Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями"

На правах рукописи

Артемова Людмила Владимировна

Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями.

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре микробиологии Российского университета дружбы народов.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Э.Г. Кравцов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, доцент

В.П. Щипков Б. К. Данилкин

Научный консультант:

кандидат медицинских наук, доцент Л.Г. Ежова

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится цй^.ОЗ » 2005г. В часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

О.Б. Гигани.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы диссертации.

Популяции условно - патогенных микроорганизмов входят в естественные биоценозы человека и в сбалансированном состоянии удерживаются в пределах определенных экологических ниш (Покровский В.И., Поздеев O.K., 1998). Любые изменения условий могут привести к реализации патогенного потенциала микроорганизма, а в ряде случаев к распространению определенной микробной популяции за пределы естественной среды обитания (Коршунов В.М. и соавт., 1999). В качестве объектов исследований нами были выбраны условно - патогенные организмы S. pneumoniae и С. albicans. Основанием для такого выбора послужило то, что оба этих микроорганизма широко распространены, и их роль в развитии патологических процессов хорошо известна. Активация популяции S. pneumoniae при развитии заболевания характеризуется выраженным распространением пневмококка из естественной экологической ниши - носоглотки, в безмикробные пространства респираторного тракта, где может реализовываться патогенный потенциал. Патогенность С. albicans может проявляться и в пределах естественной экологической ниши, и при захвате новых территорий. Обнаружение условно-патогенного возбудителя в биоматериале не всегда подтверждает его этиологическую значимость, особенно в образцах, где не исключается контаминация нормальной микрофлорой. Обнаружение условно-патогенного возбудителя в не свойственной ему среде обитания является достаточно убедительным доказательством этиологического диагноза. Получение гемокультуры того или иного микроорганизма, часто свидетельствует о генерализации процесса. В этих случаях решающим является высокая чувствительность и специфичность лабораторных тестов. В настоящее время, кроме ставшего «золотым стандартом» микробиологического исследования начинают применяться новые молекулярно-диагностические методы. ПЦР -диагностика инфекционных заболеваний, вызванных абсолютными патогенами успешно используется в клинической практике (Louie M. et al., 2000;

Tumwasorn S. et al., 2002). Применение ее для определения этиологической значимости условно-патогенных возбудителей, остается проблематичным.

Серьезной проблемой для клиницистов становится возникновение резистентности возбудителя к антибиотикам. Механизм устойчивости S.pneumoniae к пенициллину обусловлен мутациями генов пенициллин-связывающих белков. Применение ПЦР для обнаружения таких мутаций способствует быстрому выявлению таких штаммов и назначению адекватного лечения с учетом резистентности возбудителя. Цель исследования:

Определение роли ПЦР в алгоритме исследования больных с подозрением на инфекцию, вызванную условно - патогенными возбудителями. Задачи исследования:

1. Оценка эффективности применения ПЦР для выявления S. pneumoniae в мокроте и крови у больных с внебольничными пневмониями в сравнении с данными бактериологического исследования.

2. Изучение генов факторов патогенности S. pneumoniae (фибронектин-связывающего белка (pavA) и пневмолизина (plyA)), и их влияния на развитие бактериемии.

3. Оценка частоты выявления мутаций AR1 и AR2 в гене пенициллин-связывающего белка S. pneumoniae (pbplA) и их влияния на развитие резистентности микроорганизма к пенициллинам.

4. Изучение факторов, влияющих на развитие бактериемий у больных с внебольничными пневмониями.

5. Изучение влияния генов факторов патогенности С. albicans (негативной регуляции гифообразования (nrg) и хитин синтетазы 1 (chsl)) на развитие кандидоза.

6. Оценка эффективности применения ПЦР для выявления кандидемии у больных на фоне иммуносупрессии.

Научная новизна исследования:

1. Показана эффективность применения ПЦР - исследований крови при внебольничных пневмониях для установления этиологической значимости S. pneumoniae.

2. Проведен анализ встречаемости генов факторов патогенности pavA и plyA S. pneumoniae.

3. Показано, что ПНР позволяет без выделения культуры оценить состояние резистентности к пенициллинам S. pneumoniae.

4. Проведен анализ встречаемости генов факторов патогенности nrg и chsl С. albicans.

5. Изучено влияние полиморфизма в промоторе гена интерлейкина 10 (1082G/A) человека на тяжесть течения внебольничной пневмонии и развития бактериемии.

6. Показана эффективность применения ПЦР для выявления кандидемии у больных с гемобластозами на фоне иммуносупрессии.

Практическая значимость;

ПЦР может широко применяться у различных категорий больных. Ее использование помогает быстро и своевременно обнаружить ДНК S. pneumoniae в крови при развитии инвазивных процессов у больных с внебольничными пневмониями и оценить чувствительность микроорганизма к пенициллинам. ПЦР позволяет выявлять инфекции, вызванные С. albicans у больных с фебрильной нейтропенией, развившейся на фоне иммуносупрессии после проведения химиотерапии.

Внедрение:

Рекомендовано внедрение результатов в практическую работу терапевтов и гематологов.

Апробация работы: Результаты исследования докладывались и обсуждались на конференциях кафедры микробиологии Российского университета дружбы народов, научно-практической конференции НПО «Биомедицинские технологии» (г. Москва, 2003 г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура работы; Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, состоящего из 101 работы, из них 21 отечественных и 80 зарубежных авторов. Диссертация изложена наЙ^траницах, содержит таблиц,

Основные положения, выносимые на защиту;

1) Применение ПЦР для исследования биоматериалов, в которых не исключается контаминация нормальной микрофлорой, хотя и значимо позволяет увеличить частоту обнаружения условно-патогенных возбудителей, но в то же время является непригодным для определения этиологической значимости данных микроорганизмов.

2) Применение ПЦР для исследования крови, значительно позволяет увеличить частоту обнаружения условно-патогенных возбудителей и подтверждает этиологическую значимость данных микроорганизмов.

3) По частоте встречаемости генов исследованных маркеров патогенности S. pneumoniae (pavA, plyA) и С. albicans (chsl, nrg), обитающие в естественных экологических нишах, не отличаются от возбудителей, обнаруживаемых при манифестации инфекции.

4) Мутация AR1 пенициллин-связывающего белка (pbplA) S. pneumoniae коррелирует с данными микробиологического исследования резистентности возбудителя к пенициллину.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Для выполнения поставленных цели и задач нами были проведены клинико-лабораторные исследования трех групп больных:

1) Контингент обследованных на инфицированность S. pneumoniae. В исследуемую группу были включены 50 больных, госпитализированных в 64 ГКБ с диагнозом внебольничная пневмония (главврач Плавунов Н.Ф., к.м.н.; зав. кафедрой факультетской терапии РУДН, член-корреспондент РАМН, проф. Моисеев B.C.; зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней РУДН проф. Кобалава Ж.Д.). Критерием отбора больных в исследуемую группу признано

наличие следующих характеристик: возникновение заболевания вне лечебного учреждения, наличие клинических признаков. Контрольную группу составили 52 человека без клинико-рентгенологических признаков пневмонии. В алгоритм обследования больных с пневмонией были включены: бактериологические исследования мокроты и крови, определение чувствительности к антибиотикам выделенных микроорганизмов. Помимо этого была исследована мокрота и кровь методом ПНР. У всех пациентов, вошедших в контрольную группу, были проведены ПЦР - исследования крови и мазков из носоглотки.

В эту же группу были включены 226 пациентов, у которых в период с 1999 по 2002 гг. в 64 ГКБ г. Москвы было проведено архивное изучение историй болезни на предмет результатов микробиологических исследований мокроты и крови.

2) Контингент обследованных на инфицированность Candida. Эту группу составили 55 женщин, обследовавшихся в женской консультации. Критерием отбора больных служило: выделение культуры Candida spp. при микробиологическом исследовании отделяемого из влагалища. Из них 40 беременных с различными сроками гестации и 15 женщин с диагнозом "эндоцервицит". У всех пациенток этой группы было проведено ПЦР -исследования культур Candida spp., полученных при микробиологическом обследовании отделяемого из влагалища.

3) Контингент обследованных с иммуносупрессией. В группу было включено 15 пациентов с различными гематологическими новообразованиями, у которых после проведения курсов химиотерапии развилась нейтропения четвертой степени. (РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, отд. ТКМ). Пациентам проводилось бактериологическое исследование материала, полученного со слизистой зева и носа. Одновременно этим пациентам отбиралась кровь для проведения ПЦР на наличие ДНК Candida spp.

Для исследования биоматериалов, полученных от пациентов всех изучаемых групп применялись следующие методы.

Выделение и идентификацию возбудителей из мокроты проводили стандартными микробиологическими методами на «ATB-expression» («Bio-Merie»). Для определения чувствительности к антибиотикам использовался стандартный диско-диффузионным метод. Выделение ДНК из мазков и культуры клеток, проводили по модифицированной методике Boom (Boom R et al., 1990). Выделение ДНК из мокроты проводили по методике Kolk (Kolk A.H. et al., 1992). Выделение ДНК из цельной крови проводили по модифицированной методике (Kulski J.K. et al., 1996). ГЩР - исследования проводились в ЗАО "Лаборатория генно-инженерных систем «ЛАГИС». Статистическая обработка и анализ полученных данных проводился с использованием Statistica 5.1. Уровень значимости оценивался по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Из 226 пациентов, включенных в ретроспективный анализ, у 158 (70%) было проведено микробиологическое исследование мокроты. В 60 образцах (38%) были высеяны S. pneumoniae, в 40 (25%) - другие возбудители. Семь изолятов (12%) S. pneumoniae были устойчивыми к пенициллину. У 58 (37%) пациентов применение микробиологического метода не позволило идентифицировать возбудителя. У всех пациентов было проведено микробиологическое исследование крови, и только в одном случае (1,7% от выборки пациентов с высевом S. pneumoniae из мокроты) было определено наличие возбудителя в крови.

Всем больным, госпитализированным с диагнозом внебольничная пневмония, включенных в основную группу, при поступлении в стационар было проведено рентгеновское обследование органов грудной клетки. Рентгенологически диагноз подтвердился у 45 больных, что составило 90%. Бактериологическое исследование мокроты было проведено у 36 пациентов (72%). S. pneumoniae был выделен в 9 случаях (25%), из них в трех случаях резистентный к пенициллинам. Из приведенных данных следует, что частота высеваемости S. pneumoniae из мокроты сопоставима с ранее наблюдаемой в ретроспективном анализе частотой. Другие микроорганизмы были высеяны у

30 пациентов (83%). Н. influenzae - в 19 случаях (52%). Candida spp. - в 11 случаях (30%). Таблица № 1.

Таблица № 1. Сравнительная характеристика эффективности микробиологического метода и ПЦР при определении возбудителей в исследуемой и контрольной группе.

Выявляемость

Обследованная группа S. Н. Candida S.

pneumoniae influenzae spp. aureus

1. Больные с . 25% 52% 30% , 3%

пневмониями

(ММ-мокрота): п=36

2. Больные с 79% 58% 48% 6%

пневмониями

(ПЦР-мокрота): п=48

3. Контрольная группа 75% 75% 17% 4%

(ПЦР-мазки): п=52

Значение р р,.2 =0,0001 Pi-2 =0,58 P1-2 =0,09 Pi-2=0,52

Р2-З=0,63 Р2.З=0,07 р2-з=0,0013 Р2-з=0,064

ММ - микробиологический метод

ПЦР - исследования мокроты были проведены у 48 пациентов (96%). В 38 образцах (79%) выявлена ДНК S. pneumoniae. ДНК других микроорганизмов были определены у 40 пациентов (83%). В 28 образцах мокроты (58%) установлено наличие ДНК Н. influenzae, в 23 (48%) - Candida spp., в 6 (13%) -M.pneumoniae, в 3 (6%) - S.aureus, в 3 (6%) - M.tuberculosis, в 2 (4%) - CMV. ДНК С. psittaci и С. pneumoniae выявлена не была. Таблица № 1.

Полученные результаты дают основание заключить, что применение ПЦР позволяет значимо увеличить возможность определения S. pneumoniae в пробе (мокроте) в сравнении со стандартными микробиологическими методами (79±5,8% и 25±7,2% соответственно, р=0,0001).

Были проведены ПЦР - исследования мазков из носоглотки лиц контрольной группы. Из 52 исследованных образцов в 39 (75%) определено наличие ДНК S. pneumoniae. ДНК других микроорганизмов обнаружена у 43 пациентов (83%). В 39 образцах из носоглотки (75%) было определено

наличие ДНК Н. influenzae, в 9 образцах (17%) - Candida spp., в 2 образцах (4%) - S.aureus. ДНК M.pneumoniae и CMV не выявлена. Таблица № 1.

Из этого следует, что обнаружение ДНК S. pneumoniae в мокроте нельзя признать диагностическим критерием, поскольку частота обнаружения его в группе больных пневмонией и у лиц без легочной патологии совпадает. Это согласуется и с данными литературы (Murdoch D.R. et al., 2003). Для таких

патогенов как S. pneumoniae, H. influenzae, Candida sp., S. aureus, являющихся представителями нормальной флоры человека, колонизирующей назофаренгиальную область, наличие возбудителя в пробе может в равной степени свидетельствовать и о носительстве, и о развитии заболевания (Kontoyiannis D. С. et al., 2002; Murray P.R., et al., 2002; Obaro S., et al., 2002).

ПЦР способствовала обнаружению ДНК M.tuberculosis (6%) и M.pneumoniae (13%). У всех пациентов с положительным результатом ПЦР на M.tuberculosis был микробиологически подтвержден диагноз «туберкулез легких». В контрольной группе ДНК этих микроорганизмов не была обнаружена.

Микробиологическое исследование крови было проведено у 3 пациентов исследуемой группы, роста S. pneumoniae обнаружено не было. Была предпринята попытка, оценить в данной ситуации диагностическую значимость ПЦР - исследования при использовании в норме стерильной среды организма, а именно крови. У 44 пациентов (88%) исследуемой группы была исследована кровь при помощи ПЦР на наличие ДНК S. pneumoniae. ДНК этого возбудителя, была обнаружена в 11 образцах крови (25%). Все результаты ПЦР - исследований крови 44 пациентов (88%) исследуемой группы на наличие ДНК Candida sp., S. aureus, H. influenzae и CMV были отрицательными.

Для определения диагностической значимости обнаружения ДНК S. pneumoniae в крови при пневмонии методом ПЦР, нами были изучены образцы крови лиц контрольной группы. При исследовании 52 образцов крови лиц контрольной группы только в одном случае был получен положительный сигнал (2%). В этой ситуации могут возникнуть предположения о возможном ложно положительном результате ПЦР. Однако, как было показано Gillespie

S.H. et al. в 2000 году, S pneumoniae обладает способностью к

инвазивным процессам без наличия каких-либо клинических проявлений, особенно часто у детей. Таким образом, по нашим данным вероятность этиологической значимости S. pneumoniae в развитии заболевания при обнаружении видового маркера в крови может достигать 98 %. ДНК Candida sp., S. aureus, H. influenzae и CMV в крови методом ПЦР не обнаружена.

При ПЦР - исследовании различных биосубстратов при развитии пневмонии, как указано выше, были зафиксированы случаи бактериемии S. pneumoniae, которая определена в нашей работе как ПЦР - обнаружение ДНК возбудителя в крови. В работе был проведении анализ возможного влияния различных факторов на определение ДНК S. pneumoniae в крови, а именно: 1) факторов патогенности самого возбудителя S. pneumoniae, 2) количественных характеристик популяции возбудителя, 3) микст-инфицирования респираторного тракта, 4) сопутствующих заболеваний, курения, пола, возраста, особенностей иммунитета больного 5) тяжести клинического течения пневмонии.

Для изучения генов патогенности S. pneumoniae были выбраны несколько маркеров. Ими стали: ген пневмолизина (ply А), ген фибронектин -связывающего белка (pavA), ген пенициллин - связывающего белка pbplA. Пневмолизин - токсин пневмококков. Штаммы с отсутствием гена пневмолизина демонстрируют снижение вирулентности (Gillespie S.H. et al., 2000; Berry A. et al. 2000). Ген pavA кодирует фибронектин-связывающий белок, являющийся важным для адгезии пневмококков. Инсерционные мутанты по этому гену проявляют снижение вдвое этой способности (Holmes A.R. et al., 2001).. Пенициллин - связывающий белок, влияет на резистентность S. pneumoniae к данному антибиотику. Мутация AR1 гена pbplA по данным литературы ассоциирована с умеренной резистентностью к пенициллинам (МПК от 0,25 до 0,5 мг/л), мутация AR2 ассоциирована с высокой резистентностью (МПК от 1мг/л) (Plessis M. et al., 1999). Частота выявления этих маркеров приведены в таблице № 2.

Таблица №2. Встречаемость генов факторов патогенности S. pneumoniae в исследуемой и контрольной группе.

Количество Факторы патогенности

положительных % образцов ДНК % образцов ДНК % образцов ДНК

образцов ДНК по с наличием с наличием гена с наличием

видоспецифическим гена sply spav мутации AR1 в

маркерам гене pbpl А

1.Контрольная 100% 56±7,9% 28±7,1%

группа: п=39

2.Исследуемая 95±3,5% 44±7,9% 33±7,5%

группа: п=39

3.Группа больных с 100% 45±15% 36±14,4%

бактериемией: п=11

4.Группа больных 96±4,1% 43±10,3% 35±9,9%

без бактериемии:

п=23

Значение р Р 1-2= 0,16 Р j-2=0,29 Р 1-2=0,63

Р 2-3 =0,45 Р 2-з =0,48 Р 2-з =0,75

Все три штамма, охарактеризованные микробиологически как устойчивые к антибиотику, имели выше названную мутацию AR1 в гене pbplA. Шесть чувствительных к пенициллину штамма не имели выше названную мутацию. Мутация AR2 гена pbpl А не встречалась.

Все рассмотренные гены, контролирующие факторы патогенности S. pneumoniae не ассоциированы с развитием бактериемии у больных с пневмонией, т.е. не влияют на инвазивные способности возбудителя. Совокупности пневмококков, колонизирующих носоглотку и вызывающих заболевание, по генам pavA, sply и мутацией AR1 в гене pbplA не различались.

Помимо этого была изучена возможная связь между мутацией AR1 в гене пенициллин - связывающего белка 1А и наличием гена фибронектин-связывающего белка spav. Наличие этих двух признаков умеренно коррелирует в выборке ДНК штаммов S. pneumoniae группы больных с пневмониями (тетрахорический коэффициент корреляции r = 0,52), контрольной группы (r =

0,3). Объяснить эту связь без использования дополнительных методических приемов не предоставлялось возможным.

В поисках факторов, оказывающих влияние на активность инвазии пневмококков, была проведено изучение встречаемости полиморфизмов в промоторе гена иммунорегуляторного цитокина - интерлейкина 10 (точечная мутация - 1082 A\G) в исследуемой и контрольной группах, а также отдельно у больных с бактериемией и пациентов с тяжелым течением пневмонии. Аллель IL10G, характеризуется более высокой секрецией интерлейкина 10, и как показано ранее, связан с более тяжелым течением инфекционного процесса, вызванного S. pneumoniae, а также развитием септических осложнений (Gallagher P.M. et al., 2003; Schaaf В. et al., 2002). В нашем исследовании такого влияния показано не было.

Все . остальные изученные факторы, а именно: количественные характеристики популяции возбудителя, микст-инфицирование респираторного тракта, сопутствующие заболевания, курение, пол, возраст, тяжесть клинического течения пневмонии не оказывали значимого влияния на частоту развития бактериемии у больных с пневмонией.

Выявление ДНК условно - патогенных микроорганизмов при такой инфекции, при которой распространение возбудителя в новую экологическую нишу является обязательным условием для развития патологического процесса, показало, что ни один из исследованных микроорганизмов не обладает такими инвазивными свойствами как S. pneumoniae. ДНК только этого микроорганизма нам удалось обнаружить в крови у больных с внебольничными пневмониями. Представляло интерес, в какой степени выявленные закономерности проявляются при таких инфекциях, при которых дислокация возбудителя не является обязательным условием для манифестации инфекции.

С этой целью мы исследовали состояние популяции кандиды, как условно-патогенного возбудителя, не только при определенных условиях обладающего способностью к инвазии, но вызывающего воспалительные процессы в естественной нише обитания. Как было показано ранее, при внебольничной пневмонии проводимая антимикробная терапия сопровождается активацией

грибов. При этом частота обнаружения ДНК в мокроте возрастает, тем не менее, обнаружить ее в крови не удается. В то же время известно, что уникальные способности кандиды трансформироваться из комменсала в патоген, напрямую связаны с ее способностью к диморфизму и фенотипическим изменениям (Liu H, 2002). Поэтому представляло интерес изучение встречаемости генов, контролирующих факторы патогенности С. albicans и сопряженных с диморфизмом кандиды.

Для С. albicans маркерами факторов патогенности нами выбраны: ген негативной регуляции гифообразования (nrg), ген хитин синтетазы (chs). Как было указано раннее, инактивация nrg вызывает филаментацию (Munir A. et al., 2001). Активность хитин синтетазы сопровождает развитие проростковой трубки, таким образом, участвуя в морфогенезе и реализации патогенности кандид (Сергеев А.Ю. с соавт., 2000). При исследовании факторов патогенности С. albicans оказалось, что в контрольной группе встречаются штаммы с отсутствием этих генов факторов патогенности. Однако статистическая обработка данных не подтвердила различия по их встречаемости в группе больных и здоровых. Таблица № 3.

Таблица №3. Встречаемость факторов патогенности С. albicans в исследуемой и контрольной группе.

Факторы патогенности Количество положительных образцов ДНК по видоспецифическим маркерам Значение Р

Исследуемая группа: п=18 Контрольная группа: п=3

Образцы ДНК с наличием гена т^ 100% 66±27% р=0,14

Образцы ДНК с наличием гена сЬэ 1 100% 66±27% р=0,14

Исследование мокроты от больных пневмонией показало, что выявление ДНК кандид во всех случаях совпадало с обнаружением в ней генов nrg и chs 1, т.е. генов, связанных с патогенностью. Тем не менее, ни в одном случае ДНК С. albicans не была обнаружена в крови. Оставалось, не ясным отличаются ли кандиды, колонизирующие слизистые и вызывающие развитие манифестной

формы заболевания по изучаемым генам. Этот вопрос решить при изучении такого полиэтиологического заболевания как пневмония не представлялось возможным. В связи с этим мы считали целесообразным изучить ДНК музейных штаммов кандид, выделенных при манифестных и инопарантных инфекциях слизистых влагалища. Основанием к этому послужило то, что по литературным данным выделяемые при кандидозных вагинитах штаммы обладают большей вирулентностью, чем штаммы, полученные при бессимптомной инфекции (Богомолова Т.С. с соавт., 1987).

При исследовании ДНК штаммов С. albicans, выделенных от больных и носителей, оказалось, что в 100% случаев имелись гены nrg и chs. При сравнении данных ПЦР исследований культур от больных с манифестными формами кандидозов и пациенток без клинических проявлений инфекции было показано, что популяции микроорганизмов не отличаются друг от друга по исследуемым генами факторов патогенностями, также как и в случае исследований образцов ДНК С. albicans, полученной из дыхательных путей при изучении пневмонии.

В связи с отсутствием отличий в обнаружении маркеров факторов патогенности возбудителей при носительстве и развитии кандидозов, а также с попаданием в кровь только ДНК S. pneumoniae у больных с нормальным иммунитетом было решено рассмотреть вопрос о поведении данных возбудителей в организме пациентов при развитии иммуносупрессии. Для этого была сформирована дополнительная группа больных с развившейся иммуносупрессией.

У 15 пациентов с гемобластозами на фоне глубокой нейтропении (4 степень), возникшей в результате применения интенсивной цитостатической химиотерапии, было проведено микробиологическое исследование материала, полученного из зева и молекулярно - генетическое исследование крови на наличие генетического материала Candida spp.

При исследовании материала, полученного из зева у 13 больных (86%) был отмечен рост грибов рода Candida spp. При проведении ПЦР образцов крови не обнаружена ДНК Candida spp.

После возникновения фебрильной нейтропении ни у

одного из 15 больных не была диагностирована микробиологически документированная инфекция (при посевах крови, мочи - роста микроорганизмов не было). У 3 пациентов (20%) отмечалась клинически документированная инфекция - пневмония. При микробиологическом исследовании их мокроты этиологический фактор пневмонии выявить не удалось. ПЦР - анализ крови этих больных в одном случае позволил обнаружить ДНК С. albicans. При развитии у одной пациентки стоматита IV степени с образованием глубоких язвенных дефектов, также при ПЦР исследовании крови была обнаружена ДНК С. albicans. Посев крови при этом кандидемию не подтвердил. Однако проведение адекватной лекарственной терапии в соответствии с результатами ПЦР оказалось эффективным и позволило нормализовать температуру. Однако, различия не статистически значимы, что связано с небольшими размерами выборки. Таблица №4.

Таблица №4. Результаты обнаружения С. albicans при микробиологическом исследовании и ПЦР у больных с нейтропенией.

Количество пациентов Материал Частота обнаружения С. albicans при развитии нейтропении Частота обнаружения С. albicans при развитии фебрильной нейтропении Значение Р

ММ: п=15 мазок из зева 13 (86±8,9%) 15 (100%)

кровь - 0

ПЦР: п=15 кровь 0 2 (14±8,9%) р=0,24

ММ - микробиологический метод; (-) исследования не проводились

При исследовании выявленной ДНК С. albicans в обоих случаях отмечено наличие генов факторов патогенности nrg и chs. Обнаружение кандидемии и последующее эффективное лечение с применением противогрибковых препаратов подтверждает истинность наличия кандид в крови у этих больных. Приведенные данные свидетельствуют, что только при тяжелых иммунодефицитах кандидозная инфекция не может быть удержана на уровне

естественной экологической ниши возбудителя. ПЦР позволяет эффективно контролировать эту ситуацию, и оценивать адекватность проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1) Частота обнаружения S. pneumoniae в патологическом материале, полученного от больных внебольничными пневмониями значительно выше при применении ПЦР, чем при микробиологическом исследовании: в мокроте (79% и 25% соответственно) и в крови (25% и 0% соответственно).

2) Применение видоспецифических маркеров при ПЦР - исследовании мокроты непригодно для этиологической диагностики инфекций, вызванных S. pneumoniae.

3) Использование маркеров патогенности S. pneumoniae, а именно генов ply и pav, не позволяет отличить возбудителей патологического процесса от представителей нормальной микрофлоры.

4) S. pneumoniae обладает способностью вызывать бактериемию у лиц без глубоких нарушений иммунного статуса чаще, чем другие исследованные условно-патогенные микроорганизмы.

5) ПЦР - исследования крови при внебольничной пневмонии, вызванной S. pneumoniae, позволяют обосновывать этиологический диагноз.

6) Мутация AR1 пенициллин-связывающего белка (pbplA) S. pneumoniae коррелирует с данными микробиологического исследования резистентности возбудителя к пенициллину. Частота встречаемости мутации AR1 в гене пенициллин-связывающего белка S. pneumoniae (pbplA) составляет от 28% до 36%, AR2 - 0%.

7) Использование маркеров патогенности С. albicans, а именно генов nrg и chs не позволяет отличить возбудителей кандидоза от представителей нормальной микрофлоры.

8) Выявление ДНК С. albicans в крови при помощи ПЦР у больных с выраженным иммунодефицитом служит высоко эффективным методом подтверждения генерализации микотической инфекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1) При поступлении больного в стационар с подозрением на внебольничную пневмонию необходимо, наряду с микробиологическими исследованиями, провести ПЦР - исследования крови.

2) Использование видоспецифических маркеров S. pneumoniae должно быть дополнено изучением наличия мутаций AR1 в гене pbpl А с целью оценки чувствительности к антибиотику.

3) При возникновении подозрения на развитие кандидемии у больных с иммуносупрессией, развившейся на фоне применения химиотерапии необходимо, наряду с микробиологическими исследованиями, провести ПЦР -исследование крови с целью изучения наличия ДНК С. albicans.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ:

1. ПЦР как метод этиологической диагностики внебольничных пневмоний \\ «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Сб. тез. IV Всероссийской научно-практической конференции, Москва, 2002, стр.200-201, (соавт. Кириллов М.Ю., Бесхлебная В.А., Кравцов Э.Г.).

2. Применение ПЦР в лабораторной диагностике кандидозов \\ «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Сб. тез. IV Всероссийской научно-практической конференции, Москва, стр.57-59, 2002, (соавт. Никитин М.В., Кириллов М.Ю.).

3. Изучение штаммов Candida albicans, выделенных от женщин с различными формами вагинального кандидоза \\ «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», том 135, №3, стр.319-324, 2003, (соавт. Никитин М.В., Кравцов Э.Г., Далин М.В., Радзинский В.Е., Дойл Р.Д.).

4. Методические подходы к расшифровке этиологической структуры внебольничных пневмоний \\ «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», том 136, №10, стр.475-478, 2003, (соавт. Бесхлебная В.А., Ежова Л.Г., Кириллов М.Ю., Кравцов Э.Г., Далин М.В.).

5. Исследование популяции Candida species при вагинальном кандидозе и кандидоносительстве \\ «Проблемы медицинской микологии», том 5, №2, стр.43,2003, (соавт. Никитин М.В., Кравцов Э.Г., Далин М.В.).

Артемова Людмила Владимировна (Россия)

Проведен сравнительный анализ эффективности применения ПЦР и микробиологических методов для определения этиологической структуры внебольничных пневмоний. Показано, что диагностическую значимость имеет обнаружение ДНК S. pneumoniae в крови, а не в мокроте. Наличие генов ply и pay, маркеров патогенности Spneumoniae, не является маркером развившегося заболевания. Продемонстрирована возможность ГШР-детекции мутации AR1 в гене пенициллин-связывающего белка (pbpIA) S.pneumoniae. Наличие генов nrg и chsl, маркеров патогенности C.albicans, не коррелирует с развитием кандидоза. Показана эффективность применения метода ПЦР для выявления кандидемии у больных с фебрильной нейтропенией.

Artemova Lyudmila Vladimirovna (Russia)

The efficiency of PCR and microbiological methods for deciphering of the etiologic structure of non-nosocomial pneumonias is evaluated. It is shown the diagnostic significance for detection of pneumococcal DNA in blood, but not sputum. Detection of genes ply and pav, markers of S.pneumoniae pathogenicity, is not a marker of developed disease.

Possibility of PCR-detection of the AR1 mutation in gene pbpIA for penicillin-binding protein of S.pneumoniae is demonstrated.

Detection of genes nrg and chsl, markers of C.albicans pathogenicity, does not correlated with development of candidiasis. Efficiency of PCR method applying for revealing candidemia beside febrile neutropenia patients is shown.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н Н Бло»ина РАМН Подписано в печать 24. СИ • 0 f Эакм № Тираж 100 экз

14 87

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Артемова, Людмила Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. S. pneumoniae как условный патоген и его роль в развитии заболеваний

1.1.1. Морфология

1.1.2. Эпидемиология

1.1.3. Геномный анализ

1.1.4. Патогенез

1.1.5. Этиологическая значимость S. pneumoniae в развитии 22 внебольничных пневмоний и бактериемий

1.1.6. Проблема развития резистентности к пенициллинам

1.2. С.albicans как условный патоген и ее роль в развитии 25 заболеваний

1.2.1. Эпидемиология

1.2.2. Морфология

1.2.3. Геномный анализ

1.2.4. Патогенез

1.2.5. Этиологическая значимость C.albicans в развитии 34 кандидозов

1.3. Роль полимеразной цепной реакции в расшифровке 40 этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Группы больных

2.1.1. Контингент обследованных на инфицированность 47 S. pneumoniae

2.1.2. Контингент обследованных на инфицированность Candida

2.1.3. Контингент обследованных с иммуносупрессией

2.2. Микробиологические исследования

2.3. Полимеразная цепная реакция

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Результаты, полученные при исследовании ретроспективной 60 группы больных с внебольничными пневмониями, и их обсуждение

3.2. Результаты, полученные при исследовании группы больных 61 с диагнозом внебольничная пневмония; контрольной группы, их обсуждение

3.3. Результаты, полученные при исследовании группы больных 98 с генитальным кандидозом и носительством кандид, их обсуждение

3.4. Результаты, полученные при исследовании группы больных 100 с иммуносупрессией, и их обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями"

Популяции условно - патогенных микроорганизмов входят в естественные биоценозы человека и в сбалансированном состоянии удерживаются в пределах определенных экологических ниш. |Находясь J' сбалансированном состоянии, микробные ценозы удерживаются в пределах определенных экологических нишГ|Благодаря естественной резистентности макроорганизма, представители ценоза поддерживают свою численность и не могут расширить ареал обитания [12]. Разнообразные неблагоприятные внешние воздействия, экстремальные условия, стрессовые ситуации, снижение иммунного статуса, гормональные нарушения приводят к сдвигу такого равновесия. Любые изменения условий, дающие преимущества в размножении того или иного микроорганизма, входящего в ценоз, приводят к реализации его патогенного потенциала, а в ряде случаев к распространению определенной микробной популяции за пределы естественной среды обитания^[9]. ъг . -дпо/. nux<ju .

Естественно, что с большей вероятностью микроорганизмы, обладающие достаточно полным набором факторов патогенности, способны занимать новую экологическую нишу и вызывать патологический процесс. Выявление таких условно-патогенных микроорганизмов в не свойственных У «Я средах -Щ обитания является достаточно убедительным доказательством этиологического диагноза. Получение гемокультуры того или иного микроорганизма часто свидетельствует о диссеминации процесса и развитии септицемии. В этих случаях решающим] является эффективность бактериологического исследованиядправильность выбора питательных/сред, концентрация возбудителя в материале, условия его транспортировки, проводимая предварительная противомикробная терапия и т.д.). Кроме этого, ряд трудно культивируемых возбудителей, таких как S. pneumoniae, Н. influenzae, Mycoplasma spp. и др. требует использования специфических сред и условий, определенных навыков персонала. Эти обстоятельства делают необходимым повысить эффективность выявления возбудителя в исследуемом материале. В настоящее время кроме ставших «золотым стандартом» микробиологических методов идентификации и количественной оценки возбудителей, начинают широко применяться новые молекулярно-диагностические методы. В клинической практике успешно используется ПЦР - диагностика различных инфекционных заболеваний. Ряд характеристик ПЦР определяет преимущества этого метода в сравнении с другими. Высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения анализа после начала антибактериальной химиотерапии, быстрота выполнения относятся к достоинствам ПЦР. Ранее было показано удачное применение ПЦР для рутинной лабораторной диагаостаки^ возбудителей^инфекционных процессов респираторного и урогенитального тракта, например, Bordetella pertussis, Chlamydia pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и т.д. [98, 58]. В качестве объекта исследований нами были выбраны условно - патогенные организмы S. pneumoniae и С. albicans. ><■-£- j»*"**.*.

Основанием для такого выбора послужило то, что оба этих микроорганизма широко распространены, и их роль в развитии патологического процесса хорошо известна. Однако обнаружение ДНК 5 условно-патогенного возбудителя не всегда является подтверждением его этиологической значимости. Особенно это подтверждается при исследовании материала, где не исключается контаминация нормальной флорой (в мокроте, смыве из носоглотки, мазке из влагалища), которая неизбежно приводит к гипердиагностике и не позволяет решить вопрос о патогенетической значимости определяемых микроорганизмов, тем более в случае оппортунистической инфекции. Например, S. pneumoniae может обнаруживаться в респираторном тракте и у здоровых носителей, и при развитии заболевания [76, 32]. A Candida spp. может определяться во влагалище 20% здоровых женщин детородного возраста [23]. Поэтому мы считали, что обнаружение у выявляемого возбудителя факторов патогенности в определенной степени позволит судить об его этиологической значимости в развитии оппортунистической инфекции. Использование ПЦР в решении этого вопроса позволило бы определить ее место в алгоритме этиологической диагностики.

Активация популяции S. pneumoniae при развитии заболевания характеризуется выраженным распространением пневмококка из естественной экологической ниши - носоглотки, в безмикробные n r-^S) с тли-:»^- со"? ? пространства,респираторного тракта,'где может реализовываться патогенный потенциал. Патогенность С. albicans может проявляться и в пределах естественной экологической ниши, и при захвате новых территорий.

Предполагалось, что использование молекулярно - генетической детекции ДНК возбудителя, дополненное определением маркеров его патогенности при разных вариантах развития оппортунистической инфекции в определенной степени поможет установить этиологическую значимость данного микроорганизма. Так, например, известно, что кандида, выделенная от больных с манифестной инфекцией, более вирулентна по сравнению со штаммами от носителей [5]. Наличие полисахаридной капсулы, являющейся самым признанным фактором патогенности у S. pneumoniae, повышает вирулентность возбудителя в 105 раз [62]. Серьезной проблемой для клиницистов становится проявлен^ дру^ю^^ фжтора патогенности S. pneumoniae, а именно возникновение резистентности возбудителя к антибиотикам, наиболее часто используемых для лечения инфекционного процесса, вызванного данным микроорганизмом. Так, например, лечение пневмоний на протяжении десятилетий основывалось на использовании пенициллина вследствие его высокой активности в отношении пневмококка. В последнее время во всем мире наблюдается стремительный рост резистентности возбудителей пневмоний к антибактериальным препаратам. Значительно увеличилась доля пневмоний, вызываемых штаммами S. pneumoniae, устойчивыми к пенициллину. Крупное исследование по изучению устойчивости респираторных возбудителей к антибиотикам Alexander Project выявило наличие пенициллин-резистентных штаммов S. pneumoniae в отдельных регионах (Франция, Испания) до 51,4% случаев. Хотя^проблема устойчивости S. pneumoniae к антибиотикам в России пока не столь актуальна, но по данным многоцентрового исследования «ПеГАС-1», умеренно резистентные к пенициллину штаммы пневмококков были выявлены уже в 9% [1]. Следует помнить, что резистентность штаммов значительно варьирует в каждом регионе и может серьезно осложнить выбор терапии. Механизм устойчивости S.pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллин-связывающих белков клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций уменьшается сродство этих белков к бета-лактамным антибиотикам. Применение ПЦР для обнаружения мутаций пенициллин-связывающих белков способствует быстрому выявлению таких штаммов и назначению адекватного лечения с учетом резистентности возбудителя. Помимо этого, проявление различных факторов патогенности как было указано выше, помогает микроорганизмам занять новые, не свойственные им ниши обитания. Проявлением агрессии возбудителя можно считать развитие генерализации инфекционного процесса. В связи с этим диагностическую значимость может представлять изучение стерильных в норме сред организма, а именно, крови. Хорошо известно, что С.albicans обладает способностью к проникновению в эндотелий кровеносных сосудов и дальнейшей гематогенной диссеминации [47]. Пневмония, вызываемая S. pneumoniae, часто сопровождается бактериемией [38]. По данным Mandell et all, эффективность бактериологического выявления возбудителя в крови при внебольничной пневмонии остается не высокой и составляет от 1 до 16 % [64]. Применение в данном случае ПЦР в связи с ее высокой чувствительностью, возможно, поможет повысить эффективность этиологической диагностики.

Течение оппортунистической инфекции во многом обусловлено иммунным статусом человека. Воспалительные цитокины, такие как IL-10, могут ингибировать синтез про - воспалительных цитокинов, включая IL-1a \ b, IL-6, IL-8 и TNF. Измерение уровня IL-10 показало, что при внебольничной пневмонии происходит увеличение количества цитокина в крови. Оно коррелирует с тяжестью течения болезни и может иметь прогностическое значение [42]. В связи с этим изучение при помощи ПЦР полиморфизма единственного нуклеотида в промоторе гена IL-10- 1082G/A, приводящее к различной степени его экспрессии может дать предварительную оценку возможного течения заболевания. Цель исследования:

Определение роли ПЦР в алгоритме ^исследования больных с подозрением на инфекцию, вызванную условно - патогенными возбудителями. Задачи исследования:

1. Оценка эффективности применения ЦЦР для выявления S. pneumoniae в мокроте и крови у больных с внебольничными пневмониями в сравнении с данными бактериологического исследования.

2. Изучение генов факторов патогенности S. pneumoniae (фибронектин-связывающего белка (pavA) и пневмолизина (plyA)), и их влияния на развитие бактериемии.

3. Оценка частоты выявления мутаций AR1 и AR2 в гене пенициллин-связывающего белка S. pneumoniae (pbplA) и их влияния на развитие резистентности микроорганизма к пенициллинам.

4. Изучение факторов, влияющих на развитие бактериемий у больных с внебольничными пневмониями.

5. Изучение влияния генов факторов патогенности С. albicans (негативной регуляции гифообразования (nrg) и хитин синтетазы 1 (chsl)) на развитие кандидоза.

6. Оценка эффективности применения ПЦР для выявления кандидемии у больных на фоне иммуносупрессии.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Артемова, Людмила Владимировна

5. Выводы

1) Частота обнаружения S. pneumoniae в патологическом материале, полученного от больных внебольничными пневмониями значительно выше при применении ПЦР, чем при микробиологическом исследовании: в мокроте (79% и 25% соответственно) и в крови (25% и 0% соответственно).

2) Применение видоспецифических маркеров при ПЦР - исследовании мокроты непригодно для этиологической диагностики инфекций, вызванных S. pneumoniae.

3) Использование маркеров патогенности S. pneumoniae, а именно генов ply и pav, не позволяет отличить возбудителей патологического процесса от представителей нормальной микрофлоры.

4) S. pneumoniae обладает способностью вызывать бактериемию у лиц без глубоких нарушений иммунного статуса чаще, чем другие исследованные условно-патогенные микроорганизмы.

5) ПЦР - исследования крови при внебольничной пневмонии, вызванной S. pneumoniae, позволяют обосновывать этиологический диагноз.

6) Мутация AR1 пенициллин-связывающего белка (pbplA) S. pneumoniae коррелирует с данными микробиологического исследования резистентности возбудителя к пенициллину. Частота встречаемости мутации AR1 в гене пенициллин-связывающего белка S. pneumoniae (pbplA) составляет от 28% до 36%, AR2 - 0%.

7) Использование маркеров патогенности С. albicans, а именно генов nrg и chs не позволяет отличить возбудителей кандидоза от представителей нормальной микрофлоры.

8) Выявление ДНК С. albicans в крови при помощи ПЦР у больных с выраженным иммунодефицитом служит высоко эффективным методом подтверждения генерализации микотической инфекции.

6. Практические рекомендации

1) При поступлении больного в стационар с подозрением на внебольничную пневмонию необходимо, наряду с микробиологическими исследованиями, провести ПЦР - исследования крови.

2) Использование видоспецифических маркеров S. pneumoniae должно быть дополнено изучением наличия мутаций AR1 в гене pbplA с целью оценки чувствительности к антибиотику.

3) При возникновении подозрения на развитие кандидемии у больных с иммуносупрессией, развившейся на фоне применения химиотерапии необходимо, наряду с микробиологическими исследованиями, провести ПЦР - исследование крови с целью изучения наличия ДНК С. albicans.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Артемова, Людмила Владимировна, Москва

1. Авдеев С.Н., Чучалин А.Г., Тяжелая внебольничная пневмония, РМЖ, Том9 № 5, 2001, стр.177-182.

2. Антибактериальная терапия, Практическое руководство под редакцией Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н., М., 2000.

3. Антонов, В.Б., Кандидоз органов дыхания у детей, Пульмонология, 2002, №5, стр. 107-112.

4. Багдатьев В. Е., Бурова С. А., Смирнов А. В., Кандидозная инфекция в отделении интенсивной терапии, Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, 20-21 февраля 2003 года, стр 209-210.

5. Богомолова Т.С., Горшкова Г.И., Караев З.О., О факторах патогенности дрожжеподобных грибов рода Candida, Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1987, №7, С. 92-95.

6. Внутренние болезни по Тинсли Р. Харрисону, под редакцией Фаучи Э., Браунвальда Ю., Иссельбахера К., Уилсона Д., Мартина Д., Каспера Д., Хаузера С., Лонго Д., М., 2002, Практика.

7. Галил-Оглы Г. А., Паклина О. В., Балыпун Д. Г., Оппортунистические грибковые инфекции у онкологических больных, Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, 20-21 февраля 2003 года, стр. 236.

8. Коровина О.В., Эффективность и безопасность моксифлоксацина и амоксициллина в лечении внебольничной пневмонии: результаты рандомизированного двойного слепого сравнительного исследования в России, КМАХ, №1, том 3, 2001, стр. 17-19.

9. Лопухов JI.B., Эйделыптейн М.В., Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике, КМАХ 2000, Том 2, N 3, стр. 96-106.

10. Медицинская микробиология, под редакцией В.И. Покровского, O.K. Поздеева, ГЭОТАР Медицина, Москва, 1998.

11. Никонова Е. В., Чучалин А. Г., Черняев А. Л., Пневмонии: эпидемиология, классификация, клинико-диагностические аспекты, РМЖ, Том 5 № 17, 1997.

12. Роджерс К.А., Бердалл А. Д., Рецидивирующий вульвовагинальный кандидоз и причины его возникновения, ИППП № 3, 2000, стр.22-28.

13. Сергеев А. Ю., Иванов О. Л., Караулов А. В., Маликов В. Е., Сергеев Ю. В., Жарикова Н. Е., Вагинальный кандидоз: этиология, эпидемиология, патогенез, Иммунопатология, аллергология, инфектология, 2000; 2: 99-107.

14. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. // М «Медицина» - 2000.

15. Сергеев Ю.В., Сергеев А.Ю., Романовская Т.А., Местная терапия кандидных вульвовагинитов, РМЖ, Том 10, №7, 2002, стр. 351-353.

16. Сидоренко С.В., Синопальников А.И., Яковлев С.В., Антибактериальная терапия пневмоний у взрослых (рекомендации для практических врачей), М.2000.

17. Фалалеева Н. А., Багирова Н. С., Алексеева Т. Р., Дмитриева Н. В., Волкова М. А., Фунгемии у онкогематологических больных, Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, 20-21 февраля 2003 года, стр. 227-230.

18. Черняев A.JI., Ннконова Е.В., Заболеваемость, смертность и ошибки диагностики пневмоний, Materia Medica, Бюллетень для врачей и ^ фармацевтов, №4(8), 1995.

19. Чучалин А. Г., Пневмония: актуальная проблема современной медицины,

20. Materia Medica, 1995, №4 (8), стр. 5-10.

21. Alonsodevelasco Е., Verheul A.F.M.,Verheul J., Verhoef J., Snippe H., S. pneumoniae: virulence factors, pathogenesis, and vaccines, Microbiological Reviews, Dec., 1995, p.591-603.

22. Anaissie E.J., McGinnis M.R., Pfaller M.A., Clinical Mycology, Churchill Livingstone, 2003.

23. Baron E.Jo, Chang R.S., Howard D.H., Miller J.N., Turner J.A., Medical microbiology. A short course. Willey-Liss, 1994, p. 151-154; 537-541.

24. Barton RC, Gull K., Isolation, characterization, and genetic analysis of monosomic, aneuploid mutants of Candida albicans, Mol Microbiol. 1992 Jan; 6(2): 171-7.

25. Barton RC, Scherer S., Induced chromosome rearrangements and morphologic variation in Candida albicans, J Bacteriol. 1994 Feb; 176(3):756-63.

26. Berry A., Paton J. C., Additive Attenuation of Virulence of Streptococcus pneumoniae by Mutation of the Genes Encoding Pneumolysin and Other Putative

27. Pneumococcal Virulence Proteins. Infection and Immunity, Jan. 2000, p. 133-140 Vol. 68, No. 1.

28. Boom R, Sol С J, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J, Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin Microbiol 1990 Mar 28:495-503.

29. Buitron Garcia R, Romero Cabello R, Cruz Talonia F, Bonifaz A, Zarama Marquez F, Study on Candida no-albicans species and its relation to recurrent vulvovaginal candidiasis, Ginecol Obstet Мех 2002 Sep 70:431-436.

30. Catterall J. R., Streptococcus pneumoniae, Thorax 1999; 54:929-937.

31. Chang H. C., Leaw S. N., Huang A. H., Wu T. L., Chang Т. C., Rapid Identification of Yeasts in Positive Blood Cultures by Multiplex PCR Method, J. Clin. Microbiol, Oct. 2001, p. 3466-3471 Vol. 39, No. 10.

32. Cheng S, Clancy CJ, Checkley MA, Handfield M, Hillman JD, Progulske-Fox A, Lewin AS, Fidel PL, Nguyen MH, Identification of Candida albicans genes induced during thrush offers insight into pathogenesis, Mol Microbiol 2003 Jun 48:1275-88.

33. Chu W.S., Magee B.B., Magee P.T., Construction of an Sfil macrorestriction map of the Candida albicans genome, J Bacteriol. 1993 Oct; 175(20):6637-51.

34. Epidemiology, Pathogenesis, and Clinical Disease with Comparison to C. albicans, Clinical Microbiology Reviews, Jan. 1999, p. 80-96 Vol. 12, No. 1.

35. Fine MJ, Auble ТЕ, Yealy DM, Hanusa BH, Weissfeld LA, Singer DE, Coley CM, Marrie TJ, Kapoor WN., A prediction rule to identify low-risk patients with community-acquired pneumonia, N Engl J Med., 1997; 336: 243- 250.

36. Gallagher P.M., Lowe G., Fitzgerald Т., Bella A., Greene C.M., McElvaney N. т G., O'Neill S. J., Association of IL-10 polymorphism with severity of illness incommunity acquired pneumonia, Thorax 2003; 58:154-156.

37. Gillespie S.H., Balakrisnan I., Pathogenesis of pneumococcal infection, J. Med. Microbiol., V.49, 2000, p.1057-1067.

38. Hollingshead S. K., Becker R., Briles D. E., Diversity of PspA: Mosaic Genes and Evidence for Past Recombination in Streptococcus pneumoniae, Infection and Immunity, Oct. 2000, p. 5889-5900 Vol. 68, No. 10.

39. Holmes A.R., McNab R., Millsap K.W., Rohde M., Hammerschmidt S., Mawdsley J.L., Jenkinson H.F., The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding that is essential for virulence. Molecular Microbiology, 41(6), 2001, p.1395-1408.

40. Hoskins J., Alborn W. E., Arnold J., Blaszczak L. C., Burgett S., Dehoff B. S., * Estrem S. Т., Fritz L., Fu D. -J., Fuller W., Geringer C., Gilmour R., Glass J. S.,

41. Khoja H., Kraft A. R., Lagace R. E., Leblanc D. J., Lee L. N., Lefkowitz E. J., Lu J., Matsushima P., Mcahren S. M., Mchenney M., Mcleaster K., Mundy C. W., Nicas Т. I., Norris F. H., O'Gara M., Peery R. В., Robertson G. Т., Rockey P., Sun

42. Hull С. M., Raisner R. M., Johnson A. D., Evidence for Mating of the "Asexual" Yeast Candida albicans in a Mammalian Host, Science, Vol. 289, Issue 5477,307-310,2000.

43. Iannelli F., Oggioni M.R., Pozzi G., Allelic variation in the highly polymorphic locus pspC of Streptococcus pneumoniae, Gene, V. 284, N. 1-2, p. 63-71, D. 2002.

44. Jedrzejas M.J., Lamani E., Becker R. S., Characterization of Selected Strains of Pneumococcal Surface Protein A, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 35, Issue of August 31, pp. 33121-33128, 2001.

45. Jiang S.M., Wang L., Reeves P.R., Molecular Characterization of Streptococcus pneumoniae Type 4, 6B, and 18C Capsular Polysaccharide Gene Clusters, Infection and Immunity, Mar.2001, p.1244-1255.

46. Khalaf R.A., Zitomer R.S., The DNA Binding Protein Rfgl Is a Repressor of Filamentation in Candida albicans. Genetics 157, Apr.2001, p.1503-1512.

47. Kontoyiannis D. C. Pulmonary candidiasis in patients with cancer: an autopsy study, Clin. Inf. Dis., 2002, Vol.34., p.400-403.

48. Fluids by Simple Alkali Wash and Heat Lysis Method or PCR Detection, Journal of Clinical Microbiology, Aug. 1996, p. 1985-1991 Vol. 34, No. 8.

49. Lorente M. L. L., Falguera M., Nogu6s A., Gonzalez A R., Merino M. Т., Caballero M. R., Diagnosis of pneumococcal pneumonia by polymerase chain reaction (PCR) in whole blood: a prospective clinical study, Thorax 2000; 55:133137. раньше был 45 проверить

50. Louie M., Louie L., Simor A. E., The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases, CMAJ(Canadian Medical Association or its licensors) 2000; 163(3): 301-9.

51. Liu H, Co-regulation of pathogenesis with dimorphism and phenotypicswitching in Candida albicans, a commensal and a pathogen, Int J Med Microbiol 2002 Oct 292:299-311.

52. Liu H., Transcriptional control of dimorphism in Candida albicans, Current Opinion in Microbiology 2001,4:728-735

53. Luna H. I. R., The Utility of Blood Culture in Patients with Community-Acquired Pneumonia, The Ochsner Journal: Vol. 3, No. 2, pp. 85-93, 2001.

54. Magee A. D., Yother J., Requirement for Capsule in Colonization by Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity, June 2001, p. 3755-3761 Vol. 69, No. 6.

55. Magee В. В., Magee P. Т., Induction of Mating in Candida albicans by Construction of MTLa and MTL Strains, Science, Vol. 289, Issue 5477, 310-313 , 2000.

56. Mandell, Douglas and Bennetts, Streptococcus pneumoniae, Principles and Practice of Infectious Diseases, fifth edition, Churchill Livingstone, A Harcourt

57. Mencacci A., Cenci E., Del Sero G., Fe d'Ostiani C., Montagnoli C., Bacci A., Bistoni F., Romani L., Innate and adaptive immunity to Candida albicans: A new view of an old paradigm, Rev Iberoam Micol 1999; 16: 4-7.

58. Munro C. A., Schofield D. A., Gooday G. W. and Gow N. A. R., Regulation of chitin synthesis during dimorphic growth of Candida albicans, Microbiology (1998), 144, 391-401.

59. Murray P.R., Rosenthal K.S, Kobayashi G.S., Pfaller M.A., Medical Microbiology, 4th Ed., 2002 by Mosby, Inc.

60. Mio Т., Yabe Т., Sudoh M., SatohY., Nakajima Т., Arisawa M., and Yamada-Okabe H., Role of Three Chitin Synthase Genes in the Growth of Candida albicans, Journal of Bacteriology, Apr. 1996, p. 2416-2419 Vol. 178, No. 8.

61. Ng W., Olsen K., Lutsar I., Wubbel L., Ghaffar F., Jafri H., Mccracken G. H., Friedland I. R., Buffy coat PCR for diagnosis of experimental pneumococcal pneumonia, APMIS, V. 108, Issue 11, Page 729, November, 2000.

62. Normark B.H., Normark S., Antibiotic tolerance in pneumococci, Clinical Microbiology and Infection, 2002; 8: 613-622.

63. Nuorti J.P., Butler J.C., Farley M.M., Harrison L.H., McGeer, Kolczak M.S., Breiman R.F., Cigarette smoking and invasive pneumococcal disease. Active Bacterial Core Surveillance Team, The New England Journal of Medicine, V. 342, N 10, P 681-9, D 2000.

64. Obaro S., Adegbola R., The pneumococcus: carriage, disease and conjugate vaccines, J. Med. Microbiol., V.51, 2002, p. 98-104.

65. Overweg K., Pericone C. D., Verhoef G. G. C., Weiser J. N., Meiring H. D., De Jong J. M., R.De Groot, Hermans P. W. M., Differential Protein Expression in Phenotypic Variants of Streptococcus pneumoniae1.fect. Immun., August 1, 2000; 68(8): 4604 4610.

66. Plessis M., Smith A. M., Klugman K.P., Application of pbplA PCR in Identification of Penicillin-Resistant Streptococcus pneumoniae, Journal of Clinical Microbiology, March 1999, p. 628-632, Vol. 37, No. 3.

67. Polissi A., Pontiggia A., Feger G., Altieri M., Mottl H., Ferrari L., Simon D., Large-Scale Identification of Virulence Genes from Streptococcus pneumoniae, Infection and Immunity, Dec. 1998, p. 5620-5629, Vol. 66, No. 12.

68. Sethi S., Murphy T.F., Bacterial Infection in Chronic Obstructive Pulmonary Disease in 2000: a State of the Art Rewiew. Clinical Microbiology Reviews, Apr.2001, p.336-363.

69. Shin J. H., Nolte F. S., Morrison C. J., Rapid identification of Candida species in blood cultures by a clinically useful PCR method, J. Clin. Microbiol. 1997 June; 35 (6): 1454-1459.

70. Singh P., Gnosh S., Datta A., Attenuation of Virulence and Changes in Morphology in Candida albicans by Disruption of the N- Acetylglucosamine Catabolic Pathway. Infection and Immunity, Dec.2001, p.7898-7903.

71. Sobel J. D., Muller G., and Buckley H. R., Critical Role of Germ Tube Formation in the Pathogenesis of Candidal Vaginitis, Infection and Immunity, Vol. 44, No. 3, June 1984, p. 576-580.

72. Soil D.R., Mating-type locus homozygosis, phenotypic switching and mating: a unique sequence of dependencies in Candida albicans, News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology, V 26, N 1, p. 10-20, D. 2003.

73. Sonneborn A., Tebarth В., Ernst J. F., Control of White-Opaque Phenotypic ^ Switching in Candida albicans by the Efglp Morphogenetic Regulator, Infectionand Immunity, September 1999, p. 4655-4660, Vol. 67, No. 9.

74. StrauG A., Michel S., Morschhauser J., Analysis of Phase-Specific Gene Expression at the Single-Cell Level in the White-Opaque Switching System of Candida albicans, Journal of Bacteriology, June 2001, p. 3761-3769, Vol. 183, No. 12.

75. Tanoue S., Clinical and laboratory evaluation of penicillin resistant Streptococcus pneumoniae in relation to the mutations of pbp la, pbp2b andpbp2x, Kurume Med J 2001 48:1-8.

76. Tirodker U.H., Nataro J.P., Smith S., LasCasas L., Fairchild K.D., Detection of fungemia by polymerase chain reaction in critically ill neonates and children, J. Perinatol. 2003 Mar; 23(2): 117-22.

77. Tseng H.J., McEwan A.G., Paton J.C., Jennings M.P., Virulence of Streptococcus pneumoniae: PsaA mutants are hypersensitive to oxidative stress, Infection and Immunity, V. 70, N. 3, p. 1635-9, D. 2002.

78. Tumwasorn S., Nilgate S., Udomsantisuk N., Amplification of PI gene by polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma pneumoniae, J. Med. Assoc. Thai. 2002 Jun. 85, Suppl 1: S 389-98.

79. Tuomanen E.I., Austrian R., Robertmasure H., Pathogenesis of Pneumococcal Infection, The New England Journal of Medicine, May 11, 1995, p.1280-1284.

80. Vuori E, Peltola H, Kallio MJT, Leinonen M, Hedman K, Etiology of pneumonia and other common childhood infections requiring hospitalization and parenteral antimicrobial therapy. Clin. Infect. Dis. 1998; 27:566-72.

81. Wahyuningsih R, Freisleben HJ, Sonntag HG, Schnitzler P, Simple and rapid detection of Candida albicans DNA in serum by PCR for diagnosis of invasive candidiasis, J Clin Microbiol 2000 Aug 38:3016-21.