Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностика пебрины тутового шелкопряда и факторов специфической противонозематозной резистентности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Диагностика пебрины тутового шелкопряда и факторов специфической противонозематозной резистентности"

шдкш НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

О О Л инсиют шшшк

на нравах рукопиоя УДК 638.25/593.195:577.1,616.373,616.739.6

гарафутдонова меж ашровна

дитюстш. 'гшвркиы етового шелкопряда к факторы спшдапЕской пр<ш©онозттозЕЮй

РЕЗИСТЕНТНОСТИ

Оиецкадьность 03.00.04 - биохшп

03,00.09 - энтомология

дассвртецш на соасканкв ученой итедаяи доктора биологических наук

ТАШКЕНТ 1997

Работа выполнена в Узбекском научко-исс^доватвльском инстжтутэ шелководства УзАСХН

офщиальнда оппонйнты:

доктор „нолотячесхих наук, профессор 2АЛИН0В С.К. академик УэШН» чшн-норр. РАОХЙ, профессор ДШйШШВДОВ С.Н.

доктор биологических наук ШЕШЩ0Б& 0.

Ведущее учреждение Ташкентский Государствами!" 1 Университет

Защита дассергчшга состоатся^^й^^^^-^ в часов на заседания спедашшзировашзго совета Д.015Л8.01 при Институте биохимии йН Шз го ядро су: 700143, Ташкент, проспект Х.Абдуллеева, 66, Институт Окохижк АН РУз.

О днссортацией иоано ознакомиться в библиотека йкститу-тв бнохим-а АН РУз.

Автореферат разослан ^1997 г.

Ученый с&крвтарь спвцаализарованного совота.к.б.н. (/У^я- УСМ4Н0ВА Г.

Актуальность темы.Одной из задач совремэнной биохимия является выявление изменений или нарушений метаболических процессов при различии патологиях у живи организмов.

О этой точки зрения весьма интересным и актуальны» является изучение связанных с развитием патологии бжгаммчоскг' отклоно-ний в тк8. IX насекомых,в частности, тутового шелкопряда - пола-зного насекомого, промышленное рвзввдениэ которого является одной из основных отраслей сельского хозяйства Узбекистана.

Среди ряда инфекционных болезней шелкопряда наибольшую опасность представляет нозематоз, вызываемый макросноридаей Nosema bomt jia N., широко известный во всех шелководческих странах ..од названием пебрина.

Нэсмотря на то, что возбудитель заболевания известен ужо с конца прошлого века, биохимические аспекты развития нозематоз-ной патологии тутового шелкопряда до сих пор остаются практически неизученными. Патологические изменения инвазировашой мик-роспоридияш клетки-хозяина находят физиологическое и биохимическое отраженна как на организменном.так и на ткан—юм уровне. Практически полная шизученность подобных изменений у тутового шелкопряда является вэсьма существенным пробелом в представлениях как о механизма развитая хозяино-паразитпых взаимоотношений, так и о метанизме развития патологии у хозяина .ри нозематозе.

Изучена этих вопросов представляется важным на только с теоретический точки зрения, во и с точки зрения практического шелководства. Именно при изучении биохимических процессов, сопутствующих нозенатозной патологии открываются широкие возможности создания новых способов дифференциальной даагпостшш заражения в медикаментозного воздействия.

Вполне очевидно, что присутствие в организме тутового шелкопряда любой стадии развитая возбудителя пебрины имееет свое отражение в изменениях или нарушениях метаболических процессов, зависимых как от длительности развития инвазии, так и от ctí да развития самого хозяина, а шага его природной нозематозной резистентности. Y "¡ошвнно.что некоторые из этих изменений могут являться не только характеристическими показателями той или иной стада развита!, отологии и хозяшю-паразитшх взаимоотношений.по и прямыми биохимическими признаками и^азировашюсти шелкопряда, дзс-

товарными для любой фазы развитая патологического процесса при лобой природной устойчивости хозяина.

Исходя из этого, прэдставдяется весьма актуальным изучение в ходе развития нозематозной патологии и в зависимости от природной противонороматозно» устойчивости пород состояния активности клэчовых в метабоякгш насекомых ферментов.

Необходимым а интересным представляется также изучение другого аспекта биохимии хозяшо-паразитных взаимоотношений при нозематозе: факторов протгоонозематозной резистентности.

Аналогично первому направлению исследований и?учение этих вопросов имеет весьма существенное практическое значение, постольку его результаты могут и дожни стать теоретической основой для разработки принципиально новых средств и методов борьбы с нозематозом тутового кэлкопряда, направленных на специфическую про-тивонозематозную стимуляцию иммунной системы хозяина.

Таким образом, и с теоретической, и с практической точек зрения насущным является изучение вопросов биохимии развития хоэяи-да-паразитных взаимоотношений при нозематозе тутового шелкопряда.

Исходя из этого, целью данной работы явилось:

Изучение биохимических аспектов развития нозематозной патологии у тутового шелкопряда, вклнчащих состоянгэ активности клпчевых в метаболизма насекомых ферментов, динамику некоторых количественных показателей и активность факторов противонозе-матозной рез-стентаости, и разработка принципиально новых способов диагностики, о такав подходов к лечению и профилактика нозематоза.

Для достижения поставленной цеди-решались следувдио задачи:

1.Поиск биохимических тестов заракзякости.

2.Разработка иммуноферментного способа диететики нозематоза по споровой форме возбудителя.

3.Изучение влияния нозематозной инвазии на качественный состав гемограмм и функционадьн/в активность клеток гемолимфа гусениц тутового шелкопряда. .■•«

4.Наделение, биохимическая характеристика н испытаю© противо-асбранозного действия веществ"с протасоноз ивтозной активнос-

тью из тканей гусениц тутового шелкопряда. 5.Изучение противоноэематозной активности спещфке ких протинг-

споровых сывороток и юс производных и специфической противоспоровой иммунной РНК.

Научная новизна работы. В работе впервые проводек изучение состо^шя ряда биохимических поквэг-елей тканей гусениц и -грены тутового шелкоппяда в зависимости от природной пебриноуо-тойчивдсти пород н глубины развития нозвматозного процесса. Показано изменение ври нозематозе количественного содержания и электрофоретического спектра белков гемолимфы гусениц, отклоне- . ние ьт нормы активности неспецинических эстераз, протеиназ, фе~ ( лолоксвдазы, АТФ-азы и р!1 гемолимфы, АТФ-азы в жировом теле и грене тутового шелкопряда, изменение количественного содержания РНК в грена. Продемонстрировано, что эти параметры имеют сложную динамику в развитии позематозной инвазии и являются новыми биохимическими характеристиками определенных стадий развития нозвматозного процесса, а некоторые из них могут служить биохи-кичвскимч диагностическими к прогностическими призш сами пебри-коустойчивости пород тутового шелкопряд«.

В юмушкош^твнтных тканях гусениц (гемолимфе и жировое тело) впервые продемонстрировано наличие факторов с противоно-зематозной активность!), отличанцкхся алвктрофо^тически в норме и при нозематозе друг от друга и от лнзоцима.

Впервые показано, что на ранних атапах развития инвазии происходят спещфиеские изменения в дафференцировке клеток ге~ молим|ы, направленные на усиление защитной функции и зависящие от природной нозематоэной устойчивости пород. При «елее длительной патологии, очевидно, происходит нарушение кооперативное™ между клеточными * гуморальными факторами иммунитета, возникавшее вследствие выявленного подавления под действием паразита активности феиолоксядази и специфической противонозвматозной активности н иммужжомпететных тканях - гемолш!« и жар«, ом ле.

Разр?. ««ни способы получения имнунодиагдаетикума на дозе-' матоз и кон-штата фосфолкпвзм А2 с антителами для иммунсфершг-. теого анализа и способ ЙОД-диагностики пебрины.

Проведенные на зараженной но1 матоэом грене испытания дейот.-

вия специфических протиЕюнозимагозних сывороток и их производных, а тают иммунной РНК продемонстрировали впервые для больного тутогого шелкопряда возможность специ|а. .оской стимуляции его иммунной системы.

Практическая значимость работы.Три биохимических показателя могут быть использовали к с диагностические признаки нозематоз-ной инвазии не только в экспериментальных исследованиях, но а в практическом шелководстр". Это: концентрация белка в гетяиб4>и гусошц 7-го возраста, падающая при нозематозе нвза асида от природной пебриноустойчивости пород; содержание РНК в 13-твдне-шой грвпе.провышающее норму при сильной зараженности и стгаиш-;ееся шгаэ норма при слабых степенях заражения; нулевая активность AW'-азы в зараженной грене в конце летне-осенней эстива-ция и в конце дианаузи. Проведение в У-м личиночном возрасте прижизненной диагностики по белку позь-мт сохранить поголовье гусениц (и, следовательно, коконов), истребляемое в настоящее ' вррмя при проведэшш предварительной диагностики зараженности. Практическое использовав в качестве тостов зараженности ко. дчествеиного опро/еления РНК и активности АТФ-азы в грань позволит определить ее качество еще до закладки на зимне» хранение , что даст возможность сократить материальные затрата на зимовку некондиционной грени, устранить процедуру весеннего микроскопического Госконтроля грены и провести заблаговременную обработку хренм нротивонозематозшда препаратами и довести, ее кондгдап до возможности реализации. Loe это связано с определенным акоюмическим аффектом.

Состояние активности фенолохеидазы в гемолимфе гусениц на 11-й день после алиментарного заражения является прогностичес-' чм признаком пг "'ршоуитойчивости пород,что может бить использовано в селекционной работе.

Разработанный иммунофэрментный способ диагностики пебрипа по надежности а чувствительности превосходит применяемый в нас-•ояафо время микроанализ. Его практическое использование позпо лит не шысо максимально сократить материальный ущерб от побрили за счет выбраковки слабо зараженио-о материала и ненслшда ния его на выкормку, но и будет связано с научно-техническим прогрессом oTpacjáj и улучшением условий труда,поскольку способ

полностью исключает процедуру микроскопировакия.

Показанная возможность специфической противонозоматозной стимуляции тутового шелкопряда иммуноспецифическими факторам« откршзает перспективу создания нового современного нацравления в борьбе с инвазионными болезнями тутового в«>лкопряда - иммунотерапии и иммунопрофилактики.

Апробация работа.Материалы исследований были представлены на I и III Республиканских конференциях биохимиков Узбекистана в 1985 И 1996гг.

Способ иммувофермэвтаой диагностики пебрины тутового шелкопряда прошел в 1990 году производственные испытания на Самаркандской плэмшелкстгщии.

Публикации. По материалам работа опубликовано и находится в печати 28 работ, из них 4 ыторских свидетельства на изобретение, I презрительный патент РУз и 2 методические рекомендации.

Объем работы. Диссертация изложена на 224 страницах я включает 7 рисунков, 31 таблицу. Список использованной литературы представлен 215-ю наименованиями. Диссертация построена по традиционному пла:у и состоит чэ введения, обзорч литература <3 глава), материалов и методов, результатов и обсуждения (3 осно-иные главы), заключения, выводов, практически рекомендаций, списка литературы и приложения.

Содержание работа.

В обзоре литературы (главз I) рассматриваются особенности хозяино-паразитннх взаимоотношений макросцоридий с насекомыми, особенности иммунитета насекомых и проблема диагностики нозематоза тутового шелкопряда.

2.Материала и метода.

Объектом исследования являлся здоровый и: зараженный нозематозом тутовый шелкопряд (гу эшщы.бчбочки, грена). Использованы три порода тутового шелкопряда, различнее по природной пебриноус-тойчивости: Аожако - знсокоустойчивая, САНИШ1-9 - среднеустой-чивал, Багдад - неустойчивая. Кроме того, в работе использованы кролики породы Шишшла. Использовались реактивы как отечест-

ионного, так и зарубежного производства с квалификацией т.ч. и х.ч.дяя анализа.

Выделение а оч..стку спор Nosema bombycis проводили из зараженных нозематозом гусениц 1У-го возраста методом дифференциального цвнтртафугирования и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Искусственное заражение тутового шелкопряда проводили на фаза гусениц, скармливая им листья шелковиц», обработанные водной суспензией спор с титром lO^-IO6 спор в мл в зависимости от долей эксперимента в первый день III, 1У, либо У-m возраста.

Определение количественного содержания белка в гемолимфе гусениц тутового шелкопряда проводили по Лоури при разбавлении гэмолим^ы водой. .

Определение pH гемолимфы проводили на ионометре марки рЯ-131.

Электрофорез белков гемолимфы тутового шелкопряда проводила в 7,5% полиакраламидном голе в присутствии и отсутствии SDS.

Определение количественного содержания Д.-. и РНК в грене тутового шелкопряда проводили по Филипповичу (1975).

Определение активиста АЮ-азы проводили в гемолимфе, жировом теле гусениц и в грене тутового шелкопряда, используя в качество субстрата 4 Ш АТФ. Неорганический фосфат определяли по Туракулову и др. (1967).

Определегаш активности эстеразы проводили в гемолгой» гусениц трех контрастных по пвбриноустоЯчивости пород тутового шелкопряда спектр^фотометрически, используя в качестве субстрата 0,01% ^-на^гилацетат.прдаадовдащшй гз 0,0511 фосфатном буфере, содержащем 2% ацетона (Налотоы,1987).

Определение активности ьротеази проводили при pH 7,8 и 10,9 и гитжмро тех жо пород методом Антона, модифицированным для определения активности пвптидогидролаз в тзинях тутового шелкопряда. • • г

Определение активносги( фекояохсядззы проводили также в гемолимфе гусониц трех пород тутового иелкопряда далярографиче^им датодом, используя в качества йуЪстрата пирокатехин в концен-трпцяа ?,50 мхг/4 мл.

Очистку пярс(ксид8эи проводили на КМ-цвллалозв.элшруя фрак-

цни градиентом На-вцетатшго буфера от 0,005 М до 0,2 М при из менении рН от 2.4 ДО 7,4.

Коюпгаадго пероксидазц с антитела ив осуществляли по методу Атгажеа et а1. (1971) с иошцью I* ллутяроиого вльдвгвда в присутствии боргидрнда натрия.

Ешш^-яие активности пероксидаэы гг оводили либо спектрофо-тометрически, либо визуально гю развитии темно-корнчиовой окраски в инкубационных пробах посла инкубации юс с субстратным раствором, содержащим 0,043Е-о-фенш!енди8Мин, 0,04Я Н202 в 0,1 М фосфатном буфере рН 5,5.

^явление активности фосфолипази А^ проводили, определяя время коагуляции эмульсии яичного желтка (ЭЯК).

Изучение клеточного состава геыолиц$ы проводили путем под счета гемограмм гусениц 4-го дня У-го возраста 3-х контрастных но природной пеориноустойчивости псрод цри различной длительно-ста течения нозематозной инвазии.

Изучение функциональной активности клеток тешхлтзфа проводили с помощью НСТ-теста при рН инкубационной смей. 3,6.

Получение тшугшол И ¡К проводили из печени и из селезенка иммунизирование -> спорами П,ЪотЬус1з кролика фенолышм методом, проводя ее дальнейшее разделение на высоко- и нчзкомолекулярвдю Фракции.

Обработ / грены протавонозеиатозшаи препаратаия проводили, погружая образцы грены в водные растворы испытуемых веществ при температуре 23°С па 2 часа.

Э. РЕГ'ЧЬ'ГАТН И ОССУХДЕККК

3.1.Выявление биохимических признаков нозеиатозиой инвазии.

Измопешю некоторых биохимических параметров на определенных этапах развития инвазировашюго хозяша является косненным свидетельством паразитической деятельности вегетативных стадий ра звития возбудителя. С цель» опроделшгая диагностической ценное ти Оиохг-ичвских показателей, учитывая известные из литература особенности хозяипо-паразитных взаимоотношений, определяла состояние ч норме и при нозематоза кладущих пя^метров: общее ко -

личествэнное содержание и эликтрофоретический сноктр белков го-молим]ы, рН гемолимфы, количественное содержании нуклеиновых кислот ЩК И РНК) в 1-рода, активность общо*. АТФ-зы в гемолимфе, жировом телэ гусениц и грене, активность аесп&цифических астераз, протоиназ и финолоксидазы в х-емолш!» гусениц.

Учитывая, что ноземат зная инвазия сопровождается уменьшением общего количеств« темсшшфи и сущесгвошшл« угнетением Са-зиологичоского состоянии гусениц, ш провели сравнительное не-сладовагда количественного содержания белка в гемох 4е гусениц 5-го дня У-го возраста трех контрастных по природной устойчивости к нозематозу пород тутового шелкопряда при различных стйпо-ях развития нозематозного процесса, вклшая нозематоз с транс-овариалышй (наследстшнной) передачей заражения.

Показано, что у здоровых гусениц концентрация бежа в гемо-лим!» увеличивается от младших возрасти к старшим. При заражении эта тенденция сохраняется, однако, уровень повыше™ содержа*^ белка при обеих формах нозематоза (алиментарной и трансо-вариалыюй) к концу У-гг возраста существенно ниже, чем в норме „ всех изучвнных пород независимо от ах природной устойчивости к пебршю (табл.3.1.1). Из данных таблицы видно, что содержание

Таблица 3.1.1.Количественное содержание белка в гемолимфе гусениц тутового шелкопряда на б-й день У-го возраста. _( цг/ил.) ___

ьариант

порода

БАГДАД

: САНИИШ-9 : А0И4К0

здоровые 70,67 + .7,30 103,0 ± 10,2 109,7 + 8,3

заражение в У вочр. М? + 6,30 ± 6,0 95,1 + 5,4

заражение в 1У шзр. 55,00 + 5,00 85,7 * 3,2 90,7 + 2,8

заражение вШ возр. 48,50 4 3,12 79,0 * 6,1 70,0 + 6,2

трансовариальное 43.12 8,0 61,1

зара*"ние 41,42 ±2,25 - 9,8

белка в гемолимфе тем ниже, чем Солее п ^должительно заболела шю. Однако, даже при очень малой длительности заболевания (Ь-6 дней, заражение' ь У-м возрасте) уже регистрируется стшзнда концентрация белка в гемолимфе. В этот период возОудитшц.

. П

на прошел полностью даже один цикл своего внутриклеточного развития, и считается, что его отношения с пораженной клеткой носят пока "дружественна»" характер (Woieer, 7.taka,l975), отсутствуют защитные реакции со стороны как самой пораженной клетки, так и окружающих ее клеток. Тем не менее на*™! данные показывают, что уенно в этот период наблюдаются перше, пока ei,j неглубокие изменения метаболизма тканей, в частности , гемолимфы. В дальнейшем, по море развития патологического процесса и распространения возбудителя в организме, • -и изменения нарастают, концентрация белка в гемолимфе снижается, достигая минимального уровня при самой длительной из изученных нами продолжительности заболевания (17 дней, заражение в III возрасте). При трансовариальной передало инвазии к 5-му дню У возраста содор-жанио белка в гемолимфе минимально и его уровень понижен по сравнению и нормой у порода Багдад в 1,6 раза, СШИВ-9 - в 2,5 раза, Аожико - в 1,8 раза.

Факт зависимости уровня снижения концентрации белка гемолизы от продолжительности заболевания и независимости глубины этих изменений от природно' чувствительности юрод тутового шелкопряда к нсбринэ позволяет считать данный показатель универсальным признаком наличия в организме хозяина активно метабо-дизирулцего возбудителя. Безусловная ценность этого признака заключается в том, что он свидетельствует о зараженности уже тогда, когда традиционными методами зсфшшр^вать ев ещо невозможно. Кроме того, для анализа необходимо очень мзлое количество rcMOJUMja, которое можно пс (учить из надреза или прокола одной из ложноножек гусеницы, на принося ей заметпого вреда, то есть становится возможной прижизненная диагностика нозематоза на стадии гусеницы, что приводит к сохранению поголовья гусениц и соответствующему и«<у увеличению урожая коконов.

При электрофорвтическом разделении в гемолимфе здоровых гусениц во все выбранные сроки исследования Ото выявлено 9 элок-. трофоретических фракций. С возрастом в >нолимфе гусениц обнаружено лишь изменение количественного содержания белка в отдельных фрг-циях, общее же число фракций оставалось постоянным. Иная картина наблюдается в гемоличфе гус гац с т^япсовариальным нозематозом. Уже в первый день исследования,т.е. пв 4-й день

III возраста нами обнаружено I? алектрофорет^оскш фракций. Характерной особенность» алектрофоретического спектра в данном случае является о', ясительно равномерное количество иное распределение банка по фракциям. Причина больией алвктрофоретач&ской гетерогенное-« гештмфи побршозвдх гусепвд пока тает. Однако. очевадао, что это явление одно аз биохимическим выражений течения патологического процесса о теле, больных нозематозом гусениц и возникает. ою- в ответ на поражение клеток хозяина мак-росшридией.

При экспериментальном зарааенаи гусениц дазегчтозом в вача,-ла III» 1У и У возрастов было обнаружен» появление 2-х. драодага-тельннх фракций в катодной часта геля уже да 3-й день заражения (4-Й день III возраста). Обе эти фракции отсутствуя» при траэс-овараалыюм нозематозе, а при искусственном заражении сохраняется вплоть до 10 дня У-го возраста. Друг тс измоивнкй в. ошектро-форетическом спектре Оелков гемолшф! вксперашатальна заракзи-lüjx гусениц нами не отмечено.

Выявленные различия в алвктрофоретическа.. спектрах белков гемолиза при наследственном и пероралыюм заражении нозематозом свидетельствуют д«бо о различии механизмов ответной |®акц2э организма тутового шелкопряда при этих двух типах заражения ш-кроспорздиями, либо о различной степени воздействия- паразита ж> тгаОолтосшю процессы хозяина. Последнее предасложзнаа бот» вероятно, поскольку при трансоваршиыюм ишвазированш паразит, розвивалпь в греш, оказывает угаетащоо действие на оргаита® тутового шелкедряда уже в эмбриональном периоде, что и щшодал к боло о выраженным изменениям Лелков ч> спектра гемолим!» растущих гусениц.

Как известно, pH внутренней среда организма играем весь;® важную роль, обесточивая нормальное зротеканяо множоства ферментативных роакцай и фуисционированш органо.» и тканей. В наши® якснеримзнтах особое внимание было обращено па pH гркош>.Ци гусениц У-го возраста, так кок в ~ооизводствешшх условиях именно в отом возрасти осуществляется закличительный зтап предваритиль-ной диагностики нозематоза по гусеницам, и , кроме того, в ото время в шгоазировяшюм орг"Чизме патологический процесс развивается наиболее интенсивно.

го

Эксперименты проводились на гуовняцах порода САШШВ-9, й «от шяюльзов&т здоровых гусениц, гусвшщ с траг овариаль-ям к алиментарным оозематозом (табл.3.1.2). Как вадао из прол

Таблица 3.1.2.Значение величины рН гемолимфы гусениц у-г» возрасте порода СШИП-9 при нозематоза различной этиологии.

вариант

4-й дань

6-а дань : 8-й дань

здоровые

трансовараалыюе звражешю

Заражение в ИГ возраста

Заражению в У возов- -"е

6,52 ± 0,004 <> = 0.06

6,57 t 0,001 <Г- 0.032 t = 0,54

6.68 * 0,001 <Г « 0,032 t а 1,55

6,20 i 0,00 (Га 0,02

t = 4,5

6,7 £ 0,00 <Г=0

6.6 £ о,о

<Г в 0,032 t а 3,12

6.7 £ 0,001 « » 0,032 t = 0,94

6.67 £ 0,001 <Г и 0,032 t * 0,94

6,66 £ 0,01 ff* =0,033

6,73 £ О,001 . <у 0,54 t * 1,09

6,76 £ 0,002 в » 0,173 t » 0,205

6.66 £ 0,04

(Г а 0,063 » в 0,00

сташшшшх данных:, мы пв обнаружили значительного изменения рН гемолимЗи -'[тл нозематозо. статистически досте^ ля разница получена толы - на 4-й дань У-ro возраста мажду здоровыми и зараженными в У-м возрасте гусеницами и аа 6-й дань У-го возраста между здоровыми п зараженными трэнсоварнальш гусеницами. Значение разницы рН генодикф! в указанны* случаях составляет 0,,"52 и 0,1 единиц рН. Учитывая.гораздо большие естоствоташо капвбя-ния волачиш рН гемолиз«!», гусениц. южно сделать вывод о мааой информативности показателя рН при рутинном обследовании тутового шелкопряда па зараженность нозематозом па крупномасштабша производствешшх выкормках.Однако, обращает на собн внимание и требует теоретического объяснения факт резкого падания \ 1 (да 0,32) в первые дат заражения алиментарным способом. Это явяшш может бЫ5 использовано в экспериментальных исследованиях по , нозематозу тутового шелкопряда для экспресс-оценки наличия air -ражвншнля на ранних этапах инвазии,когда совершенно отсутста$ ют но только внешние прознакк за" швания, но и веюсчюжло ш -ределито шшгпю возбудителя э организме хозяина па одним иг

известных методов.

Известно, что переход насекомого-хозяина в состояние диапау-зы сопровождается усиленным спорообразование!« паразита .Принимая аналогию с бактериальным спорообразованием, сопряженным с усилением синтеза РНК.,и, учитывая данные yurusawa et al. (1985) об относительном постошетве удержания РНК и ДНК в яйцах тутового шелкопряда, начиная со второго дня поело отк-адки и в точение последующи 400 и 16п дней соответственно,можно надеяться, что сдоя i в балансе нуклеиновых кислот, возможно вцлваомыв микроспоридаальной инвазией, в этот период должны быть хорошо заметными. Исходя из этого, мы продали изучение динамики соде-|..каьгая нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в здоровой и в различной степени шшазировашой грене тутового шелкопряда порода САНИШЬ 9 по срокам, связанным со сменой фаз развития паразита (сменой вегетативных форм на спороврч), с целы» установления возможности использования этого признака как диаиюстического.Исслодова-ни? проводили на 33-й и 100-й дня после откладки грош и в конце летне-осеннего период аставацяи. Было показано,что иняапая ылкроспорвдизй tj.br, >iyoia на" вызывает достоверных отклонении от нормы в содержании ДНК во вси исследованные сроки. В случае же РНК (табл.3.1.3.) обнаружено достоверное снижение ее содержания

Таблица 3.1.3. Динамика содержания РНК в грене тутового шелкопряда в зависимости от срока ее развития (мг/г грены).

Сшша. заражен-I я грена

33-й день : поело . : откладки

100 дней после откладки

:коноц летда-: осенней : астивации

26,37 - 2,9 3,7

27,12 i I.7G <у = 3,33 t = 0,37

27,79 ± 3,48 ОГ'= 3,22 t = 0,26

Вг тант

Здоровая Грена 24,П8 - 0,38 24,3° - 6,86

а = 0,43 j = 2,63

Слабо заражен- 20,44 ± 0,29 16,87 - 2,43

ная грена ff = 0,54 в = 3,55

t = 5,38 t = 2,04

27,96 - 0,33 22,08 ± 3,06

S = 0,32 & = 3,03

t * 7,76 t = 0,63

при слабой степени зараженности на протяжении всего летне -осеннего периода. Количество РНК в слабо зараженной грене стагошч пя нормальных лишь в конце периода летта-осешюй астивации. П(л

сильном заражении наблвдается. напротив, возрастание количества РНК до 28, мг/г сухого вещества грены.Однако,уже через ТОО дней после откладки не наблвдается достоверных отклонений от норм;.

Исходя из ьашх дашшх, можно закатить, что изменение содержания ИИ в гроно на 13-й донь после отклчдки может служить биохимическим тестом зараженности нозематозом,позволяю^ ! определить и степень зяражогшосги: при слабой сгекони содержание РНК ниже нор.м, а при сильной степени - вше норм.

Одной из особенностей хозяшо-пара~тннх взаимоотношений при нозематозе пвляотсн энергетическая зависимость возбудителя, лишепиого собственной эпоргосянтазируицей системы, от энергетических процессов : >зяшш.Это позволило нам предположить, что нозематозная инвазия мохот сопровождаться из.ленвния?.м метаболизма,и, в частности, гидролиза основного макрозрглчоского сооди-пшгая - АТС, то есть специфическими изменениями активности комплекса АТФ-аз, что может являться диагностическим признаком заболевания. Исследования проводили на грене и гусоницах тутового шелкопряда породи САНЮТ~9, здоровых н при различной длительности течения но„.;Ш)То:щого »-чзцосся. Есслэдуогвга тканями гусениц были гемолимфа и жировое тело, (рис.3 ЛЛ.)

Из представленных дэнпнх видно, что позематозпая инвазия влечет за собой изменение активности лГФ-азы как в тканях гусениц, так и в грше тутового шелкопряд?'. Динамика изменения активности фермента имеет сложный харак'гор и l ..висит от длительности заболевания и возраста насекомого, в котором произошло' инвазированяэ. Вероятно, это с 'ъясняетея различной сопротивляемость!) возбудителя организма тутового шелкопряда нп разных этапах ого собственного развития. Í! исследованных тканях гусениц при разных сроках и способах заражения активность АТФ-язы на протяжении у-го ^зраста то прэвшает норму, то падает ниже нормального уровня здоровнх гусениц. По-другому обстоит дело в случае зараженной грены: имеется по крайней мере 2 срока в развитии грены - конец летттп-осетмего ujpt ча астивацни и конец диапаузы, когда в здоровой грене активность АТФ-азы опродоляэт-ся, " в зараженной, ^зависимо от уровня ее зараженности - нет. Столь однозначная разница в уровк- актив! эстн фг внта позволяет рассматривать данный признак в качестве диагностического на

мхг Р/мг белка/чао

; икг Р/мг салка/чае

6 А

дни Ув.

миг Р/мг белка/час

-----^-,-1-h

диапауза ' 3 6 9 дни инкубация

В

Рисунок 3.1*1, Динамика активности АТШ-азы в ^тканях гусениц и грене тутового шелкопряда при нозематозе А - жировое тело, Б - гемолимфа, В - грена

..... ■ здоровый шелкопряд

■ щшштщт наследственно зараженный — и«ним зараженный в III 'в. tmimm^t» аараженныи в 1У в ' :таФ»в» ,Prtp<!.*9."»!HÄ В У. В,

фвэе грены. Ценность этого тоста заключается в том, что .он. ки зволяэт определять качество грены до или без прове/ кия ее Госконтроля на зараженность небритой, осуществляемого путем ммкрл скопического анализа гусониц-оживтвнцов, что с одной стороны сокращает затраты времена и труда, а с другой - позвс~яот » случае нв ¡ходимости заблаговременно яг'чмть меры по оздоровдо» шш грены и доведению ее кондиционности до возможности реализации, например, путем обработки известным противонозематозпым препаратом возокатол-4 (Кошкарова и др. ,1937).

В организма насекомых эсторазы принимают ноиосредственное учас j9 в метаболизме пвонйлышх горшнов и их аналогов, которые в свою очередь ответственны за процессы кетаморфоза. D отношении микросноридий известно, что они способны, выделять в« -щества, обладающая шепильной активностью (Метспалу.Хиаесаер, 1984). Кроме этого, нарушение при нозематозе процессов лкныш насекомого, ишпонив периодов вступления в диапаузу и самой да анузы (Исси,1Э86) позволило пом предположить ВОЗМОКНОСТЬ Й2М»-пания а'-^гопости эстараз в гомолжф гусениц в ходе взвитая гозншга-паразитных взьнмоотпоибняй гт£гл нозематоза.

Установлено 'рис.3.1.2.),что здороша гусошща трех «зучг.-а 1шх пород па 4-й донь У-го возраста ароктичэски на отличашчы по акгипис „та эстеразы. При трансовзриалыюм з^яжопии иййзмон-iioíi остпотс« активность только у порода СА1ШИЙ-9, а у двух яру гих пород она сущоствэнно падает. Близка к этим значениям air« вность эсторазы ripi заражшш гусениц в III шзроото, то ость при самом длительном развитии ноавматозногчг процесса посла шт-монтарпо -> зар|гешгя.^стг*т1я окончания гюрпого цнк > "иугржяк-точного развития паразита и выхода вновьооразовакиихся спор но внеклеточное пространство (заражение в 1У возрасто) хврактврн зуется у всох трех пород всплеском активности эотеразн. В начр -лэ же шшозйошого процесса у пород Багдад и САНШ!-9 пвблщи атся некоторое издание активности и лишь у порода Аокико показан нобол!Люй всплеск активности.

Таким viöpaaoM, нз полученных нямк дашшх слодуот, что r:m-нив позе^чтозной патологии действитшю сопровождается иэ«.'"2-< ни»м активности неодацифнческих асторяз гемолотфьЛри пая paiuoHir-itb измокшим активности ..ри развитии интернетного ирг-

зараж.

Рисунок 3.1.°-. Зависимость активности неспецифиче&~ ких астераз гемолимфы гусениц тутового шелкопряда на 4-й д нь У ьозрасга от длительности заражения ноааиатоаом

.............и.««» - порода Аожико

шш тшят яш - порода СА121)51-9 - породе Багдад

16

цесса у всох трех пород одинакова: некоторое подавленно актив-поста, затем на 10-11 день - сильный всплеск активности и далее - существенное сотжотою.

Поскольку мы не располагаем параллельными данными о динамике количественного содержания ювднильного г'гадала у гусениц при рпрпитии "'озематозной инвазии, мы не можем судить,наскс .ко об-нзруженгаю колебания эстеразной активности при нозематозе связаны с гормональным статусом гусоняц и является ли 01га отражением каких-либо компенсаторных реакцд? ч хоэяияо-параэитннх отношениях Н.ЬотЬуо1а с тутошм пюлкопрядом. Однако, на 7.0-П-й день заражения, когда наблщдается сильный всплеск активности эстервз, наблюдаемся и увэличонио количества активных, способных к фагоцитозу (см. дчлрт>) клеток гемолю.пи. Это может свидетельствовать о том, что повышение активности астераз связано с усил~чиеш »или началом) иммунной (клеточной шм гу?юралыюй) защиты гусениц тутового шлкопряда. Необходимо также отмотить невозможность использования данного показателя как диагностического признака, поскольку в зависимости от способа заражения, длительности ь^болэвания г природной устойч! хзти пород отхло-пэпля этого показателя от пормы различны и дазэ разнопаправлон-

ГШ.

Участие протволитических форгентов в регуляции процессов, изменяющихся под влиянием нозематозней инвазии (например, обмена белков, индукции иммунного ответа) позволяло нам предположить паличиэ зависимости мазду активностью протешвз гемолим^! гусени$ тутового шелкопряда и глубиной развития нозематозной патологии, что могло Си служить диагностическим признаком заболевания. В связи с этим, ш предприняли изучение проТеолитячес-кой актишюсти гешлии2и гусениц тутового шелкопряда при различной степени развития нозематоза у трех модчлыых пород с различной природной лсбриноустойчивостьо.

Как видно из нредставлршшх на тасупкв. 3.1.3 дяпяых,уровень активности нротеаз гвьк т*}н здороьых т 'сеннц у всох трех пород относительно одинаков и при р!1 7,8, и при рН 10,9.

Чрл тр чеовяршльном Зар8ГЭПИИ у всох трех порол во всех вариантах активность протоиназы "чла су: ствеян вн-ле норага, чтб можат быть связано с сильным бактериальным и грибная зпра-

Акт. усл.йм'/мг белка

И--

адор.а

11.16 ..¿У" здор. 5 XI 15 насл^

оараж

(Акт. усл.ед./мг белка

/

инвазии —**-д:1И наел, эараж.

3,, —» ""Г" Ге*°""'Ф'

Рисунок 3.1.0« нозематозе

гу/оиии тутового В-псрода Багдад

города Ао^^^^Дн 7,е

, —1ПГ- - при Рн 10 »9

жениэм гусениц, набдадаищшса при данных условиях. Алели» дашшх но зависимости величии протоолитлчоской активности от сроков развития нозематозной инвазии и природной устойчивости пород свидетельствует, что этот признак нецелесообразно иснсш. зовать ни в качестве даагностическ /о, га в качестве прогносте чоокото л[ -знака устойчивости пород, поскольку в ходе развитии заболевания вектори изменений величины иротеолитичоской актив ности меняются сложнь..., трудно интерпретируемым образом и но прослеживаются различия величини вктивяости фермента в зависимости от природной устойчивости.

" тстема фенолоксидазных ферментов гемолии]« насекомого яв-дется тем главным звеном защити хозяина от паразита, отключение (или подавление) которого под воздействием паразита позволяет последнему весьма успешно избежать собственного распозна вания и обезвреживания иммунной системой хозяина.В связи с этим нам представлялось важным изучвшо динамики активности фонолой сидази гемолтаЦи гусениц тутового шелкопряда при нозематозной инвазии у нород с различной природной устойчивостью " данному заболоашш ц при paзJ пшх сроках р^в. лш патологии. Как видно из представленных на рисунке 3.1.4 дашшх здоровые гусеницы т^х пород различзвтол по активности фсиолсжсидозн геколим!«!, нрд-чем. как и следовало ожидать, наименыгей она ш залась у пород* Багдад, отли зицвйсл наименьшей цвбршгаустойчгаюсгыз. Насколько шоа дашлм оказался факт гораздо большой (в 3 раза) активности фенолоксидазы у порода САНШ11-9," чем у породи Аожшсо, в отношении которых известно, что послодаяи проявляет яаиболыздю цвбргаоустойчивость к^юзематозу. Начало заражения (5 дай инвазии - период интенсивного внутрнхлеточш. о развитии вегииш вншс стадий паразита) характеризуется следупнвмя иородгаищ ос«; бонностями: у породи Аоанко наблодаотся подавление активности феюлоксвдази до 86? от уровня здоровнх гусепиц; у пород Ъ'вддад а СА1ШШ-9 активность с умственно возрастает, достигая ( эттат-ствонао 282 и 213 процентов от уровня активности в нор.«.

Разви ш нозематозной инвазии, переход возбудителя к онер«! образована» и появление во внеклеточном пространств» «¡.ш/, разовань»< спор приводит к резкому пвдвниа вктив.имсти.фо(и«;'л сидяза на .[1-й дынь инвазии У в<у ' т{юх пород. Однако, фш

•Акг. хЮ"^, Ы С>2 'мин/мг белка 70 .

60

А

40 .. 30

/

/

\

/

/

/

II 15 насд.

длиг.шшаа дни

здорог-а

Рисунок 3.1,4. Зависимость активности фенолоксидизь гемолимфы гусениц 5-го дня У-го возраста различны/, пород от длительности развития нозематоэной инвази:-

...........................- ■■ ~ порода Аожико

яшт ш*шш'~ пород с САНИШ-9 ■шишт - порода Багдад

шпие с нормальным уровнем активности фенолоксвдазы показывает, что наибольшее подавление активности паблвдается у породи Багдад, далее - у породы САИМН-9 и наименьшее - у породи Аоаико. Очевидно, имогою к этому периоду развития инвазии начинают проявляться особепности хозяшо-паразитных вза—кюташений микро-спгчидии г- хозяином,обеспечивающие различпу!) природную „ тойчи-вость пород. Паразитическая деятельность поземц к данпому сроку у пород САНИИШ-9 и, особенно, Багдад приводят к более глубокому подавленно активности фенолоксвдазы, чгч у порода Аошко, по-видимому обладающей какими-то, пока неизвестными, защитными факторами, препятствувдими столь сильному депрессируюшему влиянию со сторопц парази.а па акпшнос7ь феполоксидози.Более глубокое развита» нозематозной инвазии вызывает у всех трех пород повышение активности феполоксидази, причем наименьшее ее возрастание, свиде.эльствупцее о прэдшествупцея глубоком и устойчивом подавлении, наблюдается у слабоустоИчивой к нозематозу породи Багдад. У пород Аоаико н САШШВ-9 активность повышается соответственно до 62% и 97Ж от нормального уровня.Однако, к этому периоду заболеваем гусениц» т результате их о абления паразитической деятельпосты) ноземн легко подвергаются различным сопут-ствуяцим шфекциям.Поскольку извэстпо, что бактерии-могут вызывать у тутового шелкопряда увеличение активности фенолоксидаз-ннх ферментов (АзМаа е! а1. ,1993),было Си неправильным оценивать происходящие к атому времени изменения активности фенолоксвдазы как розультат хозяшо -паразитных взаимоотношений тутового шелкопряда только лито, с ж зомой. Скорое всего, складаваици-йся к атому периоду уровень активности фюнолоксядазн является следствием реакция защитны* систем шелкопряда против смешанных инфекция.

Таким образом, развитие нозематозной штазии влечет за собой сшшлпю активности фенолоксвдазы гемолы^а, причем, к 11-му дню ипвазш, когда тип рчаииоотяошениВ микроспоридяи с клеткой хозяина сменяется с ^гмбиотмчеойогг на паразитический (Уа-гга,1973; ТЫ<1погИ973), стопош, подавлшяя активности фенолок-свдрчн у р- лличних пород тутового пэлкопряда соответствует их нркродпой чувствительности к шзгчатозу. Это ш: одяот говорить о том, что педтяеиио активности фанолоксвдазн под влиянием пя-

¡»впита является одним из механизмов, с помощ -з которого паразит ускользает от взаимодействия с защнтгшми систомамя хозяина. С другой стороны, у; -воль сохранения активности фонолоксидазы при экспериментальном заражении нозематозом свидетельствует о поб-рлшустойчизости пород.

В резудь.ате проведенных исследований нами шявдош.по крайней марв.тря биохимических показателя, могущих служить признаки наличия яозоматозной инвазиа ва фазе гусениц и грады туто-«ого шедко! _.ада. Однако, осуществление биохимических анализов требует олроделешшл навыков и наличия специальных нриборов.да-чтоцу, несмотря на их высокую информативность и ^шюсть, их тюдрениэ в отечественное шелководство еще долгое время будет оставаться проблематичным. Насуцшю проблеш колководства тро-бувг скорейшего создана« надежного сог;ромашого метода диагностика взамен трудоемкого и морально устарогеюто шкроскскшчаско-го анализа. В атом шшк» нам продегазшшсь порешетншой рэз-рпботао тазуаологачоского тесто на заракегшость, основанного на йшунофор:431гпюм ааалкзо.

3.2. Рйзработо тшфюлогичЕСпого теста зерЕкенностй тутсоого еалзеопреда иозоиатозон,

Ыотод зшшлаатся в ш&?упохи?.теско:з взшюдр&сгвпя скор яозбудателя с шшггалаян к ним, содорзздгйнхся в-^лобулаттеой Франции сийоротаа щют кролика (роагент1), и паслэдущс« изо • вмодрйстхш этого кошяонса с энтптолака к глобулшкшой фракция ¡¡».¡зороткн крг п? нроляка, шчвшшвд фэрмаытом фосфсышазой /и, (реап /г 3). О ИЕлачиа антагока (спор и.ЪошЬуо1п) судят но наличии йоркоктатяваой ахташюь л, которая проявляется в увеличения вредаш коагуляция эмульсий качного азлтаа.

При разработав Емгйупофоршгокголо способа дпагноепшш даа&-*мтоза кягмввгаш валялась слэдуида ющой1: подготовка ыти-о ип, получение антисызоротки, разработке схеш проведения »нала за.

Для получения «птигоиЗ, свъиодного от примесей тканой х< чп ни«, могувдгх снизить диагностическую данность адгпкшюротки.ггл чи б«л разработан способ получения спор ?я из гусениц

ту*?!чч'то пвлкоириди, тттащЮ. гт отчту :« гр»»лямт> ня-тм

га сахарозы.

Для установления оптимальных условий получения гиперимугеюй сипкротки проводились испытания различных доз и схом голмугаюв-та кроликов. Установлено, что оптшалышм является трехкратное нодкокноо введение 2.5 мл иммунизационной с-чей с интервалом в 10 чией. при этом наибольшее количество онтатол наблвда :-ся на 14-о сутки после последней инъекции. Таким образом были определены оптимальные условия получения реагента I.

Нам! исследовалась возможность йог тьзовяния в IШ нп пеб-рияу двух маркерных ферментов: пероксидазы и фосфолипази А^.Поел» серия экспериментов бил выбран фермой? фосфолотеза Л^ из яда сродкоазийтск й кобры, так как наличие у тутового шелкопряда больного количества гоботтошюЛ порокевдг.зы создает большой (Зон активности этого (фермента.Всо иослвдувдио эксперименты ПРОВОДИ "ЧСЬ С -1С р.® НТО?.! фосфолшазой Л^.

Бил рйзрэбогян способ получения конытгата фосфолшазн с яя-тлтолзмл для Шк - роагвнт 2. Способ защищен авторским свидето-льстпом, випущрге» методическая ракомэндация. При этом отработана параметры диагностику"'), изигочевдив еле 'вщио юшчевме ус-ловилгспособ конхмгаровашгя фермент» с штасывороткоЯ;контроль активности фермента в колмзгато и кодтпг^вдлм» шакошгастя ло-луколичостютюй оценки результатов Шк (уволячошю формонтати-тюЯ активности с увеличением количеств конгюгвта, вносимого в инкубационную пробу); оггрэдэледао оитщалъп^го состава компот-птов даагностзксума (необходимость дополнительной очистки и оптимальной соотношение фермент "юг/ж); контроль с4ф01!тиигости полученного дпагпостикума в ге&гунофор^птш»Г анализо с чистым пологигольная антигеном (сдарэ.'ш).

Пала проведана нешсродстюнная диагностика нозематоза разработанным методом д ерэвпепие результатов с ДОПНЫМа.ЩЯтЯТОГО в производство >ягк}юаиаиста. Способ догляди? слэдуицим обрезом. ИсслэдуеуаЗ материал (гусоняци. куколкгт, бябочкя. гротга) растирается в стугоса с доОяг.гптп;м ноболишоп количества пода.Из го-дагеяата дотают мпзок по покровном стекло; подсушивают, фиксирую* п СГТОГТ1 спирт:э^ир и наносят 1-2 капли реагента I (пропарят этгтстап против спор я.ьодаъуо'ч). Ир- ¡эра? ипурярувт 30 минут при 371Ю вляяитоЯ кемзро и плтвм тщательно отмывав* от

не связавшегося реагента физиологическим раст">ром. Далее на пртарат наносят 1-2 капли реагента 2 (антисьшоротки к глобули-нотой фракции сиволотки крови кролика, конъюгироввшой с фюсфо-люшзой а2). Повторяют инкубации во влаетой каморе в течение 30 минут. Тщательно отмывают несвязавшайся реагент 2 физраствором и погружают . репарат в эмульсию яичного желтка для определения наличия активности фосфолипазы. Пробирки переносят на кипящую шдянув баню и фиксируют время наступления полной коагуляции

В результате бь о установлено, что способ иммуноферментной диагностики по чувствительности превосходит нрим^июмый в производстве микроанализ, так как позволяет обнаружить с большой степенью достоверности очень слабое заражение, не диагностируемое световым фазово-коптрастинм ыпкроскопированием;индикация искомого антигена - спор - представляется достаточно специфичной: фосфюлкпазшш актшшость и соответственно реет времени коагуляции ЭЯХ имеет место только в тех случаях, в которых созданы условия для реализации всего комплекса ш*-'нохимичоских вза-жюдейстшй(табл.3.2.1);при централизованном снабжении даагноо-тикумами (реагентом I ч реагентом 2) промиялвшюго производства идауноформонтный способ диагностики пэбртш в сравнении с применяемым на производстве микроанализом характеризуется существенно мэныюй трудоемкостью, абсолютной простого*, отсутствием потребности в дефицитных реактивах, оборудования и специалистах высокой квалификации, так как полностью устраняется необходя- , шеть мшфосхппированья.

Ее I доя реагенте 2 в настоящее время мы на видим возможности усовершенствования, то в ношении реагента I - антисыворотки - существуют два направления усовершенствования. Во-первых, ,зто перевод ентигэна в растворимую Форму и получение ~лтисыво~ {»тки на растворимый, а нэ на корпускулярш'Ч антиген. При этом, очевидно, должен повысится татр специфических антител в антисн-воротке. Во-вторых, выделена, из общей антиснвороткЬ иммупоспв-щфпеской фракция и ее ешхти.гелшое использование в ИФА ч ¡¡ячество реагента I, что и было*сделано при получении шмуподи-нгносткуна вв нозематоз. Это паюштольно отразилось на спади-! лчаог,та н чувствительности анализа (табл.3 1.1). '

Таблица 3.2.1. Определение зараженности материала пебринеч с использованием в ИФА противоспоравай антисыворотки и усоаершЕМСТВОввнного мммунодизгностикум».

•X >ак~-риетика исследуеппго материала,!ИЧ>А с усовершенствованным!ИФА с обшей противо—

* по ааьнип мкроскопического анализа 'диагностикумом «спорое«. ■ амтисыаорот-

• • !кой

заражения

3 минут 50 секунд

—. Слабое заражение <7 спор на 50 полей 1*? минут 50 секунд эрвния! ^

3.Сильное заражение £5 спог на 1 поле зрения)

4. Слабое заражение (7 спор на 50 полей зрения)

": - Заражения пебриной мет, наблюдаются полиэдры В£П

¿•Чистый положительный антиген <50 спор »»л 1 поле зрения) — контроль

21 минута ЗО секунд 12 минут ОО секунд 0 минут 40 секунд 7 минут Ю секунд

12 минут АО секунд 17 минут 40 секунд

20 минут ОО секунд

12 минут ОО секунд-

11 минут 50 ¿ек/нд

7 минут Ю секунд

ьарилнт 4 ма первом этапе обработан нспмальной сывороткой неиммунизированнрго кролика» •Ьариант Ь — контроль, не подвергался о работке сыворотками.

Иммунофериешшй способ .иагностшш пеСрины прошел щюизпо • дстшшшз испытания на Самаркандской племшелкстанцаи. Получено положительное заключение об ис; «ании способ в производственных условиях со стороны работников племшелкстянции. принимавших непосредственное участие в проведении испытания.

3.3.Изучение факторов специфической протевонозематозной резистегкости тутового ыелкопра^а.

Другим способом борьбы с нозематозом яиляется г^здайотвио на зараженного тутового шелкопряда противоа. эматозними средствами. Эти сродства разрабатываются и испитываотся постоянно, однако, их подбор осуществляется по аналогии из извзетных дм теплокровных организмов лечебных препаратов, избирательно дай -ствушдос на болезнетворных простейших. Среда известных нротн-вопозоматоьшх препаратов нот ни одного, специфично иацрандон цого против М.ЬояЬуо1в и с мулирушдаго иммунные защитные сис теш хозяина. Это объективно связано с абсолютной неизученное ть^ иммушшх реакций хозяина при нозематозной инвазии. В сняз -чи с олш и о целью раз^богки принципиально новых ерэдда бы и о проведено шучэпш. реакции клеток гемолимфы гусениц па позема-точную инвазия и зависимости от длительности заболевания и при родной неОришустойчивости пород, а также изучение гуморальных противоназоматозшх факторов в гедадшф) и аировом тело гуся-шц. Нами установлено, что по рашшх этапах развитая нозематоз ной шшазш! выраженность изменений гемограмм гусениц тутового шелкопряда, сввдетельствущих о а вкглишш клеточных защитных механизмов, а именно: резкое увеличение содержания фагоцитов, макроцуклооцатов и ашхешю количества пролейкоцатон,совпадает с природной побрииоусг Ччивостьи юрод. Наиболее существен™ ата изменения у устойчивой порода Аоашко, среднее шшжлш занимает среднеустойчивая шрода СА1ШШ-9 и мшкш существенна реакция со стороны клеточных адамантов чувствительной к нооом,. гозу юрода Багдад. Корреляции неаду обп(им уиэличонаш калач и та активных к; ¡ток и природой пабраноустойчивостьа пород но отмочено, поскольку наибольшое количеств активных клеток ни"-« далось у средиэустойчиэой порода СДНИИШ-9.

Изучений гуморальных проттюнозематозише (¡«кто}«« пякюп:

ч,

наличие в имчудакомлетоптшк тканях здорового тутового гселкопр-яда - гемолимфе и жировом тело - компонентов с высокой протшзо-даэрматозпой пктавностьн, э^ектрофоретически отличвгасосся друг от друга и от известного нэспещфпеского фактора гуморального иммунитета насокомнх - лнзонима (их внполоипе п олактрофороз про Но^андян АЛ, ,ИВХ АН РУэ).Нозематозаал инвазия I лводит к резкому снжкешпо протяшодазематозпой активности в гемолимфо и йяровом теле.Наряду с подавлением активности фонолжсидпзи это явление макет быть еще одним механизмом способствующим патологи вескому изменения занятных реакций хозяина.

Таким образом.обнаружэшшэ особонноста реакции на поземэтоэ-ную инвазию со стт они клеточных и гуморальных факторов иммунной защити позволяют зашагать,что на ранних эталах заражения,несмотря на внутриклеточную ликь«язацию возбудителя и симбиотический характер вг^ямоотноавний иозду ним и пораженным* клетками,от после дюа все го поступает сигналы, вызывайте изменения в специ-фп&ской дифферешщхшо клеток гемолтфа.непревлешше на усиленно зоздтной фушоди.Мвдаородкне различия в степени этих изменений на ранних . шах заражетш в свою очвредт предполагают, что пртгродаоя устойчивость к пворане связана именно с интенсивностью этого первичного сигнала,а отсутствие существенной межпородной разницы в количества еятявных фагоцитирующих клеток при длительном заболевании возможно связано с нарушением коонэраташюсти мзэду клеточными и гуморальными факторами ж -унитета.происходя-вдм ~сладспш подавления под действием'паразита активности фе-нолоксидазц а специфической цр^тивонозематозной активности в ш-мунокошэтэнтшх тканях - гемолимфе и жировом- теле.

Это обстоятельство породило идеи использования в качестве ентшозештоэяого средства специфической антисыворотки к спорам П.ЪотЬ7о1а а оо про: подах хан онсошгчоских агентов и специфической иияунпоЗ РНК, вяделенпой из селеэеякк Еилуннзяровэнного сиор$мя кролпкэ как индуктора специфических юздунных реакций.

Прог&дэкнаэ на зарагенн.Л всэвнсловом грэнэ тутового пелко-щшда Еслнтапяя дайствая указания вегцэетв продешнстрярозэли гшршв для больного утозого вэлкоарядо шсг.таюсгь специфической стимуляции его Е*мунноЯ систеля (гв^шщ Э.Я.Э.Я 3.3.4) а оперши пзрепективу создана! косого, соирдашшги шдгода в бо-

{>:/« с инвазионными болезнями тутового шелкопряда - иммунотера-лш и иммунопрофилактики.

"абл.З.З.З.Результвтн испытания действия иммушспецифи-ческих сюроток на зараженную нозематозом грену тутового шелкопряда.

вари н т

тмтпп :Экстен~ : Снижение ээражеаностн ™^.:сшои'ь :ш сравнению с контрэдем

* : шя : абс. г : относ. Ж

_Средняя_зкстенсивяость заражения

Антиснворотка 91,3 5,54 7,21 56,54

Антиснворотка + ь% дасо 94,7 . 6,22 6,53 51,21

Сыворотка крови 91,2 10,90 1,85 14,6

кролика

ДМСО 91,7 12,70 - -

Контроль (вода) 92,7 12,75 - -

Антиснворотка

Комплекс антител к антигенам споровой поверхности

Контроль (вода)

_Сильная_экстепси1Шость заражения _

81,5 15,75 17,95 53,30

86,0 13,95 19,75 58,60

71,0 33,7 -

♦ДМСО -диметилсульфоксид, добавляется для уменьшения вязкости анти «воротки

В проведршшх нами акспараментах специфичес а противонозе-яатозний аффект препаратов на основе специфических антител дос. тагал КЗ, 6 процентов при очень васо ой исходной экстенсивности заражения, а обеззараживающий еффект препаратов ИИ превышал 96 процентов при исходной экстенсивности заражения грады существенно большей, чвм практически встречается в производство.

Столь высокий противонозематозпнй эффект па больную грену тутового взелкопряда иммунной от таксономачески очонь дчле-!;п1ч. донора свидетельствуо* о том, что гештпо'таю механизмы л'пмгска эицияюж реякцр* звадацк .ю кояшрввтявиы и пртдааи-

алыю одинаковы у насекомых и ылекошгтавдях. В этой связи , тм

Таблица 3.3.4. Влияние обработки препаратами РНК на заряженную нозематозом грен" тутового шелкопряда.

:концопт- :выход гу-:заражение :сшшшто аз п п п и » тт г : рация : сениц, из .гусениц- граженностя вариант лтепарата: грепы :оживлонцев:по сравчмш»

гмкглоомл: (С) ; (%) ПЕ)

Среаяяя_8кстенсивность зарагония

РНК дрошшвая 50 96,3 4,61 33,09

РНК дроЕйввая 100 95,3 4,55 33,96

РШС дрожжевая 150 96,0 5,32 . 22,6-1

РНК нечени нммупя- 50 97,5 5,52 19.79

зиропанного кролика

ГНК печет нммухы- ТОО 95,8 3.46 49,79

зкровашки-о кролика

РНК селезенки икму- 50 97,5 0.26 96,23

низкпо' 1шюго кро-

лика

Контроль (вода) - 94,0 6,69 -

_Шодкпя_экстепсавпость зврчвйпия

РНК высокомолекуляр- - 50 03,0 21,22 34.51

ная из сол!. зш им-

муниз^ювашого кро-

лика

РНК нязкомолекуляр- 50 83,0 19.77 39.00

ная из селезенки им-

мунизированного кро-

лика

Контроль (вода) - 71.0 32,0 -

нимая во вшманнз способность иммунных РНК индуцировать спец» фнческие иммунные реашсш без крздаествуицего контакта с соот вотствущами антигенаан у позвоночных, можно надеяться, что им основе «Мчунных РНК п перспективе могут быть созданы »якц.>ш;|;е препарат" против протозойной болезни насекомых, действий кочо [их будет паирапдено на регуляцию механизмов гегстиопюго ко 4 тролн с!"т иммунного р081Ир0ВВН)Ь..

¿.Заявление.

Ь результате проведешшх исследований показано, что позема-тознвя иняазия тутового шелкопряда сопровоау, атся изменением ряда биохимически* показателей тканой гусениц тутоиого шелкопряда. Их краткая характеристика представлена в таблица 4.1.

Однако, как видна из -пшшх таблицу, Оольк.,лство из 1шх в ходе течения и углубления нозематозной инвазии меняются сло"Шм образом, вынлитуда и вектора етих изменений резко колеблются и завцсюг'чга от стадаи развития хозяяно-паразитншс с одоикй. Это делает невозмокким использование подобии* показателей в качестве диагностических признаков в крупномасштабной промаишен-юй диагностике.Тем ш мшюе, установленные закономерности их изминекая при развитии патологии могут найти свое приметшие в аколеримонтйлышх иссладовзнши по нозематозу. Безусловно ценными биохимическими диагностическими нж шаками явдлотся:конце-нтрацм солка в гемолимфе ъсэниц У-го возраста, содержание НИ в ТЗ-тиднэвной грене, активность АТФ-ааи в зараженной грош в конце лотио-осеппой эстинации и в конце диапауза. Прошостичьс!-1 .лм признаком нозематозной устойчивости пород является изм.що-шо активности фоколоксвдази гемолимфы к 11-му дна развития ш ваг а.

В целях совершенствования практического способа диагностики нэОрнни разработан кммунофоршшшй снособ диагностика спорокЛ Форш с использованием формонта-маркеро фосфолиназн А^ из ядн среднеазиатской кобры. Способ отличас зл высокой чувствительно--стьн, спецж5ичностьв, простотой исполнения, полностью исключает необходашсть мякросконярованяя и использования какого-чйабо сложного оборудованы и дефицитных рооктшюв.

Изучение клеточных л гуморальных фшчгоров иммунитета гусо-ииц тутового шэлкопряда ири нозематозе показало, что на рашмк этапах, развития инвазии происходят специфические изйзншгая в дифферанцаровко клоток гемолим^, направленные на усиление за цигас.. Фушоди. При более длительной патологии, очевидно, про исходят "тврушоь^з коонеративности меаду клеточными и гушрал1, нами факторами иммунитета,возиикащео н ¡дствио подавления год дойсгаааи паразита активности Зонолоксидазы и ттм

4«'ш«кой противоаозенатозной активности и иммушжомттшичшх

Таблиц« 4.1. Характеристика некоторых биохимических показателей тутового шслкопряал при нозоматозной инвазии и оценка их диагностической ценное-и

1 ♦ Показатель ! Динамика при нозематоза < Зависимость от1Возможность

1 ! » природной ус (исполь зова—

( ! 1 тойчиаости ?ния а дчтг—

( 1 ? 1мостик*

1» • 2 ! о » 4 1 3

1. Количественное содержание? белка в гемолимфе гу сениц

А.Уменьшается с развитием но— звмлтозного процесса

2.Электрофор этический спектр Б.Зависит от фермы заражени

—елков гегшлиифу гусениц

3.РН гемолимфы

4.Содержание '-ОС в грене

5.Содсрх*нив РНК в гране

б.йкп ность АТФ—азы в гемолимфа гусениц

(Наследственная или алиментарная)

В.Существенных отклонений нет На 3—Л день инвазии резкое падение на О _ — единицы

Б.Нет отклонений от норны

Б.На 13-й и на 100-й лень после откладки при слабом заражении ниже нормы, при силь ом заражении на 13—й .день выше нормы.

Б.Зависит от возраста заражения гусениц и длительности инвазии» при заражении в IV возрасте и в У—м на 6—ой день У воз-

не зависит

возможно

возможно эксперимент«

возможно

невозможно «следствие СЛОЖНОЙ

динамики

".Активность АТФ—азы и.жировом теле

3.Ак-чвносгь АТФ—азы в I рене

рас-га -еозрастание) затем на 8—ой йене - резкое падение. При заражении в Iî X возрасте —подавлении ¿и: шности мл протяжении всего Y—го возраста.

Б.В начале Y—га возраста при эара-жеш î в любом возрасте активность ниже нормы, затеи возрастает,достигая нормы,если заражение произошло s IY и Y возрастах,« сущес-гоеи-на превышает норму при заражении е III возрасте.

Б.В конце летнэ—осенной астиаации вации и s конце зимнего «ранения

ни« активность атф—аза в заражЕМ—

лй грене близка к нулю. При весеннем развитии грены м 3-й день инкубации активность выше нормы» на ¿»—ой и 9—й дни -ниже нормы.

возможно

9.Активность неспецифических эстераэ гемолимфы гусениц

При трансоаариальном заражении на наблнэдамтся 4—й день, Y—го возроста у по- эды А различия и В -существенное падение?, у породы Б —нет отклонений.Аналогичная активность при заражен», и III—м ооэрасте.При заражении а IY возрасте у всех город <А,Б,В,) -вгплеск ^ активности,при заражении в Y—м воз-

расте у А -превышает норму,у Б—чуть ниже нормы,у В—существенно ниже нормы

IG. QtcTvteHocTb общей про—При трансовариальнам заражении — »—

геиназы при РН 7, 8 в у всех пород (А, Б, В> жтионость геиолт^е гусениц выше норни. При алиментарном

заражении у пород А,Б —превышение

невозможно

вследствие

сложного

характера

динамики

отклонений

I !

.8

нормы при любой длите 1ЬНОСти инвазии, у породы В -при 5—ги и 11-ти (з. га мой инвазии чиве «эрмы, при 15—ги дмевио^ —кет отличий от нормы.

11.Активность общей При трансоьириальнач заражении выше протеиназы при' нормы у веек пород. При алиментарном

рН Ю,9 в гемолимфе заражении у А —5-.и дневная инвазия

гусениц

12.Активность фенол— .месидазы в гемолимфе гусениц

—активность, ниже нормы, 11—ти и 15-тидн^виая -активность выше нормы, у .4? гактианасть выше нормы во все сроки инвазии,у В дней инаазии - активность ниже норты,"11 дней —нет отличий от нормы, 15 имей существен но ниже нормы.

При трансовариальмом заражении активность у породы В существенно выше нормы,у А и В ниже нормы. При алиментарной заражении у В —на 5—й день инаазии акт< зность несколько- ниже нормы, на 11—й и 13—й

-•и —существенное подавление акгтио мости, у Б — на 5—й день инвазии активность в 2 раза превышает нормы, на 11—й день - тнетвнив активности, на 15 день приближается к норме. У А —на 5~й день-инаазии активность почти в 3 раза выше н мы, на 11—й I. 15—й дни —угнетение активности.

невозможно, возможно ис— по зование данного признака для определения пеОримо—ус— точивости пород

неустойчивая порода, Б — среднеустойчиаая порода, В — высокоустойчива« порода

тканях гусениц.

Проведенные' на аараженгоЯ воэдматозон гране испытания действия сгощфкесюа противонозематозных снвориток я тиушЛ Ш продемонстрировали впервые для Сольного тутового шелкопряда возможность специфической отвдулявдв его иммунной системы в открыл* перспективу создании ювого современного ¡годкода в борьОэ с инвазионными болезнями тутового шелкопряда - жчыунотераши и иммунопрофилактики.

В и в о д и .

1.Нозематоз сопровождается сниженном концвнтрадая бежа в гемолимфа гусениц, которое прямо зввасиг от длительности течения болезни я на зависит от природной пабршгоусгойтавоаги пород. Это позволяет рассматривать показатель концентрация белка гемолимфы как првжшаяный даагносгячес: гй признак на гусеничной стадии при.проведении предварительной даагиостики зараженности дабршой •

2. Содержание РНК в еаражошюй гране тутового келкопрядь на 1Э-Й день поело откладки сущаственда отличается от нормы. При атом в слабо заражашюь грене содержание РНК гаже норм«, в в сильно зара$0шгой - выше нормы.

Содержание ДНК в грена при нозокатозной инвазии не подвержено достоверным изменениям.

3.Уровень активности АТФ-ези в грепэ тутового шелкопряда в конце летне-осенней эставацни и в конце зимнего хранения является показателем зараженности нозематозом.В ети периоды активность АТФ-ази в зараженной грене существенно падает, приближаясь к нули.

Активность АГФ-вз:. в тканях гусениц при нозематозе также отличается от нормы, однако, диагностической ценности не имеет вследствие сложной динамики отклонений. ¿.Экспресс признаком зараженности гусениц тутового шелкопряда возе зтозом в экспериментальных исследованиях является резкое оаденив (на О, ; единицы) рН гемолимфы в первые дан заражения алиментарным путем.Дяя использования в -путинной диагностике данный показатель непригоден. б.Нозематозвая инвазия, начиная о 3-го дня заратения, сопрово*-

дается увеличением гетерогенности электрофоретических спектров белков гемолюф» гусениц.Наиболее гетерогеннн белки гемолимфы ' гусениц с наследственным нозематозом. !

в. Активность не специфических астераэ и протеолйическая акта»- ! воеть гемолим!« гусениц тутового шежопрядч при рН ?,8 к 10,9 в развили ноэематозной инвазии отличается от таковой у здоровых гусениц. Однако.ати признаки нецелесообразно рассматривать на как диагностические, пи как прогностические признаки устойчивости пород, поскольку в ходе пазвитая заболевания вектора изменений величины естеразной и протеиназной активностей меняются сложным образом и не прослеживавтся различия ве-лячинн активностей этих ферментов в зависимости от природной устойчивости пород.

7.Активность фонолоксидазы а гемолимфе гусениц к 11-му дню- развития интэзни резко падает по сравнению с нормой. Степень- подавления активности фэнолоксидазы у различных пород тутового шолкопряда на 11-й день развития нозематозной инвазии соотеэ-тствует их природной чувствительности к нозематозу, а уровень во сохранена, является свидетельством пабр^оустойчивостя пород.

8.Разработана способы получения аитасиворотзот к нот:ш:шм спорам пебриш.конъюгата фердганто-маркеро фосфолшкш А^ из яда среднеазиатской кобры с антителами, иммунодиагностпкума но нозематоз тутового шелкопряда, На основе этогг создан госокоспв-ИМггшй способ илмуноформонтной диагностики пебршш, превосходящий ло чувствительности чуцествуицяй в производстве спо- 1 сод микроскопического анализа и но требувицй использования дефицитных реактивов и какого-либо сложного лабораторного оборудования, в том числа и микроскопического, гак как возможна визуальная оц-чка результатов реакция.

9.На ранних этапах развитая нозэматозшй иа. Jзии внрежонность изменений гемограмм гусениц тутового иедкопрядэ* свидэтель-ствукцих об активации кло очных згцитннх механизмов,а именно: резкое увеличение содь^жашл фагоцитов, мшеронуклеоцитов и сниетнкэ количестве пролейкоцитоз совладеет с природной пвб-рь^оусток ^япостью пород. Наиболее существенны эти изкенония у устойчивой порода Аожико.срвдас- положение занимает средаеус-

тойчивая породе САНИКШ-Э в менее существенна реакция со стороны клеточных элементов чувствительной к нозематозу порода Багдад,

ГО.Гемолшфа н «яровое тело здоровья гусениц тутового шелкопряда содержрт компоненты,отличные друг от друга и от лизоцщю, обладаицие высокой ыротивонозематозной активностью, резко уменьшающейся ори ноземзтсзной инвазия.

11. Ключевыми биохимическими изменениями, коррелирупвдми со снижением ь^отивонозематозной резистентности гусениц тутового иелхопряда, являются падение активности фенолочсидазы г изменение электрофоретического спектре веществ с противоно-зематозной активностью в имнуноконшетентных тканях (гемолимфе я жировом теле).

12.В зараженной грене тутового шелкопряда специфические цроти-вовозематозные реакции могут быть еф^ктивно активированы под действием гуморальных иммуносоеци]шеских факторов как гомологичного, так в гет&родогачного происхождения.

13.Высоким противонозематозннм терааввгачеоа. действием на за, режэную грену тутового шелкопряда обладают иммуноспещфпес-

кзя противонозематс щая сыворотка и ее производные (до 56%) и, особенно, иммунная противоспоровая РНК, обеззараживающий вфВект которой достигает 96,3*.

Практические рекомендация.

При проведении •научно-исслбдоввтельских и аксперихенталыш ■

работ по нозегзтозу тутового шелкопряда рекомендуется применение ел биохимических тестов ввраженности нозематозом:

1. Определение количественно!"». содержания белка в гемолимфе гусениц У-го возраста. При заражении концентрация белка в гемолимфе снижается независимо от тщродной чувствительности пород к нозематозу; уменьшение концентрации белка прямо зависит от длительности инвазии,

2. Определение активности АТФ-азн в грене тутового шелкопряда в конце периода летне-осейней „отивации и в конце диапаузи. В здоровой грене активность определяется, а в зараженной грена - нулевая активность..

3. Определение количественного содержания И"', в 13-тидаевной

грезе тутового шелкопряде. При слабой экстенсивности зврахя-ния содержание РНК на иг сухого вещества грены гчга нормы, б ври высокой - вше норма.

При проведении промышленной диагностики пэбрины на любой

стадии развития тутового шелкопряда рекомендуется прг"енение

следувдих разработок:

1.Способ приготовления конъюгата для имиуноферюнтного анализа, (авторское свидетельство Л 1524682 от 15.06,87).

2.Способ получения иммунодиагностакума нозематоза тутового шелкопряда. (Авторское свидетельство Л 1727221 от 4.04.90).

3.Спссоб диагностики пебршш тутового шелкопряда. (Авторское свидетельство М 1671805 от 21.10.87).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Кашкарова Л.Ф. .Гарафутдинова В.А. Способы борьбы с пебриной тутового шелкопряда.// Достижения науки и техники АПК.-1989,-М 9.-0.48-49.

2.Гарафутдинова Е.А.,::аикарова Л.Ф. Но^оэ направление в диагностике тутового шелкопряда.//Достижения наука и техники АПК.-1990.-ЛГ1.-0.Э/-Э8.

3.Гарвфутд'таова Е.А.,Исматудлавва Д.А..Нешкароьо Л.Ф. О возможности г~таизнэшюй даапгостики нозематоза гусениц тутового шсиюПуЯда.//Шелк.-1994.- #1-2.- 0.17-18. .

4.Гарафутдинова Е.А..Кещкарова Л.Ф.Влшшие нозематозной инвазии на клеточный состав гемолизы.//Шелк.-1994.-Я 5-6.-0. 19-20. „,. ,

5.Гарафутдинова Е.А.,Кашк><рора Л.Ф. К воп, су о подготовке ш-тигена для получения антиснворотки к возбудителю нозематоза тутового шелкопряда.//Шелк.-19Э4.-ЖЗ-4.-С.15-16.

6.Гарафутданова Е.А.Перспективы биохимической диагностики пеб-рины - .//Шелк.-1995.-5-6.-С. 17-18.

7.Гарафутдинова Е.А.«йсматуллаева Д.А.,Хамидов Д.Х. Влияние ноземг озной инвазии на эстервзную активность гемолимфа гусениц тутового шелкопряда.//Докл.АН РУз.-1995.-й2.-С.5.0-СО.

8.Гвреф&.динова Е.А..Кашкарова Л.Ф.Дамидов Д.Х. Аитинозомлго-зное действие противоспоровых вывороток.//Докл.АН РУз.-КШ.

- * 4.-0.56-Б8.

9. Гарафутданова Е.А..Исметудлаэва Д.А.,Кашхароаэ Л.Ф. Цротесия-таческая активность гемолздф! гусениц тутового шелкопряда при нозематозе.//Узб.биол. ж.- 19%.1-2,-С. 0-Б.

10. Гарафутданова Е.А. .Кзшкарова Л.Ф. Фанолоксидазная активность гемолимфы гусениц тутового шелкопряда при нозематозе.// Узб, биол.а.-199б,-я 3.-0.3-5

11.Гарафутданова Е.А..Кашкарова Л.Ф.Бедок гемолимфы тутового : ■»-лкопряда в норме и при нозематозе.// Научные основы развития шелковг-ства. Сб.трудов САШШШ.-Ташкент.:Госагропрс.л УзССР, 1987.-с.71-75.

12.Кашкарова Л.Ф., Нагорная И.М., Гарафутданова Е.А. К вопросу 5 влиянии степени инвазированности тутового шелкопряда иозе-моа на уровень ферментативной активности мурамвдаэы.//Научные основы развития шелководства. СИ. трудов САНШШ.-Тешкент.: Госагропром УзССР,I987.-с.78-83.

13.Гарафутданова Е.А. Дшкероча Л.Ф.,3ияэва Е.М. Изучение рН ге-мо1ш?4и гусениц тутового шелкопряда при мшфоспоридаозв.//На-учвые основы развития шелководства в Узбекистане. Сб.трудов "ШШШ.-Ташкент.:Госагропром УзС0РД989.-с.93-97

14.Кашарова Л.Ф..Нагорная И.V..,Гарафутданова Е.А. О содераса-ш; ■! лкзощша в грене тутового шелкопряда //Научные основы развития шелководства.Труда ОШЙШ.-Ташкент..1992.-внп. 26.-61-65С.

16.Гарафутданова Е.А.Дашкарова Л.Ф. Драхотин Н.Ф. Об испытании действия белкового препарата в качестве питательной добавки к корму тутового шелкопряда.//Научные основы развития шелководства. Тру да ОАНЙИШ.-Таикент.,1993.-ВЫП.Е6.-61-660.

1в.Юкельсон Л.Я., Гарафутданова Е.А..Кашкарова Д.ф. Способ приготовления кошлгате для иммунофермвитного анализа./Авторское свидетельство » 1524682 от 15.16.87.

17.йя ьсон Л.Я. .Гарафутданова Е.А,,Квшкарова Л.Ф. Способ диагностики пебрн.ы тутового шелкопряда./Авторское свидетельство » 1671605 от 21.10.87.

18.Гарафутданова Е.А.,Кашкарова л.Ф. Способ получения иымуноди-

агнссгикумз нозематоза тутового шелкопряда./Авторское свидетельство Я1767ЭТ2 от 25.04.90.

1Э.Капкврова Л.«.,Андоскина Л.Т.,Гарафутдшюва Е.А. и др.Препа-рат для борьбы с пебриной тутового шелкопряда./Авторское свидетельство JJI72722I от 4.04.90.

ЗО.Гарафутданова В.А..Налбавдян А.А..Б8беов i.A.,KaüKapc"m Л.Ф. Спосоо получения биологически активных веществ с противонозе-матозной активностью./Предввр. патент РУз Л 2728. зарегистр. 26.06.1995.

21.йселъсон Л.Я.,Гарафутдшюва В.А.,Квшкарова Л.Ф.Магодаческая рекомендация пг способу приготовления конъпгата для иммунофе-рментного анализа.-Ташкент. :УзШШИ!.-19е9.-4С.

22.Пкельсон Л.Я. .Гарафутдиьова Е.А. «Кашкарова Л.Ф.Методические рекомен"ации по диагностике пебринн тутового шелкопряда.-TbuiKöHT. :УзШШШ, -1990. -40.

23.Гарефутдинова Е.А.«Кашкаровв Л.Ф. Изучение изменения количественного содержания белка гемолизы гусениц тутового шелкопряда при нозематозе. //Материала I конференции биохимиков Узбекистана .»Ташкент,1986.-с.Б4.

24.Гврафутдинова Е.А.,Зяяева Е.М.,Кешкарова Л.Ф.Изучение динамики содержания нуклеиновых кислот в грена тутового шелкопряда при нозематозе.//Аграрная наука.-1991.-ДЕЛ.

25.Налбавдян А.А.,Бабаев Т.А.,Гар8футданова ^.А. Выделение фракций с противонозематозной активность» из ге(.юлж4ы и жирового тела гусениц тутового шелкопряда./Материалы III конференции биохимиков Узбекистана. Тышквнт,199б.-С.

26.Нвлбавдян А.А.,Гарафутдинова Е.А.,Бабаев Т.А. Сравнительный анализ компонентов с противонозематозной активностью.// Материалы III ко-фэренщга биохимиков Узбекистана. Ташкент. 1996.-0.

"Иаак цуртадаги пебрина касаадипши вьлцлаш ва нозематоз рявожланишиге керши Султан узига хос ома.- ар" мавзудэги дассертациянинг КВДА ШЗМШ

Нозематоз (пебрина) шакчилиюса катта моддий зерар келти-ради.Иу боисдан Су квселлакка кераи кургшига баришланган ишлар катта ехашдаг кясб этади. Касвллшши ениклаш ва у ни даволаш парши курашиншг асосий чоралари *исобланада.

КвсаллБ.я'ан туцимэларда Узига хос Оиокимёвий узгаришлар содар Оклада. Бу ^згаришлар пебринани аншушш Ое.'-'иси булиб хизмат кшюда.Бизншг тадквдотлвр нозематоз содар булгаяда гемолимфа оцсилларининг электрофоре тик спектр» узгвришини, гемо-лимфада ва &гли танада узига хос булмаган эстераз хамда проте-иназ фаоллигшвшг узгаришни курсатади. Аммо бу узгвришларнинг динамикаси касаллик еуройгвндв худа мур?"каб булада. Шу сабаб-дан икоридаги кУрсаткичлар касаллик аншушш белгиси булиб хизмат цилмайди ва улар текинхур (паразит) Силен хужайин орасадаги мунособэтлар ривокшинг маыум бос}?ичларини с лгилайди. Бундай курсаисичлар нозематоз пвтологияси ривожлашш механизма масала-ларини урганшда каттг е*амиятга эгедар.

Виз неСрана касаллипши анвоугашга имкон берздиган учта би-окимёвий курсаткични авшуадик. Булвр У ёвдаги курт гемолимфз-сидаги ок,сил концентрацияси, 13 кунлик урутдаги -РЧК микдори ва ; урурдаги АТФпинг ёз-куз ривоюшшш даври охирздага *амда диана-уза охиридаги касашшкка церии фаолликдак иборатдар. Нозематоз мавжуд б5лган~т курт зотинияг пебринага нераи табий тургунлаги-га к,ар. ,юй гешлнмфадаги оксал концентрацияси сезиларли камая-ди. Уруг «уйилгаздан 13 кун андан кегин ундаги РНК мивдори кучли касалланивда квмаяде, кучскз кесаэдвшвда аса меъёрига : гисбатан ортади. Касаплаиган ур^де-и АТФ фаоллиги ез-куз риво-жланиш даври ва даэлауза охирлэрада нульга -ваг, соглом урутда пса АТФ фаоллиги намоён булада.

Нозематоз ривоаланишиниш1 П-кичи кунада курт гемолимфаси-дога фенолоксвдаза фаоллигй зот„арда пейрин^га каря тябиий ~у-ргунлик мвккудлигидая далолвт беради. Тургун зотларда фенолоксвдаза фаоллиги меъёрига якин ёки озроц кячик булзди. Тургун ^лмаган зотлврда фешшжсздэза фаоллиги сег *ларли кам булади.

Побрина касаллигичи амалий анюушшни такомиллаштириш мак • садвда спораларни вниклайдиган иммунофермент усули .шлаб чинил-ди. Тарш килишда Уртв Осий кобраси захаридан олинадиган фоо-фолипаз А.2 фермент-мартердан фойдр'чшищи. Усул щори сезувчен-лнги, узига хослиги ва цулланишда соддалиги билан ажр либ тирада. Касал. :ншни иммуняфермент усулида тшушшда микроскоп,бош-ца мураккат ускуна ва ноёб реактивлар керак булмайди.

Ипак од>ти нозематоз билан квсалланганда царши курашувчи ту-рма ва сущ (гумораль) омиллар холати Ургалиддн.Касалланишншп' дастлабки даврида гемолимфа туцималарида узига хос ?згарилшар зршо. цшшш крбилиятини ошршига царатилиаи анизданди.Касаллик „зощхщ давом зтганда, шубхасиэ.иммунитвтли тукима ва гумораль омшшар орасидагн узаро богланишликншгг бузияиш содар булада, бундай бузилишга свбаб фэнолоксидаэа хамда иммунитетга кавоб бэрувчи ва ёгли тана каби тукималврда фаолликнинг сусатишидир.

Ипак куртшшнг нозематозга ^арш касал щтирмаслик цобили-яти мое иммунитетли моддалар билен кучаттирилиши мумкин. Шу ма-Чсауда стораларга царши курашувчи зарбдорлар ва каем п$майдиган РНКдан фойдаланшда. Ly препаратлар пеоринв билан касалланган НУрт уругларида позематозгв нарши катта курашувчанлик цобилияти-га ara булиш еншуганди. Нозематозга квриш булган бундай мехсус препаратле* тинг яратшшши пебринага карой курацлда янги замонз-вий иммуноте, 'шм ва иммунопрофилактика нуцтан назардан вндгшил-гв имко!. тухдиради.

Илмий Таллин:тут ипак цурти тунимёлардаги бъвзи бир биокимё-вий узгаршларш урганиш, нозематоз квсалликда текшгхур билан хужайин ораевдаги мунревбптлар ривохининг ва ноземятоз ривожлп-нишяга кврши булган узига хос оиилларнинг ...аълуи боскичларюга белгшшйди.

Амалий товди! пебринани ашвуиэш иммунофермент усули ишлаб чикилда. Бу усул щори сезувчанлиги, Узига хослиги ва ишлатили-шда ишончлираушга билан ахралиб туради; ипвкчилида тут . лак 1угрти. иммунотерапия буйича пршщилиая янги йуналиш ишлаб чш;ал-да.

Diagnostic» oX pewrina uX silkworm and factors oX apeciXit antinosenatose resiatenoe.

AHN0TA3I0N

A. greate eoorwmio damage in sericulture from noscmatoao o1 silkworm makes work direo' >d to the light with thia illneaa very aotual. fundamental measures of thia fight ere diagnostic and treatment of disease.

SpeeiXio bioohamio changes in hosta tiaaea can idioate to the presenoe oX stinulua'a vegetative oella in ailkworm organism.

It haa been ahowed that noseaatoae invasion causes changes oX eleotrophretio spectrum proteins oX haemolymph and rejeotioi from normal level of nonapeolfio esterases, proteinases in silkworm haamo lymph and fat body. However -heae rejection have complicated dynamics, so they oan be only as oharaoterlstlo sigra oX definite stages oX hoat-paraaitio relation development,but not as dia&wstio teats of contamination. Those are: oanoentra tlon of protein in haemnymph 5-th iristar larvnoa,r«duoing by noseoatose independently of natural pebrineatable of breeds; RNA. content In 13-th day grene, exceeding a noma by hard oon-tamination and reducing by weak degree of contamination; eero activity of ATP-aae in contaminated grene at the end of summer-autumn estivation and at the end of diapause. Alteration of phenoloxidase aotlvity on 11-th day or invasion development is a prognostic test of noseaatoae stability of breeds: the anile aotlvity is suprwssed the more stable the breed is.

iMmmo-emsy*» Method of diagnostics of spore st^e using phoapholipaaa Aj> from i lson of central «sis oobra as etusyme-narkDT has been developed to laprove a practio method of pebri ne diagnostic. the Method is distinguished by high sensibility speoiphity, simplicity of realisation. It fully eliminates the neoea Ity of ualng mioroaoope and soma other complicated equip li.^nt am* deiioi. „ reaotivea.

Study of eellular and humoral Xaotr i of immunity of a ilk won» larvaea by noaematoaa has showed that there are speoifio alterations oX h»amulyi>h cella dlfferenoiatlon, wioh %e dir«

oted to intensification of defence iunotlon. By more prolonged pathology, apporently,distortion of cooperativity between oel-and humoral factors oooura. Those breaohea are the result of auproaaion of phenoloxidaae aotlvitjr and epeoifio antinose-matose aotivity In immunocompetent tisses - haemolymph and fat body, tinker the action of parasite.

?or the first time teats of acting specific antinosematooe somrifl and inmune RNA. carried on for grene oontamlnated by no-oematoae have demonstrated a possibility of spooifio stimulation of iasnune oyotem for ill silkworm. Those teats have oppe-ned the perspootive of creation of ne# modem approach to flgjh-tnesa with invasion illnesa of silltworn - imuunothorapie and inmunoprophylaotio.