Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностика вибриоза радужной форели в аквакультуре

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Диагностика вибриоза радужной форели в аквакультуре"

О/]

На правах рукописи УДК 597-12:639.371.13

БЕЗГАЧИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ДИАГНОСТИКА ВИБРИОЗА РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ ВАКВАКУЛЬТУРЕ

Специальность - 03.00.10. - ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии Департамент по рыболовству Минсельхозпрода России

Научные Заслуженный деятель науки Российской

руководители: Федерации, доктор ветеринарных наук,

профессор К.В.Шумилов

Кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник О.Д.Скляров

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук Е.М.Малкин (ВНИРО).

2. Кандидат биологических наук, доцент Л.И.Грищенко (МГВА и Б им. К.И.Скрябина)

Ведущее учреждение - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

Защита диссертации состоится с О ^ЛХХ^Г^ЦХ 1998 г.

в_часов на заседании диссертационного совета Д 117.01.02 при

Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО) по адресу: 107140, Москва, В. Красносельская, д.17.

С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке ВНИРО

Автореферат разослан "_"_1998 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук А.В.Астафьева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рыбоводство является одной из перспективных отраслей экономики многих странах мира, в том числе, и Российской Федерации. В свою очередь форелеводство является важной составляющей рыбоводства.

Целесообразность разведения радужной форели объясняется рядом факторов. Во-первых, эта рыба выделяется среди других лососевых высокой степенью эврибионтности. Во-вторых, она обладает отличными вкусовыми качествами и диетическими свойствами. В-третьих, дает высокий выход продукции с единицы площади культивирования, в сравнении с другими объектами рыбоводства

Успешному развитию и выращиванию радужной форели мешает восприимчивость ее ко многим инфекционным заболеваниям и, в частности, к вибрио-зу.

Возбудителя данной болезни впервые выделил Bergmann в 1909 году от больных угрей. Он описал это заболевание как краснуху или бубонную чуму угрей. Позднее, аналогичное заболевание у угрей, мигрирующих в Балтийском море, регистрировал Schaperclaus в 1927 и в 1934 годах. Впервые в Японии бактерии Vibrio anguillaram описал Muroga et al. в 1976 году, а в Северной Америке Crosa et al.- в 1977 году. В нашей стране первые работы по изучению заболевания рыб Каспийского моря, вызванного вибрионами, выполнены Вылегжани-ным (1958, 1967, 1973). Впервые о бактериологическом подтверждении этиологии эпизоотии вибриоза сообщили Ыун А.И. и Щукина И.Н. (1976).

Вибриоз является одним из наиболее опасных инфекционных заболеваний радужной форели в пресной, солоноватой и морской воде.

Быстрая диагностика вибриоза рыб имеет важнейшее значение, так как она определяет стратегию и тактику профилактических и лечебных мероприятий.

Разработкой методов диагностики болезней рыб и, в частности, вибриоза занимались многие отечественные ученые. Эти методы достаточно подробно представлены в работах Щербины (1973), Иванова (1976), Радина (1976), Ыун и Щукиной (1976), Гончарова (1980), Бауэра и др. (1981), Луллу и др. (1982), Ыун и Луллу (1982), Юхименко (1980) и др.

В нашей стране диагноз на вибриоз устанавливают по результатам эпизо-отологического, клинического и бактериологического метода исследования. Но даже выделение чистой культуры бактерий, по морфологическим и культураль-ным свойствам идентичных Vibrio anguillarum, предполагает их идентификацию по результатам исследования в биохимических тестах. В целом, диагностика вибриоза радужной форели требует значительных затрат времени и средств. Методы серологической диагностики заболевания в РФ не разработаны, хотя согласно сообщениям многих зарубежных исследователей и на основании результатов собственных исследований их можно считать перспективными.

С учетом важности успешного развития форелеводства в стране, исследования, посвященные разработке новых методов идентификации возбудителя вибриоза рыб, способствующих более быстрой и точной диагностике заболевания, являются вполне актуальными.

Цель и задачи исследований

Целью настоящего исследования являлось усовершенствование диагностики вибриоза рыб на модели радужной форели с использованием метода серологической идентификации возбудителя болезни.

Для достижения указанной цели на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать штаммы Vibrio anguillarum, пригодные для изготовления диагностических агглютинирующих сывороток.

2. Разработать схему гипериммунизации кроликов культурами штаммов Vibrio anguillarum с целью получения агглютинирующих сывороток.

3. Изготовить моноштаммные агглютинирующие сыворотки против Vibrio anguillarum и проверить их активность до и после лиофилизации в РА на стекле и в пробирках.

4. Испытать активность и специфичность агглютинирующих сывороток в РА на стекле и в пробирках с культурами гомологичных и гетерологичных штаммов Vibrio anguillarum и культурами штаммов других видов рода Vibrio и семейства Vibrionaceae, вызывающими у рыб заболевания сходные с вибриозом.

5. Испытать агглютинирующие сыворотки против Vibrio anguillarum и установить их рабочий титр в РА на стекле и в пробирках с полевыми культурами, выделенными из патологического материала от рыб, культивируемых в Черноморском и Балтийском бассейнах.

6. Разработать нормативную документацию на сыворотку агглютинирующую против Vibrio anguillarum, предназначенную для идентификации возбудителя вибриоза рыб и диагностики данного заболевания.

Научная новизна работы

1. Впервые установлено антигенное родство между бактериями Vibrio anguillarum, -выделенными из патологического материала от радужной форели и стальноголового лосося в Черноморском бассейне и от радужной форели в Балтийском бассейне.

2. Впервые установлено, что активность агглютинирующих сывороток против Vibrio anguillarum не снижается в процессе их лиофилизации.

3. Разработан метод изготовления агглютинирующей сыворотки против Vibrio anguillarum, позволяющей идентифицировать культуры Vibrio anguillarum разных биотипов.

Новизна полученных результатов подтверждена Авторским свидетельством № 1268172 от 8.07.1986 г. "Способ получения сухой агглютинирующей сыворотки для диагностики вибриоза лососевых рыб".

Практическая значимость работы

Для практического применения предложена сыворотка агглютинирующая против Vibrio anguillanun, позволяющая идентифицировать возбудителя вибрио-за рыб от других бактерий, патогенных для рыб. Использование данной сыворотки значительно ускоряет и упрощает диагностику вибриоза радужной форели. Сыворотка предназначена также для контроля активности антигена эритро-цитарного для диагностики вибриоза рыб и контроля антигенной активности культур штаммов Vibrio anguillarum при изготовлении вакцины бивалентной инактивированной против вибриоза рыб..

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены в годовых отчетах научной диагностической лаборатории болезней рыб и других гидробионтов на заседании Ученого совета ВНИРО за 1990-1995 тг, на заседании секции марикультуры научно-методического совета ВНИРО 30 ноября1991 года; на Y Всесоюзном симпозиуме по инфекционным болезням рыб (Москва, 1986); на I Всесоюзном совещании по болезням морских гидробионтов (Большой Утриш, 1986); На Всероссийской конференции "Научно-технические проблемы марикультуры в стране"(Владивосток, 23-29 октября 1989года); на IX Всесоюзном совещании по паразитологии и болезням рыб (Петрозаводск, март 1991 год); на научно-практической конференции "Развитие аквакультуры на внутренних водоемах", посвященной 50-летию кафедры прудового рыбоводства МСХА (Москва, 1995); на Международном симпозиуме по марикулыуре (Краснодар, п.Небуг, 24-27 сентября 1995 года); на Всероссийском совещании "Проблемы товарного выращивания лососевых рыб России" (Мурманск, 1-4 августа 1995 года); на Международном симпозиуме "Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре" ( Адлер, 1996); на Всероссийском совещании "Состояние и перспективы научно-практических разработок в области марикультуры России" (Ростов-на-Дону, 1996); на YIII Международной конференции "Болезни рыб и гидробионов" (Шотландия - Эдинбург,1997); на объединенном коллоквиуме научной диагностической лаборатории болезней рыб и других гидробионтов, отдела управления реализации МКЦП "Марикультура" ВНИРО и отдела препаратов против хронических болезней животных ВГНКИ 30 июля 1997 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ .

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список литературы и приложение на 26 страницах

Работа иллюстрирована 14 таблицами и 4 рисунками. Список использованной литературы содержит 134 источников, в том числе 85 иностранных.

К основным положениям диссертационной работы, выносимым на защиту, относятся результаты, показывающие возможность идентификации возбудителя вибриоза рыб в РА с помощью агглютинирующей сыворотки против Vibrio anguillarum.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в лаборатории марикультуры и в научной диагностической лаборатории болезней рыб и других гидробионтов ВНИРО, на базе рыбного хозяйства на Большом Утрише Анапского района Краснодарского края и в Латвийской республиканской лаборатории особо опасных инфекций животных, в рыбколхозе "Банга" в Латвии, в рыбколхозе "Им. В.И.Ленина" Выборгского района Ленинградской области в период с 1983 по 1997 годы.

Для исследования использовали культуры 236 штаммов микроорганизмов, а также вибриозный антиген для РА; антиген сальмонеллезный моновалентный Холера суис; антиген сальмонеллезный Тифи муриум; антиген сальмонеллезный моновалентный аборта овец; антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК; сыворотки вибриозные (кампилобакгериозные) моноспецифические агглютинирующие, сыворотки агглютинирующие для идентификации различных микроорганизмов.

Клиническому, патологоанатомическому и бактериологическому исследованию было подвергнуто 3500 экземпляров лососевых, в том числе 3200 экземпляров радужной форели и 300 экземпляров стальноголового лосося.

Для выделения, выращивания и типирования культур штаммов Vibrio anguillarum использовали стандартные питательные среды: полужидкий, плотный мясо- пептонный агар (МПА) cl,5% хлористого натрия и дифференциально-диагностический агар (ДДА).

Для изготовления агглютинирующих сывороток использовали 80 кроликов массой 2,5-3,0 кг.

Работу проводили руководствуясь общепринятыми в бактериологии методиками.

Принадлежность исследуемых культур к виду anguillarum определяли в соответствии с оценками результатов изучения их свойств в различных тестах

(Гончаров,1973; Радин,1976; Ыун, Щукина, 1979; Бауэр и др., 1981; Лул-лу и др., 1982).

Ориентировочную дифференциацию вибрионов от других микроорганизмов проводили по оценке роста колоний на ДДА.

Приготовление антигенов для РА

Для приготовления антигена испытуемые односуточные культуры, выращенные на МПА с содержанием 1,5% хлористого натрия, суспендировали в физиологическом растворе с содержанием 0,3% формалина. Пбсле инактивиро-вания бактериальную массу дважды отмывали физиологическим раствором с содержанием 0,3% формалина путем центрифугирования при 3000 об/мин в те-

чение 30 мин. После второго центрифугирования надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок суспендировали в идентичном растворе с таким расчетом, чтобы в 1 см"' суспензии содержался I млрд. микробных клеток по оптическому стандарту мутности ГИСК и использовали в качестве антигенов.

Приготовление антигенов для гнпериммунизацнн кроликов

.Односуточные второй генерации культуры штаммов суспендировали в стерильном 0,3%-ном формалинизированном физиологическом растворе и определяли концентрацию микробных клеток в 1 см", путем сравнения их мерных последовательных разведений с оптическим стандартом мутности ГИСК. После чего готовили суспензии вибрионов каждого штамма с концентрацией 5 млрд. микробных клеток в 1 см' и использовали их для гипериммунизации кроликов.

Постановка и учет РА на стекле.

Для постановки реакции использовали обезжиренные предметные стекла. Стекло делили на 3 равные части путем нанесения восковым карандашом поперечных линий . На первую часть стекла наносили каплю агглютинирующей сыворотки против Vibrio anguillarum, разведенной 1:40 физиологическим раствором, на вторую- каплю нормальной сыворотки крови кролика в идентичном разведении, на третью - каплю физиологического раствора (отрицательные кон-троли). На стекло рядом с каждой каплей наносили бактериологической петлей небольшое количество исследуемой культуры и тщательно ее суспендировали. После каждого суспендирования петлю прожигали и охлаждали. Учет реакции проводили визуально в течение 4 минут, слегка покачивая стекло. Если в пробе с агглютинирующей сывороткой наблюдалось просветление жидкости и образование хлопьев агглютината, а контрольные пробы оставались гомогенными реакцию оценивали как положительную. Если исследуемая проба оставалась гомогенной реакцию оценивали отрицательно. При образовании хлопьев агглютината в контрольных пробах результаты реакции считали неспецифическими.

Постановка и учет РА в пробирках

Агглютинирующую сыворотку против Vibrio anguillarum разводили физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина, в соотношении 1:12,5; 1:25; 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200. Количество рядов пробирок с содержанием по 0,5 см3 каждого разведения сыворотки готовили в соответствии с количеством исследуемых антигенов, приготовленных из испытуемых культур, плюс один ряд - для положительного контроля с гомологичным антигеном. В пробирки с разведениями сыворотки вносили по 0,5 см3 испытуемых и контрольного антигенов.

Для контроля антигенов на самоагглютинацию в пробирки с 0,5 см3 раствора, применяемого для разведения сыворотки и с 0,5 см3 нормальной кроличьей сыворотки в разведении 1:25 вносили по 0,5 см3 антигенов.

После добавления антигенов штативы с пробирками встряхивали и помещали в термостат при температуре 37-38°С на 15 - 20 часов, затем их выдерживали их при температуре 18 - 22°С в течение 3-4 часов и проводили учет реакции. За титр сыворотки принимали ее последнее разведение, в котором произошла агглютинация испытуемого антигена с оценкой не менее чем на три креста. При этом контрольный антиген из культуры Vibrio anguillarum (положительный контроль) должен агглютинироваться сывороткой до ее предельного титра и оба антигена должны давать отрицательный результат (отрицательный контроль) в реакции с нормальной кроличьей сывороткой в разведении 1:25 и с физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. ПОДБОР ШТАММОВ Vibrio anguillarum ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК

Отбирая штаммы вибрионов, которые могли бы быть использованы для получения диагностических агглютинирующих сывороток против Vibrio anguillarum, мы руководствовались рядом соображений. Штаммы должны были:

- быть выделенными из патологического материала от рыб с клиническими признаками вибриоза;

- быть патогенными для рыб по результатам биопробы;

- быть выделенными в разных регионах страны;

- обладать выраженными антигенными свойствами.

Согласно паспортным данным, требованиям первых трех пунктов отвечали штаммы Vibrio anguillarum № 1,2, 3,4, 5 и 19.

Путем микроскопирования мазков культур штаммов было установлено, что морфологически все исследуемые штаммы представлены грамотрицатель-ными, тонкими, короткими, слабоизогнутыми палочками с одним полярным жгутиком.

Результаты изучения дифференциально-диагностических свойств данных штаммов показали, что по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам они не различаются. Причем, все штаммы обладают свойствами, характерными для бшсгерий вида anguillarum биотипа А, а именно, не растут на питательной среде без хлорида натрия, дают положительную реакцию в тесте на индолообразованяе, ферментируют глюкозу, сахарозу, лактозу, арабинозу, маннозу, маннит без образования газа и не ферментируют инозит.

Антигенные свойства штаммов изучали в опыте на кроликах. Односуточ-ные культуры вибрионов, выращенные на МПА с 1,5% хлорида натрия, скошенном в пробирках, суспендировали в физиологическом растворе. Суспензии каждого штамма в объеме по 1 см3 с концентрацией 10 млрд. микробных клеток в см3 по оптическому стандарту мутности ГИСК вводили кроликам внутривенно. Каждый антиген вводили двум кроликам. Пробы сыворотки крови исследовали в пробирочной РА с использованием гомологичных и гетерологичных

инактивированных антигенов с концентрацией 1 млрд. микробных клеток в 1см3 через 7, 14, 21,28 и 42 дня после иммунизации (табл.1). За титр антител принимали наибольшее разведение сыворотки, агглютинирующей антиген с оценкой не менее чем на три креста (+++).

Из материалов таблицы видно, что исследуемые штаммы различаются по агглютиногенным свойствам. В частности, максимальные титры сыворотки крови кроликов, иммунизированных культурами штаммов № 2, 4, 19, при исследовании через 28 суток составили 1:400. Титры сыворотки крови кроликов, привитых культурами штаммов № 1,3, 5, были в этот период вдвое меньше.

Для определения антигенной специфичности двухсуточные агаровые культуры штаммов вибрионов, исследовали в РА на стекле с сыворотками, полученными в опыте по проверке агглютиногенных свойств штаммов и с разными диагностическими сыворотками. Культуры штаммов Vibrio anguillarum № 1, 2, 3, 4,5, 19 агглютинировались в прямой и перекрестных реакциях с сыворотками крови, полученными на эти штаммы и разведенными физиологическим раствором 1:40. При этом реакции отличались по характеру агглютината в зависимости от используемой культуры. Так, культуры штаммов № 2, 4, 5, 19 формировали крупнозернистый, а культуры штаммов № 1 и 3 - мелкозернистый агглютинат.

Ни одна из культур испытуемых штаммов вибрионов не агглютинировалась коли-, сальмонеллезными, кампилобактриозными, псевдомонозной, холерными сыворотками и сыворотками против протея, что позволяет сделать вывод о наличии у культур штаммов № 1,2,3,4, 5,19 общего видоспецифичного антигена.

Учитывая, что штамм № 19 выделен из патологического материала радужной форели'в Черноморском бассейне, а остальные штаммы - в Балтийском, что штамм № 2 при культивировании на стандартных питательных средах дает большее накопление бактериальной массы, что эти два штамма и штамм № 4 при агглютинации вибриозными сыворотками формируют крупнозернистый агглютинат, хорошо учитываемый невооруженным глазом, а также, что эти штаммы обладают выраженными агглютиногенными свойствами и видовой специфичностью, именно они были выбраны для приготовления гипериммунн-ных агглютинирующих сывороток против Vibrio anguillarum.

3.2. ИЗГОТОВЛЕНИЕ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК ПРОТИВ

Vibrio anguillarum

Исходя из того, что в опыте по проверке агглютиногенных свойств штаммов у кроликов, иммунизированных живыми культурами вибрионов в дозе 10 млрд. микробных клеток, наблюдались негативные явления (резко выраженная угнетенность и отказ от корма), для гипериммунизации животных было решено использовать культуры вибрионов инакгивированные формалином,а также уменьшить дозу бактерий вдвое и первое введение осуществлять подкожно,

Таблица 1

Результаты изучения агглготинОгенных свойств культур штаммов вибрионов в пробирочной РА

Сыворотка, полученная на штамм (№) Антиген из штамма (№№) СРЕДНИЙ ТИТР АНТИТЕЛ

7-ые сутки 14-ые сутки 21-ые сутки 28-ые сутки 42-ые сутки

1234567 1234567 1234567 1234567 1234567

1 1 4200000 443 1000 4443 100 444 3 100 4432000

2 2 4300000 4443 100 44443 00 44443 10 4443 200

3 3 4 100000 ^ 443 1000 4443000 4443 100 4432 100

4 4 443 1000 4 4 4 3 2 0 0 4444300 4 4 4 4 3 10 4443200

5 5 43 10000 43 2 1000 4433000 4 4 4 3 2 0 0 4432 100

19 19 42 1 0000 4443200 4443200 44443 10 4432000

Примечания: порядковые номера (1-7) соответствуют разведениям сывороток - 1:25,1:50,1:100,1:200, 1:400, 1:800, 1:1600;

цифры, расположенные под порядковыми номерами, обозначают оценку реакции в крестах

а последующие внутривенно. Для приготовления агглютинирующих сывороток культу рой каждого из штаммов иммунизировали по два кролика. Сыворотки, полученные от кроликов не смешивали" и исследовали раздельно, поэтому результаты их испытания представлены средними титрами. Схема гипериммунизации кроликов представлена в таблице 2.

Таблица 2

Схема гиперпммунизашш кроликов при изготовлении агглютинирующих сывороток

Порядковый номер инъекции Объем антигена (см3) Доза млрд. микробных клеток Способ введения

1 1 5 подкожно, в область бедра

2 1 5 в ушную вену

3 2 10 в ушную вену

4 2 10 в ушную вену

5 3 15 в ушную вену

Антигены вводили кроликам с интервалом 7 дней. Через 7 дней после пятой инъекции у кроликов брали кровь из ушной вены. Пробы сыворотки крови исследовали в пробирочной РА с гомологичными антигенами. При полной агглютинации антигенов в титре 1:1600 кроликов тотально обескровливали.

В РА с гомологичными антигенами определяли титр агглютининов в сыворотке и разливали ее в ампулы из нейтрального стекла. Одну половину сыворотки в ампулах оставили в нативном виде, а другую - лиофилизировали в лаборатории инструментальных методов контроля ВГНКИ. Ампулы с нативной сывороткой запаивали без вакуума, а с лиофилизированной сывороткой - под вакуумом.

В РА с гомологичными антигенами определяли титр агглютининов в сыворотке и разливали ее в ампулы из нейтрального стекла. Одну половину сыворотки в ампулах оставили в нативном виде, а другую - лиофилизировали в лаборатории инструментальных методов контроля ВГНКИ. Ампулы с лиофилизированной сывороткой запаивали под вакуумом.

3.3. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК ПРОТИВ Vibrio anguillarum Активность приготовленных агглютинирующих сывороток против

Vibrio anguillarum вначале изучали в РА на стекле с живыми двухсуточными культурами вибрионов. Культуры испытуемых штаммов агглютинировались сыворотками в достаточно высоких разведениях - от 1:50 до 1:800. Самой активной оказалась сыворотка, полученная на штамм №2. Культуры штаммов №1,2,3,4, 5 и 19 агглютинировались этой сывороткой соответственно в разведениях 1:300; 1:800; 1:75; 1:300; 1:50 и 1:50. Сыворотка, полученная на штамм № 4 в разведении 1:50 агглютинировала культуру штамма № 5; 1:200 - культуры штаммов № 1, 3,19; 1:300 - культуру штамма № 4; 1:400-культуру гомологичного штамма. Сыворотка, полученная на штамм №19, в титре 1:50 агглютинировала культуры штаммов №1,2,3, 5; в титре 1: 100 - культуру штамма №4 и в титре 1:200 - культуру гомологичного штамма. При этом ни одна из культур не давала агглютинации с нормальной кроличьей сывороткой в разведении 1:25 и с физиологическим раствором.

После изучения активности сывороток в РА на стекле их активность определили в пробирочной РА. Вначале это сделали в отношении нативных сывороток. При этом самые высокие титры антител были зарегистрированы при взаимодействии сывороток с гомологичными антигенами. Так, сыворотки, полученные на культуры штаммов № 2,4,19, агглютинировали антигены, приготовленные из штаммов №2,4,19, соответственно в титрах! :6400; 1:4800; 1:3200. Сыворотка, полученная на штамм № 2, агглютинировала антиген из штамма № 4 в титре 1:3200, антиген из штамма №19-1:1600; полученная на штамм № 4, агглютинировала антиген из штамма №2 в титре 1:3200, из штамма № 19 - 1:1600; полученная на штамм № 19, агглютинировала антиген из штамма № 2 в титре 1:400, из штамма № 4 - 1:1600.

Результаты исследования лиофилизированных сывороток представлены на гистограмме (рис.1). Изучая гистограмму можно увидеггь, что, как и при исследовании нативных сывороток, самые высокие титры лиофилизированных сывороток зарегистрированы в реакции с использованием антигенов, приготовленных из гомологичных штаммов. Так, сыворотка, полученная на штамм № 2, агглютинировала гомологичный антиген в титре 1:6400; полученная на штамм № 4 - в iTpe 1:4800; полученная на штамм № 19 - в титре 1:3200.

Титры сыворотки, полученной на штамм № 2, зарегистрированные в перекрестной РА с антигенами, приготовленными из штаммов 1,3,4, 5,19 составили соответственно 1:1200,1:1600, 1:3200, 1:4800,1:600, что свидетельствуют о наличии у этих штаммов общего видоспецифического антигена. Такой же вывод можно сделать, изучая результаты РА, зарегистрированные при взаимодействии сыворотки, полученной на штамм № 4, с антигенами, приготовленными из штаммов №1,2,3,5,19. Титры сыворотки при этом были соответственно равны 1:1600, 1:3200,1:3200,1:400 и 1:1600.

Титр сыворотки

1:6400 1:3200 1:1600 1:800 1:400 1:200 1:100 1:50 1:25

Сыворотка, полученная на штамм Ni 2

1 2 3 4 5 19

Сыворотка, полученная на штамм № 4

№

Щ

, . » да

B««í йк

1 2 3 4 5 19

Сыворотка, полученная на штамм № 19

Щ

ч»

■йи

1 2 3 4 5 Антигены

19

Рис. 1 Сравнительное изучение активности лиофилизированных

сывороток против Vibrio anguillarum в пробирочной РА с антигенами, изготовленными из культуры Vibrio anguillarum № 1,2,3,4,5 и 19.

Результаты исследования сыворотки, полученной на штамм 19, с антигенами, приготовленными из штаммов 1, 2,3,4, 5, также подтверждают наличие антигенного родства между этими штаммами.Титр сыворотки в реакции с антигеном из штамма № 1 составил 1:50; с антигеном из штамма № 2 - 1:400; с антигеном из штамма № 3 - 1:200; с антигеном из штамма № 4 -1:1600; с антигеном из штамма № 5 -1:100.

Сравнение результатов, полученных при исследовании нативных и лиофи-лизированных сывороток не позволило установить различия в их активности и, таким образом, явилось основанием для вывода о том, что процесс лиофилиза-ции не снижает активности агглютинирующих сывороток против Vibrio anguillarum.

3.4. ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК ПРОТИВ Vibrio anguillantm

О специфичности опытных сывороток судили по результатам исследования их в РА на стекле и в пробирках с культурами штаммов различной видовой и родовой принадлежности и приготовленными из них антигенами.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности агглютинирующих сывороток, полученных на культуры штаммов в № 2,4,19. В РА на стекле сыворотки в разведении 1:40 полностью агглютинировали двухсуточные культуры штаммов № 2,4,19. В тоже время при исследовании культур вибрионов видов alginalyticus, salmotiicida, vulnificus, damsella, splendidas, diazo-trophicus, cambelii, pelagius, а также культур бактерий рода Aeromons видов hy-drophila, anaerogenes, salmonicida, рода Pseudnomonas видов aeruginosa, alcalige-nes, Salmonella enteretidis и Escherichia coli, с теми же сыворотками в тех же разведениях положительных результатов не зарегистрировали. С нормальной кроличьей сывороткой, разведенной 1:20, и физиологическим раствором антигены также не давали положительной реакции.

Вывод о высокой видовой специфичности сывороток, полученных на штаммы № 2, 4, вытекающий из настоящего опыта, подтвержден отрицательными результатами исследования этих сывороток в РА на стекле с живыми культурами Aeromonas hydrophila и Vibrio parahaemolyticus, проведенного в Аз-НИИРХе зав. сектором микробиологии Бермант М.В.

Сыворотки были также исследованы с отрицательным результатом в РА на стекле с 10 живыми культурами разных штаммов V.cholerae 01; 10 культурами штаммов Vibrio-Nag и пятью культурами бактерий рода Aeromonas. Работа выполнялась на базе Центральной противочумной станции г.Москвы зав. лабора-

торным отделением Огневой Н.С., врачами Милютиной Л.Б. и Гусевым В.В. Сотрудником Ленинградской областной ветеринарной лаборатории Хабаровой Е.А. получен отрицательный результат при исследовании сывороток с культурой штамма Vibrio parahaemolyticus, выделенной от радужной форели в рыбкол-хозе "Им. В.И.Ленина".

При взаимодействии сывороток в РА на стекле с живой культурой

A.salmonicida, выделенной нами в 1994 году от камбалы в экономзоне Балтийского моря, и в пробирочной РА с приготовленным из этой культуры антигеном были зарегистрированы отрицательные результаты.

Результаты изучения активности и специфичности агглютинирующих сывороток позволили дать им предварительную положительную оценку в плане применения для идентификации бактерий Vibrio anguillarum.

3.5. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ КУЛЬТУР ПОЛЕВЫХ ШТАММОВ ВИБРИОНОВ

Для окончательного ответа на вопрос о возможности практического применения агглютинирующих сывороток нами была выполнена работа по выделению возбудителя внбриоза от рыб, культивируемых в Черноморском и Балтийском бассейнах и, таким образом, по изучению распространенности внбриоза в этих регионах.

В процессе работы на Большом Утрише в Анапском районе Краснодарского края от радужной форели и стальноголового лосося, культивируемых в пресной и соленой водах, при бактериологическом исследовании были выделены соответственно 52 и 24 культуры, отнесенные по результатам изучения культу-ральных и морфологических свойств к вибрионам.

В Латвии в рыбколхозе "Банга" от радужной форели, выращиваемой в садках в Рижском заливе, было выделено 90 культур вибрионов. Также в Балтийском регионе в форелевом питомнике "Камышевка" рыбколхоза "Им.

B.И.Ленина" и на форелевом участке "Кирпа" от радужной форели, культивируемой в понтонных садках в Финском заливе, было выделено соответственно 11 и 27 культур, отнесенных при первичном исследовании к вибрионам.

При исследовании в РА на стекле все выделенные культуры агглютинировались сыворотками, полученными на штаммы №2.4,19 в разведении 1:50.

Результаты исследования данных культур в пробирочной РА показали, что все выделенные культуры давали положительную РА с каждой из испытуемых сывороток, причем, в достаточно высоких разведениях. Так, сыворотка, полученная на штамм № 2, агглютинировала 4,4% культур в титре 1:100 - 1:200; 29,7% - в титре 1:400; 49,5% - в титре 1:800; 12,2% - в тигре 1:1600; 3,9% - в титре 1:3200, 1,9% - в титре 1:6400.

Сыворотка, полученная на штамм № 4 была также активна. Она агтлюти-

нировала 2% культур в титре 1:100 - 1:200; 23,5% - в титре 1:400; 52% - в титре 1:800; 13,2% - в титре 1:1600; 4,4% - в титре 1 ;3200; 3,9% - в титре 1 ;6400.

Сыворотка, полученная на культуру штамма № 19, агглютинировала 4,9% культур в титре 1:100 - 1:200; 47% - в титре 1:400; 31,3% - в титре 1:800; 11,7% -в титре 1:1600; 4,9% -в титре 1:3200. Таким образом, эта сыворотка обладала наименьшей активностью. Однако, культуры вибрионов, давшие положительную реакцию с сыворотками, полученными на штаммы № 2 и 4 в титре 1:100 -1.200, данной сывороткой агглютинировались при разведении её 1:800 - 1:1600 с оценкой не меньше, чем на 3 креста.

С учетом этих результатов нами была приготовлена серия лиофилнзиро-ванной агглютинирующей сыворотки с использованием для гипериммунизации кроликов смеси равных количеств культур штаммов № 2 и 19. Изготовление антигенов, схема гипериммунизации кроликов, дозы микробных клеток и объем вводимой суспензии оставались такими же как и при получении моноштаммных сывороток. С той лишь разницей , что приготовленные суспензии инакгивиро-ванных культур вибрионов штаммов № 2 и 19 с концентрацией 5 млрд микробных клеток в 1 см3 перед введением кроликам смешивали в равных объемах.

Приготовленную таким образом сыворотку исследовали в сравнении с моноштаммными сыворотками в пробирочной РА с антигенами из штаммов №2,4,19 (рис. 2).

Из материалов гистограммы, представленной на рисунке 2, видно, что сыворотка, полученная на смесь культур штаммов №2 и 19 агглютинирует антигены, приготовленные из штаммов №2,4,19, соответственно в титрах от 1:6400, 1:3200 и 1:3200, то есть практически в тех же титрах, в которых с этими антге-нами работают гомологичные сыворотки. Причем, необходимо отметить, что в перекрестной РА моноштаммные сыворотки работают с данными антигенами в более низких титрах. Так, сыворотка, полученная на иггамм № 2 агглютинирована антигены, приготовленные из штаммов № 4 и 19 в титрах 1:3200 и 1:1600; сыворотка, полученная на штамм № 4 агглютинировала антигены, приготовленные из штаммов № 2 ц 19 в титрах 1:3200 и 1:1600; а сыворотка, полученная на штамм № 19 агглютинировала антигены, приготовленные из штаммов № 2 и 4 в титрах 1:400 и 1:1600. Анализ этих данных позволил предположить, что для идентификации культур штаммов вида anguillarum лучше использовать не несколько моноштаммных сывороток, а одну сыворотку, полученную на смесь культур штаммов № 2 и 19. Для подтверждения этого предположения было проведено исследование антигенов, приготовленных из культур полевых штаммов, в пробирочной РА с сывороткой, полученной на штаммы №2 и 19 (таблица 2). Для сравнения в таблицу включены результаты исследования этих же антигенов в пробирочной РА с моноштаммными сыворотками.

Титр сыворотки

1:6400 1:3200 1:1600 1:800 1:400 1:200 1:100 1:50 1:25

Сыворотка, полученная на смесь штаммов № 2 и № 19

Сыворотка, полученная на штамм №2

Сыворотка, полученная на штамм № 4

Сыворотка, полученная на штамм № 19

2 4 19 2 4 19 2 4 19 2 4 19

Антигены

Рис. 2.

Сравнительное изучение активности сыворотки, полученной на смесь штаммов Vibrio anguillarum № 2 и 19, с моноштаммными сыворотками в пробирочной РА с вибриозными антигенами.

Согласно табличным данным сыворотка, полученная на смесь культур штаммов № 2 и 19, агглютинирует 1,4% антигенов в титре 1:100 - 1:200; 2С,5% -в титре 1:400; 54,9% - в титре 1:800; 16,1% - в титре 1:1600; 4,9% - в титре 1:3200; 1,9% - в титре 1:6400. При этом нужно отметить, что большая часть антигенов 77,8% давала положительную реакцию с сывороткой в титрах от 1:800 до 1:6400, а сыворотки, полученные на штаммы №2, 4,19 агглютинировали в таких титрах соответственно 67,5%, 73,5% и 47,9% антигенов. Вышеизложенные результаты позволили сделать вывод, что для идентификации вибрионов вида anguiilarum целесообразно применять сыворотку.полученную на смесь культур штаммов № 2 и 19, а не моноштаммные сыворотки. Кроме того, они послужили основанием для идентификации всех исследованных полевых культур, как бактерий Vibrio anguiilarum и, вытекающего отсюда вывода, что бактерии Vibrio anguiilarum, выделенные от радужной форели и стальноголового лосося в Черноморском бассейне и от радужной форели в Балтийском бассейне имеют обший видоспецифичный антиген. Эти результаты позволили также установить, что рабочий титр сыворотки, полученной на смесь культур штаммов Vibrio anguiilarum № 2 и 19 с предельным титром 1:3200 - 1:6400, при идентификации вибрионов в пробирочной РА составляет 1:50 оценкой агглютинации не меньше чем на 3 креста.

3.6. ИЗУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

КУЛЬТУР ПОЛЕВЫХ ШТАММОВ ВИБРИОНОВ, ОТНЕСЕННЫХ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ К ВИДУ anguiilarum

В целом, результаты исследования культурально-морфологических, тинктори-альных и биохимических свойств культур полевых штаммов позволили отнести их к Vibrio anguiilarum и, таким образом, они полностью согласуются и подтверждают результаты серологической идентификации этих культур. Кроме того, полученные результаты позволили подразделить исследуемые штаммы на биотипы. Так как, в отличие от большинства полевых штаммов, выделенные от радужной форели и стальноголового лосося на Большом Утрише соответственно 3 и 4 культуры, а также - от радужной форели в рыбколхозе "Банга" и на участке "Кирпа" 5 и 2 культуры, росли на МПА, не содержащем хлорид натрия и не обладали способностью к индолообразованию при культивировании на переваре Хоттингера. Согласно результатам исследования из 52 и 24 культур Vibrio anguiilarum, выделенных от радужной форели и стальноголового лосося на Большом Утрише, соответственно 94,3% и 83,3% культур были отнесены к биотипу А, а 5,7% и 16,7% к биотипу С. От радужной форели в рыбколхозе "Банга" было выделено 90 культур возбудителя вибриоза рыб, 94,4% которых типировапи как биотип А, а 5,6% - как биотип С.

Таблица 3

Результаты сравнительного изучения в пробирочной РА а(сгивности моиоштаммных агглютинирующих сывороток и сыворотки, полученной на смесь культур штаммов Л1> 2 и № 19.

Сыворотка, полученная на штамм № Кол-во идентифици рованных культур Культуры, давшие положительную реакцию (кол-во/%)

1:100-1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400

2 204 9/4,4 57/27,9 101/49,5 25/12,2 8/3,9 4/1,9

4 204 4/2 48/23,5 107/52,0 27/13,2 9/4,4 8/3,9

19 204 10/4,9 96/47,0 64/31,3 24/11,7 10/4,9 0

2,19 204 3/1,4 42/20,5 112/54,9 33/16,1 10/4,9 4/1,9

Все 11 культур, выделенных от радужной форели в питомнике "Камышевка" были представлены биотипом А. Из 27 культур, выделенных от рыб форелевого участка "Кирпа," 93,1% типировали как биотип А, а 7,4% - как биотип С. Общее количество выделенных культур Vibrio anguillarum составило 204. Из них 93,1% были отнесены к биотипу А, а 6,9% - к биотипу С.

Результаты биотипирования послужили основанием для вывода о том, что радужная форель и стальноголовый лосось в Черноморском бассейне и радужная форель в Балтийском бассейне чаще всего инфицированы культурой Vibrio anguillarum биотипа А. Гораздо реже от рыб выделяют культуры вибрионов данного вида биотипа С.

4. ВЫВОДЫ

1 .Бактерии Vibrio anguillarum, выделенные из патологического материала от радужной форели и стальноголового лосося в Черноморском бассейне и от радужной форели в Балтийском бассейне имеют общий видоспецифичный антиген.

2. Гипериммунизация кроликов культурами штаммов № 2, 4 и 19 позволяет получать высокоактивные специфичные сыворотки для идентификации в пластинчатой и пробирочной РА вибрионов вида anguillarum биотипов А и С.

3. Для идентификации бактерий Vibrio anguillarum в пластинчатой (ориентировочной) и пробирочной РА целесообразно применять агглютинирующую сыворотку, полученную на смесь культур Vibrio anguillarum штаммов № 2 и 19, а не моноштаммные агглютинирующие сыворотки.

4. Рабочий титр сыворотси, полученной на культуры Vibrio anguillarum штаммов № 2 и 19, в пробирочной РА для идентификации культур вибрионов составляет 1:50 с оценкой агглютинации не менее чем на три креста.

5. Активность агглютинирующих сывороток, полученных на культуры вибрионов вида anguillarum, не снижается в процессе их лиофилизации.

6. Радужная форель и стальноголовый лосось, культивируемые в Черноморском бассейне и радужная форель, выращиваемая в Балтийском бассейне чаще всего инфицированы культурой Vibrio anguillarum биотипа А и реже - биотипа С.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического применения предложена "Сыворотка агглютинирующая против Вибрио ангвиллярум". Сыворотка применяется для идентификации культур вибрионов вида anguillarum в пластинчатой (ориентировочной) и пробирочной РА, для контроля активности антигена эритроцитарного для диагностики вибриоза рыб и контроля антигенной активности культур шаммов Vibrio anguillarum при изготовлении вакцины бивалентной инакгивированной против вибриоза рыб.

Разработаны:

1.Технические условия "Сыворотка агглютинирующая против Вибрио ангвиллярум" № 9384-001-00008064-98 - утверждены 23 декабря 1997 года директо-

ром ВГНКИ А.Н.Паниным, 24 декабря 1997 года зам. директора ВНИРО Б.Н.Котеневым и согласованы 8 января 1998 года с зам. начальника Департамента ветеринарии В.В.Селиверстовым.

2. Временная инструкция по изготовлению и контролю сыворотки агглютинирующей против Вибрио ангвиллярум - утверждена 23 декабря 1997 года директором ВГНКИ А.Н.Паниным, 24 декабря 1997 года зам. директора ВНИРО Б.Н.Котеневым.

3. Временное наставление по применению сыворотки агглютинирующей против Вибрио ангвиллярум № 13-7-2/189 - утверждено 8 января 1998 года зам. начальника Департамента ветеринарии В.В.Селиверстовым.

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Безгачина Т.В. Применение реакции агглютинации в диагностике вибриоза лососевых рыб // Тезисы докладов 1 Всесоюзного совещания морских гидробионтов. Большой Утриш, сентябрь 1986.-М.-1986,- С. 3-4.

2. Безгачина Т.В.О специфичности антигена из культуры штамма Vibrio anguillarum № 4// Тезисы докладов 1 Всесоюзного совещания морских гидробионтов. Большой Утриш, сентябрь 19S6.-M.-1986.- С. 4-5.

3. Безгачина Г.В. Агглютинирующая сыворотка для идентификации возбудителя вибриоза лососевых рыб.// Тезисы докладов Y Всесоюзного симпозиума по инфекционным болезням лососевых рыб. "Профилактика лечения и диагностика инфекционных болезней рыб". - М.- 1986.- С. 10-11.

4. К вопросу серологической диагностики вибриоза лососевых рыб. /Безгачина Т.В., Радин И.Д., Ыун А.И., Кяэри М.К., Шумилов К.В., Бондарен-ко В.З., Климанов А.И.// Сб. Научных трудов. Паразиты и болезни морских гидробионтов,- Мурманск.- 1987,- С.30-39.

5. Безгачина Т.В., Радин И.Д., Бондаренко В.З. Гипериммунная сыворотка кроликов для серодиагностики вибриоза лососевых.// Журн. Рыбное хозяйство,- 1989,- № 3. С.38-39.

6. Безгачина Т.В., Шумилов К.В., Бондаренко В.З. Диагностика вибриоза лососевых рыб в Черноморском регионе России.//Сб. Докладов Всероссийского совещания 1-4 августа 1995 года. Мурманск. Проблемы выращивания лососевых рыб в России.- Мурманск: Изд. ПИНРО.- 1995,- С. 75-77.

7. Безгачина Т.В., Шумилов К.В., Бондаренко В.З. Испытание антигена из культуры штамма Vibrio anguillarum на специфичность для диагностики вибриоза лососевых рыб.// Сб. Докладов Всероссийского совещания 1-4 августа 1995 года. Мурманск. Проблемы выращивания лососевых рыб в России,-Мурманск: Изд. ПИНРО,- 1995.- С. 77-79.

8. Безгачина Т.В., Шумилов К.В., Бондаренко В.З. Идентификация возбудителей "тепловодного" и "холодноводного" вибриоза стальноголового лосося, культивируемого в Черноморском регионе на побережье Северного Кавказа в условиях ухудшения экологической среды.// Тезисы докладов Между-

народного симпозиума по марикультуре. Сентябрь, 24-27.1995. Краснодар, п. Небуг. Россия,- М.: Изд. ВНИРО,- 1995,- С.15-16.

9. Безгачина Т.В. О специфичности антигена из культуры штамма Vibrio salmonicida, используемого при получении агглютинирующей сыворотки для диагностики болезни "Хитра" лососевых рыб в Черноморском регионе страны. //Тезисы докладов Международного симпозиума "Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре", октябрь, 21-24. 1996. Адлер, Россия- Краснодар.-1996,-С.38.

10. Безгачина Т. В. Испытание на активность и специфичность агглютинирующей сыворотки для идентификации бактерий Vibrio salmonicida, выделенной от стальноголового лосося в Черноморском регионе России. // Материалы совещания "Состояние и перспектива научно-практических разработок в области марикультуры России". Ростов-на-Дону август, 1996,- М.: Изд. ВНИРО.-1996,-С. 25-28.

11. Безгачина Т. В., Шумилов К.В. Идентификация возбудителя вибрио-за - бактерии Vibrio anguülarum от радужной форели при выращивании ее на пресной воде в Балтийском регионе. // Информ. бюллетень "Итоги научно-практических работ в ихтиопатологии". МИК, РАСХН, ЦПС. - М.: 1997,- С. 41-42.

12. Безгачина Т.В., Бродинова Н.С. Выделение возбудителя фурункулеза Aeromonas salmonicida от балтийской камбалы. // Информ. бюллетень "Итоги научно-практических работ в ихтиопатологии". МИК, РАСХН, ЦПС. -М.: 1997,-С. 40-41.

13. Пученкова С.Г., Безгачина Т.В. Биологические свойства ихтиопато-логических аэромонад, выделенных от культивируемых рыб. // Сб. научных докладов Всесоюзной конференции "Научно-технические проблемы марикультуры в стране". - Владивосток.- 1989,- С. 184-185.

14. Пученкова С.Г., Безгачина Т.В. Выделение потенциальных патогенов от больных и здоровых рыб, выращиваемых в Черном море у берегов Северного Кавказа. // Тезисы докладов IX Всесоюзного совещания по паразитам и болезням рыб. - Петрозаводск, март 1991. - Л.-1990 - С 107-108.

15. Пученкова С.Г., Безгачина Т.В. Аэромонадная инфекция у культивируемых рыб. // Журнал "Рыбное хозяйство". - 1991. № 12,- С. 68.

16. Пученкова С.Г., Безгачина Т.В. Болезнь стальноголового лосося аэ-ромонйдной этиологии. //Журнал "Ветеринария". -1991 5,- С. 33-35.

17. Штамм бактерии Vibrio anguillarum , используемый для получения вакцины против вибриоза рыб. /Радин И.Д., Безгачина Т.В., Карягин В.В., Спешилов Л.И., Грибанова Г.Н., Бондаренко В.З., Шумилов К.В., Ниязов У.Э., Климанов А.И., Шихалеева H.A. // Авторское свидетельство № 1646292.3.01.1991.

18. Способ получения сухой агглютинирующей сыворотки для диагностики вибриоза лососевых рыб. / Шумилов К.В., Бондаренко В.З., Климанов

А.И., Томашевская Н.А.,Радин И. Д., БезгачинаТ.В., Ыун А.И., Кяэри М.К. // Авторское свидетельство № 1268172.- 8.07.1986.

19. Bezgachina T.V., Shumilov K.V. Isolation of bacteria Vibrio anguillaram as vibriosis inducer from rainbov trout grown at freshwater farms in the Baltic Sea region. // Abstract book VI 11 !h International Conference "Diseases of Fish and Shellfish" European Association of Fish Patologists. Edinburgh Conference Centre Heriot - Watt University - 1997,- P. 71.

Форыат 60 x84 I/I6 Подписано к печати 17/П-98г. Тирах 100 OSseu - 1,25 п » л » Заказ 28

ВНИРО, I07I4Û,Москва,В.Красносельская,17