Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Амилоид бета и липидный метаболизм

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Амилоид бета и липидный метаболизм"

РГ6 од

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи УДК 612.82+616.001.31+577.112.115

КУДИНОВА Наталья Владимировна АМИЛОИД БЕТА И ЛИПИДНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ.

(Специальность 03.00.04 - биохимия )

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

МОСКВА-1996

Работа выполнена в на кафедре биохимии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Т.Т. Березов

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Панченко Л.Ф.

доктор биологических наук, профессор Болдырев А. А.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится *27' сентября 1996 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 053.22.02 при Российском Университете Дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинский Факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского Университета Дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан"_"_1996 года

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор В.Э. Торбек

Актуальность проблемы. В последнее время в медико-биологической науке пристальное внимание исследователей приковано к проблеме амилоидозов. Амилоидозы представляют большую группу клинически и биохимически разнообразных патологических состояний, характеризующихся отложением в тканях и органах нерастворимых фибриллярных белков. Особое место в этой группе занимают бета амилоидозы мозга при болезни Альцгеймера (БА), синдроме Дауна (СД) и старческом слабоумии (деменции). Главным морфобиологическим признаком этих заболеваний является отложение специфического белка— амилоида бета (Ар) в виде амилоидных фибрилл в ткани и сосудах мозга. Ар состоит из 39-43 аминокислотных остатков. Он образуется путем протеолиза из своего предшественника— трансмембранного гликопроте-ина. Длительное время в литературе существовало мнение, что Ар является исключительно патологическим белком. Однако в 1992 году Ар был обнаружен в растворимой форме (рАр) в плазме крови и спинномозговой жидкости (СМЖ) не только больных, но и здоровых людей, а также в секретах многих клеточных линий. На сегодняшний день основными нерешенными остаются вопросы о тонких молекулярных механизмах патологического изменения растворимой формы Ар и его фибриллогенеза, о причинах возникновения р-амилоидоза мозга при нормальном старении и при патологии; еще далеки от своего разрешения и проблемы избирательности поражения мозга и последствия амилоидоза для всего организма. Одним из направлений в решении этих вопросов является изучение нормальной биологии рАр и его взаимосвязи с липидным метаболизмом. Почву для такого рода исследований дают экспериментальные доказательства нарушения метаболизма липидов мембран при БА и СД, а также открытие в 1994 году ассоциации рАр с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП) в плазме крови здоровых доноров. В этой связи особенно актуальным представляется исследование возможности взаимосвязи Ар и метаболизма липопротеинов (ЛП) в целом. Понимание молекулярной сущности этого процесса позволило бы приоткрыть причинно-следственные отношения между нарушениями липидного обмена у больных БА и СД и отложениями Ар, выяснить этиологию и патогенез бета-амилоидозов мозга, и в связи с этим попытаться разработать принципы патогенетически обоснованной терапии заболеваний. Не менее актуальным является решение фундаментальной биохимической задачи— понимание механизмов поддержания гидрофобных белковых молекул в растворенном состоянии. С этих позиций важным является выяснение вопроса о взаимодействии рАр с липопротеиновыми частицами в спинномозговой жидкости, что, наряду с существованием ассоциации рАр с ЛПВП плазмы крови, позволяет рассматривать липопротеины как систему транспорта рАр в биологических жидкостях организма.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы было выяснение ассоциации растворимой формы Ар с липопротеи-

нами СМЖ здоровых людей, выделение нативного Ар из липопротеинов СМЖ здоровых доноров и определение возможных физиологических функций рАр в липидном метаболизме.

В соответствии с целью в работе были поставлены следующие практические задачи: 1) исследовать возможность существования связи рАр с липопротеинами спинномозговой жидкости здоровых доноров; 2) разработать метод выделения нативного АР из ЛП СМЖ; 3) изучить влияние Ар пептидов на реакцию этерификации холестерина в плазме крови здоровых доноров; 4) исследовать действие Ар на синтез внутриклеточных липидов в культуре клеток печени человека НерЭг.

Научная новизна.

В работе впервые показана важная роль липопротеинов спинномозговой жидкости как системы транспорта рАр. Ассоциация рАр с липопротеинами высокой плотности 3-го класса (ЛПВПЗ) и липопротеинами очень высокой плотности (ЛПОВП) СМЖ, доказанная прямым определением 1Ч-концевой аминокислотной последовательности, высокоэффективной жидкостной гельфильтрацией и методом иммуноэлек-тронной микроскопии, дает основание для заключения, что рАр циркулирует в составе липопротеинов в биологических жидкостях организма.

Нативный рАр впервые был выделен из ЛПВП СМЖ. Разработанный метод выделения и очистки рАр открывает широкие возможности для получения этого белка в количествах, достаточных для более детального исследования его физико-химических и биологических свойств.

При исследовании возможных функций рАр, связанных с липидным обменом, впервые был обнаружен ингибирующий эффект его синтетических гомологов на: 1) этерификацию холестерина в плазме крови здоровых доноров; 2) биосинтез различных липидов в культуре клеток печени Нер62.

Практическое значение работы.

Проведенные исследования впервые позволили: 1. Показать существование связи рАр с ЛПВПЗ и ЛПОВП в спинномозговой жидкости здоровых доноров. 2. Разработанный метод выделения и очистки нативного рАр из ЛПВПЗ СМЖ может быть использован для выделения препаративных количеств этого белка. 3. Участие Ар в липидном метаболизме посредством ингибирования: а) реакции этерификации холестерина в плазме крови здоровых доноров и б) синтеза внутриклеточных липидов в культуре клеток печени Нер62, с одной стороны отражает возможные биологические функции рАр, а с другой предлагает объяснение этиологии и патогенеза бета амилоидозов. Это в свою очередь может служить основой .. для разработки методов патогенетически обоснованной терапии этой группы заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Растворимый Ар ассоциирован с липопротеинами высокой плотности спинномозговой жидкости здоровых доноров, в частности ЛПВПЗ и ЛПОВП.

2. Липопротеины высокой плотности, с которыми ассоциирован рАр представляют собой сферические частицы со средним диаметром 16,8 нм и с молекулярной массой ~200 кДа.

3. Нативный рАр был выделен из ЛПВП спинномозговой жидкости здоровых доноров.

4. Синтетические пептиды Ар, длиной в 40 и 28 аминокислот, оказывают ингибирующие влияние на реакцию этерификации холестерина плазмы крови здоровых доноров, максимальный эффект составляет 40-50%

5. Первые 28 аминокислот внемембранной последовательности Ар отвечают за ингибирование реакции этерификации холестерина.

6. Синтетический пептид Ар 1-40 в культуре клеток печени НерС2, -оказывает ингибирующее действие на синтез внутриклеточных липидов. Этот эффект зависит от концентрации пептида.

7. Максимальный ингибирующий эффект АР1-40 на синтез липидов составляет: 40% для свободного холестерина, 30% для эфиров холестерина, 25% для фосфолипидов и 23% для триацилглицеринов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на:

1. Межуниверситетской научной неврологической конференции, проводимой на базе Медицинского центра Нью-Йоркского Университета, Нью-Йорк, декабрь 1995.

2. Межлабораторном научном семинаре кафедры биохимии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов РАМН, сентябрь 1995.

3. Научном семинаре лаборатории нейрохимии института неврологии РАМН, сентябрь 1995.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, обсуждения, заключения и выводов. Она изложена на 123 страницах машинописного текста и иллюстрирована 6 таблицами, одной схемой и 16 рисунками. Библиография содержит 225 отечественных и зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. •

Спинномозговая жидкость нормолипидемических доноров, не имеющих | диагноза деменции, была получена из Клинической Лаборатории Нью- ' Йоркского Медицинского Центра. Плазму крови получали путем 15 мин 1 центрифугирования цельной крови нормолипидемических доноров при 2500 об/мин при 4°С и немедленно использовали для экспериментов по определению скорости этерификации холестерина. Синтетические

пептиды: Api-40 и Ар 1-28 были синтезированы твердофазным методом в Йельском Университете, США. Липопротеины СМЖ выделяли методом препаративного ультрацентрифугирования в роторе фирмы Beckman Ti 50.2. Во всех случаях центрифугирование проводили при 16°С и скорости 45000 j об/мин.Сначала СМЖ подвергали центрифугированию при плотности 1,063 ' г/мл в течении 16 ч, получая флотирующий слой (1/10 объема), соответствующий общей фракции липопротейнов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНГ1). Инфранатант собирали, доводили до плотности 1,125 г/мл и центрифугировали в течении 20 ч, получая флотирующие ЛПВП2. Последовательными центрифугированиями в течении 40 ч при плотностях 1,21 г/мл и 1,25 г/мл получали фракции: ЛПВПЗ и ЛПОВП, соответственно, и инфранатант— свободную от ЛП СМЖ (СЛПСМЖ). В отдельных случаях плотность цельной СМЖ доводили сразу до 1,25 г/мл и после 60 ч центрифугирования получали тотальную фракцию ЛПВП. Все фракции ЛП диализовали против воды, лиофилизировали и анапазировапи на общий белок, электронномикро-скопически, высокоэффективной жидкостной гельфильтрацией, гель-электрофорезом и иммуноблот анализом с антителами против разных апобелков. Для электронной микроскопии (ЭМ) ЛПВП СМЖ диализовали, наносили на ЭМ- решетки и инкубировали 2 мин, затем фиксировали 2 мин в 2 % фосфотунгстате и визуализировали в электронном микроскопе Цейса при 80 kV. В случае иммуноэлектронной микроскопии (И-ЭМ) ЭМ-решетки после нанесения на них материала инкубировали в 0,5% растворе бычьего сывороточного альбумина и 0,1% желатине 1 ч, а затем с поликлональными анти-Ар антителами (SGY3160) 30 мин во влажной камере. После 2 отмывок материал инкубировали 30 мин с Протеином А, коньюгированным с частицами золота диаметром 10 нм, фиксировали 2% фосфотунгстатом и визуализировали в электронный микроскоп. Высокоэффективную Жидкостную Хроматографию . (ВЖХ) проводили в ВЖХ-системе фирмы Waters. Нативную ВЖХ-гельфильтрацию проводили на колонке Супероза 6/60 фирмы Pharmacia, США. Колонку уравновешивали и элюцию проводили буфером, содержащем 150 мМ NaCI, рН 7.3 и 1 мМ ЭДТА со скоростью потока 0.2 мл/мин и при длине волны детектора 214 нм. Обратно-фазную ВЖХ (ОФ-ВЖХ) вели на аналитической колонке Видак С4 (США). Аликвоты ЛПВП СМЖ растворяли в 200 мкл 20% ацетонитрила в 0,1% ТФУ и наносили на колонку. Элюцию проводили линейным градиентом 20-80% ацетонитрила в 0.1% ТФУ в течении 30 или 60 мин при скорости потока 0.5 мл/мин и длине волны детектора 214 нм. Фактор удержания вещества на колонке во всех случаях обозначали как к1 [к'= (tR х ts ) /ts, где tR— время задержания вещества в колонке или время элюции, ts— значение tR для вещества, не связавшегося с колонкой]. Гельэлектрофорез и иммуноблот анализ. Аликвоты ЛП СМЖ разделяли на Трис/Трициновом/SDS 10% и 14% ПААГе в редуцирующих условиях (200 мМ дитиотриетола), далее осуществляли электроперенос на Иммобилон Р мембраны. Мембраны либо окрашивали Кумаси, либо инкубировали с 5% раствором сухого молока в ЮмМ Na2HP04

+ 150 мМ NaCI, рН 7,4 и затем с различными антителами в течении 16 ч при 4°С. Специфическое связывание выявляли вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена. Флуорограммы готовили с использованием хемилюминисцентного реагента фирмы DuPont (США) согласно инструк-циям фирмы. Концентрацию Ар определяли

ности интересуемых белковых полос осуществляли методом автоматической Эдмановской деградации на 477А белковом анализаторе; образующиеся фенилгидантоиновые производные аминокислот определяли на подключенном к системе анализаторе фенилгидантоиновых производных аминокислот 120А (Applied Biosystem, США). Масс-спектроскопия. Очищенный методом ОФ-ВЖХ рАр и синтетический пептид Api-40 подвергали лазерному масс-спектроскопическому анализу.

В начальный момент времени в экспериментах, проводимых без пептидов, каждая контрольная проба содержала 6 мкл свежей плазмы крови, 3 мкл 150 мМ йодоацетата и 3 мкл инкубационного буфера (50 мМ фосфата натрия, pH 7,4), в то время как каждая тестируемая проба содержала 6 мкл плазмы крови и 6 мкл инкубационного буфера. В экспериментах с синтетическими пептидами Ар1-40, Api-28 или человеческим сывороточным альбумином (ЧСА), 3 мкл раствора пептида или белка и 3 мкл 150 мМ йодоацетата добавляли к контрольной пробе, содержащей 6 мкл плазмы, в то время как 3 мкл пептида и 3 мкл инкубационного буфера добавляли в каждую тестируемую пробу (6 мкл плазмы). Все пробы инкубировали при 37°С в течении 40 минут. Реакцию останавливали добавлением 3 мкл 150 мМ йодоацетата к тестирумым пробам и 3 мкл инкубационного буфера к контрольным пробам, где реакция была заингибирована в начальный момент времени. Затем 100 мкл цветного реагента добавляли в каждую пробу и инкубировали 45 мин при 37°С. Оптическую плотность образцов измеряли спектрофотомет-рически на аппарате ELISA (Cambridge Technologies, США) при длине волны 490 нм. Скорость этерификации холестерина в плазме определяли как разницу концентраций холестерина в тестируемой пробе и в пробе, где реакция была заингибирована йодоацетатом (% уменьшения свободного холестерина в час). Культура клеток. Клетки печени человека HepG2 были получены из американской коллекции культуры клеток (АККК, Роквилл, США). Клетки выращивали в минимальной среде ДМЕМ с 10% эмбриональной телячей сывороткой (ЭТС), 6,99 мМ L-глутамином и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептавидина) при 37°С в клеточном инкубаторе в атмосфере 5% С02 и 95% 02 в 6-луночных (35 мм. в диаметре) пластиковых микротестах для культивирования клеток.

осуществляли путем инкубирования клеток с 0,1 мкКи 14С-ацетата на лунку (0,5 мл ДМЕМ без ЭТС). Эксперименты проводили в присутствии различных концентраций синтетического пептида Ар1-40 или ЧСА и без пептада/ЧСА (контроль). После 3 ч инкубации клетки промывали с ДМЕМ

без ЭТС и инкубировали 24 ч без радиоактивной метки и пептида. По окончании инкубации внутриклеточные липиды экстрагировали три раза смесью гексан : изопропанол (3:2, объем/объем) в течении 30 мин. Экстрагированные липиды анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silica Gel G (Wattman, США). Непосредственно перед нанесением липиды растворяли в 20 мкл гексана. Разделение липидов проводили в системе петролиевый эфир: этиловый эфир: уксусная кислота (70:30:1, объем/ объем/ объем) и визуализировали парами йода. Области, соответствующие стандартам липидов вырезали из пластинок, помещали в сцинтилляционные пробирки с 2 мл сцинтилляционной жидкости (ICN, США) и анализировали степень радиоактивности в сцинтилляционном счетчике (Beckman, США). Статистические методы. Данные представлены в виде среднего значения с указанием стандартной ошибки. В экспериментах по определению влияния Aß пептидов на: 1) скорость этерификации холестерина плазмы крови и 2) степень включения 14С-ацетата в новосинтезированные липиды, достоверность различий средних величин в присутствии и в отсутствии синтетических пептидов определяли с помощью непараметрического критерия знаков Вилкоксона. Этот же критерий использовали для оценки различий в эффекте синтетических пептидов Aß1-40 и Aß1-28 на этерификацию холестерина в плазме крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение ассоциации pAß с ЛПВПЗ и ЛПОВП.

Основываясь на известных фактах ассоциации pAß с ЛПВПЗ и ЛПОВП в плазме крови и циркуляции в СМЖ только ЛПВП, представляло интерес изучить возможность взаимодействия pAß с липопротеинами этого класса в спинномозговой жидкости. Для этого различные классы липопротеинов СМЖ выделяли методом препаративного ультрацентрифугирования. Для специфической характеристики апобелко-вого состава выделенных ЛП все полученные фракции разделяли электрофорезом в ПААГе и окрашивали Кумаси. Белковый спектр был специфичен для каждого класса ЛП СМЖ (Рис.1а). Это подтверждали иммуноблот анализом с антителами против различных аполипопротеинов (ano): A-I, A-II, A-IV, В, C-II, Е, J и сывороточный альбумин A (CAA). Фракция с плотностью <1,063 г/мл содержала следовые количества апобелков ЛПВП СМЖ и не содержала апоВ, что свидетельствует об отсутствии апо-В содержащих фракций (ЛПОНП и ЛПНП) в нормальной СМЖ. Остальные фракции: ЛПВП2, ЛПВПЗ, ЛПОВП содержали в основном апоА-1 (28 кДа) и апоЕ (34кДа) и в меньшем количестве апоС (6-8 кДа). Альбумин (66 кДа), основной компонент ИЛПСМЖ, составлял около ~1-3% всего белка ЛПВП (Рис.1а). Анализ белково-липидного состава ЛП СМЖ выявил, что ЛПВП содержали по весу 38,2 % белка, остальное содержание представляли липиды: фосфолипиды (34,8 %), холестерин (18,8 %) и триацилглицерины (8,8 %). Свободная от липопротеинов СМЖ, в отличие от фракций ЛПВП содержала только свой специфический белок: al- антихимотрипсин.

Рис. 3. Высокоэффективная жидкостная гельфильтрация ЛПВПЗ и ЛПОВП СМЖ.

Фракции ЛПВПЗ (сплошная линия) и ЛПОВП (пунктирная линия) СМЖ подвергали ВЖХ гельфильтрации в нативных условиях. Позиция стандартов мол. массы указаны вверху. Иммуноблот анализ с моноклональ-ными анти-др (6Е10) антителами (вставка) выявил мономерную форму Ар только во фракции II ( ~ 200 кДа). Эта фракция обнаружила также иммунореактивностъ с антителами против аполипопротеи-нов: апоА-1, апоА-11, anoA-IV, апоЕ, ano J и CAA (данные не показаны).

8

200 66 29 1 1 1 1 I II IV V ffyjjgpт?, Ч» ¿«vulK&tlUCAfe*!

1 И м i i i i

IV V ■ 1

50

80

время,мин

110

Для выявления рАР в ЛП СМЖ, фракции, выделенные из 6 мл цельной СМЖ, разделяли на ПААГе, переносили на мембрану и анализировали с моноклональными антителами против Ар (6Е10). Растворимый Ар был обнаружен преимущественно в ЛПВПЗ (Рис.1 В, линия 3) и в ЛПОВП (линия 4). ЛПВП2 содержали значительно меньше рАр (линия 2), в то время как во фракциях ЛПОНП+ЛПНП (линия 1) и СЛПСМЖ (линия 5) рАр отсутствовал.

Локализация рАР в ЛПВП была подтверждена:

1) Анализом N-концевой аминокислотной последовательности белка (Рис.1 В, линия 3), по электрофоретической подвижности соответствующего синтетическому пептиду Api-40, использованного в качестве контроля (Рис. 1В, линия 6). Для этого область в 4 кДа вырезали из мембраны и подвергали автоматической Эдмановской деградации на белковом анализаторе. Полученная последовательность DAEFRXDXG (X-неидентифицированные аминокислоты) совпадала с аминоконцевой последовательностью Ар.

2) Иммуноэлектронной и электронной микроскопией. Эпитопы Ар были обнаружены на поверхности ЛПВПЗ и ЛПОВП (Рис. 2А). Эти Ар-содержащие ЛП частицы имели сферическую форму и средний диаметр 16,8±3,2 нм, соответствующий диаметру ЛПВП СМЖ.

3) Высокоэффективной жидкостной хроматографией ЛПВПЗ и ЛПОВП на гельфильтрационной колонке (Рис. 3). После гельфильтрации все хроматографические фракции диализовали против воды, лиофилизировали, разгоняли на гельэлектрофорезе, переносили на мембрану и анализировали иммуноблот анализом с антителами против различных апобелков: A-I, A-ll, A-IV.E и CAA. Все эти аполипопротеины были выявлены во втором хроматографическом пике (пик II, Рис. 3). Этот пик с

молекулярной массой -200 кДа, соответствующей известной молекулярной массе ЛПВПЗ, обнаружил также иммунореактивность с антителами против <\р (Вставка, Рис. 3).

Полученные результаты являются доказательством положения, что эАр в СМЖ ассоциирован с ЛПВП, в частности с ЛПВПЗ и ЛПОВП. Подобное взаимодействие ранее было обнаружено и в плазме крови, что тозволяет сделать заключение об ассоциации рАр с ЛПВП как общем чвлении, которое может иметь место и в биологических жидкостях, и в гканях целостного организма.

Выделение нативного рАр из спинномозговой жидкости.

Обнаружение рАр в ЛПВП СМЖ и его относительно высокая юнцентрация в СМЖ по сравнению с плазмой крови послужило основанием для его выделения из этих частиц. Выделение рАр имело эольшой практический интерес, поскольку на сегодняшний день не :уществует метода выделения нативного рАр и все физико-химические :войства этого белка изучаются на примере его синтетических гомологов. 3 настоящем исследовании предлагается оригинальный, быстрый и простой метод выделения нативного рАр.

Метод выделения включает две основные стадии:

1) выделение Ар- содержащей тотальной фракции ЛПВП из СМЖ методом ультрацентифугирования при плотности < 1,25 г/мл. На этом этапе степень очистки рАр составила примерно 100 раз;

2) двухэтапная обратно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография, выделенных ЛПВП. На первом этапе ОФ-ВЖХ ЛП высокой плотности СМЖ проводили с 30 минутным градиентом ацетонитрила. Профиль элюции представлен на Рис. 4А. Все хроматографические фракции были разделены на ПААГе и окрашены Кумаси для выявления белкового спектра. Во фракциях 8-11 выявлялись два основных белка, по молекулярной массе соответствующих ano A-I (28 кДа) и апоЕ (34 кДа). Для специфического выявления рАр и апобелков, белки геля перенесили на мембрану и окрашивали иммунохимически с моноклональными анти-Ар (6Е10) антителами и антителами против различных апобелков: A-I, Е, A-IV, J, CAA (данные не показаны). Около 80% рАр было выявлено во фракциях 4 и 5 (Рис. 4А, фракции 4-5: к'=1,93-1,96). Остальные 20% рАр были обнаружены в других фракциях: в альбуминсодержащей фракции, которая элюировала сразу после рАр (Рис. 4А, фракция 6: к'=2,1), и во фракциях, юдержащих апоА-1, апоЕ, ano С и другие апобелки ЛПВП СМЖ (Рис. 4А, фракции 8-11: к'=2,6-3,52). Для получения более чистой фракции рАр был проведен дополнительный этап очистки на ОФ- ВЖХ. Фракции 4-5, собранные в пяти хроматографических экспериментах, объединяли и лиофилизи-эовали; объединенную фракцию подвергали ОФ-ВЖХ с 60 минутным ■радиентом ацетонитрила (Рис. 4В). Все хроматографические фракции эазделяли на ПААГе и переносили на мембрану. Иммуноблот анализ с моноклональными анти-Ар антителами (6Е10) выявил рАр преимущественно

Габлица 1. Выделение рАр из спинномозговой жидкости здоровых доноров (60 мл).

Ступени очистки (Объем Общий Степень

(мл) белок рАр (нг) очистки (%)

. Цельная СМЖ 60 *21.25 мг — —

I. Ультрацентрифугиро-

вание СМЖ при 1.25 г/мл 6 0.25 мг 451 100

(выделение ЛПВП)

II.1-ая ОФ-ВЖХ, 30 мин 2 0.5 мкг 357 50000

градиент (фракции 4/5, х5)

2-ая ОФ-ВЖХ, 60 мин

градиент (фракция 7) 0.25 — 250 .100000

о фракции 7 (Рис.5, линия 7). Фактор к" для рАр в данных условиях роматографической элюции составил 2,96 (Рис. 4В, фракция 7) и совпадал о значением фактора к' для синтетического пептида АР1-40, спользованного в качестве контроля.

Следует отметить, что выделенный рАр был представлен ономерной и димерной формами (Рис. 5, линии 7-11). Однако димерная орма белка полностью отсутствовала в случае иммуноблот анализа ативных ЛПВП (Рис. 1) и ЛПВП, подвергнутых нативной гельфильтрации эис. 3, вставка). Это наблюдение можно объяснить тем, что при репаративном ультрацентифугировании, равно как и при гельфильтрации, роводимой в нативных условиях, ЛПВП СМЖ сохраняют свою изиологическую целостность, в то время как органический растворитель ри ОФ-ВЖХ приводит к разрушению липопротеиновых частиц. Возможно, го при этом нарушается физиологическая ассоциация рАр с ЛПВП СМЖ , как следствие, приводит к его димеризации. С другой стороны, такое эведение может отражать хроматографические свойства самого белка, эскольку синтетический пептид АР1-40 ведет себя аналогично, т.е. имеризуется в течении ОФ-ВЖХ. Таким образом, на основании слученных результатов можно сделать предположение о важности чпидного окружения для поддержания рАр в физиологической энформации.

Выделенный рАр также был охарактеризован анализом Ы-конце->й аминокислотной последовательное™ и масс-спектроскопией. Таким 5разом, с помощью комбинации ультрацентрифугирования и ОФ-ВЖХ далось быстро и эффективно выделить рАр из ЛПВП СМЖ со степенью 1истки белка 100000 раз (Таблица 1). Разработанный метод можно :пользовать' с целью получения нативного рАр в препаративных >личествах, необходимых для дальнейшего изучения его физико-шических и биологических свойств.

Изучение_влияния синтетических пептидов Ар на реакчи

этерификации холестерина.

Реакция этерификации холестерина плазмы крови катализируете ферментом ЛХАТ, который специфически локализуется в ЛПВПЗ плази, крови человека. Смысл реакции заключается в переносе остатка жирн< кислоты от фосфотидилхолина к гидроксильной группе холестерина, результате образуются эфиры холестерина и лизофосфатидилхолин.

Располагая фактом ассоциации рАр с ЛПВПЗ и ЛПОВП, а так> известной взаимосвязью рАр с Ano А-1, основным кофактором ЛХА представляло интерес проверить влияние рАр на реакцию этерификащ холестерина. С этой целью определяли скорость этерификащ эндогенного холестерина плазмы, крови здоровых доноров. Реакци этерификации оценивали путем прямого определения количест эндогенного свободного ХС в тестируемых образцах плазмы кров Реакцию проводили присутствии различных концентраций синтетическ пептидов Ар 1-40 и Ар1-28: 0,001; 0,01; 0,1; 1 и 10 нг/мл; в качест отрицательного контроля использовали ЧСА. Влияние синтетическ пептидов на реакцию этерификации выражали в процентах от контро! (без пептидов), принятого за 100%.Концентрация свободного холестери! в контрольной пробе (без пептида), где в начальный момент време! реакция была заингибирована, составляла 1,35±Д12 ммоль/л.

Добавление пептидов в реакционную среду в диапозо! физиологических концентрации рАр ингибировало этерификащ-холестерина (Рис. 6). Это позволяет сделать предположение о том, ч ингибирующий эффект Ар может иметь место и в физиологическ условиях. Максимальный эффект ингибирования составлял 40-50' Статистический анализ не выявил различий в действиях АР1-40 и Ар1-£ На основании этих данных было сделано заключение об ответственное внемембранной 1-28 аминокислотной последовательности Ар за ингибир ющий эффект. ЧСА не оказывал влияния на реакцию этерификац холестерина.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать выве что одной из возможных физиологических функций рАр являет ингибирование реакции этерификации холестерина в плазме крови.

Исследование влияния синтетического пептида Ар1-40 на синт внутриклеточных липидов.

Существующие в литературе экспериментальные доказательст нарушения мембранных липидов при БА, побудили к изучению влияния на биосинтез отдельных классов липидов. Общепризнанной моделью д изучения метаболизма липидов является клетки печени. Поэтому д исследования была выбрана культура клеток печени человека НерС Клетки инкубировали в присутствии синтетического пептида Api-40 концентрациях: 0 (контроль); 0,5; 1; 5; 10; 100 и 500 нг/мл среды. Как отри!

12Г

с.6. Влияние синтетических пептидов Ар1-40 и А01-28 на ерификацию холестерина в плазме крови.

Анализ эффекта синтетических пептидов Ар 1-40 и 1-28 на этерификацию 1естерина в пламе крови в зависимости от их концентрации проводили -ласно протоколу в главе "Экспери-нтальная часть". Данные представлены в це графика зависимости скорости эрификации холестерина ( % от контроля) концентрации пептидов (нг/мл): Ар1-40 ¡мные бары) и АР1-28 (светлые бары), оростъ этерификации холестерина в итроле (без пептида) была принята за 0%. Начиная с концентрации 0.1 нг/мл оих пептидов, ингибирование реакции ерификации было статистически значимо с0.05).

ЛР1-40 Л01-28

ю.7. Влияние синтетического пептида Ар1-40 на синтезы липидов сультуре клеток печени человека НерС2.

1ияние синтетического пептида Ар 1-40 на утриклеточный синтез холестерина и его иров (А), фосфолипидов (Б) и триглице-дов (В) оценивали по степени встра-ания С14-ацетата во вновь синтези-ванные липиды в печеночных клетках грв2. Клетки инкубировали в присутствии [зличных концентраций Ар 1-40. В качестве нтроля инкубацию проводили без штида (полученные значения принимали I 100%). Данные представляли в юцентах от контроля в виде среднего очения с указанием стандартной ошибки, =9. В диапозоне концентраций АР1-40 от | до 100 нг/мл среды эффект 1гибирования достигал своего насыщения составлял 40% для холестерина, 30% ш эфиров холестерина, 25% для >сфолипидов и 23% для триглицеридов.

тельный контроль использовали ЧСА. Влияние Ар1-40 на синте внутриклеточных липидов оценивали по степени встраивав радиоактивного 14С-ацетата во вновь синтезированные фосфолипид! свободный и этерифицированный холестерин и триацилглицерин! Внутриклеточные липиды экстрагировали и разделяли методе тонкослойной хроматографии. Области, соответствующие положени липидных стандартов, вырезали и степень их радиоактивности оценива/ на сцинтилляторе. Полученные данные для каждого класса липидс выражали как 14С-радиоактивностъ имп/мин на 1 мкг клеточного белка процентах от контроля (без пептида), принятого за 100%. Контрольнь значения (без пептида) для разных липидов составляли (имп/мин/ м> клеточного белка): 18,54_± 0,54 для фосфолипидов, 0,534_± 0,02 для свободного холестерина и его эфиров и 7,63±0,42 дл триацилглицеринов.

Синтетический пептид Ар1-40 оказывал ингибирующее действие и синтез внутриклеточных липидов разных классов, в частности на синте: фосфолипидов, свободного холестерина и его эфиров и триацилглицеринс (Рис. 7). Статистически значимые результаты ингибирующего эффект были получены при концентациях пептида 0,5-10 нг/ мл средь соответствующих физиологическим концентрациям рАр (концентрация Ар плазме крови 1 нг/мл , а в СМЖ 4-20 нг/мл). Это может отражать еще одн физиологическую функцию Ар в обмене липидов: регуляцию синтез внутриклеточных липидов. Ингибирующее влияние Ар1-40 н внутриклеточный синтез было различным для липидов разных классо! Наибольший эффект пептид оказывал на синтез свободного холестерин; ингибируя его синтез на ~40%. В меньшей степени были снижены синтез эфиров холестерина (на 30%), фосфолипидов (на 25%) и триацилглицерин ов (на 23%). ЧСА не оказывал влияния на синтезы липидов.

В диапозоне концентраций АР1-40 от 10 до 100 нг/мл среды эффек достигал своего насыщения. В физиологических условиях столь высоки концентрации Ар (100-500 нг/мл среды) маловероятны, однако таки концентрации могут иметь место локально в ткани мозга больных БА.

Обнаруженный эффект ингибирования синтеза липидов амилоидо Р, позволяет дать объяснение ряду экспериментальных наблюдений предложить следующую вероятную схему патогенеза р-амилоидозо мозга. Известно, что повышенное содержание холестерина в организм приводит к увеличению продукции Ар, высокие концентрации которого, п данным настоящей работы, в свою очередь ингибируют синте холестерина. С другой стороны в высоких концентрациях Ар полимерк зуется с образованием амилоидных отложений в ткани мозга, чт I составляет морфологическую и биохимическую основу главных признако I БА, СД и сенильной деменции.

Таким образом, обнаруженные ингибирующие эффекты амилоида на реакцию этерификации холестерина в плазме крови и на синте внутриклеточных липидов позволяют сделать заключение о важной рол

эго белка в регуляции обмена липидов. Наряду с этим, полученные нные об ассоциации Ар с липопротеинами высокой плотности дают -ювание рассматривать Ар в качестве непосредственного участника таболизма липидов. ,

ВЫВОДЫ

1. Растворимый Ар ассоциирован с липопротеинами высокой этности спинномозговой жидкости здоровых доноров, а именно с ЛПВПЗ 1ПОВП.

2. Липопротеины высокой плотности, с которыми ассоциирован рАр вдставляют собой сферические частицы со средним диаметром 16,8 нм и юлекулярной массой 200 кДа.

3. Нативный рАр был выделен из ЛПВП спинномозговой жидкости оровых доноров.

4. Синтетические пептиды Ар, длиной в 40 и 28 аминокислот, азывают ингибирующие влияние на реакцию этерификацию холестерина азмы крови здоровых доноров; максимальный эффект составляет 40-50%

5. Первые 28 аминокислот внемембранной последовательности Ар зечают за ингибирование реакции этерификации холестерина.

6. Синтетический пептид АР1-40 в культуре печеночных клеток pG2, оказывает ингибирующее действие на синтез внутриклеточных тидов. Этот эффект зависит от концентрации пептида.

7. Максимальный ингибирующий эффект АР1-40 на синтез дриклеточных липидов составляет: 40% для свободного холестерина, % для эфиров холестерина, 25% для фосфолипидов и 23% для чглицеридов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Is amyloid beta ап apolipoprotein? // In: Neiroscience Meeting Abstract □k. New York University Medical Center, New York, USA, 2-3 Dec.-1995 fleag. Koudinov A.R., Kumar A.

Alzheimer's peptides Api-40 and Api-28 inhibit the plasma cholesterol ierification rate // Biochem Mol Biol Internat- 1996.- Vol. 38 (4)- p. 747-752 / leag. Koudinov A.R., Berezov Т. Т./.

Амилоид p в плазме крови и спинномозговой жидкости ассоциирован 1ипопротеинами высокой плотности.// Вопр. Мед. Химии. - 1996. -т. 42.?. - с. /соавторы Кудинов А.Р., Березов Т.Т./

Alzheimers soluble amyloid protein in associated with high density Dproteins in normal human cerebrospinal fluid and is secreted by HepG2 cells a part of lipoprotein complexes. // 26th Annual Meeting, Society for uroscience Washington, DC, USA, 1996 (nov 16-21)- Abstract Book 22.-p. . lalleg. A.R. Koudinov, A. Kumar, R.S. Beavis, J. Ghiso.

THE AMYLOID BETA PROTEIN AND LIPID METABOLISM

N.V. Koudinova.

Department of Biochemistry, Russian Peoples' Friendship University.

Miklucho-Maklay St., 8, Moscow 117198, Russia.

SUMMARY

The amyloid fibrils of Alzheimer's disease and Down's syndrome amylc deposits are composed mainly of aggregated amyloid beta protein (Aß) whi also exists in a soluble form.The soluble form of amyloid ß protein (sAß) associated with high density lipoprotein (HDL) in normal human plasma, ascertain whether sAß to HDL association is a rather more general phenomen taking place in other biological fluids and reflecting sAß function(s) in lif metabolism the colocalization of sAß with lipoproteins (LP) in CSF and t effects of Aß peptides on plasma cholesterol esterification and on synthe: lipids in hepatoma cells were investigated. Normal human CSF LPs we obtained by sequential flotation ultracentrifugation and analysed for the presen of sAß via immunoblot, size-exclusion (SE) HPLC, immunoelectron microscof N-terminal sequence and mass-spectrometry analyses. Soluble Aß w associated with ~200 kDa CSF-HDL particles of 16.8 ± 3.2 nm in diameter. ~4.3 kDa component purified by reverse phase HPLC was immunoreactive w anti-Aß antibodies, exhibited an N-terminal sequence identical to the Aß pepti and a mass of 4325.1 Da, indicating that the main sAß specie associated w CSF-HDL is sAß1-40. Our novel method for purification of sAß can be used the peptide preparative isolation for its further studies.

The studies of the effect of synthetic peptides Aß1-40 and Aß1-28 normal human plasma cholesterol esterification, accessed colourimetrica revealed that both peptides at a concentration of 1 ng/ml inhibited plasi cholesterol esterification rate to 40-50 % of control value. Statistical analy showed no differences in the effect of Aß1-40 and Aß1-28 on the inhibiti« suggesting the importance of Aß sequence 1-28 for this effect.

We also studied the effect of synthetic peptide Aß1-40, homologous to 1 major circulatory specie of alzheimer's amyloid ß protein (Aß), on multiple li| biosyntheses in human hepatoma HepG2 cells. This culture synthesize varic lipids from [14C]-acetate as a precursor. Treatment of cells with differi concentrations of Aß1-40 decreased the syntheses of various radiolabeled li species. The decrease reached saturation at the peptide concentration equal to 100 ng per ml of media. The lipids whose synthesis was most decreased wi free and esterified cholesterol and phospholipids. This inhibitory effect sugg that Aß protein may modulate physiological intracellular lipid syntheses. It a may be of special importance in the pathological condition and contribute to neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders.Our resi suggest that sAß to LP association represents a common mechanism for peptide transport in biological fluids and that sAß has important functions in li metabolism.