* ЛПОНП по сравнению с ЛПИП для окриламида может быть з оно с кдастерккм характером рссполсжония амфипатических

lb

апооелков на поверхности ЛПОНП и/шш их экранировкой апобелком

Влияние детергентов на доступность апобелков липопротеинов 041

низкой плотности

Для изучения структурно-динамического повэд амфипатических белков на поверхности частиц ЛПОНП был использ неиошшй детергент твин-20. В предварительных экспериментах показано, что при весовых отношениях детергент/балок ЛПОНП<3-5 наблюдается разрушения частиц. Параметр эксимеризации встроен в лилидную фазу частиц флуоресцентного зонда пирена не измен при добавлении твин-20 в указанных пределах, что свидетельст об отсутствии изменений упаковки и подвижности липидных молеку также перехода пирена на твин-20.

В присутствии твин-20 в домнцоллярных концентрациях (ь 0,025%) наблюдалось сшшэние на 12% квантового выхода бел! флуоресценции частиц ЛПОНП и сдвиг максимума спектра флуоресш на 3-5 нм в длинноволновую область. При дальнейшем узсипг отношеш:я дотергент/Оолск и переходе -в область мицелл; концентраций детергента (свыше 0,025Х) эти изменения протерт обратный сдвиг. Это, по всей вероятности, свидетельству сходстве микроокрухешя остатков триптофана агюбелков в нат: чвсуицах ЛПОНП и мицеллах твин-20.

Для выяснения . причин спектральных изменений при до Я твин-20 на частицы ЛПОНП было изучено тушение триптофи флуоресценции частиц ЛПОНП акриламидом и анионами' Г тусит Для незаряженного, тушителя акриламида параметры тушени присутствии детергента в концентрации 0,01 % существенно

ялись: по данный конкретного эксперимента величина т оставалась змеиной и равной 0,6й; константа тушения несколько личивалась с 5,2 до 6,87 И-1. Параметры тушения для иотюго ителя 1~ изменялись гораздо значительней при действии твин-20: тугаюсть для I" уменьшалась с 0,5 до О,: Ъ, в константа тушения ристала с 4,49 до 8,85 М-1.

Можно предположить, что детергвнт-индуцируемпй переход связан вменениями в структурном окружении трмптофашиюв апоболков. При м доступность трштофшшлов для I" сникь.-тся без существенного ©нения подвижности их микроокружения, определяющейся по ичине константы тушения. для экриламэда. Можно

дположить, что обнаруженные изменения являются следствием пирализащш апобелков в 'результате их диссоциации от ¡ерхности ЛПОНП под действием детергента.

Для экспериментальной проверки этого предположения . бил юльзован индуктивно-резонансный перенос энергии с трюттофанилов локализованный в липидной фазе зонд пирэн. Билл расчитаны мчкны доступности для пкрека трилтофанилов натикшх Л1ЮНП 99) и после обработки твином а домицэллярноП концентрации 0,02% 69), т.е. происходило удаление белков от липидной фазы, »бх^димо отметить, что после обработки теином в мииелллрной щентрации 0,05$ наблюдалась ЮОЖ-ная доступность флуоро-юров I пирона, связанная, возможно, с перераспределением пирена в ¡шатше бзлок-Д9тергент!ша мицеллы.

Било изучено злкяиив твин-20 к ионного детергента зоксихолатэ Ь'а ь широком диапазоне их концентраций на ;пскнровншюсть триптофанилов в водную фазу и подвижность

е <

е

Рис.5. Измененив степени доступности а и константы тушения Ытеш-Фэльмера К для тушения акриламидом триптофановоя (флуоресценции апобелков ЛГОНП при действии на частицы твина-20 (о) и дезоксихолата Ма (в).

хромофоров, оцененные по тушению их флуоресценции акриламидом.

рис.Ь представлены данные по влиянию обоих детергентов

нормировашшй показатель доступности и константу тушения Кц

НоршровашшЯ показатель доступности флуорофоров а для моле

'тушителя рассчитывали следующим образом: а = ^Двт ~ *-дэт

1 - Г

-дет

гда гчдэт и • *-дет

величины доступности в присутствии отсутствие детергента. Введенная нами величина а отражает I изменения доступности в присутствии дотергента относите: максимально возможного изменения. Можно выдели"- 3 зоны измене доступности фпуорофоров: первая зона - область диссоцие

о

»

О

о

2

7М/ЛГОТ, »г/м- «зга

Рис.6. Изменение относительного содержания апоЕ (о) и апоС (в) в частицах ЛПОНП в зависимости от разведения частиц ШОНП в присутствии 0,018% тв!ша-20. Содержание апоОелков знракено относительно содержания апоОелков ЛПОНП при эдинзкових разведениях .частиц в растворе без детергента.

э.таов без измопония релаксационных характеристик ближайшего гсфонового окружения (белок/детергент менее 3,5); вторая -зть частичной солюбилизащш чвстиц ЛПОНП с одновременным зтвовогаточ мицелл болок/детергент и' белок/лшгад/детергонт ж/П'>торг9НТ 2,5-76); наконец, третья - зона полной <яр:з.-е*.*я Л10Ш (Сэлок/доторгенг .>75).

Л 'П.--1 ■ * с^" с п л о II!' п '|а'ст!) диссошиясл! опобэлюв от поверхности

тван~20 бнлп изупт

0\\У-\ СССПГ ';!:*. Сгтияитл

::';лс:! ':!Г'! О:'1 1

,'Ч'и •! ОС

1

лг:!) ; " 'Т гл:

апоК к липидному матриксу ЛПОНП по сравнению с апоС, подтвержавтся данными (Уокоуаш,|9853 о более низком сродстве а к фосфатидилхолин-триолеиновш частицам.

Т.о., при действии твин-20 на ЛПОНП в субмиделляр концентрациях происходит диссоциация апоЕ и в меньшей стап апоС, сопровокдащаяся обратимым изменением их сгруктури, но затрагивающая их релаксационные характеристики из-за схожа динамического поведения апобелков в нативной частице и в компле белок-детергент. Статистически-значимое снижение доступно триптофанялов белков в составе ЛПОНП по сравнению с ЛПНП акриламида может бить связано с кластерным характером рвсполоке амфипатических впобелков на поверхности ЛПОНП и/или екранировкой впобелком В.

Иииунохиинческое исследование доступности впобелков Е и С лшюаротешгав очень низкой плотности

Предварительные эксперименты по связыванию ГаЬ-фрагментов очищенными ФИТЦ-мечешмм апобелками в растворе показали хоро аффинность полученных антител. К^ комплекса онтиген-антитоло растворе составила 12 нМ для апоС-П и 20-75 им для апоС-Ш стехиометрии, близкой в обоих случаях к 1. Однако, стохиомет связывания резко снижалась при взаимодействии РаЬ-фрагмеи антител с соответствующими апобелкаш в состава частиц ЛИ (рис.7). При сшпкэшш концентрации -частиц ЛПОНП доступна антигенных. детерминант возрастало: для апоЕ от г!% при концентра ЛПОНП 0,6'мг белка/мл до 485 при 0,077 мг белка/мл, для апоС-11 <1* при концентрации ЛПОНП 0,4-0,6 мг белка/мл до 4,8% при 0,2

тт. /г беша/мп

Рис.7. Зависимость стехиометрии связывания РвЬ-Фрогментов' антител к соответствующему аяоОелку с апоЕ (х),- апоС-П (о) и апоС-Ш (о) в составе ЛПОНП от концентрации бежа ЛПОНЛ в препарате.

а/мл. Доступность хэ апоС-Ш на поверхности ЛИОЬ'П к ветстйущему антителу оказалась крайне низкой (<0,15%) и тически ;.о зависела от конц-эктрации ЛПОНП в рабочем диапазоне. Т.о., результаты иммунохимичбского исследования согласуются деланным ранее на основе спектральных измерений предположением ж ¡ни скрытой от водной фазы популяции молекул амфтатических элков в составе частиц ЛПОНП.

ВЫВОДЫ

1. регулятор активности лппопротеинлипэзы апоС-П при ••«грациях ниж ««^кашицей улучшает связнвашю фермента с 1ХН--П.0 искусственного субстрата - эмульгированного траолеяно

н увеличивает скорость его ферментативного гидролиза. Побыв концентрации апоС-П приводит к, ухудшению встраив липопротеинлипазы в липидную фазу при сохранении скорости раак

2. Участок апоС-II, экспонированный в водную среду, облег связывание липопротеинлипазы с поверхностью ЛПОНП, фосфояипид-связанный участок апоС-II активирует катализ.

3. .Выявлена различная способность амфилатиче аполипопротеинов Е и С к диссоциации от поверхности ЛПОНП ' действии детергента твин-20. Предположена саморегуляция прои лилолиза ТГ-богатых частиц на уровне их ' апобелкового состэе результате диссоциации амфилатических апобелков.

4. Изменение отношения апоС-1I/апоС-III в частицах ЛПОНП действии твин-20 позволило установить бесконкурентный харг шгибирования апобелком C-III апоС-11-ективируе липопротчинлиполиза.

5. Аполипопротекш Е, C-ÏI и C-III на поверхности' наг, частиц ЛПОНП малодоступна для антител. Предполокена клэсте природа организации амфипатических апобелков на поверхности J и/или их экранировка апоОэлком В.

раюш, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕПЕ ДИССЕРТАЦИИ .1. Кинетика, гидролиза триолэина липонротеилглназой , присутствии опоОелка С-II// Доклада АН CGC}1.- 1£в5.- î.281.- 1 С.19&-200.- В соавт, с Двргуиоиым -А.Д., Сокольниковым i Ыетельской В.А., Паровой Н.В.

2. Роль дискретны* структурных доменов молекулы ano С-рогуляцим активности лигюпротеидлшшзц// i со.: Вгъео;

¡»ронция молодых ученых "Современные проблемы биохимии и псо-химической биологии". Тезисы докладов.- Москва.- 1986.- ■ в гг. с А.Д.Дэргуновым.

3. Регуляция активности липопротеидлипазы апобелком C-II. сциональная значимость различных участков молекулы апоболка// В

Всесоюзный симпозиум по медицинской энзимологии. Тезисы гадов.- Махачкала.- 1986.- в соавт. с Дергуновнм А.Д., (льской В.А., Перовой Н.В.

4. Механизмы регуляции активное: липопротеидлипазы ¡елками// В.сб.: Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов. [сы докладов.- Алма-Ата.- 1987.- в соавт. с Перовой Н.В., ■уновым А.Д.

5. Динамическое поведение апобелков на поверхности стротеидов плазмы крови человека// В . сб.¡Всесоюзный симпозиум иохимии липидов. Тезисы докладов.- Алма-Ата,- 1987.- в соавт. ргуновым А.Д.

6. Lipid-proteln interactions In human plasma lipoproteins, aodelktlcua membranes and reconstituted gyatema// Abstracta oí nternatlonal school "Structure and function oí biologocal ranea".- Varna.- 1987.- в соавт. с Дергуяовым А.Д.

7. Белок-лишдныэ взаимодействия в'липопротевдах очень 1шзкой ности плазмы крови человека// Доклада АН СССР.- 1988,- Т.299.-- с.1498-1502.- в соавт. с Дергуновнм А.Д., Перовой Н.В.

8. Споктрофотометрическоэ определение активности протеидлипззы// В кн.: Новые метода практической биохимии.-

Наука.- 1989.- 170-173- в соавт. с Дергуьовим А.Д., льской В.А., Перовой Н.В.

9. VLDI substrate .properties and efficiency of th< metabolic transformation by LPl// Experlentla.- 1989.- V.4! N.5.- P.461-463.- В соавт, с Дергуновым А.Д., Перовой Н.В.

10. Apollpoprotein aggregation state in solution and In i complex with lipid: fluorescence anlaotropy and energy transí etudy// Abstracts of III International Symposium on Quantitat: Luminescence Spectrometry in Biomedical Sciences.- Ghei Belgium.- 1939.- в соавт. с Дергуновым А.Д., Розеню М.

'11. Topo-dyrtantic characteristics of human plasma V] apollpoprotelns and efficiency of trlacylglycerol hydrolysis lipoprotein lipase// ВВА,- 1989.- V.1005.- N.I.- P.79-86.-соавт. с Дергуновым А.Д., Паровой Н.В.

12. Динамическое поведение апоОелков лилопротеидов оч< низкой плотности плазмы крови человека и регуляция irpouei липолиза// Биохимия.- 1990.- Г.65.- N.I.- С.134-146.- в соавт. Дергуновым А.Д., Перовой Н.В. •

13. Protein-protein Interactions and LFI activ: regulation// Abstráete of International Congress "Trlglycerldi The role in diabetes and atherosclerosis".- Vienna.- 1990.- в c< с Дергуновым А.Д., Перовой Н.В.-

14. VIDL apoprotein dissociation Гrom, lipoprotein aurfai effects of VLDL goncentratiori/7 Abstracts of 59th E.A Congress.- Nice.- 1992.~ в соавт. с ДергуноЕык А.Д.

15. Иммунохимическое обнаружений диссоциации аясбелкап частиц ;пшопротошюв' очйиь низкой плотности плазмы кр чоловека// Билл.экспер.биологии и медицины.- 1992.- Т.СлШ,-¡шчати.- в соавт. с Даргуновым А.Д., Перовой Н.1

г 4