Дифференциальная композиция эпигенетических маркеров сегментов метафазных хромосом человека

Ефимова, Ольга Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дифференциальная композиция эпигенетических маркеров сегментов метафазных хромосом человека
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Дифференциальная композиция эпигенетических маркеров сегментов метафазных хромосом человека"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

005054420

ЕФИМОВА Ольга Алексеевна

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ СЕГМЕНТОВ МЕТАФАЗНЫХ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

Специальность: 03.02.07 - генетика

- 8 НОЯ 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2012

005054428

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д О. Отга» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук и в Санкт-Петербургском государственном университете

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Кузнецова Татьяна Владимировна, в.и.с. ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Родионов Александр Викентьевич,

заведующий лабораторией биосистематики и цитологии ФГБУН Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Паткин Евгений Львович,

заведующий лабораторией молекулярной цитогенетики развития млекопитающих ФГБУ НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Ведущая организация:

ГНУ ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии

Защита состоится И ОЯ %/> Я 2012 г. в Ой часов на заседании

диссертационного совета Д 212.232.12 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Санкт-Петербург, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.232.12

доктор биологических наук

Мамон Людмила Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопрос о принципах и механизмах, лежащих в основе дифференциальной экспрессии генов в индивидуальном развитии человека, представляется крайне актуальным на сегодняшний день. Остается до конца неясным, как в условиях идентичности наследственного аппарата, при одинаковом наборе генов во всех клетках, возникает многообразие клеток и тканей.

Важнейшим условием корректной реализации наследственной информации на разных этапах онтогенеза является дифференциальная активность генов, которая определяется составом и структурой хроматина. Профили экспрессии генов устанавливаются и поддерживаются за счет наследуемых эпигенетических модификаций хроматина. К эпигенетическим модификациям хроматина относят метилирование цитозина ДНК и посттрансляцнонные модификации гистоновых белков. Под метилированием ДНК понимают обратимую энзиматическую реакцию, в результате которой происходит присоединение метальной группы к 5 положению остатков цитозина в динуклеотиде 5'-CpG-3' (Ванюшин, 2006; Senner, 2011). Модификации аминокислотных остатков гистоновых белков, к числу которых относят ацетилирование, метилирование, убиквитинирование и фосфорилирование происходят, в основном, в N-терминальных участках, которые расположены за пределами компактного октамера и могут подвергаться действию различных клеточных сигналов. В результате метилирования ДНК и модификаций гистонов устанавливается специфичный структурно-функциональный статус хроматина и осуществляется эпигенетическая регуляция транскрипционной активности, специфичная для разных типов клеток и/или этапов онтогенеза (Dhall, Chatterjee, 2011). Таким образом, клетки с идентичным геномом и разными фенотипами характеризуются разными эпигеномами.

Актуальным представляется вопрос, когда устанавливаются, как изменяются и каким образом поддерживаются в хроматине схемы расположения эпигенетических маркеров, специфичные для различных тканей и разных стадий развития. Определенная информация на эту тему получена на модельных объектах (Miyanari et al., 2010; Zhao et al„ 2010; Smallwood et al., 2011). В период доимплантационного развития происходит интенсивная эпигенетическая реорганизация генома, изменяются профили метилирования ДНК, унаследованные из родительских гамет - высокоспециализированных клеток, - и устанавливается собственно эмбриональный рисунок метилирования ДНК, направляющий дифференцировку бластомеров во все многообразие типов клеток и тканей организма (Feng et al., 2010). Нарушения этого процесса могут приводить к сбою программы онтогенеза, формированию аберрантных профилей экспрессии генов, и, как следствие, тяжелым патологиям или остановке развития (Haaf, 2006). Таким образом, информация о динамике эпигенетических изменений родительских геномов имеет как фундаментальную, так и практическую значимость. Следует, однако, учитывать, что многие ключевые процессы эмбриогенеза, включая оплодотворение, первые деления дробления, время активации генома и эпигенетическое репрограммирование, являются видоспецифичными (Beaujean et al., 2004; Shi et al., 2004; Hou et al., 2005; Fulka et al., 2006), что не позволяет экстраполировать все данные, полученные на модельных объектах, на человека.

Уникальная возможность изучения доимплантационного развития человека, в том числе выявление причин его нарушений, появилась с разработкой и внедрением в медицинскую практику вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Однако, исследования динамики эпигенетических изменений в эмбриональном развитии человека остаются ограниченными по ряду причин, связанных, прежде всего, с труднодоступиостью материала и этическими факторами, вплоть до полного запрета в некоторых странах проведения исследований на эмбрионах человека. Не освещенным остается вопрос о том, каким образом происходит репрограммирование родительских геномов при первых делениях дробления эмбрионов Человека. Данные о динамических и тканеспецифических изменениях эпигеиома при дифференцировке клеток в постимплантационном развитии человека также остаются неполными. Большинство исследований модификаций гистонов и метилирования ДНК сфокусированы на описании эпигенетических изменений отдельных локусов, и лишь небольшая часть работ посвящена оценке эпигенетического статуса всего генома. Следует подчеркнуть, что наиболее часто изучение модификаций гистонов и метилирования ДНК проводят на интерфазных ядрах (Fulka et al., 2004; Beaujean et al., 2004; Xu et

al., 2005; Skalníková et al., 2007). Ограничение таких исследований состоит в невозможности определения времени стирания/установления эпигенетических маркеров в отдельных локусах. Между тем, участки генома неоднородны по структуре и имеют разное функциональное значение. Оценить набор эпигенетических маркеров как всего генома в целом, так и его отдельных участков позволяет выявление метилированной ДНК и модифицированных гистонов на метафазных хромосомах.

Для изучения метилирования ДНК метафазных хромосом разработаны подходы, позволяющие прямо или косвенно определить характер распределения метилированных остатков' цитозина. К таким подходам относятся обработка митотических хромосом метилчувствительными эндонуклеазами рестрикции, ник-трансляция in situ с предварительной обработкой метилспецифичными рестриктазами (Adolph, Hameister, 1990), PRINS и SPR]NS (Andersen et al., 1998). Наиболее перспективным является метод иммуноцитохимической детекции 5-метилцитозина с помощью высокоспецифичных моноклональных антител. Метод иммуноцитохимического окрашивания применяют также для детекции модифицированных гистонов. Использование антител позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты. Отмечают, что использование иммуноцитохимического подхода для оценки эпигенетического статуса генома особенно целесообразно при работе с отдельными клетками, в том числе с бластомерами ранних зародышей (Santos, Dean, 2006).

Наибольший интерес для изучения эпигенома человека представляют бластомеры ранних зародышей, клетки из эмбриональных и экстраэмбриональные тканей на разных стадиях эмбриогенеза человека и мезенхимные стволовые клетки в сравнительном аспекте с клетками в терминальной стадии дифференцировки. На их примере можно проследить динамику изменений и установить вклад эпигенетических модификаций в репрограммирование генома в эмбриогенезе.

Целью настоящего исследования было:

Охарактеризовать распределение метилированной ДНК и ацетилированного гистона НЗ на метафазных хромосомах в клетках различных тканей человека в пре- и постнатальный период развития.

Задачи:

1) Локализовать участки, обогащенные 5-метилцитозином, на дифференциально окрашенных метафазных хромосомах из разных тканей на эмбриональной и постнатальной стадиях онтогенеза человека.

2) Сопоставить на метафазных хромосомах из лимфоцитов взрослых индивидов и плодов человека рисунок распределения ацетилированного гистона НЗ с QFH-исчерченностью и рисунком распределения 5-метилцитозинобогащепной ДНК

3) Изучить характер метилирования ДНК метафазных хромосом в бластомерах дробящихся зародышей человека.

4) Охарактеризовать тканеспецифические особенности метилирования ДНК метафазных хромосом из лимфоцитов, мезенхимных стволовых клеток, цитотрофобласта хориона, эмбриональных печени и легкого человека.

5) Провести анализ распределения 5-метилцитозина вдоль плеч хромосом X в лимфоцитах и цитотрофобласте хориона при нормальном и аберрантном кариотипе.

6) Оценить и провести сравнительный анализ статуса метилирования блоков прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 в клетках из разных тканей на доимплантационной, эмбриональной и постнатальной стадиях онтогенеза человека.

Научная новизна. Впервые проведен иммуноцитохимический анализ метилирования ДНК метафазных хромосом из мезенхимных стволовых клеток, эмбриональных и экстраэмбриональных тканей в сравнительном аспекте с лимфоцитами взрослых индивидов человека. Выявлено сегментспецифичное распределение метилированных участков вдоль плеч хромосом, повторяющееся в клетках из разных тканей, определенное нами, как МеС-сегментация. Впервые описана динамика изменений характера метилирования ДНК метафазных хромосом доимплантационных зародышей человека. Впервые проведено сравнительное иммуноцитохимическое исследование особенностей распределения ацетилированного гистона НЗ

на метафазных хромосомах лимфоцитов взрослых и плодов человека. Продемонстрированы ткане-и стадиоспецифические особенности метилирования ДНК и ацетилирования гистона НЗ метафазных хромосом человека.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы вносят вклад в освещение принципов эпигенетической регуляции организации и работы генома в онтогенезе человека. Описанная в работе динамика изменений метилирования ДНК метафазных хромосом в доимплантационном, эмбриональном и постнатальном развитии человека позволяет приблизиться к пониманию вклада эпигенетических модификаций в репрограммирование как всего генома, так и его отдельных локусов.

Полученные результаты могут служить основой при разработке и совершенствовании методов оценки функционального состояния генома. Выявление отклонений в характере эпигенетического модифицирования генома может быть информативным при использовании ВРТ, проведении пренатальной диагностики, а также при оценке негативного влияния внешних факторов на работу генома.

Положения, выносимые на защиту:

1) Распределение 5-метилцитозинобогащенной ДНК в метафазных хромосомах человека, выявляемое иммуноцитохимическим методом, представляет собой особый тип рисунка линейной дифференцированное™ хромосом - МеС-сегментацию.

2) Степень обогащения отдельных сегментов метафазных хромосом человека метилированной ДНК и/или ацетилированным гистоном НЗ тканеспецифична и зависит от срока развития.

3) Хромосомы обоих родительских геномов в доимплантационном развитии человека со стадии зиготы до стадии бластоцисты подвергаются градуальному деметилированию, проходя стадию гемиметилирования на стадии 2-х клеток.

4) Установление сегментной специфичности распределения 5-метилцитозинобогащенной ДНК на метафазных хромосомах происходит в доимплантационном развитии человека на стадиях 8-ми клеток - бластоцисты.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на Европейской конференции по генетике человека (European Human Genetics Conference) в 2005, 2007, 2008 г., Международной конференции «Генетика в России и мире» в 2006 г., Британской конференции по генетике человека (British Human Genetics Conference) в 2006 г., Европейской конференции по эпигенетике (Epigenetics Europe) в 2010 г. и Европейской конференции по цитогенетике (European Cytogenetics Conference) в 2009 и 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 работ (10 статей, 28 тезисов конференций), в том числе 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (322 источника). Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 29 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом исследования служили препараты метафазных хромосом, полученные из:

- лимфоцитов периферической крови 20 взрослых индивидов человека, направленных на кариотипирование в НИИ АГ им. Д.О. Отга СЗО РАМН;

- лимфоцитов пуповинной крови 15 плодов человека 20-24 недель развития, полученной путем кордоцентеза с целью проведения пренатальной диагностики в НИИ АГ им. Д.О. Отга СЗО РАМН;

- эмбриональных печени и легкого 4 эмбрионов человека, полученных в результате искусственного прерывания беременности по желанию пациенток на сроке 5-8 недель в НИИ АГ им. Д.О. Отга СЗО РАМН;

- 20 образцов хориона, полученных методами хорион- или плацентобиопсии на сроке беременности 9-20 недель с целью пренатального кариотипирования, при прерывании беременности по желанию пациенток на сроке 5-12 недель и при прерывании неразвивающейся беременности на сроке 5-8 недель в НИИ АГ им.Д.О.Отта СЗО РАМН;

- культур мезенхимных стволовых клеток 3-5 пассажа, любезно предоставленных ООО «Транстехнологии». МСК выделяли из эксплантов костного мозга грудины 5 взрослых индивидов

человека; фенотипирование и культивирование проводили по описанной ранее методике (Шалыгина и др., 2009; Grigorian et al., 2010).

- бластомеров 78 доимплантационных триплоидных и морфологически аномальных диплоидных зародышей человека различных стадий развития - от зиготы до бластоцисты, полученных в результате экстракорпорального оплодотворения в Международном центре репродуктивной медицины и в отделении вспомогательных репродуктивных технологий НИИ АГ им. Д.О. Отта С 30 РАМН.

Культивирование лимфоцитов периферической и пуповинной крови проводили по стандартной методике с собственными модификациями (Кузнецова и др., 1999). Препараты метафазных хромосом из хориона и эмбриональных органов готовили «прямым» методом без предварительного культивирования по стандартной методике с собственными модификациями (Чиряева и др., 2012). Препараты метафазных хромосом из бластомеров доимплантационных зародышей готовили, согласно описанной ранее методике (Dyban et al., 1993), с собственными модификациями (Баранов и др., 2005; Pendina et al., 2011). Детекцию 5-метилцитозина (5-МеС) и ацетилированного гистона НЗ (АсНЗК9) на препаратах проводили с помощью специфических антител и ПТС/СуЗ-коньюгированных вторых антител при уровне разрешения -400 и -300 сегментов, соответственно (ISCN, 2009). Детекцию 5-МеС проводили на зафиксированных уксусно-спиртовым фиксатором (1:3) и QFH/AcD-окрашенных метафазных хромосомах. Детекцию АсНЗК9 проводили на зафиксированных 2% спиртовым раствором уксусной кислоты фрагментах метафазных пластинок, содержащих 5-15 хорошо идентифицируемых хромосом, не налегающих друг на друга. Для идентификации хромосом применяли АТ-специфичный краситель DAPI.

Анализ препаратов проводили с помощью микроскопа LEICA DM LS, оборудованного объективами FLUOTAR 20х/0,40 и 100х/1,30-0,60, автоматической фотонасадкой, цветной камерой Leica DFC 320, блоком светофильтров. Для получения фотооизображения использовали программное обеспечение Leica DFC Twain. Распределение и интенсивность флуоресцентного сигнала оценивали визуально и с помощью программного обеспечения Image J 1.34s.

Для визуальной оценки различий использована балльная система: AT-5-MeC флуоресценцию оценивали визуально по пятибалльной шкале (0 - отсутствие сигнала; 1 - очень слабый сигнал; 2 - слабый сигнал; 3 - сигнал средней интенсивности; 4 - сильный сигнал); АТ-АсНЗК9 флуоресценцию оценивали визуально по четырехбалльной шкале (0 - отсутствие сигнала; 1 - очень слабый сигнал; 2 - слабый сигнал; 3 - сигнал средней интенсивности). Проводили индивидуальный анализ каждой хромосомы кариотипа из разных метафазных пластинок. Каждому сегменту данной хромосомы присваивали определенное количество баллов на основе визуальной оценки уровня его флуоресценции в гомологичных хромосомах на 10 метафазных пластинках. Результирующий балл определяли по простому большинству присвоенных значений.

Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения Image J 1.34s проводили на цифровых фотоизображениях иммуноокрашенных хромосом. Каждому пикселю в выделенной области изображения автоматически присваивалось значение от 0 до 255, в зависимости от его оттенка серого в 8-ми битном режиме. Средняя интенсивность свечения выделенной области рассчитывалась автоматически при суммировании значений, присвоенных всем пикселям, и делении полученной суммы на количество пикселей. Построение кривой распределения сигнала производилось на основе абсолютных значений свечения пикселей, лежащих в проведенной по объекту линии, шириной в один пиксель.

Достоверность различий интенсивности флуоресценции сравнивали в программе STATISTICA 8.0 с помощью t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни для малых выборок и с помощью критерия Крускала-Вэллиса при сравнении сегментов в гомологичных триадах и тетрадах хромосом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Феномен сегментспецифичной локализации эпигенетических маркеров на метафазных хромосомах человека

При иммуноцитохимическом анализе метафазных пластинок из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови взрослых индивидов (72 метафазных пластинки 7 взрослых индивидов) выявлена гетерогенность распределения сайтов связывания антител к 5-метилцитозину

(АТ-5-МеС) вдоль плеч всех хромосом набора (рис.1). Сегментная локализация флуоресцентных сигналов установлена при сопоставлении на совмещенных кариограммах фотоизображений хромосом после (2РН/АсО и иммунофлуоресцентного окрашивания. Большинство сайтов связывания моноклональных антител к 5-метилцитозину были локализованы в С>РН/АсО-негативных сегментах, соответствующих Я-блокам. Высокая плотность сайтов связывания антител к 5-метилцитозину также была отмечена в районах прицентромерного гетерохроматина хромосом 1,9, 16, гетерохроматиновом блоке хромосомы У и в коротких плечах акроцентрических хромосом групп О (хромосомы 13, 14, 15) и в (хромосомы 21, 22). Различий между гомологичными хромосомами выявлено не было. Характер распределения 5-МеС сигналов повторялся на всех метафазных пластинках и не характеризовался индивидуальной специфичностью.

Рис.1. Метафазная пластинка из лимфоцита взрослого индивида после С}РН окрашивания (а) и иммунофлуоресцентной детекции 5-метилцитозина с помощью моноклональных антител (б).

Эти результаты, в целом, согласуются с данными других авторов. Следует отметить, однако, что в первом исследовании, проведенном с помощью антител к 5-метилцитозину, была зарегистрирована высокая степень метилирования центромерных районов хромосом у мыши и блоков конститутивного гетерохроматина хромосом 1, 9, 16, 15 и Y у человека, тогда как специфичной исчерченности хромосом выявить не удалось (Miller et al., 1974). Аналогичные результаты были описаны в работах других авторов (Lubit et al., 1976; Montpellier et al., 1994). Сегментспецифичное распределение сайтов связывания антител к 5-метилцитозину вдоль плеч метафазных хромосом человека впервые было выявлено в работе Барбин с соавторами (Barbin et al., 1994). Подчеркнем, что в вышеупомянутых исследованиях биологические причины дифференциального метилирования хромосом практически не обсуждаются и иммуноцитохимическое окрашивание хромосом рассматривается в качестве способа диагностики предраковых состояний, сопровождающихся изменениями статуса метилирования ДНК (Barbin et al., 1994; Montpellier et al., 1994; Pfarr et al., 2005).

На наш взгляд, отдельного внимания заслуживает сам феномен сегментной специфичности локализации на хромосомах 5-метилцитозинобогащенной ДНК. На основании полученных результатов нами предположено, что распределение обогащенных 5-метилцитозином участков ДНК вдоль плеч хромосом представляет собой особый тип дифференциальной исчерченности, объединяющий все Т-, большинство R-сегментов, блоки прицентромерного гетерохроматина и районы коротких плеч акроцентрических хромосом. Идентифицированы характерные морфологические маркеры (табл.), по которым можно идентифицировать пары гомологов, а наблюдаемый рисунок поперечной исчерченности назван МеС-сегментацией (от англоязычного обозначения 5-метилцитозина - 5-МеС) (Пендина и др., 2005).

Для проверки наличия МеС-рисунка на хромосомах из клеток разных типов проведена иммуноцитохимическая детекция 5-метилцитозина на препаратах метафазных хромосом из мезенхимных стволовых клеток взрослых индивидов (30 метафазных пластинок 5 индивидов), лимфоцитов плодов (49 метафазных пластинок 5 плодов 20-24 недель развития), из клеток хориона (76 метафазных пластинок 9 эмбрионов), печени и легкого эмбрионов с нормальным кариотипом (32 метафазных пластинки из клеток печени и 29 - из клеток легкого от 4 эмбрионов 5-8 недель развития) (рис. 2). Во всех случаях наблюдали преимущественную локализацию AT-5-MeC

сигналов в Я- и Т-сегментах, в коротких плечах акроцентрических хромосом, в конститутивном гетерохроматине (Ефимова и др., 2009).

Таблица

Характерные морфологические маркеры, выявляемые на метафазных хромосомах из лимфоцитов

Хромосома № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Сегмент р36 р25 р25 р16 р 15 q23 р22 р23 р12 р15 Р15

q\2 р23 р21 Я35 431 р21 Я11.2 Р21 Я34 р13 Ч13

421 Я37 421 Я35 q25 q22 q24 ян.2 Я23

q42 q27 Я27 q36 Я26

q29

Хромосома № 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Сегмент р13 ql2 q24 р! 1.2 Р13 р13 р11.2 Р13 р13 р11.2 р11.2

q24 q32 q32 q24 1.2 Ч21 Я23 Я13 Я11.2 Я22 Я11.2

Я34 q26 q24 Я25 Я13 а!3

Характерное сегментспецифичное распределение 5-метилцитозинобогащенной ДНК также обнаружено в дополнительных и структурно-перестроенных хромосомах из клеток хориона при неразвивающейся беременности: при наличии в кариотипе дополнительных хромосом 7, 9, 13, 16, 17, при триплоидии и в случае кариотипа 47,ХХ,1(7)(я10),+1(7)(р10) (рис. 3). Отличия, специфичные для разных тканей, выявлены лишь в степени метилирования отдельных сегментов. Проведенный сравнительный анализ позволил сделать вывод об одинаковом типе распределения 5-метилцитолзинобогащенной ДНК вдоль плеч хромосом в исследованных тканях в пренатальный

Рис.2. МеС-сегментация метафазных хромосом из мезенхимной стволовой клетки взрослого индивида человека (а), лимфоцита пуповинной крови плода 22 недель развития (б), цитотрофобласта хориона (в), печени (г) и легкого (д) эмбриона 5/6 недель развития после

иммуноцитохимической детекции 5-метилцитозина с помощью моноклональных антител.

■

% *

* щ.я • - 1 - .. в *■ ,*.

<1 г*

р,

- 'г » « ~ ч . - ."У •" V •■ , V -V * * ... % .» 1 < « .

Рис. 3. Распределение АТ 5-МеС флуоресцентного сигнала по длине нормально и структурно

перестровенной хромосомы 7. Слева -гомологичные хромосомы 7 после ОРН и иммуноокрашивания: триада из клеток цитотрофобласта с кариотипом 47,ХХ,Н7)(Ч10),+1(7)(РЮ); в центре -идиограммы 5-МеС и С>РН исчерченности хромосомы 7; справа -гомологичные хромосомы 7 после <2РН и иммуноокрашивания при

нормальном кариотипе.

Таким образом, рисунок МеС-сегментации был выявлен на всех метафазных пластинках из ФГА-стимулированных лимфоцитов, мезенхимных стволовых клеток, клеток хориона и эмбриональных тканей. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что МеС-сегментация действительно является типом дифференциальной исчерченности хромосом человека.

На следующем этапе работы проведено иммуноцитохимическое исследование распределения на метафазных хромосомах из лимфоцитов взрослых индивидов и плодов человека другого эпигенетического маркера — ацетилированного по лизину в 9-м положении гистона НЗ (АсНЗК9). Проанализировано 180 фрагментов метафазных пластинок из лимфоцитов 13 взрослых и 120 фрагментов - из лимфоцитов 10 плодов человека 20-22 недель развития. Установлено неравномерное распределение АТ-АсНЗК9-сигналов по длине метафазных хромосом взрослых индивидов и плодов человека с локализацией в DAPI-негативных сегментах хромосом, соответствующих R-сегментам (рис.4). Характер исчерченности индивидуальных хромосом повторялся на всех фрагментах метафазных пластинок.

Известно, что ацетилирование гистона НЗ характерно для транкрипционно активного хроматина. Принимая во внимание более высокую плотность генов в R-сегментах по сравнению с G-сегментами (Родионов, 1985; Bicmore, Sumner, 1989), наблюдаемая в нашем исследовании специфика локализации АсНЗК9 может быть объяснена высоким и низким уровнем транскрипционной активности хроматина этих сегментов.

В МеС+ и АсНЗК9+-районах хромосом выявлена варьирующая в зависимости от сегмента интенсивность флуоресценции. На основе сравнения распределения AT-5-MeC и АТ-АсНЗК9 флуоресцентных сигналов с QFH/AcD и DAPI-исчерченностью, а также с учетом различий в интенсивности флуоресценции, были составлены идиограммы всех аутосом кариотипа (рис.5, 6).

Наиболее яркий AT-5-MeC флуоресцентный сигнал (4 балла) установлен в 54 из 157 R-сегментов у взрослых и 46 из 157 R-сегментов у плодов, блоках прицентромерного гетерохроматина хромосом 1 и 16 и коротких плечах больших и малых акроцентриков. Флуоресценция средней интенсивности (3 балла) зарегистрирована в 53 R-сегментах у взрослых и в 64 у плодов, а также в блоке прицентромерного гетерохроматина хромосомы 9. Слабый флуоресцентный сигнал (2 балла) характерен для 33 R-сегментов у взрослых индивидов и 35 у плодов. Во всех QFH-позитивных блоках, соответствующих G-сегментам, флуоресцентный сигнал был очень слабым (1 балл), а в центромерных участках отсутствовал (0 баллов). Следует отметить, что в 17 R-сегментах у взрослых и в 12 у плодов интенсивность флуоресценции сопоставима с таковой в G-сегментах, т.е. очень слабая (1 балл) (рис.5, отмечено красным). Выявленные в нашем исследовании различия в интенсивности AT-5-MeC флуоресценции сегментов хорошо согласуются с особенностями их нуклеотидного состава. Известно, что для R- и G-сегментов характерен разный нуклеотидный состав: R-диски являются более GC-богатыми, по сравнению с G-, и, следовательно, содержат больше потенциальных сайтов связывания AT-5-MeC. Наблюдаемые отличия в степени обогащения 5-метилцитозином R-сегментов объясняются более ярко выраженной неоднородностью их нуклеотидного состава по сравнению с G-сегментами (Saccone, Bernardi, 2001).

Хроматин, имеющий АТ-АсНЗК9 сигнал средней интенсивности (3 балла) зарегистрирован в 33 R-сегментах у взрослых и у плодов. Сигнал слабой интенсивности (2 балла) выявлен в 62 R-сегментах хромосом у взрослых и в 59 R-сегментах хромосом у плодов человека. Участки, имеющие очень слабый флуоресцентный сигнал (1 балл) - наименее обогащенные ацетилированным гистоном НЗ, - во всех G-сегментах и в 38 R-сегментах хромосом у взрослых и в 42 R-сегментах хромосом у плодов. Флуоресцентного сигнала не выявлено (0 баллов) в прицентромерном гетерохроматине хромосом 1, 9 и 16 у взрослых индивидов и плодов человека. Варьирующая степень ацетилирования R-блоков может отражать разную транскрипционную активность локализованного в них хроматина.

Обратило на себя внимание гипометилированное состояние двух сегментов хромосомы 9 (9р13, 9q22) и одного хромосомы 15 (15q24), характеризующихся высоким содержанием изохора НЗ и CpG островков. В сегменте 9р13 нами было зарегистрировано высокое содержание АсНЗК9 (рис.6). Нуклеотидный состав сегмента в совокупности с его эпигенетическим статусом,

выявленном в нашем исследовании, локализованного в нем хроматина. _

могут указывать на потенциальную активность

Рис.4. Фрагмент метафазной пластинки из лимфоцита взрослого индивида человека (а) и из лимфоцита плода человека 20 нед. развития (б) после иммунофлуоресцентного окрашивания с помощью моноклональных антител к АсНЗК9.

[! » "Ц

II |1

"и 8 й Т "и Р

□I

зШ

II =11

РФ"

»В"

Рис. 5. Сопоставление сегментной локализации 5-метилцитозинобогащенной ДНК на хромосомах из лимфоцитов взрослых индивидов человека (идиограмма слева) и О-исчерченности (идиограмма справа). Различные оттенки зеленого отражают интенсивность АТ 5-МеС флуоресценции, оцененную в 2-4 балла в Я-сегментах, блоках прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 и коротких плечах акроцентрических хромосом. Белым показан низкий уровень свечения (1 балл), характерный для всех в-сегментов. Красным отмечены Я-сегменты, интенсивность АТ 5-МеС сигнала в которых оценена в 1 балл. Уровень разрешения -400 сегментов (18С>), 2009).

Полученные в нашем исследовании результаты привлекают внимание к интересному факту: блочной структуре хромосомы на уровне организации ее эпигенома. Это проявляется в сегментспецифичном расположении сайтов, обогащенных 5-метилцитозином и ацетилированным гистоном НЗ. По всей видимости, дифференциальное эпигенетическое модифицирование является одним из факторов, определяющих разделение хромосомы на функционально активные и инертные участки.

Рис. 6. Сопоставление сегментной локализации АсНЗК9 на хромосомах из лимфоцитов взрослых индивидов человека (идиограмма слева) и в-исчерченности (идиограмма справа). Различные оттенки красного отражают интенсивность АТ АсНЗК9 флуоресценции, оцененную в 2-3 балла в Я-сегментах. Черным показан низкий уровень свечения (1 балл), характерный для всех в, белым - свечение, оцененное в 1 балл в К сегментах. Серый цвет маркирует сегменты, в которых сигнал отсутствовал (0 баллов). Уровень разрешения ~300 сегментов (ЮО), 2009).

2. Становление дифференциального метилирования ДНК хромосом в доимплантационном развитии человека

Для установления времени появления МеС-сегментации в онтогенезе было проведено изучение специфичности метилирования ДНК в доимплантационном развитии человека. В связи с недоступностью нормальных зародышей, в исследовании использовали триплоидные зародыши или диплоидные зародыши с аномальной морфологией (содержащие вакуоли и фрагментированные бластомеры). Способность таких зародышей к имплантации, дальнейшему развитию и рождению свидетельствуют о том, что эпигенетическое репрограммирование их генома, играющее ключевую роль в установлении программы эмбриогенеза, может не отличаться от такового у нормальных. Характер распределения сайтов связывания моноклональных антител к 5-метилцитозину анализировали после каждого деления дробления, со стадии зиготы до стадии бластоцисты. Проанализировано 78 зародышей: 15 зигот, 12 двухклеточных зародышей, 14 четырехклеточных зародышей, 12 зародышей на стадии 5-8 клеток, 13 зародышей на стадии морулы и 12 бластоцист. Общее число проанализированных метафазных пластинок и их фрагментов составило 143 (Баранов и др., 2005; Репёша е1 а1., 2011).

На стадии метафазы в 15 зиготах выявлено практически равномерное распределение АТ 5-МеС флуоресцентных сигналов вдоль плеч хромосом. Гомологичные хромосомы различались по степени метилирования. У диплоидных эмбрионов в одном из гомологов всегда наблюдали более интенсивную АТ-5-МеС флуоресценцию, чем во втором. У триплоидных эмбрионов два гомолога из триады всегда характеризовались одинаковой интенсивностью АТ-5-МеС сигнала, которая была больше или меньше по сравнению с таковой третьего гомолога (рис.7а). Вероятнее всего, более низкий уровень метилирования характерен для отцовских хромосом, что связано с деметилированием мужского генома (Веащеап е1 а!., 2004; Ри1ка е! а1., 2004; Хи е1 а1., 2005; Ефимова и др., 2012). Визуализация сигнала на обоих гомологах свидетельствует о том, что деметилированию подвергаются не все последовательности ДНК, и некоторые участки сохраняют метилированный статус, в результате чего образуются так называемые «недометилированные» хромосомы.

На стадии двух бластомеров обнаружено равномерное распределение АТ-5-МеС флуоресцентного сигнала вдоль плеч хромосом на 13 метафазных пластинках. Во всех хромосомах выявлена асимметрия АТ-5-МеС между сестринскими хроматидами: в одной хроматиде интенсивность флуоресценции была больше, чем в другой. Показаны различия в интенсивности АТ-5-МеС сигнала в хроматидах с сильной флуоресценцией между гомологичными хромосомами (рис.76). Иными словами, каждая пара гомологов была представлена асимметрично окрашенными хромосомами, при этом флуоресценция одной из хроматид была одинаково слабой в обоих гомологах, а оставшиеся хроматиды характеризовались более сильной флуоресценцией, различающейся по интенсивности в гомологичных хромосомах. Таким образом, разный эпигенетический статус отцовских и материнских хромосом сохраняется после первого деления дробления. Описанный тип распределения сайтов связывания АТ-5-МеС наблюдали в большинстве хромосом из бластомеров диплоидных и триплоидных двухклеточных эмбрионов. В отдельных хромосомах выявлена сегментспецифическая локализация сигнала, напоминающая МеС-сегментацию хромосом из ФГА-стимулированных лимфоцитов, клеток эмбриональных органов и цитотрофобласта хориона человека.

Асимметричное метилирование хромосом было описано у ранних эмбрионов мышей и определено как гемиметилирование (Яоадег е! а1., 1998). Гемиметилированное состояние может достигаться за счет пассивного (зависимого от репликации) деметилирования ДНК зародыша, при котором новосинтезированная цепь ДНК не метилируется в соответствии с характером метилирования старой цепи (Но\у1еП, Яе1к, 1991). В результате, каждая асимметрично метилированная хромосома состоит из двух хроматид, одна из которых содержит неметилированную, а другая - гемиметилированную ДНК. Слабый равномерный сигнал, выявленный в нашем исследовании на одной из хроматид каждой хромосомы, свидетельствует о том, что не все последовательности ДНК находятся в деметилированном состоянии.

На стадии четырех клеток в 21 метафазной пластинке, наряду с двумя типами асимметричных хромосом, наблюдавшимися на стадии двух клеток, показано наличие хромосом с одинаково слабой интенсивностью флуоресценции в обеих хроматидах (рис.7в). Появление

хромосом, у которых гипометилированы обе хроматиды, по всей видимости, связано с дальнейшим пассивным деметилированием генома зародыша. Наличие одинаково слабых флуоресцентных сигналов, тем не менее, свидетельствует о сохранении низкого уровня метилирования ДНК в обеих хроматидах. В диадах и триадах гомологов наблюдали различные комбинации асимметричных и слабоокрашенных хромосом, т.е. одни диады или триады состояли только из асимметричных хромосом, в то время как в составе других были обнаружены также и слабоокрашенные хромосомы. Не было выявлено хромосомной специфичности для слабого или асимметричного сигнала. Соотношение асимметричных и слабоокрашенных хромосом было неодинаковым на разных метафазных пластинках. Это позволяет предположить, что при делении бластомеров двухклеточного зародыша человека сегрегация по-разному метилированных хроматид происходит случайным образом. В результате комбинации хроматид с разным статусом метилирования различаются в дочерних клетках. В нашем исследовании было выявлено три типа хроматид, согласно степени их метилирования - метилированные, гипометилированные и характеризующиеся промежуточной степенью метилирования (недометилированные). Теоретически возможное число комбинаций таких хроматид для одной диады гомологов составляет 4, а для одной триады - 8 (рис. 8). Следует отметить, что если рассматривать весь хромосомный набор, то число сочетаний диад с различными комбинациями гомологов составит 423 в случае диплоидного зародыша и 823 в случае триплоидного._

А ш 1 ; 1. 4 | ' г " ^ 1 1 < % г V* " V ч> ^ * , £ '> > ** Б V ' я / Я г > " И

' \ » * «а? "Г «р 12 хр '5 4 в « ..«, 1 8|

В , * | , -"Г • ' - * 1 • р, л; хг~ ■ »» »» 1 "о > * ■л * " » "..... -

- я V 1 ► И • *ж' ■ ' ^ * Е А 1 -

Рис.7. Метафазные хромосомы дробящихся зародышей человека после ОРН/АсО окрашивания (голубой) и иммуноцитохимической детекции 5-мегилцитозина с помощью моноклональных антигел/ИТС (зеленый). А -Метафазные хромосомы из 3-х отдельно лежащих пронуклеусов зиготы человека и фрагмент совмещенной кариограммы. Б - Фрагмент метафазной пластинки из бластомера 2-клеточного зародыша человека и фрагмент совмещенной кариограммы. В - Метафазные хромосомы из бластомера 4-клеточного зародыша и фрагмент совмещенной кариограммы. Г - Фрагмент метафазной пластинки из бластомера 8-клеточного зародыша и фрагмент совмещенной кариограммы. Д,Е- Метафазные хромосомы из бластоцисты.

На стадии пяти - восьми бластомеров характер распределения AT-5-MeC сигнала на проанализированных 32 метафазных пластинках оказался схож с таковым у четырехклеточных эмбрионов, но диады и триады гомологов состояли преимущественно из слабоокрашенных хромосом. На стадии восьми клеток метафазные хромосомы из некоторых бластомеров характеризовались сегментспецифичным распределением сигнала, соответствующим МеС-сегментации (рис.7г). Неравномерное распределение 5-метилцитозинобогащенной ДНК вдоль плеч хромосом свидетельствует о том, что на стадии восьми бластомеров происходит метилирование ДНК de novo. Это предположение подтверждается исследованием характера метилирования ДНК в интерфазных ядрах доимплантационных зародышей человека, выявившим высокий уровень содержания 5-метилцитозина в некоторых бластомерах (Fulka et al., 2004).

| Метнлирпианнаи хрома гида | Нсдометнлироианнан хроматмда й 1 in к 1 ,н"1 нл н роыа н ная хромагнда

4-клеточнан стадия

2-клсточнаи стадия

перное деление дроблении

Рис.8. Схема возможных комбинаций по-разному метилированных хроматид гомологичных хромосом после 1-го и 2-го деления тришюидного эмбриона человека. После 1-го деления каждая хромосома состоит из одной метилированной/недометилированной и одной гипометилированной хроматиды. Случайное расхождение хроматид на стадии 2-го деления приводит к одной из восьми комбинаций гомологичных геми- и гипометилированных метафазных хромосом в каждом бластомере 4-х клеточного эмбриона.

На стадии морулы в 30 проанализированных метафазных пластинках также встречались асимметричные и слабоокрашенные хромосомы. На стадии бластоцисты асимметрично окрашенных хромосом выявлено не было (рис. 7д,е). В 27 метафазных пластинках наблюдали сегментспецифичный тип распределения сигнала (рис. 7д), соответствующий МеС-сегментации в лимфоцитах и клетках эмбриональных и экстраэмбриональных тканей. Появление рисунка МеС-сегментации, вероятнее всего, указывает на завершение репрограммирования генома зародыша. Для метафазных хромосом из некоторых бластомеров - 5 из 32 проанализированных - показана практически равномерная флуоресценция плеч хромосом (рис.7е). Такие различия характера метилирования ДНК могут быть связаны с дифференциацией бластомеров на трофэктодерму и внутреннюю клеточную массу. При изучении метилирования ДНК интерфазных ядер другими авторами было показано гипометилирование ДНК из клеток внутренней клеточной массы по сравнению с клетками трофэктодермы (Ри1ка й а1., 2004).

Можно заключить, что в доимплантационном развитии человека каждое деление дробления сопровождается глобальными изменениями характера метилирования ДНК. Деметилирование происходит градуально и затрагивает все хромосомы и все сегменты хромосом обоих родительских геномов. К стадии бластоцисты в результате реметилирования хромосомы приобретают характерное для соматических клеток сегментспецифическое распределение 5-метилцитозина.

3. Тканевая специфичность метилирования ДНК сегментов хромосом в пре- и постнатальном развитии человека

Проведенный анализ позволил установить одинаковый характер локализации 5-метилцитозина на метафазных хромосомах из лимфоцитов взрослых индивидов и плодов, из

клеток хориона и эмбриональных печени и легкого, а также из мезенхимных стволовых клеток человека. Однако, несмотря на общий тип распределения метилированных сайтов, выявлены как ткане-, так и стадиоспецифичные особенности.

При сопоставлении интенсивности AT 5-МеС флуоресцентного сигнала на хромосомах из лимфоцитов взрослых индивидов человека с таковой у плодов 20-22 недель развития, выявлены отличия в 22 сегментах: lq42 (Т), 2q23, 2q31, 2q33, 3q21, 3q25, 5ql3, 6pll.2, 7pl3, 7pl5, 12pl3, 12ql3 (T), 13q22, 14ql3, 15qll.2-13, 15ql5, 16q22, 17q21 (T), 18qll.2, 20ql 1.2 (T), 21ql 1.2, 22qll.2 (T) (U-критерий Манна-Уитни, p<0,01).

Интенсивность AT-5-МеС-флуоресценции R-сегментов хромосом плодов была изменена как в сторону увеличения, так и уменьшения по сравнению с таковой у взрослых индивидов. При этом в 9 R-сегментах интенсивность флуоресценции была выше, а в 13 R-сегментах - ниже у плодов, чем у взрослых. Возможно, разный уровень метилирования этих сегментов у взрослых и плодов связан с динамическими изменениями их структурно-функционального статуса, необходимыми для реализации программы развития (Ефимова и др., 2012).

Наибольшее внимание привлекал сегмент 2q31, по которому, помимо различий в степени метилирования ДНК, были обнаружены различия в содержании АсНЗК9. Согласно полученным нами результатам, сегмент 2q31 в лимфоцитах взрослых характеризуется высоким уровнем ацетилированния гистона НЗ и низким уровнем метилирования ДНК, а в лимфоцитах плодов -низким уровнем ацетилирования гистона НЗ и высоким уровнем метилирования ДНК. Полученные результаты указывают на потенциально более низкую функциональную активность хроматина в сегменте 2q31 у плодов человека 20-22 недель развития по сравнению с таковой у взрослых индивидов. В сегменте 2q31 локализованы тканеспецифичные гены молекул иммуноглобулинового суперсемейства CD51 (ген ITGAV) и CD49D (ген ITGA4). Выявленные нами особенности метилирования и ацетилирования сегмента 2q31 могут быть связаны с активной работой иммунной системы у взрослых индивидов, но не у плодов человека (Cicala et al., 2009). Наши данные свидетельствуют о зависимости характера метилирования ДНК и ацетилирования гистона НЗ в лимфоцитах человека от стадии развития.

Анализ метилирования ДНК в других тканях человека в пренатальный период развития также позволил выявить ряд особенностей. Для метафазных хромосом из клеток цитотрофобласта хориона показана более низкая по сравнению с лимфоцитами степень метилирования ДНК (t-критерий Стьюдента, р<0.001). Несмотря на общее снижение степени метилирования в метафазных пластинках, характер распределения 5-метилцитозинобогащенной ДНК вдоль плеч хромосом не отличался от такового в других тканях. Таким образом, степень метилирования всех сегментов хромосом из клеток цитотрофобласта хориона оказалась ниже, чем в лимфоцитах. Известно, что клетки хориона активно дифференцируются и пролиферируют. Механизмы, обеспечивающие интенсивную пролиферацию нормальных клеток хориона до 13-й недели развития, схожи с таковыми в малигнизированных клетках (Raabe, 1990), характеризующихся гипометилированием на уровне генома и локальным аберрантным гиперметилированием CpG островков (Туско, 2000). В связи с этим, сниженный по сравнению с лимфоцитами уровень метилирования ДНК в хорионе, выявленный в нашей работе, может быть связан с его высоким пролиферативным статусом.

Выявлена разная интенсивность AT-5-MeC сигнала в гомологичных локусах хромосом из цитотрофобласта хориона, свидетельствующая о неодинаковой степени их метилирования. Число дифференциально метилированных гомологичных сегментов было неодинаковым на разных сроках развития: в хорионе 5-9 недель развития отличия были выявлены в 3-х сегментах (lq32, 4р12-14 и 6р21; t-критерий Стьюдента, р<0,01); в хорионе 10-14 недель развития - по 2 сегментам (lq32 и 4р12-14; t-критерий Стьюдента, р<0,01; в хорионе 15-20 недель развития - по 4 сегментам (lq32, 4р 12-14, 13q32-34, 16ql 1.2; t-критерий Стьюдента, р<0,01). Природа выявленного феномена остается до конца неясной. Известно, что дифференциальное метилирование ДНК характерно для гомологичных локусов, подверженных геномному импринтингу - эпигенетическому маркированию, обеспечивающему дифференциальную экспрессию генов в зависимости от их родительского происхождения (Назаренко, 2004; Пендина и др., 2007). Характерным свойством большинства импринтированных генов в трофэктодерме является инактивация материнской аллели. Согласно базе данных импринтированных генов Geneimprint, в ряде сегментов, по которым мы выявили отличия в степени метилирования в гомологичных хромосомах, локализованы гены,

для которых предсказан эффект материнского импринтинга: в сегменте lq32 локализован ген PTPN14, в сегменте 6р21 - BTNL2, в сегменте 13q34 -FAM70B. Таким образом, не исключено, что выявленные различия в статусе метилирования ДНК гомологичных хромосом в хорионе могут быть связаны с импринтированным состоянием хроматина. Изменения статуса метилирования ДНК в зависимости от срока могут быть связаны с запрограммированными активацией и репрессией хроматина в разные периоды развития, необходимыми для корректной реализации программы эмбриогенеза.

Анализ характера метилирования метафазных хромосом из мезенхимных стволовых клеток человека также позволил выявить ряд тканеспецифических особенностей. Мезенхимные стволовые клетки человека обладают основными свойствами мультипотентных стволовых клеток -способностью к ограниченному самообновлению и дифференцировке в нескольких направлениях (Шалыгина и др., 2009; Grigorian et al., 2010). При сопоставлении характера метилирования ДНК метафазных хромосом МСК и лимфоцитов человека, выявлены сегменты, отличающиеся по обогащенности 5-метилцитозином. В сегментах lq42, 4р18, 5q35, 8р24, 9q34, 11р15, 12р 15, 13q34, 16р13.1-13.3, 20р13.3 показано увеличение интенсивности флуоресценции по сравнению с таковой в лимфоцитах человека (U-критерий Манна-Уитни, р<0,05). В сегментах же 5р11.2-13, 6q21-23, 12ql3, 16ql3 наблюдали уменьшение интенсивности флуоресценции по сравнению с таковой в лимфоцитах человека (U-критерий Манна-Уитни, р<0,05). С использованием базы данных www.ncbi.nih.gov проведен анализ, в результате которого показано, что в гиперметилированных сегментах хромосом из МСК локализованы тканеспецифичные гены, активация транскрипции которых происходит только после дифференцировки стволовой клетки. В гипометилированных сегментах локализованы гены рецепторов ингибиторного фактора лейкемии и онкостатина М (5р 11.2-13), гены субъединиц белков теплового шока и ген бета-тубулина (6q21-23), активное состояние которых может быть необходимо для правильного функционирования и деления стволовой клетки.

Таким образом, интересным наблюдением в нашем исследовании являются различия в степени метилирования ДНК и ацетилирования гистона НЗ одних и тех же сегментов хромосом в клетках разных тканей. Дифференциальное эпигенетическое модифицирование указывает на функциональную неравнозначность таких локусов, связанную, по всей видимости, со спецификой организации и работы генетического аппарата в клетках разных типов. Полученные нами результаты указывают на то, что МеС-исчерченность является функциональным типом сегментации хромосом.

4. Профили метилирования ДНК гомологичных хромосом X при нормальном и аберрантном кариотипе

Представляло интерес изучить статус метилирования гомологичных хромосом X, для которых характерна функциональная инактивация всех гомологов, кроме одного. Анализ проведен на метафазных хромосомах из лимфоцитов взрослых индивидов и плодов и из клеток хориона. Выявлены различия в характере метилирования гомологичных хромосом X в лимфоцитах взрослых индивидов по сегментам Хр22, Xq24 и Xql2-ql3 и в лимфоцитах плодов по сегментам Хр22 и Xq24 (t-критерий Стьюдента, р<0,01) (рис.9). Объяснением выявленных различий, вероятнее всего, является разное функциональное состояние, вызванное инактивацией одного из гомологов. Вызывает удивление различный статус метилирования содержащих псевдоаутосомный район гомологичных сегментов Хр22, выявленный как в лимфоцитах, так и в клетках хориона на сроке 19-20 недель. Возможным объяснением является локализация в сегменте Хр22 участвующего в регуляции экспрессии НОХ-генов гена SCML1 (sex comb on midleg-like 1 (Drosophila)), активность которого зависит как от метилирования его регуляторной области, так и окружающего хроматина (Bernardino et al., 2000).

Различия в статусе метилирования сегмента Xq24 на гомологичных хромосомах X из лимфоцитов не противоречат данным, полученным другими исследователями. В сегменте Xq24 располагается гипервариабельный тандемный повтор, имеющий более высокую степень метилирования на активной хромосоме X по сравнению с инактивированной (Giacalone et al., 1992). Различия в степени метилирования сегмента Xql2-ql3 на гомологичных хромосомах X из

лимфоцитов взрослых индивидов, но не плодов человека могут объясняться стадиоспецифичной регуляцией хроматина содержащего центр инактивации хромосомы X.

= 1

ОГМ 5МсС ОГ'Н

Рис. 9. Совмещенные кариограммы хромосом X из лимфоцита взрослого индивида (слева) и плода человека (справа) после (ЗЕН окрашивания и после иммунофлуоресцентной детекции антител к 5-метилцитозину. Стрелками указаны гомологичные сегменты, отличающиеся по интенсивности флуоресценции после иммунофлуоресцентной детекции АТ-5-МеС: Хр22, Хц24 и Хд12-ч13 в лимфоцитах периферической крови взрослых индивидов и Хр22 и Хя24 в лимфоцитах пуповинной крови плодов.

Отличия в степени метилирования сегментов гомологичных хромосом X из клеток хориона зависели от срока развития: на сроке развития 6-7 недель показаны различия в интенсивности метилирования гомологичных сегментов Хр11 (^критерий Стьюдента, р<0,01), а на ¡9-20 недель -Хр22 и Хр11 (^критерий Стьюдента, р<0,01). Отличия по статусу метилирования сегмента Хр11 на гомологичных хромосомах X из клеток цитотрофобласта хориона могут отражать тканеспецифичные и стадиоспецифичные особенности эпигенетического статуса хроматина в этом сегменте. Интересно отметить, что при триплоидии (69,XXX) нами выявлены различия по 3-м гомологичным сегментам хромосом X: Хр22, ХрИ и Xql2-qlЗ. При этом по сегменту Хя12^13 различия оказались достоверными между 3-мя гомологичными хромосомами X ^-критерий Стьюдента, р<0,01), тогда как для сегментов Хр22 и ХрП показан одинаковый уровень метилирования в двух гомологах, отличающийся от такового в третьем (^критерий Стьюдента, р<0,01). Возможно, это обусловлено аберрантным метилированием, связанным с нарушением реализации эпигенетической программы развития из-за наличия дополнительного генома.

5. Динамические изменения статуса метилирования ДНК блоков прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16

Изучены особенности метилирования ДНК блоков прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16 из клеток разных типов.

В гетерохроматиновых блоках хромосом из бластомеров доимлпантационных зародышей человека наблюдали низкий уровень метилирования или даже его полное отсутствие до стадии бластоцисты включительно (рис.10). Низкий уровень содержания 5-метилцитозина в гетерохроматиновых участках, возможно, необходим для репрограммирования генома зародыша.

лимфоцит и фОС.ЮГО .Шмф(Щ1| I ii.io.ia мск хорион печень .10! КОС зигота 2 клетки 4 клетки 8 клеток бластоциста

«р1 I ш • ' »1 . * 1 ■1 А * 1 ••» * и «.( * г • и » « т о 1 » * Г > «'г 1 К

ХР9 | 3 1: XI »1 ■. V »2 I/; 1, «Ч а

хр16 | 1 1* 1» * Я «С **

Рис. 10. Статус метилирования прицентромерных гетерохроматиновых районов хромосом 1. 9 и 16 в лимфоцитах взрослых индивидов и плодов, мезенхимиых стволовых клетках, клетках хориона, клетках эмбриональных печени и легкого и бластомерах доимплаитационных зародышей человека.

Уровень метилирования ДНК прицентромерного гетерохроматина в лимфоцитах и клетках эмбриональных и экстраэмбриональных тканей обнаруживал как хромосом- так и стадиоспецифичность (рис. 10). Интенсивность AT-5-MeC флуоресценции гетерохроматина хромосом 1 и 16 на всех проанализированных метафазах из ФГА-стимулированных лимфоцитов взрослых и плодов и эмбриональных тканей была высокой и не зависела от размеров блока. Для района 9ql2 был характерен сигнал меньшей интенсивности. Известно, что в геноме человека гетерохроматин большей частью образован сателлитной ДНК I, II, III классов, распределение которых характеризуется определенной хромосомной специфичностью (Andersen et al., 1998). В состав гетерохроматина хромосомы 9 преимущественно входят сателлиты III и р, более богатые CpG динуклеотидами, по сравнению с сателлитной ДНК других классов, образующих прицентромерные гетерохроматиновые районы хромосом 1 и 16. Можно предполагать, что слабая интенсивность флуоресцентного сигнала гетерохроматина хромосомы 9 обусловлена его гипометилированным состоянием. Не исключено, что такое состояние важно для поддержания особой конформационной структуры этого района, необходимой для сохранения функциональной активности прилежащих генов (Пенднна и др., 2005).

Выявлен более низкий по сравнению с лимфоцитами уровень содержания 5-метилцитозина в прицентромерном гетерохроматнне хромосом из клеток цитотрофобласта хориона. На гипометилированное состояние гетерохроматиновых блоков хромосом 1, 9 и 16 из клеток цитотрофобласта хориона указывают также результаты исследования характера метилирования ДНК с помощью метода ник-трапсляции in situ с предварительной обработкой хромосом метилчувствительными эндонуклеазами рестрикции (Пендина и др., 2001). Интересно отметить, что в нашем исследовании выявлены отличия в степени метилирования гетерохроматинового блока 9ql2 в клетках хориона на разных сроках развития: на сроке развития 15-20 недель интенсивность флуоресценции сегмента 9ql2 в обеих гомологичных хромосомах была достоверно ниже по сравнению с таковой на сроке 5-9 и 10-14 недель (t-крнтерий Стьюдента, р<0,01). Прн трисомпи 9 или 16, а также при триплоидии нами отмечены различия в степени метилирования гетерохроматиновых блоков в гомологичных хромосомах (критерий Крускала-Вэллиса, р<0,05). Обнаруженные изменения статуса метилирования ДНК гетерохроматина свидетельствуют о его значимости для эмбрионального развития.

Таким образом, характер метилирования прицентромерного гетерохроматина, по всей видимости, также важен, как и уровень содержания 5-метилцитозина в эухроматине.

ВЫВОДЫ

1. Распределение 5-метилцитозинобогащенной ДНК в метафазных хромосомах из лимфоцитов человека является сегментспецифичным. МеС-позитивные сегменты соответствуют всем Т-сегмеитам и большинству R-сегментов аутосом, а также коротким плечам акроцентрических хромосом групп D и G и блокам прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 16.

2. Наличие постоянных МеС+-сегментов - морфологических маркеров, - идентифицируемых на каждой паре гомологичных аутосом из клеток различного происхождения (лимфоцитов периферической и пуповинной крови, мезенхимных стволовых клеток, эмбриональных печени и легкого, цитотрофобласта хориона), позволяет охарактеризовать МеС-сегментацию, как новый тип рисунка линейной дифференцированное™ хромосом.

3. Гиперацетилирование сегментов метафазных хромосом из лимфоцитов взрослых индивидов и плодов человека может сочетаться с высоким, средним и низким уровнем метилирования ДНК.

4. В доимплантационном развитии человека со стадии зиготы до стадии бластоцисты происходят динамические изменения статуса метилирования хромосом в результате деметилирования родительских геномов. Сегментная специфичность локализации 5-метилцитозинобогащенной ДНК на хромосомах появляется на стадии 8 клеток.

5. Уровень метилирования ДНК как эухроматиновых, так и гетерохроматиновых районов метафазных хромосом тканеспецифичен и изменяется в зависимости от срока развития.

6. Гомологичные хромосомы X отличаются по статусу метилирования сегментов Xpll, Хр22, Xql2-ql3 и Xq24 в зависимости от типа клеток и стадии развития.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ в журналах, рекомендованных ВАК

1. Пендина A.A., Ефимова O.A., Каминская АН., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Иммуноцитохимический анализ статуса метилирования метафазных хромосом человека. // Цитология. 2005. Т.47, №8, с.731-737.

2. Баранов B.C., Пендина A.A., Кузнецова Т В., Ефимова O.A., Федорова И.Д., Леонтьева O.A., Корсак B.C., Никольский H.H. Некоторые особенности статуса метилирования метафазных хромосом у зародышей человека доимплантационных стадий развития. // Цитология. 2005. Т.47, №8, с.723-730.

3. Пендина A.A., Ефимова O.A., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Болезни геномного импринтинга. // Журнал акушерства и женских болезней. 2007. Т. LVI, выпуск 1/2007, с.76-83.

4. Grigorian AS, Kruglyakov PV, Taminkina UA, Efimova OA, Pendina AA, Voskresenskaya AV, Kuznetsova TV, Polyntsev DG Alterations of cytological and karyological profile of human mesenchymal stem cells during in vitro culturing. // Bull Exp Biol Med. 2010. V.150 (1), P.125-130. (Григорян A.C., Кругляков П.В., Таминкина Ю.А., Ефимова O.A., Пендина A.A., Воскресенская A.B., Кузнецова Т.В., Полынцев Д.Г. Изменения цитологических и кариологических характеристик мезенхимальных стволовых клеток человека при культивировании in vitro. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010. №3, с. 141149).

5. Pendina A.A., Efimova O.A., Fedorova I.D., Leont'eva O.A., Shilnikova E.M., Lezhnina J.G., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. DNA methylation patterns of metaphase chromosomes in human preimplantation embryos.// Cytogenet Genome Res. 2011. V.132 (1-2), P.l-7.

6. Чиряева О.Г., Пендина A.A., Тихонов A.B., Ефимова O.A., Петрова Л И., Дудкина B.C., Садик H.A., Галембо И.А., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Сравнительный анализ аномалий кариотипа при неразвивающейся беременности, наступившей естественным путем и с применением вспомогательных репродуктивных технологий. // Журнал акушерства и женских болезнен. 2012. Т. LXI, выпуск 3/2012, с. 132-140.

7. Ефимова O.A., Пендина A.A., Тихонов A.B., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Метилирование ДНК — основной механизм репрограммирования и регуляции генома человека. // Медицинская генетика. 2012. Т. 11, №4 (118), с. 10-18.

Статьи в научных журналах и изданиях, не входящих в перечень ВАК:

1. Ефимова O.A., Пендина A.A., Чиряева О.Г., Петрова Л И., Садик H.A., Дудкина B.C., Кузнецова Т В., Баранов B.C. Дифференциальное метилирование ДНК метафазных хромосом -основа нового способа окраски хромосом человека в пре- и постнатальный периоды онтогенеза. С. 143-149. // В «Современные технологии профилактики наследственных болезней и детской инвалидности» (к 40-летию медико-генетического центра), под ред. Романеико О.П., - СПб. ГУЗ МГЦ.: «Феникс», 2009 г. -368 с.

2. Шалыгина Ю.А., Ефимова O.A., Кругляков П.В., Пендина A.A., Григорян A.C., Кузнецова Т.В., Полынцев Д.Г., Баранов B.C. Сравнительный цитогенетический анализ мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток ранних пассажей и лимфоцитов человека. // Клеточная транспланталогия и тканевая инженерия. 2009. Т. IV, №2, с.63-69.

3. Ефимова O.A., Пендина A.A., Тихонов A.B., Крапивин М.И., Копать В В., Лежнина Ю.Г., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Распределение метилированной ДНК и модифицированных гистонов на метафазных хромосомах человека в пре- и постнатальные периоды онтогенеза. С.132-149. // В «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике», под ред. Баранова B.C., Масленникова А.Б., — Вып. 17. - Новосибирск: «НСК Регион», 2012 г. - 152 с.

Подписано в печать 25.06.2012г. Формат 60x84/16 П.л. 1,12 Уч.-изд.л 1,12. Тир. 100 экз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. torousseliajmail.ru Зак. № 13412 от 25.06.2012г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ефимова, Ольга Алексеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярно-цитогенетическая организация генома человека.

1.1.1. Блочная организация хромосом человека.

1.1.2. Повторяющиеся последовательности в геноме человека.

1.1.3. Изохорная организация генома человека.

1.1.4 Гетерохроматин.

1.1.5. Эухроматин.

1.2. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов у человека.

1.2.1. Метилирование ДНК.

1.2.1.1. Ферменты, осуществляющие метилирование ДНК.

1.2.1.2. Механизмы деметилирования ДНК.

1.2.1.3. Сайты метилирования ДНК и их локализация в геноме человека.

1.2.1.4. Регуляция генетической экспрессии с помощью метилирования ДНК.

1.2.1.5. Метилирование ДНК и геномный штринтинг.

1.2.2. Модификации гистонов.

1.2.2.1. Ацетилирование.

1.2.2.2. Фосфорилирование.

1.2.2.3. Метилирование.

1.2.2.4. Механизмы регуляции транскрипции посредством модифицирования гистонов.

1.2.3. Варианты гистоновых белков.

1.2.3.1. Варианты гистона Н2А.

1.2.3.2. Варианты гистона НЗ.

1.2.4. Взаимосвязь эпигенетических механизмов регуляции структурно-функционального состояния генома.

1.2.5. Эпигенетическоерепрограммирование генома.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Материал исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом для иммунодетекции 5-метилцитозина.

2.2.1.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической и пуповинной крови.

2.2.1.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом из ворсин хориона и из фрагментов эмбриональных тканей.

2.2.1.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом из бластомеров доимплантационных зародышей.

2.2.1.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом из мезенхгшных стволовых клеток человека.

2.2.2. 0,¥Н окрашивание препаратов метафазных хромосом.

2.2.3. Денатурация и иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов метафазных хромосом с помощью моноклональных антител к 5-метилцитозину.

2.2.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом для иммунодетекции ацетилированного по лизину в 9-м положении гистона НЗ.

2.2.4.1. Культивирование лимфоцитов периферической крови взрослых индивидов человека и пуповинной крови плодов человека для иммунодетекции ацетилированного гистона НЗ.

2.2.4.2. Фиксация метафазных хромосом раствором параформальдегида.

2.2.4.3 Фиксация метафазных хромосом спиртовым раствором 2% ледяной уксусной кислоты.

2.2.5 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов метафазных хромосом с помощью моноклональных антител к ацетилированному по лизину в 9-м положении гистону НЗ.

2.2.6 ЕВА окрашивание препаратов метафазных хромосом.,.

2.2.7Анализ препаратов.

2.2.8 Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала и статистическая обработка результатов.

2.2.8.1. Посегментное сравнение интенсивности флуоресцентного сигнала.

2.2.8.2. Построение графиков распределения флуоресцентного сигнала разной интенсивности вдоль плеч хромосом.

2.2.8.3. Сравнение интенсивности флуоресценции метафазных пластинок.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Поперечная исчерчеииость метафазных хромосом из лимфоцитов взрослых индивидов человека, выявляемая методом иммунодетекцни 5-метилцитозина.

3.2. Дифференциальное метилирование ДНК метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови взрослых индивидов и пуповинной крови плодов человека.

3.3. Сравнительный анализ характера метилирования ДНК гомологичных хромосом X в лимфоцитах взрослых и плодов человека. Влияние 5-бром-2-дезоксиуридина на иммуиоцитохимическую детекцию 5-метилцитозина.

3.4. Специфичность локализации ацетилированного гистона НЗ на метафазных хромосомах из лимфоцитов взрослых и плодов человека.

3.5. Сопоставление метилирования ДНК и ацетилирования гистона НЗ на метафазных хромосомах в лимфоцитах взрослых индивидов и плодов человека.

3.6. Распределение 5-метилцитозина на метафазных хромосомах из различных типов клеток эмбрионов человека.

3.7. Динамические изменения метилирования ДНК метафазных хромосом из клеток цитотрофобласта хориона человека в 1-м и 2-м триместре развнтия.

3.8. Метилирование ДНК дополнительных и структурно перестроенных хромосом в клетках цитотрофобласта хориона при неразвивающейся беременности.

3.9. Стадиоспецифичные последовательные изменения метилирования ДНК родительских геномов в бластомерах дробящихся зародышей человека.

ЗЛО. Распределение 5-метилцитозинобогащенной ДНК на метафазных хромосомах из мезенхимных стволовых клеток человека.

3.11. Сравнительный анализ характера метилирования блоков прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 в доимплантационном, эмбриональном и постнатальном развитии.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Феномен сегментспецифичной локализации эпигенетических маркеров на метафазных хромосомах человека.

4.2. Становление дифференциального метилирования ДНК хромосом в доимплантационном развитии человека.

4.3. Тканевая специфичность метилирования ДНК сегментов хромосом в пре-и постнатальном развитии человека.

4.4. Профили метилирования ДНК гомологичных хромосом X при нормальном и аберрантном кариотипе.

4.5. Динамические изменения статуса метилирования ДНК блоков прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дифференциальная композиция эпигенетических маркеров сегментов метафазных хромосом человека"

Вопрос о принципах и механизмах, лежащих в основе дифференциальной экспрессии генов в индивидуальном развитии человека, представляется крайне актуальным на сегодняшний день. Остается до конца неясным, как в условиях идентичности наследственного аппарата, при одинаковом наборе генов во всех клетках, возникает многообразие клеток и тканей. Важнейшим условием корректной реализации наследственной информации на разных этапах онтогенеза является дифференциальная активность генов, которая определяется составом и структурой хроматина. Профили экспрессии генов устанавливаются и поддерживаются за счет наследуемых эпигенетических модификаций хроматина.

К эпигенетическим модификациям хроматина относят метилирование цитозина ДНК и посттрансляционные модификации гистоновых белков. Под метилированием ДНК понимают обратимую энзиматическую реакцию, в результате которой происходит присоединение метильной группы к 5 положению остатков цитозина в динуклеотиде 5'-CpG-З' (Ванюшин, 2006; Senner, 2011). Модификации аминокислотных остатков гистоновых белков, к числу которых относят ацетилирование, метилирование, убиквитинирование и фосфорилирование происходят, в основном, в N-терминальных участках, которые расположены за пределами компактного октамера и могут подвергаться действию различных клеточных сигналов. В результате метилирования ДНК и модификаций гистонов устанавливается специфичный структурно-функциональный статус хроматина и осуществляется эпигенетическая регуляция транскрипционной активности, специфичная для разных типов клеток и/или этапов онтогенеза (Dhall, Chatterjee, 2011). Таким образом, клетки с идентичным геномом и разными фенотипами характеризуются разными эпигеномами.

Актуальным представляется вопрос, когда устанавливаются, как изменяются и каким образом поддерживаются в хроматине человека схемы расположения эпигенетических маркеров, специфичные для различных тканей и разных стадий развития. Определенная информация на эту тему получена на модельных объектах (Miyanari et al., 2010; Zhao et al., 2010; Smalhvood et al., 2011). В период доимплантационного развития происходит интенсивная эпигенетическая реорганизация генома, изменяются профили метилирования ДНК, унаследованные из родительских гамет -высокоспециализированных клеток, - и устанавливается собственно эмбриональный рисунок метилирования ДНК, направляющий дифференцировку бластомеров во все многообразие типов клеток и тканей организма (Feng et al., 2010). Нарушения этого процесса могут приводить к сбою программы онтогенеза, формированию аберрантных профилей экспрессии генов, и, как следствие, тяжелым патологиям или остановке развития (Haaf, 2006). Таким образом, информация о динамике эпигенетических изменений родительских геномов имеет как фундаментальную, так и практическую значимость. Следует, однако, учитывать, что многие ключевые процессы эмбриогенеза, включая оплодотворение, первые деления дробления, время активации генома и эпигенетическое репрограммирование, являются видоспецифичными (Beaujean et al., 2004; Shi et al., 2004; Hou et al., 2005; Fulka et al., 2006), что не позволяет экстраполировать все данные, полученные на модельных объектах, на человека.

Уникальная возможность изучения доимплантационного развития человека, в том числе выявление причин его нарушений, появилась с разработкой и внедрением в медицинскую практику вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Однако, исследования динамики эпигенетических изменений в эмбриональном развитии человека остаются ограниченными по ряду причин, связанных, прежде всего, с труднодоступностыо материала и этическими факторами, вплоть до полного запрета в некоторых странах проведения исследований на эмбрионах человека. Не освещенным остается вопрос о том, каким образом происходит репрограммирование родительских геномов при первых делениях дробления человека. Данные о динамических и тканеспецифических изменениях эпигенома при дифференцировке клеток в постимплантационном развитии человека также остаются неполными. Большинство исследований метилирования ДНК и модификаций гистонов сфокусированы на описании эпигенетических изменений отдельных локусов, и лишь небольшая часть работ посвящена оценке эпигенетического статуса всего генома. Следует подчеркнуть, что наиболее часто изучение эпигенома проводят на интерфазных ядрах (Fulka et al., 2004; Beaujean et al., 2004; Xu et al., 2005; Skalnikova et al., 2007). Ограничение таких исследований состоит в невозможности определения времени стирания/установления эпигенетических маркеров в отдельных локусах. Между тем, участки генома неоднородны по структуре и имеют разное функциональное значение. Оценить набор эпигенетических маркеров как всего генома в целом, так и его отдельных участков позволяет выявление метилированной ДНК и модифицированных гистонов на метафазных хромосомах.

Для изучения метилирования ДНК метафазных хромосом разработаны подходы, позволяющие прямо или косвенно определить характер распределения метилированных остатков цитозина. К таким подходам относятся обработка митотических хромосом метилчувствительными эндонуклеазами рестрикции, ник-трансляция in situ с предварительной обработкой метилспецифичными рестриктазами (Adolph, Hameister, 1990), PRINS и SPRINS (Andersen et al., 1998). Наиболее перспективным является метод иммуноцитохимической детекции 5-метилцитозина с помощью высокоспецифичных моноклональных антител. Метод иммуноцитохимического окрашивания применяют также для детекции модифицированных гистонов. Использование антител позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты. Отмечают, что использование иммуноцитохимического подхода для оценки эпигенетического статуса генома особенно целесообразно при работе с отдельными клетками, в том числе с бластомерами ранних зародышей (Santos, Dean, 2006).

Наибольший интерес для изучения эпигенома человека представляют бластомеры ранних зародышей, клетки из эмбриональных и экстраэмбриональные тканей на разных стадиях эмбриогенеза человека и мезенхимные стволовые клетки в сравнительном аспекте * с клетками в терминальной стадии дифференцировки. На их примере можно проследить динамику изменений и установить вклад эпигенетических модификаций в репрограммирование генома в эмбриогенезе.

Целью настоящего исследования было:

Задачи:

3) Изучить характер метилирования ДНК метафазных хромосом в бластомерах дробящихся зародышей человека.

Научная новизна:

Впервые проведен иммуноцитохимический анализ метилирования ДНК метафазных хромосом из мезенхимных стволовых клеток, эмбриональных и экстраэмбриональных тканей в сравнительном аспекте с лимфоцитами взрослых индивидов человека. Выявлено сегментспецифичное распределение метилированных участков вдоль плеч хромосом, повторяющееся в клетках из разных тканей, определенное нами, как МеС-сегментация. Впервые описана динамика изменений характера метилирования ДНК метафазных хромосом доимплантационных зародышей человека. Впервые проведено сравнительное иммуноцитохимическое исследование особенностей распределения ацетилированного гистона НЗ на метафазных хромосомах лимфоцитов взрослых и плодов человека. Продемонстрированы ткане- и стадиоспецифические особенности метилирования ДНК и ацетилирования гистона НЗ метафазных хромосом человека.

Теоретическая и практическая значимость:

Результаты работы вносят вклад в освещение принципов эпигенетической регуляции организации и работы генома в онтогенезе человека. Описанная в работе динамика изменений метилирования ДНК метафазных хромосом в доимплантационном, эмбриональном и постнатальном развитии человека позволяет приблизиться к пониманию вклада эпигенетических модификаций в репрограммирование как всего генома, так и его отдельных локусов.

Полученные результаты могут служить основой при разработке и совершенствовании методов оценки функционального состояния генома. Выявление отклонений в характере эпигенетического модифицирования генома может быть информативным при проведении процедуры ЭКО, пренатальной диагностики, а также при оценке негативного влияния внешних факторов на работу генома.

Положения, выносимые на защиту:

1) Распределение 5-метилцитозинобогащенной ДНК в метафазных хромосомах человека, выявляемое иммуноцитохимическим методом, представляет собой особый тип рисунка линейной дифференцированности хромосом - МеС-сегментацию.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 38 работ (10 статей, 28 тезисов конференций), в том числе 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете и НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ефимова, Ольга Алексеевна

выводы

1. Распределение 5-метилцитозинобогащенной ДНК в метафазных хромосомах из лимфоцитов человека является сегментспецифичным. МеС-позитивные сегменты соответствуют всем Т-сегментам и большинству Я-сегментов аутосом, а также коротким плечам акроцентрических хромосом групп Б и в и блокам прицентромерного гетерохроматина хромосом 1,9, 16.

2. Наличие постоянных МеС+-сегментов - морфологических маркеров, -идентифицируемых на каждой паре гомологичных аутосом из клеток различного происхождения (лимфоцитов периферической и пуповинной крови, мезенхимных стволовых клеток, эмбриональных печени и легкого, цитотрофобласта хориона), позволяет охарактеризовать МеС-сегментацию, как новый тип рисунка линейной дифференцированности хромосом.

4. В доимплантационном развитии человека со стадии зиготы до стадии бластоцисты происходят динамические изменения статуса метилирования хромосом в результате деметилирования родительских геномов. Сегментная специфичность локализации 5-метилцитозин-обогащенной ДНК на хромосомах появляется на стадии 8 клеток.

6. Гомологичные хромосомы X отличаются по статусу метилирования сегментов Хр11, Хр22, Хц12-д13 и Xq24 в зависимости от типа клеток и стадии развития.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа выполнена в рамках исследования структурно-функциональной организации генома человека. Иммуноцитохнмический метод, использованный для детекции на метафазных хромосомах участков, обогащенных 5-метилцитозином, позволил нам описать новый тип дифференциальной исчерченности метафазных хромосом человека - МеС-сегментацию. Выявленный в клетках разных типов феномен сегментспецифичного распределения 5-метилцитозина и ацетилированного гистона НЗ на метафазных хромосомах позволил нам выдвинуть предположение о блочной структуре хромосомы на уровне организации эпигенома. Такая структура, вероятно, является одним из факторов, лежащих в основе разделения хромосомы на функционально активные и инертные участки. В то же время, изменяющиеся уровни метилирования ДНК и ацетилирования гистона НЗ в отдельных сегментах хромосом в зависимости от типа исследуемой ткани и срока развития эмбриона, свидетельствуют о том, что рисунок распределения эпигенетических маркеров является функциональным типом сегментации хромосом, отражающим специфику организации и работы генома в клетках разных типов. В пользу этого также свидетельствует тот факт, что установление сегментной специфичности метилирования ДНК метафазных хромосом происходит при реметилировании генома доимплантационных зародышей вслед за практически полным деметилированием родительских геномов в ходе их эпигенетического репрограммирования.

Таким образом, результаты настоящего исследования вносят вклад в понимание эпигенетической организации генома в ходе развития человека. Учитывая связь эпигенетического состояния хроматина с его функциональной активностью, полученные результаты могут быть использованы при разработке и совершенствовании методов оценки функционального состояния генома в до- и постимплантационный периоды эмбриогенеза в рамках проведения процедур ВРТ и пренатальной диагностики, а также в постнатальном развитии при оценке негативного влияния внешних факторов на работу генома. Обратимость процесса метилирования ДНК позволяет говорить о принципиальной возможности коррекции многих эпигенетических нарушений. Полученные в настоящем и других исследованиях данные о механизмах деметилирования и реметилирования, динамике этих процессов в ходе эпигенетического репрограммирования, а также об изменениях паттернов метилирования за счет внешних воздействий, послужат основой для разработки способов профилактики и коррекции аберрантного метилирования ДНК и связанных с ним патологических состояний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ефимова, Ольга Алексеевна, Санкт-Петербург

1. Баранов B.C., Кузнецова Т.В. Цнтогенетнка эмбрионального развития. СПб: Издательство H-JI, 2007. - 640с.

2. Восток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки: Пер. с англ. Москва: Мир, 1981.-596с.

3. Ванюшин Б.Ф. Энзиматическое метилирование ДНК эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки // Биохимия. - 2005. - Т.70. - С.598-611.

4. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика // Генетика. 2006. - Т.42. -№9.-С. 1-14.

5. Ефимова O.A., Пендина A.A., Тихонов A.B., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Метилирование ДНК основной механизм репрограммирования и регуляции генома человека // Медицинская генетика. - 2012-. Т.П. - №4(118). - С.10-18.

6. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф. 5-метилцитозин в пиримидиновых последовательностях ДНК растений и животных: специфичность метилирования // Биохимия. 1981. -Т.46. - С. 1458-1474.

7. Конюхов Б.В., Платонов Е.С. Геномный импринтинг у млекопитающих // Генетика.- 2001. Т.37. - С.5-18.

8. Кузнецова Т.В., Логинова Ю.А., Чиряева О.Г., и др. Цитогенетические методы // Медицинские лабораторные технологии: под ред. Карпищенко А.И. СПб: Интермедика, 1999. - С.550-578.

9. Кузнецова Е.В., Кекеева Т.В., Ларин С.С., Землякова В.В., Бабенко О.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Новые маркеры метилирования и экспрессии генов при раке молочной железы // Молекулярная биология. 2007. -Т.41. -№4. - С.624-633.

10. Назаренко С.А. Эпигенетические модификации генома и болезни человека // Медицинская генетика. 2004. - №2. - С.70-77.

11. Немцова М.В. Геномный импринтинг и наследственная патология у человека // Молекуляр. биол. 2000. - Т.34. - С.646-653.

12. Паткин Е.Л. Эпигенетические механизмы распространенных заболеваний человека.- СПб.: Нестор-История, 2008. 196с.

13. Паткин Е.Л., Сорокин A.B. Изучение метилирования генома лабораторной мыши в раннем эмбриогенезе при помощи рестрикционных эндонуклеаз in situ // Цитология. 1992. - Т. 34. - С. 65-69.

14. Пендина A.A., Кузнецова Т.В., Логинова Ю.А., Баранов B.C. Особенности метилирования прицентромерных гетерохроматиновых районов хромосом 1,9, 16 у эмбрионов человека // Цитология. 2001. - Т.8. - №43. - С.772-776.

15. Пендина A.A., Гринкевич В.В., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Метилирование ДНК- универсальный механизм регуляции активности генов // Экологическая генетика.- 2004. Т.2. - С.27-37.

16. Пендина A.A., Ефимова O.A., Каминская А.Н., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Иммуноцитохимический анализ статуса метилирования метафазных хромосом человека // Цитология. 2005. - Т.47. - №8. - С.731-737.

17. Пендина A.A., Ефимова O.A., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Болезни геномного импринтинга. // Журнал акушерства и женских болезней. 2007. - T.LVI. - №1. -С.76-83.

18. Родионов A.B. Генетическая активность ДНК G- и R-блоков митотических хромосом человека //Генетика. 1985. -Т.21.- №12.- С.2057-2065.

19. Саложин С.В., Прохорчук Е.Б., Георгиев Г.П. Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических маркеров // Биохимия. 2005. - Т.70. - С.525-532.

20. Сингер М., Берг Д. Гены и геномы. Москва: Мир, 1998. - 391с.

21. Чиряева О.Г., Пендина A.A., Тихонов A.B., Ефимова O.A., Петрова Л.И., Дудкина

22. Aapola U., Kawasaki К., Scott H.S., et al. Isolation and initial characterization of a novel zinc finger gene, DNMT3L, on 21q22.3, related to the cytosine-5- methyltransferase 3 gene family // Genomics. 2000. - V.65. - №.3. - P.293-298.

23. Adams J.W., Kaufman R.E., Kretschmer P.J., Harrison M., Nienhuis A.W. A family of long reiterated DNA sequences, one copy of which is next to the human beta globin gene // Nucl. Acids Res. 1980. - V.8. - P.6113-6128.

24. Adams-Cioaba M.A., Min J. Structure and function of histone methylation binding proteins// Biochem Cell Biol. -2009. -V.87. -P.93-105.

25. Adolph S., Hameister H. In situ nick translation of human metaphase chromosomes with the restriction enzymes Mspl and Hpall reveals an R-band pattern // Cytogenet. Cell Genet. 1990. - V.54. - №3-4. - P. 132-136.

26. Aguirre-Arteta A.M., Grunewald I., Cardoso M.C., Leonhardt H. Expression of an alternative Dnmtl isoform during muscle differentiation // Cell Growth Differ. 2000. -V.ll. -№10. -P.551-559.

27. Allfrey V.G., Faulkner R., Mirsky A.E. Acetylation and Methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis // Proc Natl Acad Sci USA. 1964. V.51. - P.786-794.

28. Amir R.E., Van der Veyver I.B., Wan M., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2 // Nat. Genet. 1999. - V.23.- P.185-188.

29. Andersen C.L., Koch J., Kjeldsen E. CpG islands detected by self-primed in situ labeling (SPRINS) // Chromosoma. 1998. -V. 107. - P.260-266.

30. Aravin A.A., Lagos-Quintana M., Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder B., et al. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development // Dev Cell. 2003. -V.5. -P.337-350.

31. Arrighi F.E., Hsu T.C. Localization of heterochromatin in human chromosomes // Cytogenetics. 1971. - V. 10. - P.81 -86.

32. Ayala T., Rama S.T., Ricarda G., Mark H., Serge A. A New Nuclear Function of the Entamoeba histolytica Glycolytic Enzyme Enolase: The Metabolic Regulation of Cytosine-5 Methyltransferase 2 (Dnmt2) Activity // PLoS. Pathog. 2010. - V.6. - №2. -el000775.

33. Bachman K.E., Rountree M.R., Baylin S.B. Dnmt3a and Dnmt3b are transcriptional repressors that exhibit unique localization properties to heterochromatin // J. Biol. Chem.- 2001. V.276. - P.32282-32287.

34. Bannister A.J., Schneider R., Kouzarides T. Histone methylation: dynamic or static? // Cell. 2002. - V.109. - P.801-806.

35. Bannister A.J., Zegerman P., Partridge J.F., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromodomain // Nature. 2001. - V.410. - P.120-124.

36. Barber J.C., Mahl H., Portch J., Crawíurd M.D. Interstitial deletions without phenotypic effect: prenatal diagnosis of a new family and brief review // Prenat Diagn. 1991 Jun. -V.ll.-№6.-P.411-416.

37. Barbin A., Montpellier C., Kokalj-Vokac N., Gibaud A., Niveleau A., Malfoy B., Dutrillaux B., Bourgeois C.A. New sites of methylcytosine-rich DNA detected on metaphase chromosomes // Hum Genet. 1994. - V.94. - №6. - P.684-692.

38. Barlow D.P. Competition a common motif for the imprinting mechanism? // EMBO J.- 1997. V. 16. - №23. - P.6899-6905.

39. Bartke T., Vermeulen M., Xhemalce B., Robson S.C., Mann M., Kouzarides T. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation // Cell. -2010. V.143. - P.470-484.

40. Beaujean N., Hartshorne G., Cavilla J. et al. Non-conservation of mammalian preimplantation methylation dynamics // Curr Biol. 2004. - V.14. - R266-R267.

41. Bedford M.T., Clarke S.G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why // Mol Cell. 2009. - V.33. - P. 1-13.

42. Beechey C.V., Cattanach B.M., Blake A. MRC Mammalian Genetics Unit, Harwell, Oxfordshire, 2003. World Wide Web Site Mouse Imprinting Data and References (http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/imprinting/ imprinting.html).

43. Bell A.C., Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene // Nature. 2000. - №405. - P.482-485.

44. Bernardi G. Isochores and the evolutionary genomics of vertebrates // Gene. 2000. -V.241. - P.3-17.

45. Bernardi G., Olofsson B., Filipski J. et al. The mosaic genome of warm-blooded vertebrates // Science. 1985. - V.228. - P.953-958.

46. Bernardino J., Lombard M., Niveleau A., Dutrillaux B. Common methylation characteristics of sex chromosomes in somatic and germ cells from mouse, lemur and human//Chromosome Research. 2000. - V.8 - P.513-525.

47. Bestor T.H. The host defence function of genomic methylation patterns // Novartis Found Symp. 1998. - V.214. - P. 187-195.

48. Bhutani N., Brady J.J., Damian M., Sacco A., Corbel S.Y., Blau H.M. Reprogramming towards pluripotency requires AID-dependent DNA demethylation // Nature. 2010. -V.463. - P.1042-1047.

49. Bhutani N., Burns D.M., Blau H.M. DNA demethylation dynamics. // Cell. 2011. -V.146. — №6. -P.866-872.

50. Biamonti G. Nuclear stress bodies: a heterocliromatin affair? // Nat Rev Mol Cell Biol. -2004. №5. - P.493-498.

51. Bicmore W.A., Sumner A.T. Mammalian chromosome banding an expression of genome organization // Trends Genet. - 1989. - V.5. - P.144-148.

52. Bird A.P. Gene number, noise reduction and biological complexity // Trends Genet. 1995. V.l 1, № 3. - P.94-100.

53. Bird A.P., Wolffe A.P. Methylation-induced repression belts, braces, and chromatin // Cell. - 1999. - V.99. - P.451-454.

54. Black B.E., Bassett E.A. The histone variant CENP-A and centromere specification // Curr. Opin. Cell Biol. 2008. - V.20, №1. - P.91 -100.

55. Black B.E., Cleveland D.W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes // Cell. 2011. - V.144, №4. - P.471-479.

56. Bonenfant D, Towbin H, Coulot M, Schindler P, Mueller DR, van Oostrum J. Analysis of dynamic changes in post-translational modifications of human histones during cell cycle by mass spectrometry // Mol Cell Proteomics. 2007. - V.6. -№11.- P. 1917-32.

57. Bostock C.J., Sumner A.T. The eukaryotic chromosome. Amsterdam; New York: North-Holland Pub., 1978. - 525p.

58. Bourc'his D., Xu G.L., Lin C.S., Bollman B., Bestor T.H. Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints // Science. 2001. - V.294. - №5551. - P.2536-2539.

59. Bourc'his D., Le Bourhis D., Patin D., Niveleau A., Comizzoli P., Renard J.P., Viegas-Pequignot E. Delayed and incomplete reprogramming of chromosome methylation patterns in bovine cloned embryos // Curr Biol. 2001. - V. 11. - № 19. - P. 1542-1546.

60. Britten R.J. Mobile elements inserted in the distant past have taken of important functions //Gene. 1997.- Y.205. - P. 177-182.

61. Buhler M., Mohn F., Stalder L., Muhlemann O. Transcriptional silencing of nonsense codon-containing immunoglobulin minigenes // Mol. Cell. -2005. -V. 18. P.307-317.

62. Carlson B.M. Human embryology and developmental biology // 4th edition. USA: Mosby, 2009.-541 p.

63. Caspersson T., Farber S., Foley G.P. et al. Chemical differentiation along metaphase chromosome // Exp. Cell. Res. 1968. - V.49. - P.219-222.

64. Castanotto D., Tommasi S., Li M., et al. Short hairpin RNA-dirccted cytosine (CpG) methylation of the RASSF1A gene promoter in HeLa cells // Mol. Ther. 2005. - V.12. - P.179-183.

65. Chadwick B.P., Willard H.E. A novel chromatin protein, distantly related to histone H2A, is largely excluded from the inactive X chromosome // J. Cell Biol. 2001. -V.152.-P. 375-384.

66. Chadwick B.P., Willard H.F. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome // Proc Natl Acad Sci US A.-2004. V. 101. -№50. - P. 17450-17455.

67. Champagne K.S., Kutateladze T.G. Structural insight into histone recognition by the ING PHD fingers // Curr Drug Targets. 2009. - V.10. - P.432-441.

68. Chen T., Ueda Y., Xie S., Li E. A novel Dnmt3a isoform produced from an alternative promoter localizes to euchromatin and its expression correlates with active de novo methylation // J. Biol. Chem. 2002. - V.277. - №41. - P.38746-38754.

69. Chowdhury D., Novina C.D. Potential roles for short RNAs in lymphocytes // Immunology and Cell Biology. 2005. - V.83. - P.201-210.

70. Conte R.A., Gupta S., Brennan J.P., Verma R.S. Rare variants of chromosome 9 with extra G positive band within the qh region are not alike // J Med Genet. 1995. - V.32. -P.405-406.

71. Copeland R.A., Solomon M.E., Richon V.M. Protein methyltransferases as a target class for drug discovery // Nat Rev Drug Discov. 2009. - Y.8. - P.724-732.

72. Cox G.S., Gutkin D.W., Haas M.J., Cosgrove D.E. Solation of an Alu repetitive DNA binding protein and effect of CpG methylation of binding to its recognition sequence // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V.1396. - P.67-87.

73. Craig J.M., Bickmore W.A. The distribution of CpG islands in mammalian chromosome // Nature Genetics. 1994. - V.7. - P.376-382.

74. Craig J.M. Heterochromatin many flavours, common themes // BioEssays. - 2005. -V.27. - P. 17-28.

75. Daujat S., Zeissler U., Waldmann T., Happel N., Schneider R. HP1 binds specifically to Lys26-methylated histone HI.4, whereas simultaneous Ser27 phosphorylation blocks HP1 binding // J Biol Chem. 2005. - V.280. - P.38090-38095.

76. Dawson M.A., Bannister A.J., Gottgens B., et al. JAK2 phosphorylates histone H3Y41 and excludes HP1 alpha from chromatin // Nature. 2009. - V.461. - P.819-822.

77. Deaton A.M., Bird A. CpG islands and the regulation of transcription // Genes Dev. -2011. -V.25.-№10. -P.1010-1022.

78. Deininger P.L., Batzer M.A. Alu repeats and human disease // Mol. Genet. Metab. -1999. V.67. - P. 183-193.

79. Deng J., Szyf M. Multiple isoforms of DNA methyltransferase are encoded by the vertebrate cytosine DNA methyltransferase gene // J. Biol. Chem. 1998. - V.273. -№36. - P.22869-22872.

80. Dhall A, Chatterjee C. Chemical approaches to understand the language of histone modifications // ACS Chem Biol. 2011. - V.6. - №10. - P.987-999.

81. Dimitri P, Caizzi R, Giordano E, Carmela Accardo M, Lattanzi G, Biamonti G. Constitutive heterochromatin: a surprising variety of expressed sequences // Chromosoma. 2009. - V.l 18. - №4. - P.419-435.

82. Doerfler W. DNA methylation and gene activity // Annu. Rev. Biochem. 1983. - V.52. -P.93-124.

83. Dryhurst D., Thambirajah A.A., Ausio J. New twists on H2A.Z: A histone variant with a controversial structural and functional past // Biochem. Cell Biol. 2004. - V.82. -P.490-497.

84. Dyban A.P., De Sutter P., Verlinsky Y. Preimplantation cytogenetics analysis. In book: «Preimplantation Diagnosis of Genetic Diseases» 1993. Wiley-Liss, NY P.93-128.

85. Engel E. A fascination with chromosome rescue in uniparental disomy: Mendelian recessive outlaws and imprinting copyrights infringements // Eur J Hum Genet. 2006. -V.14. - №11. - P. 1158-1169.

86. Feng S., Jacobsen S.E., Reik W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development // Scienc. 2010. - v.330. - №6004 P.622-627.

87. Ficz G., Branco M.R., Seisenberger S., Santos F., Krueger F., Hore T.A., Marques C.J., Andrews S., Reik W. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation // Nature. 2011. - V.473. - P.398^02.

88. Filipski J., Thiery J. P., Bernardi G. An analysis of the bovine genome by Cs2S04-Ag density gradient centrifiigation // J. Mol. Biol. 1973. - V.80. - P. 177-197.

89. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostos S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans II Nature.- 1998. V.391. - P.806-811.

90. Fischle W., Tseng B.S., Dormann H.L., et al. Regulation of HP1 chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation //Nature. 2005. - V.438. - P.l 116 -1122.

91. Fukagawa T., Nogami M., Yoshikawa M., Ikeno M., Okazaki T., Takami Y., Nakayama T., Oshimura M. Dicer is essential for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells // Nat Cell Biol. 2004. - №6. - P.784-791.

92. Fulka H., Mrazek M., Tepla O., Fulka Jr.J. DNA methylation pattern in human zygotes and developing embryos // Reproduction. 2004. - V. 128. - P.703-708.

93. Fulka J., Fulka H., Slavik T., Okada K., Fulka J. Jr. DNA methylation pattern in pig in vivo produced embryos // Histochem Cell Biol. -2006. -№126. -P.213-217.

94. Gardiner-Garden M., Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes // J Mol Biol. 1987. - V.196. - №2. -P.261-282.

95. Gatti M., Smith D.A., Baker B.S. A gene controlling condensation of heterochromatin in Drosophila melanogaster // Science. 1983. - V.221. - P.83-85.

96. Giacalone J, Friedes J, Francke U. A novel GC-rich human macrosatellite VNTR in Xq24 is differentially methylated on active and inactive X chromosomes//Nature Genet. 1992.-V.l -P.137-143.

97. Goll M.G., Bestor T.H. Eucaryotic cytosine methyltranferases // Annu. Rev. Biochem. 2005. - V.74. - P.481-514.

98. Goll M.G., Kirpekar F., Maggert K.A., Yoder J.A., Hsieh C.L., Zhang X., Golic K.G., Jacobsen S.E., Bestor T.H. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyl transferase homolog Dnmt2 // Science. 2006. - V.311. - №5759. - P.395-398.

99. Goto H., Yasui Y., Nigg E.A., Inagaki M. Aurora-B phosphorylates histone H3 at serine28 with regard to the mitotic chromosome condensation // Genes Cells. 2002. -Y.7.-P.l 1-17.

100. Goto T., Monk M. Regulation of X-chromosome inactivation in development in mice and humans // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. - V.62. -№2. - P.362-378.

101. Grant P.A., Duggan L., Cote J., et al. Yeast Gcn5 functions in two multisubunit complexes to acetylate nucleosomal histones: characterization of an Ada complex and the SAGA (Spt/Ada) complex // Genes Dev. 1997. - V.l 1. - P. 1640-1650.

102. Grigoryev S.A. Higher-order folding of heterochromatin: Protein bridges span the nucleosome arrays // Biochem. Cell Biol. 2001. - V.79. - P.227-241.

103. Grimaldi G., Skowronski J., and Singer M.F. Defining the beginning and end of Kpn\ family segments // EMBOJ. . 1984. - №3. - P. 1753-1759.

104. Haaf T. Dynamics in the early mammalian embryo: implications of genome reprogramming defects for development // Curr.Top.Micro biol. Immunol. - 2006. -V.310. - P. 13-22.

105. Haaf T., Ott G., Schmid M. Differential inhibition of sister chromatid condensation induced by 5-azadeoxycytidine in human chromosomes // Chromosoma. -1986. V.94. - P.389-394.

106. Hajkova P., Ancelin K., Waldmann T., Lacoste N., Lange U.C., Cesari F., Lee C., Almouzni G., Schneider R., Surani M.A. Chromatin dynamics during epigenetic reprogramming in the mouse germline // Nature. 2008. - V.452. - P.877-881.

107. Han J.S., Boeke J. D. LINE-1 retrotransposons: modulators of quantity and quality of mammalian gene expression // Bioessays. 2005. - V.27. - P.775-784.

108. Hark A.T., Schoenherr C.J., Katz D.J., et al. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus // Nature. 2000. - V.405. - P.486-489.

109. Hassan A.H., Prochasson P., Neely K.E., et al. Function and selectivity of bromodomains in anchoring chromatin-modifying complexes to promoter nucleosomes // Cell. 2002. - V. 111. - P.369- 379.

110. He Y.F., Li B.Z., Li Z., Liu P., Wang Y., Tang Q., Ding J., Jia Y., Chen Z., Li L. et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA // Science. 2011. - V.333. - P. 1303-1307.

111. Hemberger M., Dean W., Reik W. Epigenetie dynamics of stem cells and cell lineage commitment: digging Waddington's canal // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. -V.10. - P.526-537.

112. Hendrich B., Bird A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG-binding proteins // Mol Cell Biol. 1998. - V.18. - P.6538-6547.

113. Hendrich B., Bird A. Mammalian methyltransferases and methyl-CpG-binding domains: proteins involved in DNA methylation // Curr Top Microbiol Immunol. 2000. - V.249. - P.55-74.

114. Henikoff S. Heterochromatin function in complex genomes // Biochimica et Biophysica Acta. 1999. - V.1470. - №2000. - P. 1-8.

115. Henikoff S., Ahmad K. Assembly of variant histones into chromatin // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2005. - V.21. -P.133-153.

116. Hennig W. Heterochromatin // Chromosoma. 1999. - V.23. - P. 179-234.

117. Hermann A., Gowher H., Jeltsch A. Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases // Cell Mol. Life Sci. 2004 - V.61. - №19-20. - P.2571-2587.

118. Hirota T., Lipp J.J., Toh B.H., Peters J.M. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin // Nature. 2005. - V.438. -P.l 176-1180.

119. Hodawadekar S.C., Marmorstein R. Chemistry of acetyl transfer by histone modifying enzymes: structure, mechanism and implications for effector design // Oncogene. 2007. - V.26. - P.5528-5540.

120. Holmquist G.P. Chromosome bands, their chromatin flavors, and their functional features // Am J Hum Genet. 1992. - V.51. - P.7-37.

121. Holmquist G.P., Ashley T. Chromosome organization and chromatin modification: influence on genome function and evolution // Cytogenet Genome Res. -2006. V.l 14. -№2. -P.96-125.

122. Hou J., Lei T.H., Liu L., Cui X.H., An X.R., Chen Y.F. DNA methylation patterns in in vitro-fertilized goat zygotes // Reprod Fert Devel. 2005. - V.l7. - P.809-813.

123. Howlett S.K., Reik W. Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development// Development. 1991. - V.l 13. - P. 119-127.

124. Hsu D.W., Lin M.J., Lee T.L., Wen S.C., Chen X., Shen C.K. Two major forms of DNA (cytosine-5) methyltransferase in human somatic tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. -1999. V.96. - №17. - P.9751-9756.

125. Hu S., Xie Z., Onishi A., et al. Profiling the human protein-DNA interactome reveals ERK2 as a transcriptional repressor of interferon signaling // Cell. 2009. -V. 139.-P.610-622.

126. Huang Y., Fang J., Bedford M.T., Zhang Y., Xu R.M. Recognition of histone H3 lysine-4 methylation by the double tudor domain of JMJD2A // Science. 2006. - V.312. -P.748-751.

127. Ihgs, Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. 2001. - V.860. - P.860-921.

128. Illingworth R., Kerr A., Desousa D., Jorgensen H., Ellis P., Stalker J., Jackson D., Clee C., Plumb R., Rogers J., et al. A novel CpG island set identifies tissue-specific methylation at developmental gene loci // PLoS Biol. 2008. - V.6. - №1. - e22.

129. Iqbal K., Jin S.G., Pfeifer G.P., Szabo P.E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine // Proc Natl Acad Sci U S A. 2011. - V.108. - №9. -P.3642-3647.

130. ISCN (2009) An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J. (eds.). - Basel: Karger, 2009. - 138p.

131. Ito S., D'Alessio A.C., Taranova O.V., Hong K., Sowers L.C., Zhang Y. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification // Nature. 2010. - V.466. - P.l 129-1133.

132. Ito S., Shen L., Dai Q., Wu S.C., Collins L.B., Swenberg J.A., He C., Zhang, Y. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine // Science. 2011. - V.333. -№6047. - P.1229-1230.

133. Jablonka E., Lamb M. The Changing Concept of Epigenetics // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002. - V.981. - P.82-96.

134. Jaeger S., Barends S., Giege R., Eriani G., Martin F. Expression of metazoan replication-dependent histone genes // Biochimie. 2005. - V.87, №9-10. - P.827-834.

135. Jasinska A., Krzyzosiak W.J. Repetitive sequences that shape the human transcriptome // FEBS Lett. 2004 Jun 1. - Y.567. - №1. - P. 136-141.

136. Jeffery L., Nakielny D.S. Components of the DNA methylation system of chromatin control are RNA-binding proteins // J. Biol. Chem. 2004. - V.279. -P.49479-49487.

137. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervarible "minisatellite" regions in human DNA // Nature. 1985. - V.314. - P.67-73.

138. Jeffreys A.J., Macleod A., Tamaki K., Neil D.L., Monckton D.G. Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing // Nature. 1991. - V.354. - P.204-209.

139. Jenuwein T. Re-SET-ting heterochromatin by histone methyltransferases // TRENDS in Cell Biology. 2001. - V.l 1. - №6. - P.266-273.

140. Jolly C., Metz A., Govin J., Vigneron M., Turner B.M., Khochbin S., Vourc'h C. Stress-induced transcription of satellite HI repeats // J Cell Biol. 2004. - №164. -P.25-33.

141. Jurkowski T.P., Meusburger M., Phalke S., Helm M., Nellen W., Reuter G., Jeltsch A. Human DNMT2 methylates tRNA(Asp) molecules using a DNA methyltransferase-like catalytic mechanism // RNA. 2008. - V.14. - №8. - P.1663-1670.

142. Kafri Т., Ariel M., Brandeis M., et al. Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line // Genes & Dev. 1992. - V.6. -P.705-714.

143. Kamakaka R.T., Biggins S. Histone variants: Deviants? // Genes Dev. 2005. -V.19. -P.295-310.

144. Katz DJ, Beer MA, Levorse JM, Tilghman SM: Functional characterization of a novel Ku70/80 pause site at the H19/Igf2 imprinting control region // Mol Cell Biol. -2005. №25. - P.3855-3863.

145. Kawasaki H., Taira K. Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells // Nature. 2004. - V.9. - P.211-217.

146. Kawasaki H., Taira K., Morris K.V. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. // Cell Cycle. 2005. - V.4. - P.442-448.

147. Kiefer C.M., Hou C., Little J.A., Dean A. Epigenetics of betaglobin gene regulation // Mutat Res. 2008. - V.647. - P.68-76.

148. Kim J., Daniel J., Espejo A., et al. Tudor, МВТ and chromodomains gauge the degree of lysine methylation // EMBO Rep. 2006. - V.7. - P.397-403.

149. Ko M., Huang Y., Jankowska A.M., Pape U.J., Tahiliani M., Bandukwala H.S., An J., Lamperti E.D., Koh K.P., Ganetzky R., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2 // Nature. 2010. - V.468. -P.839-843.

150. Koop B.F., Hood L. Striking sequence similarity over almost 100 kilobases of human and mouse T-cell receptor DNA //Nat Genet. 1994. - V.7. -№1. - P.48-53.

151. Korenberg J.R., Rykowski M.C. Human genome organization: Alu, lines, and the molecular structure of metaphase chromosome bands // Cell. 1988. - V.53. - P.391-400.

152. Kriaucionis S., Heintz N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain // Science. 2009. - V.324. - P.929-930.

153. Lachner M., O'Carroll D., Rea S., Mechtler K., Jenuwein T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins // Nature. 2001. - V.410. -P.116-120.

154. Lan F., Shi Y. Epigenetic regulation: methylation of histone and non-histone proteins // Sci China C Life Sci. 2009. - V.52. - P.311- 322.

155. Lange U.C., Schneider R. What an epigenome remembers // Bioessays. 2010. -V.32. - №8. -P.659-668.

156. Laurent A.M., Puechberty J., Prades C., Gimenez S., Roizes G. Site-specific retrotransposition of LI elements within human alphoid satellite sequences // Genomics. 1997.- V.46. -№1. - P.127-132.

157. Li E., Bestor T.H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality // Cell. 1992. - V.69. - P.915.

158. Lister R., Pelizzola M., Dowen R.H., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences // Nature. 2009. - V.462. - P.315-322.

159. Lowndes N.E., Toh G.W. DNA repair: The importance of phosphorylating histone H2AX // Curro. Biol. IS. 2005. - P.99-102.

160. Lubit B.W., Pham T.D., Miller O.J., Erlanger B.F. Localization of 5-methylcytosine in human metaphase chromosomes by immunoelectron microscopy // Cell. . 1976 . -V.9. - №4. - Pt 1. - P.503-509.

161. Luger K., Mader A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution // Nature. 1997. - V.389. -P.251-260.

162. Ma D.K., Jang M.H., Guo J.U., Kitabatake Y., Chang M.L., Pow-Anpongkul N., Flavell R.A., Lu B., Ming G.L., Song H. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. // Science. 2009. - V.323. -P.1074-1077.

163. Macaya G., Thiery J. P., Bernardi G. An approach to the organization of eukaryotic genomes at a macromolecular level // J. Mol. Biol. 1976. - V.108. - P.237-254.

164. Macaya G., Thiery J.-P., Bernardi G. DNA sequences in man. In J.J. Yunis, ed. Molecular Structure of Human Chromosomes (pp. 35-58). New York: Academic Press, 1977.-336p.

165. Malik H.S., Henikoff S. Phylogenomics of the nucleosome // Nat. Struct. Biol. 2003.- V.10, №11. -P.882-891.

166. Mancini-DiNardo D., Steele S.J.S., Levorse J.M., et al. Elongation of the Kcnqlotl transcript is required for genomic imprinting of neighboring genes // Genes & Dev. -2006. V.20. -№10. - P.1268-1282.

167. Manuelidis L. A view of interphase chromosomes // Science. 1990. - V.250. -№4987. -P.1533-1540.

168. Martin C., Beaujean N., Brochard V., Audouard C., Zink D., Debey P. Genome restructuring in mouse embryos during reprogramming and early development // Dev Biol. 2006. - V.292. - P.317-332.

169. Marzluff W.E, Duronio R.J. Histone mRNA expression: Multiple levels of cell cycle regulation and important developmental consequences // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. -V. 14. - P.692-699.

170. Marzluff W.E, Gongidi P., Woods K.R., Jin J., Maltais L.J. The human and mouse replication-dependent histone genes // Genomics. 2002. - V.80. - P.487-498.

171. Mathieu O., Bender J. RNA-directed DNA methylation // Journal of Cell Science.- 2004. V.l 17. - №21. - P.4881-4888.

172. Maurer-Stroh S., Dickens N.J., Hughes-Davies L., Kouzarides T., Eisenhaber F., Ponting C.P. The Tudor domain 'Royal Family': Tudor, plant Agenet, Chromo, PWWP and MBT domains // Trends Biochem Sci. 2003. - V.28. - P.69-74.

173. Mertineit C., Yoder J.A., Taketo T., Laird D.W., Trasler J.M., Bestor T.H. Sex-specific exons control DNA methyltransferase in mammalian germ cells // Development. 1998. - V.125. - №5. - P.889-897.

174. Meyne J., Moyzis R.K. Human chromosome-specific repetitive DNA probes: Targeting in situ hybridization to chromosome 17 with a 42-base pair alphoid DNA oligomer // Genomics. 1989. - V.4. - P.472-478.

175. Miller O.J., Schnedl W., Allen J., Erlanger B.F. 5-Methylcytosine localized in mammalian constitutive heterochromatin // Nature. 1974. - V.251. - P.636-637.

176. Miyanari Y., Torres-Padilla M.E. Epigenetic regulation of reprogramming factors towards pluripotency in mouse preimplantation development. // Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2010. - V.17(6). - P.500-506.

177. Monk M., Boubelik M., Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembrionic and germ cell lineages during mouse embryo development // Development. 1987. - V.99. - P.371-382.

178. Morgan H.D., Santos F., Green K., Dean W., Reik W. Epigenetic reprogramming in mammals // Human Molecular Genetics. 2005. - V. 14. - R47-R58.

179. Morris K.V. siRNA-mediated transcriptional gene silencing: the potential mechanism and a possible role in the histone code // Cell. Mol. Life Sci. 2005. - V.62. -P.3057-3066.

180. Morris K.V., Chan S.W., Jacobsen S.E., Looney D.J. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells // Science. 2004. - V.305. -P. 1289-1292.

181. Morrison A.J., Shen X. DNA repair in the context of chromatin // Cell Cycle. 2005. -V.4.-P.568-571.

182. Motamedi M.R., Verdel A., Colmenares S.U., Gerber S.A., Gygi S.P., Moazed D. Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs // Cell. 2004. - №119. - P.789-802.

183. Mujtaba S., Zeng L., Zhou M.M. Structure and acetyl-lysine recognition of the bromodomain // Oncogene. 2007. - V.26. - P.5521- 5527.

184. Musió A., Mariani T., Vezzoni P., Frattini A. Heterogeneous gene distribution eflects human genome complexity as detected at the cytogenetic level // Cancer Genet Cytogenet. 2002. -V. 134. - №2. - P. 168-171.

185. Nan X., Campoy F.J., Bird A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin // Cell. 1997. - V.88. -P.471.

186. Nan X., Cross S., Bird A. Gene silencing by methyl-CpG-binding proteins // Novartis Found Symp. 1998. - V.214. - P.6-16, discussion 16-21,46-50.

187. Newell-Price J., Adrian J.L., King C., King P. DNA methylation and silencing of gene expression // TEM. 2000. -V.l 1. - №4. - P. 142-148.

188. Ngo S.S., Yue W.W., Oppermann U., Klose R.J. Dynamic protein methylation in chromatin biology // Cell Mol Life Sci. 2009. - V.66. - P.407-422.

189. Nishioka K., Chuikov S., Sarma K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation // Genes Dev. 2002. - V. 16. - P.479-489.

190. Noma K., Sugiyama T., Cam H., Verdel A., Zofall M., Jia S., Moazed D., Grewal S.I. RITS acts in cis to promote RNA interference mediated transcriptional and post-transcriptional silencing // Nat Genet. 2004. - №36. - P. 1174-1180.

191. Novina C.D., Sharp P.A. The RNAi revolution // Nature. 2004. - V.430. -P.161-164.

192. O'Neill M.J. The influence of non-coding RNAs on allele-specific gene expression in mammals // Hum. Mol. Genet. 2005. - V.l4. - Spec № 1. - P. 113-120.

193. Okano M., Xie S., Li E. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases //Nat. Genet. 1998. - V.l9. -№3. -P.219-220.

194. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development // Cell. -1999.-V.99.-P. 247-257.

195. Oki M., Aihara H., Ito T. Role of histone phosphorylation in chromatin dynamics and its implications in diseases // Subcell Biochem. 2007. - V.41. - P.319-336.

196. Ooi S.L., Henikoff S. Germline histone dynamics and epigenetics // Curr Opin Cell Biol. -2007. V. 19. -P.257-265.

197. Oyer J.A., Chu A., Brar S., Turker M.S. Aberrant epigenetic silencing is triggered by a transient reduction in gene expression // PLoS ONE. 2009. - V.4, №3. - P.e4832.

198. Parris G.E. Developmental diseases and the hypothetical Master Development Program // Med Hypotheses. 2009. - V.74 - №3. - P.564-73.

199. Parris G.E. Scope of medical implications of the Master Development Program hypothesis // Med Hypotheses. 2010. - V.74. - №5. - 953.

200. Parthun M.R. Hatl: the emerging cellular roles of a type B histone acetyltransferase // Oncogene. 2007. - V.26. - P.5319-5328.

201. Penn N.W., Suwalski R., O'Riley C., Bojanowski K., Yura R. The presence of 5-hydroxymethylcytosine in animal deoxyribonucleic acid // Biochem J. 1972. - V.126. -P.781-790.

202. Pezer Z., Ugarkovic D. RNA Pol II promotes transcription of centromeric satellite DNA in beetles // PLoS ONE. 2008. - V.3. - №2.

203. Pfarr W., Webersinke G., Paar C., Wechselberger C. Immunodetection of 5'-methylcytosine on Giemsa-stained chromosomes // Biotechniques. 2005 . - V.38. -№4. - P.527-8, 530.

204. Pfeifer K. Mechanisms of genomic imprinting // Am. J. Hum. Genet. 2000. -V.67. - P.777-787.

205. Plohl M., Mravinac B. Satellite DNA junctions identify the potential origin of new repetitive elements in the beetle Tribolium madens // Gene. 2007. - V.394. - P.45-52.

206. Plohl M., Luchetti A., Mestrovic N., Mantovani B. Satellite DNAs between selfishness and functionality: structure, genomics and evolution of tandem repeats in centromeric (hetero) chromatin // Gene. 2008. - V.409. - P.72-82.

207. Popp C., Dean W., Feng S., Cokus S.J., Andrews S., Pellegrini M., Jacobsen S.E., Reik W. Genome-wide erasure of DNA methylation in mouse primordial germ cells is affected by AID deficiency //Nature. 2010. - V.463. - P.l 101-1105.

208. Preece M.A., Moore G.E. Genomic imprinting, uniparental disomy and fetal growth // Tern. 2000. - V.l 1. - № 7. - P.270-275.

209. Prosser J., Frommer M., Paul C., Vincent P.C. Sequence relationships of three human satellite DNAs // J. Mol. Biol. 1986. - V.187. - P. 145-155.

210. Puri D., Dhawan J., Mishra R.K. The paternal hidden agenda: epigenetic inheritance through sperm chromatin // Epigenetics. 2010. - V.5. - P.386-391.

211. Raabe G., Miller K. Cell proliferation in chorionic villi at different gestational ages, as analyzed by premature chromosome condensation // Cytogenet Cell Genet. -1990. V.54. - №3-4. - P. 127-131.

212. Ramsahoye B.H., Biniszkiewicz D., Lyko F., Clark V., Bird A.P., Jaenisch R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - V.97. - P.5237-5242.

213. Razin A, Kafri T. DNA methylation from embryo to adult // Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. 1994. - V.48. - P.53-81.

214. Razin A. CpG methylation, chromatin structure and gene silencing a three-way connection // The EMBO Journal. - 1998. - V. 17. - №17. - P.4905-4908.

215. Razin A., Cedar H. DNA methylation and embryogenesis. In: Jost JP and Saluz HP. DNA methylation. Molecular and biological significance // Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland (1993) P.343-357.

216. Rea S., Eisenhaber F., O'Carroll D., et al. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases // Nature. 2000. - V.406. - P.593-599.

217. Reik W., Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome // Nat Rev Genet. 2001. - V.2. - P.21-32.

218. Reik W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development //Nature.-2007.-V.447.-№7143.-P.425-432.

219. Reinliart B.J., Bartel D.P. Small RNAs correspond to centromere heterochromatic repeats // Science. 2002. - V.297. - P. 1831.

220. Rinehart F.P., Ritch T.G., Deininger P.L., Schmid C.W. Renaturation rate studies of a single family of interspersed repeated sequences in human deoxyribonucleic acid // Biochemistry. 1981. - V.20. - P.3003-3010.

221. Rougier N., Bourc'his D., Molina Gomes D. et al. Chromosome methylation pattern during mammalian preimplantation development // Genes and Development. -1998. -V. 12. P.2108-2113.

222. Ruthenburg A.J., Allis C.D., Wysocka J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic mark // Mol Cell. 2007. - V.25. -P. 15-30.

223. Saccone S., Federico C., Solovei I., Croquette M-F.E., Valle G.D., Bernardi G. Identification of the gene-richest bands in human prometaphase chromosomes // Chromosome Research. 1999. - V.7. - P.379-386.

224. Saccone S., Bernardi G. Human chromosomal banding by in situ hybridization of isochores // Methods in Cell Science. 2001. - V.23. - P.7-15.

225. Santos F., Dean W. Epigenetic reprogramming during early development in mammals // Reproduction. 2004. - V.127. - P.643-651.

226. Santos F., Dean W. Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos // Methods Mol Biol. 2006. - №325. - P.129-137.

227. Sarma K., Reinberg D. Histone variants meet their match // Nat. Rev. Mol. Cell Bioi. -2005. V.6. - P.139-149.

228. Sasaki H., Matsui Y. Epigenetic events in mammalian germ- cell development: reprogramming and beyond // Nat.Rev.Genet. 2008. - V.9. - P.129-140.

229. Satoh T., Obara Y. Nonrandom distribution of sister chromatid exchanges in the chromosomes of three mammalian species // Zoolog Sci. 1995. - V. 12. - P.749-756.

230. Schubert I., Rieger R. Sister chromatid exchanges and heterochromatin // Hum Genet. 1981. - V.57. - P.l 19-130.

231. Schueler M.G., Higgins A.W., Rudd M.K., Gustashaw K., Willard H.F. Genomic and genetic definition of a functional human centromere // Science. 2001. - V.294. -P.109-115.

232. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes // Lancet. -1971.-V.2.-P.971-972.

233. Senner C.E. The role of DNA methylation in mammalian development. // Reprod Biomed Online. 2011. - V.22(6). - 529-535.

234. Shi Y., Lan F., Matson C., Mulligan P., Whetstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., Shi Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1 // Cell. 2004. - V.l 19. -№7):P.941-953.

235. Shi W., Dirim F., Wolf E., Zakhartchenko V., Ilaaf T. Methylation reprogramming and chromosomal aneuploidy in in vivo fertilized and cloned rabbit preimplantation embryos // Biol Reprod. 2004. - V.71. - P.340-347.

236. Shi X., Hong T., Walter K.L., et al. ING2 PHD domain links histone H3 lysine 4 methylation to active gene repression // Nature. 2006. - V.442. - P.96-99.

237. Shogren-Knaak M., Ishii H., Sun J.M., Pazin M.J., Davie J.R., Peterson C.L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions // Science. 2006. - V.311. - P.844- 847.

238. Skalnikova M., Bartova E., Ulman V., Matula P., Svoboda D., Harnicarova A., Kozubek M., Kozubek S. Distinct patterns of histone methylation and acetylation in human interphase nuclei // Physiol Res. 2007. - V.56. - №6. - 797-806.

239. Simmen M.W. Genome-scale relationships between cytosine methylation and dinucleotide abundances in animals // Genomics. 2008. - V.92. - P.33-40.

240. Sims R.J. Ill, Chen C.F., Santos-Rosa H., Kouzarides T., Patel S.S., Reinberg D. Human but not yeast CHD1 binds directly and selectively to histone H3 methylated at lysine 4 via its tandem chromodomains // J Biol Chem. 2005. - V.280. - P.41789-41792.

241. Singer M.F. Highly repeated sequences in mammalian genomes // Int. Rev. Cytol. 1982. - V.76. - P.67-112.

242. Sleutels F., Zwart R., Barlow D.P. The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes // Nature. 2002. - Vol.415. - P.810-813.

243. Smallwood S.A., Tomizawa S., Krueger F., Ruf N., Carli N., Segonds-Pichon A., Sato S., Hata K., Andrews S.R., Kelsey G. Dynamic CpG island methylation landscape in oocytes and preimplantation embryos // Nat Genet. 2011. - V.43. - №8. - P.811 -814.

244. Smeets D.F. Historical prospective of human cytogenetics: from microscope to microarray // Clin Biochem. 2004. - №6. - P.439-446.

245. Spahn L., Barlow D.P. An ICE pattern crystallizes // Nat. Genet. 2003. - V.35. -P.ll-12.

246. Stallings R.L., Ford A.F., Nelson D. Torney D.C., Hildebrand C.E., Moyzis R.K. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes // Genomics. 1991. - V. 10. - P.807-815.

247. Stephan W. Tandem-repetitive noncoding DNA: forms and forces // Mol Biol Evol. 1989. - V.6. - P. 198-212.

248. Sugiyama K., Sugiura K., Hara T., et al. Aurora-B associated protein phosphatases as negative regulators of kinase activation // Oncogene. 2002. - V.21. -P.3103-3111.

249. Sumner A.T. Chromosome banding. London: Unwin Hayman., 1990. - 434p.

250. Szabo P.E., Hubner K., Scholer H., Mann J.R. Allele-specific expression of imprinted genes in mouse migratory primordial germ cells // Mech.Dev. 2002. - V.l 15. -P. 157-160.N

251. Tahiliani M., Koh K.P., Shen Y., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1 // Science. 2009. -V.324. - P.930-935.

252. Tanimoto K., Shimotsuma M., Matsuzaki H., Omori A., Bungert J., Engel J.D., Fukamizu A. Genomic imprinting recapitulated in the human beta-globin locus // Proc Natl Acad Sei USA. -2005. -№102. P. 10250-10255.

253. Tate P., Skarnes W., Bird A. The methyl-CpG-binding protein MeCP2 is essential development in the mouse // Nat. Genet. 1996. - V.l2. - P.205.

254. Tate P.H., Bird A.P. Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression // Curr. Opin. Genet. Dev. 1993. - V.3. - P.226.

255. Taylor J.H. Origins of replication and gene regulation // Mol Cell Biochem. -1984.-V.61 -P.99-109.

256. Tazi J., Bird A. Alternative chromatin structure of CpG islands // Cell. -1990. -V.60. P.909.

257. Thiery J. P., Macaya G., Bernard! G. An analysis of eukaryotic genomes by density gradient centrifugation // J. Mol. Biol. 1976. - V.8. - P.219-235.

258. Thomson J.P., Skene P.J., Selfridge J., Clouaire T., Guy J., Webb S., Kerr A.R., Deaton A., Andrews R., James K.D., et al. CpG islands influence chromatin structure via the CpG-binding protein Cfpl // Nature. 2010. - V.464. - P. 1082-1086.

259. Ting A.H., Schuebel K.E., Herman J.G., Baylin S.B. Short double-stranded RNA induces transcriptional gene silencing in human cancer cells in the absence of DNA methylation // Nat. Genet. 2005. - V.37. - P.906-910.

260. Tjeertes J.V., Miller K.M., Jackson S.P. Screen for DNA-damage- responsive histone modifications identifies H3K9Ac and H3K56Ac in human cells // EMBO J. -2009. -V.28.-P.1878-1889.

261. Tritto P., Specchia V., Fanti L., Berloco M., D'Alessandro R., Pimpinelli S., et al. Structure, regulation and evolution of the crystal-Stellate system of Drosophila // Genetica. 2003. - V. 117. - P.247-257.

262. Trojer P., Li G., Sims R.J. III, et al. L3MBTL1, a histonemethylation-dependent chromatin lock // Cell. 2007. - V.129. - P.915- 928.

263. Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H., et al. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins // Nature. 2006. - V.439. - P.811-816.

264. Tycko B. Epigenetic gene silencing in cancer // J. Clin. Invest. 2000. - №105. -P.401-407.

265. Valgardsdottir R., Chiodi I., Giordano M., Rossi A., Bazzini S., Ghigna C., Riva S., Biamonti G. Transcription of satellite III noncoding RNAs is a general stress response in human cells // Nucleic Acids Res. 2008. - №36. -P.423-434

266. Vails E., Sánchez-Molina S., Martínez-Balbás M.A. Role of histone modifications in marking and activating genes through mitosis // J Biol Chem. 2005. - V.280. - №52. -P.42592-42600.

267. Van Attikum H., Gasser S.M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response // Trends Cell Biol. 2009. - V.19,№5. - P.207-217.

268. Van den Wyngaert I., Sprengel J., Kass S.U., Luyten W.H. Cloning and analysis of a novel human putative DNA methyltransferase FEBS Lett. 1998. - V.426. - P.283-289.

269. Van Leeuwen F., Gafken, P.R., Gottschling D.E. Dotlp modulates silencing in yeast by methylation of the nucleosome core // Cell. 2002. - V.109. - P.745-756.

270. Vanyushin B.F., Tkacheva S.G., Belozersky A.N. Rare bases in animal DNA // Nature. 1970. - V.225. - P.948-949.

271. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W. et al. The sequence of the human genome // Science. 2001. - V.291. - P. 1304-1350.

272. Verma R.S., Babu A. Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. N-Y: Pergamon Press. Inc., 1989. - 240P.

273. Vermeulen M., Eberl H.C., Matarese F., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers // Cell. 2010. - V.142. - P.967-980.

274. Verona R.I., Mann M.R., Bartolome! M.S. Genomic imprinting: Intricacies of epigenetic regulation in clusters // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2003. - V.19. - P.237-259.

275. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.I., Martienssen R.A. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi // Science. 2002. - №297. -P. 1833-1837.

276. Wakimoto B.T., Hearn M.G. The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster II Genetics. 1990. -№125. -P.141-154.

277. Wang Z., Zang C., Rosenfeld J.A., Schönes D.E., Barski A., Cuddapah S., Cui K., Roh T.Y., Peng W., Zhang M.Q., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome // Nat Genet. 2008. - V.40. - P.897-903.

278. Waring M., Britten R.J. Nucleotide sequence repetition: a rapidly reassociating fraction of mouse DNA // Science. 1966. - V.154. - P.791-794.

279. Weber J.L., May P.E. Abundant class of human polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction // Am. J. Hum.Genet. 1989. - V.44. - P.388-396.

280. Wei Y., Mizzen C.A., Cook R.G., Gorovsky M.A., Allis C.D. Phosphorylation of histone H3 at serine 10 is correlated with chromosome condensation during mitosis and meiosis in Tetrahymena II Proc Natl Acad Sei USA. 1998. - V.95. - P.7480-7484.

281. Whetstine J.R., Nottke A., Lan F., et al. Reversal of histone lysine trimethylation by the JMJD2 family of histone demethylases // Cell. 2006. - V.125. - P.467-481.

282. Witt 0., Albig W., and Doenecke D. Testis-specific expression of a novel human H3 histone gene // Exp. Cell Res. 1996. - V.229. - P.301-306.

283. Wolf S.S. The protein arginine methyltransferase family: an update about function, new perspectives and the physiological role in humans // Cell Mol Life Sci. -2009. V.66. -P.2109-2121.

284. Wossidlo M., Nakamura T., Lepikhov K., Marques C.J., Zakhartchenko V., Boiani M., Arand J., Nakano T., Reik W., Walter J. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming // Nat Commun. 2011. -V.2. -№241.

285. Wu H., D'Alessio A.C., Ito S., Xia K„ Wang Z., Cui K„ Zhao K., Sun Y.E., Zhang Y. Dual functions of Tetl in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells // Nature. 2011. - V.473. - №7347. - P.389-393.

286. Wu H.H., Su B. Adaptive evolution of SCML1 in primates, a gene involved in male reproduction // BMC Evol Biol. . 2008 . -№8. -P. 192.

287. Wu S.C., Zhang Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome // Nat Rev Mol Cell Biol. 2010. - V. 11. - P.607-620.

288. Xhemalce B., Dawson M.A., Bannister A.J. Histone modifications In: Meyers R, ed. Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine. John Wiley and Sons, 2011.

289. Xu G.L., Bestor T.H., Bourc'his D., et al. Chromosome instability and immunodeficiency syndrome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene // Nature. 1999. - V.402. - P. 187-191.

290. Xu Y., Zhang J.J., Grifo J.A., Krey L.C. DNA methylation patterns in human tripronucleate zygotes // Molecular Human Reproduction. 2005. - V.l 1. -№3. - P.167-171.

291. Yang X.J., Seto E. HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention // Oncogene. 2007. - V.26. - P.5310-5318.

292. Yang X.J., Seto E. The Rpd3/Hdal family of lysine deacetylases: from bacteria and yeast to mice and men // Nat Rev Mol Cell Biol. 2008. - V.9. - P.206-218.

293. Yuan G., Zhu B. Histone variants and epigenetic inheritance // Biochim Biophys Acta -2011. -V.33. P.35-43.

294. Yulug IG, Yulug A, Fisher EM. The frequency and position of Alu repeats in cDNAs, as determined by database searching // Genomics. 1995. №27(3). - P.544-548.

295. Zegerman P., Canas B., Pappin D., Kouzarides T. Histone H3 lysine 4 methylation disrupts binding of nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) repressor complex // J Biol Chem. 2002. - V.277. - P. 11621-11624.

296. Zeng L., Zhang Q., Li S., Plotnikov A.N., Walsh M.J., Zhou M.M. Mechanism and regulation of acetylated histone binding by the tandem PHD finger of DPF3b // Nature. 2010. - V.466. - P.258-262.

297. Zeng Y., Cullen B.R. RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm // RNA. 2002. - V.8. - P.855-860.

298. Zhang P, Su L, Wang Z, Zhang S, Guan J, Chen Y, Yin Y, Gao F, Tang B, Li Z. The involvement of 5-hydroxymethylcytosine in active DNA demethylation in mice // Biol Reprod. 2012. -№86(4). - P.104.

299. Zhao J, Whyte J, Prather RS. Effect of epigenetic regulation during swine embryogenesis and on cloning by nuclear transfer // Cell Tissue Res. 2010. - №341(1). - P. 13-21.

300. Zhu J., He F., Hu S., Yu J. On the nature of human housekeeping genes // Trends Genet. 2008. - V.24. - p.481-484.

301. Zhu J.K. Active DNA demethylation mediated by DNA glycosylases // Annu. Rev. Genet. 2009. - Y.43. - P. 143-166.

302. Zoubak S., Clay 0., Bernardi G. The gene distribution of the human genome // Gene. 1996. - V.174. - P.95-102.

303. Zlatanova J., Thakar A. H2A.Z: view from the top // Structure. 2008. - V.16. - №2. -P. 166-179.1. БЛАГОДАРНОСТИ

304. В заключении хотелось бы поблагодарить моего научного руководителя Татьяну Владимировну Кузнецову за помощь при выполнении и написании работы, подготовке презентации и доклада.

305. Считаю своим приятным долгом поблагодарить Лидию Ивановну Самойленко и Татьяну Николаевну Панкову, преподававших биологию во время моего обучения в школе и всегда поощрявших и поддерживавших мой интерес к естественным наукам.

306. Искреннюю благодарность хотелось бы выразить всему коллективу кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.

Информация о работе

Ефимова, Ольга Алексеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Дифференциальная композиция эпигенетических маркеров сегментов метафазных хромосом человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы