Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие современных инсектицидов и биохимический статус основных ферментов детоксикации в онтогенезе колорадского жука

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Действие современных инсектицидов и биохимический статус основных ферментов детоксикации в онтогенезе колорадского жука"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи

ПОСКРЯКСй Александр Витальевич

ДЕЙСТВИЕ СОВРЕМЕННЫХ ИНСЕКТИЦИДОВ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СТАТУС ОСНОВНЫХ ФЕРМЕНТОВ ДЕТОКСИКАЦИИ В ОНТОГЕНЕЗЕ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА

ОЗ. 00. 09 - энтомология .

АВТОРЕФЕРАТ '

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992

Работа выполнена в Отделе 6иохи:лгл и цитохимии Уральского отделения РАИ

Научяий руководитель; кандидат.биологических паук, с. и. с. Д. В. Амирханов

Официальные оппоиевты: доктор биологических наук, профессор II Г. Берим

кандидат биологических наук, с. н. с. Т. К Васильева

Ведена* организация: Всероссийский институт защиты

растений МОХ Российской Федерации

Защита диссертации состоится " г. в

1& час. на яьседании специализированного совет« й 020.01.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте залиты растений РАСЗФ по адресу: 1&Р'ЗК0, г. Санкт-Петербург-Пушкин-6, шоссе Шдбельского, 3. ВИЗР.

С диссертацией медао ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан " " ^"/¡Я^ч^ 1992

Ученый секретарь специализированного совета

Г. А. Наседкина

• г ';■

Ш1Ш ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ • Актуальность темы. Решение задач-по обеспечению страны в полном объеме и ассортименте всеми видами продуктов высокого качества требует интенсификации сельского хозяйства, что, в свою очередь, предполагает рациональное использование' химических • средств защиты растений от вредителей и болезней. Большое значение для обеспечения этих вадач имеет наличие широкого ассортимента современных пестицидов.

Однако, в условиях ' широкого использования химических средств защиты растений особое внимание необходимо уделять предупреждению таких негативных последствий, как формирование устойчивых популяций вредных организмов к систематически применяемым препаратам. Помимо непосредственного ущерба урожаю, устойчивость вызывает увеличение норм расхода препаратов, возрастание кратности обработок и, как следствие, нежелательные сдвиги в аг-роценозах, экономические убытки и загрязнение окружающей среды.

Для успешной работы с целью как предотвращения развития резистентности вредителей к кспользуемнм против них препаратам, так и для преодоления этого явления, необходимо большое внимание уделять изучению физиолого-биохшнческнх механизмов устойчивости. Другой важнейшей задачей является научно-обоснованный контроль за развитием резистентности ь природе, что требует хорошо отработанных как токсикологических, так и биохимических методов, позволяющих установить не только сам (Jara развития резистентности у того или иного вредителя, но и определить механизмы, по которым идет этот процесс. ^

Все эти проблемы имеют прямое отношение и к колорадскому зкуку, который является опаснейшим вредителем картбфеля как в нашей стране, так и зарубеаюм, и подвергается повсеместно систематическим химическим обработкам.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей ¡заботы заключается в изучении токсиколого-биохимических показателей для башкирской популяции колорадского жука как основы для разработки мероприятий по проведению мониторинга резистентности вредителя к инсектицидам. В задачи исследования входило:

1. Установить природную чувствительность различных стадий развития башкирской популяции колорадского кут к действию новых инсектицидов из различим классов.

2. Определить диагностические до&и и концентрации для про-

ведения мониторинга резистентности вредителя к используемым инсектицидам.

3. Изучить активность основных групп ферментов детоксикации в онтогенезе колорадского жука.

4. Оценить вклад различных ферментных систем в детоксикацню инсектицидов с использованием специфических ингибиторов ферментов детоксикации.

Научная новизна Показано, что башкирская популяция колорадского жука является чувствительной к действию широко применявшихся ранее и используемых в настоящее время инсектицидов. Установлена природная чувствительность личинок II, 1У возраста и имаго банкирской популяции вредителя к ШП, гамма-изомеру ГХЦГ, фенЕалерату, перметрину, циперметрину, фсксиму, трихлорфону, а также к таким перспективным инсектицидам, так лямбда-цигалотрин, бифенат, зтофенпрокс и бенсултап. Впервые в едином комплексе изучена возрастная динамика содержания цктохрома Р-450 и цитох-рома Е5, активность микросомальных монооксигеназ, неспецифических эстераз и глутагион -3- трансфераз. Получены новые данные по возрастным изменениям изоферментных спектров эстераз. Детально на' разных стадиях развития колорадского жука оценен вклад основных ферментов детоксикации в метаболизм инсектицидов из разных классов.

Практическая ценность работы. Предложены диагностические дозь; и концентрации широко применяемых в Башкирии и перспективных препаратов из разных классов для мониторинга резистентности вредителя. Предлагается использовать полученные результаты биохимических и токсикологических исследований с применением ингибиторов ферментов детоксикации в качестве базовых при многосторонней углубленной оценке резистентности колорадского жука к инсектицидам и механизмов ее формирования. После успешной апробации в производственных условиях, Башкирской республиканской станции защиты растений переданы рекомендации по применению спиленных в 2 раза доз пиретроидов для борьбы с колорадским жуком.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых ученых "Изучение, охрана и рациональное ис-. пользование природных ресурсов" (г.Уфа, 1987, 1991), на региональном совещании "Насекомые .в биогеоценозах Урала" (г.Сверд-

- О -

ловск, 1988), на X Всесоюзном сьезде энтомологического общества (г.Ленинград, 1989), на республиканской научно-практической конференции "Экологические проблемы агропромышленного комплекса Башкирской АССР" (г.Уфа, 1989), на совещании "Селекционно-генетические, физиолого-биохимические и технологические аспекты интенсификации производства картофеля'Чг. Уфа, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, одна находится в печати. _ -

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и б рисунков, и состоит кз введения, 5 глав, выводов, списка литература и приложения. Список использованной литературы включает 287 источников, в том числе 204 - иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глаза 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Описана история развития резистентности ' членистоногих к пестицидам, в частности, состояние этого вопроса в отношении колорадского кука. Отмечается, что этот вредитель развил высокий уровень резистентности к инсектицидам из различных классов, в том числе и к пиретроидам. Подробно рассмотрена проблема резистентности колорадского жука в нашей стране. Проанализированы механизмы устойчивости членистоногих к пестицидам. Подчеркивается важность ферментных систем детоксккации, а'также таких факторов, как нечувствительность мишени к действию инсектицидов и проницаемости покровов, в развитии-резистентности.

Большое внимание в обзоре обращается на важн<?сть систематического контроля за развитием устойчивости членистоногих к инсектицидам. Описаны используемые для.этого современные методы, включая применение диагностических доз и концентраций, ингибиторов ферментов детоксикацш, феромонных ловушек, • биохимических методов in vivo и in vitro, включая экспресс-методы. Детально рассмотрены способы управления резистентностью вредных насекомых к инсектицидам и пути предотвращения ее развития. Особое внимание уделено использованию смесей'инсектицидов, применению синер-гистов, Подчеркивается, что основным способом является чередование препаратов.

- 4 -

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований является колорадский картофельный хук LepLinotarsa decemlirteata Say, 'впервые обнаруженный на территории Башкортостана в 1976 году,

В работе были использованы следующие инсектициды: пермет-рин, (синтез ИОХ БНЦ УрО РАН, 90X Д. в.), циперметрин (циперкилл, 25% к. э.), фенвалерат (сумицидин, 20?. к. э.), лямбда-цигалотрин (каратэ, 5% к. э.), зтофенпрокс (требон, ЗОХ, к. э.), бифенат (талстар, 10% к. э.), фоксим (волатон, 50% к. э.), трихлорфон (хлорофос, 80% техн.), ДДТ (90% д. в. J, гамма-изомер ГХЦГ (99% д. в.), бенсултап (банкол, 50 % с. п.).

Лабораторные опыты проводили на собранных в Уфимском, клъ-шеевском и Давлекановском районах Башкортостана различных стадиях развития колорадского кука с 1986 по 1951 г. включительно. Личинок 1 возраста выводили из яиц в лаборатории условиях.

Инсектицидную активность пиретрокдов оценивали на личинках 11, ÍY возрастов и имаго летней генерации колорадского жука. Вредителя обрабатывали топикальным методом (Рославцева, 1978). Кроме того, бенсултап испытывали и при кишечно-контактном способе обработки через корм. При топикальной обработке на личинок II, IY возрастов и имаго наносили растворы инсектицидов в количестве 0,1; 0,5 и 1,0 мкл/особь, соответственно. Все соединения испытывались в 5-6 концентрациях. Эксперименты проводились в чайках Петри по 20-25 особей на концентрацию в двух повторнос-тях. Учет гибели вели через 72 часа для личинок и через 3-5 суток для имаго. Величины СК-50 и СД-50 рассчитывали методом пробитанализа в модификации Улллера-Тейнтера (Беленький, 1963).

При изучении вклада ферментов детоксикации в метаболизм инсектицидов из различных классов в качестве ингибиторов микросо-мальных монооксигеназ, неспецифических эстераз и глутатион-S-трансфераз использовали пиперонилбутоксид (ГОТЕ), S,S,S- трибу-тилтритиофосфат (ТБТФ) и дизтилмалеат (ДЭМ), соответственно. Ин-■ гибиторы накосили топикалыю за 1 час до обработки инсектицидами в сублетальных дозах. Козффщиент синергизма рассчитывали т формуле КС - СД-50 иисектицида/(СД-50 инсектицида + ингибитор).

Содержание- цитохрома Р-450 и цитохрома В5 определяли по методу Т. Omura и R.S^to (1S64) в микросомальной фракции, используя

коэффициенты молярной экстинции 91000/(М*см) для цитохрома Р-4БО и 164000/(М*см) для цигохрома В5. Активность микросомалышх мо-нооксигенаэ определяли в микросомальной фракции по скорости образования формальдегида в результате реакции деметилирования аминопирина ( Naoh, 1953 ). Активность глутатион - S - трансферам определяли в постмикросомэльной фракции, используя 1-хлор-2,4-динитробензол в качестве субстрата (Habier et al., 1974). Активность эстераз. определяли в супернатанте, полученном при центрифугировании при 10000 g-, по скорости гидролиза 1-наф-тилацетата ( Van Asperen, 1968 ). Электрофорез множественных молекулярных форм эстераз проводили в полиакршшидном геле по системе B.J.Davis (1962). Концентрацию белка определяли по методу 0. Н. Lowry et al. (1951). Статистическая обработка проводилась согласно Г. Ф. Лакнна (1980).

Глава 3. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА К ИНСЕКТИЦИДАМ В ОНТОГЕНЕЗЕ И Д11АГН0СТИЧЕСКИЕ ДОЗУ И КОНЦЕНТРАЦИИ ДЛЯ МОНИТОРИНГА РЕЗИСТЕНТНОСТИ ВРЕДИТЕЛЯ.

Чувствительность к инсектицидам в онтогенезе колорадского ?кука. Результаты экспериментов представлены в таблице 1. Видно, что наибольшей инсектицидной агаивностью в отношении всех стадий развития колорадского жу!<а обладают инсектициды из класса пирет-роидов. Высокой активностью отличался также бенсултап при кишеч-но-контактной обработке. Минимальная активность отмечалась для ЖГ, а трихлорфон, фоксим, гамма-изокер ГХЦГ и бенсултап при то-пикальной обработке занимал» промежуточное положение.

Внутри класса пиретроидов инсектицидная активность соединений на всех стадиях развития убывает в ряду лямбда-цигалот-рин-бифенат-цяперметрин-фэнвалерат-это'фенпрокс-перметрин. Подобное соотношение токсичности некоторых пиретроидов для имаго вредителя отмечается в большинстве опубликованных по"этому вопросу работ (Выховец, Быховец, 1981; Мач&варкани и др., 1985; Амирха-нов и др. , 1990). Результаты экспериментов по изучению инсектицидной активности бенсултапа показали, что этот инсектицид имеет ярко выраженное кишечное действие, поэтому, если по контактной токсичности он близок к хлор- и фосфорорганичр- '"им инсектицидам,

Таблица 1.

Возрастная чувствительность колорадского лука к инсектицидам из различных классов

Инсектицид СД 50, мкг/г (доверительный интервал, | Р-0,05) .

лич. 11 возраста лич. 1У возраста имаго

Фенвалерат 0,15 (0,13 - 0,18) 0,2 (0,17 - 0,25) 0,9 (0,7 - 1,1)

перметрин 0,68 (0,48 - 0,88) ■0,92 (0,74 - 1,1) 1,9 (1,6 - 2,2)

щшерметрлн 0,046 (0,036 - 0,06) 0,052 (0,045 - 0,063) 0,24 (0,17 - 0,31)

лямбда-цига-лотрин 0,001? (0,0012-0,0022) 0,0034 (0,0014-0,0044) 0,015 1 (0,011-0,019)!

бкфеиат 0,033 (0,035 - 0,04) 0,072 (0,06 - 0,084) 0,12 (0,1 - 0,14)

этофенпрокс 0,29 (0,16 - 0,39) 0,75 (0,61 - 0,89) 1,15 (0,9 - 1,4)

ООКСИМ 3,4 (2,9 - 4,0) 1,5 (1,2 - 1,3) 3,03 {2,32 - 3,74)

трихлорфон 18,7 (15,0 - 22,4) 14,1 (9,6 - 13,6) 28,8 (24,5 - 33,1)

бенсултап 7,04 (6,34 - 7,74) 2,36 (1,96 - 2,76) 24,0 (21,4 - 26,6)

оенсултап* 0,00012 (0,0001-0,00015) 0,0005 (0,0003-0,0007) ■ 0,003 (0,002 - 0,004)

гамма-изомер гхаг 3.1 (2,5 - 3,7) 10,6 (7,1 - 14,1) 14,4 (9,0 - 19,8)

ддт 11,5 (9,4 - 13,9) ! 1 66,2 (52,0 - 83,6) 1 62,0 (45,6 - 78,4)

* токсичность при кишечно-контактном способе обработки, приведена величина СКБО (% по д. в.)

Ю ПО КИШЭЧ110-контактной ОН бИаЧИТОИЫЮ ПГ.еЬОПХОЦИЛ ИХ. Т.-.К.мЗ ¡юдверждено, что чувствительное** раоких стадий раэштм к пи-ретроидам, хлорорганическим инсектицидам и бенсултапу при кпиг.-ч--но-контактнем действии понижается г> ряд/ личинки Г! ьоьрадгл -личинки 1У возраста-имаго. 4оксим, тг<ихло|>6г,н а оенсулгап при топикалыюй обработке были более токенчии для личинок IV ыл-раста, чем для личинок II возраста. Г<ероатио, отшчвншда различия п чувствительности личинок П и 1\' еозр&стоь к дейстыяо &>в-еима и трихдюрфона могут объясняться различиям,! ь екодот! активационных процессов, которым подвергаются эти соединен;!.! н органи&ме насекомых. Что касается Оепсултапа, то при ярко вил-кбнном кишечном действии интерпретация результатов, колучвптк при контактной обработке, представляет определенную трудность.

Таким образом, результаты оценки чувствительности колорадского лука к изучаемым инсектицидам и возрастании« требования к экологической безопасности в задае рас-тений дают основание рекомендовать для ийрокого использования против колорадского ь-ука ТЕ1Кне высокоэффективные инсектициды как оенеултап, лямбда-цига-лотрин и бифенат, и малоопасный этсфенпрокс.

Сравнительный анализ чувствительности_различных популяиий

вредителя к инсектицидам. Оценивая чувствительность колог адского жука к инсектицидам в Башкортостане, необходимо было выяснить, обладает ли он в зтой зоне устойчивостью к ранее применявшимся инсектицидам. Наибольший интерес представляет ДДТ, . поскольку сохранение устойчивости к этому препарату часто способствует быстрому развитию устойчивости к пкретроидам (Перегуда, 1985). Поэтому мы провели сопоставление литературных данных с нашими результатами по чувствительности колорадского мука к ряду применявшихся инсектицидов. Сравнение проводили с теми популяциями, которые авторы опубликованных работ считали чувствительными.

Результаты этого анализа позволяли сделать вывод, что по уровню чувствительности к инсектицидам из различных классов башкирская популяция колорадского хука может быть охарактеризована гак чувствительная к широкому спектру различных по механизму действия инсектицидов. Вышеизложенные материалы, а также полевые эксперименты позволили нам дать производству рекомендации по оптимизации борьбы с колорадским хуком в условиях Южного Урала и

синь;'.!!, уюруы применения ¡шретроидов при контроле численности вредителя не менее чем в 2 раза от рекомендуемых ( Список,1987) без снякет-.л биологической активности препаратов при существующей технике и технологии обработок.

Диагностические дозы и концентрация инсектицидов для проведения мониторинга резистентности колорадского хука. В системе мониторинга резистентности вредителей к инсектицидам одним из первых этапов является выявление устойчивых особей в популяции с похода) диагностических доз или концентраций инсектицидов, которые представляет собой удвоенное значение СК-95 или ЛД-95. Рассчитанные диагностические дозы (ДД, мкг/г) и концентрации (ДК, % по д. в.) представлены в таблице 2.

Таблица 2

Рекомендуемые диагностические дозы и концентрации для мониторинга резистентности колорадского гкука '

1.......................... ■ (Инсектицид 1 1 1 1 Лич. II возраста! .......г Лич. 1У возраста | | 1 ймаго |

ДК 1 ДД 1 1 ДК 1 1 ! га 1 1 1 ДК 1 I . ДД !

1 ! Перметрин 0,044 8,2 | 0,22 1 7,62 | 0,17 12,2 |

Щиперметрин 0,0072 1,1 1 0,013 0,46 | 0,038 2,6 |

|<1еквалерат 0,008 1,3 | 0,05 1,72 | 0,1 6,8 |

|Лямбда-цига- 1

|лотрин 0,00013 0,024| 0,0012 0,042| 0,002 0,14|

|Этофенпрокс 0,03 5,4 | 0,16 5,22 | 0,124 9,0 |

|Еифенат 0,0014 0,26 ! 0,012 0,42 | 0,011 0,8 !

I Фокскм 0,14 22,2 | 0,6 21,0 | 0,34 23,4 |

|Трихлорфон 0,72 132,8 | 5,4 184,4 | 2,4 173,0|

[Гамма-изомер 1

| ГХЦГ 0,12 23,2 | 5,0 173,2 | 3,6 259,41

1ДДТ 0,76 117,6 | 20,8 724,8 | 8,8 606,0|

¡Бенсултап* 0,002 | 0,0088 ( 0,044 - )

|Бенсултап** 1 ________ 0,46 . .. . .. 86,2 | ..1 1,64 55,8 | 1 5,8 376,6! ...... _)

* кииечно-контактная обработка через корм

+* топикальная обработка

Глава 4. ШХИШЕСШ МЕХАНИЗМЫ ЛЕТОКСЙКАДИИ ЮШГГГУЗУЯ В ОНТОГЕНЕЗЕ КОЛОРАЛСКОГО ЖУКА Цитохром Р-450, цятохром Е5 и активность микрссомаль-!л 1/0-нооксигеназ на рагньгх стадиях раввитил колорадского хух-и Цитохром Р-450 является ключевым звеном ыикроссмальних мскоскслгенго, метаболизируквдх различные ксенобиотики, в тем числе и. ::нс«1гга-цнды (Наск|зоп, 1983). Результаты экспериментов по нзучеиип содержания цитохрома Р-450,. цитохрома Б5 и активности м;:кросомаль-них монооксигаш у перезимовавших имаго, ' шаг о летней генерации, а такхе у личинок всех возрастов, предстаымии в таблице 3.

Таблица 3.

Содэряшке цитохрома Р-450, штохрома £5 и.ачгиыюсть микроссмальних моиоокекгеназ в онтогенезе колорадского

1 ........ ( 1 | Содержание Содержание 1 1 АКТИВНОСТЬ |

1 цитохрома цитохрома в5 микросомаль- 1

| Р- 450, ш-'.У/мг лкМ/мг микро- ных моноскси- !

¡Стадия развития | мжросомадь- сомалыюго геназ, I

1 кого белка ! белка ш!//иин/мг I шфосомадь- [ ното бежа 1 ]

1 Перезимовавшие

1 имаго: самцы 1450, £+-62 ,9а 576,1+-47,7 576,6+-88,3 , 1

| самки• |232,7+-33,4 420, И-47,5 496,0+- 82, б |

|Личинки I возр. ] 30,9+-29,0 368,6-1-61,6 |

I Личинки П ьозр. | 00,Й+-9,3 359.5+-50.0 !

I Личинки 111 возр. | 94,5+-16,5 375»6+-47,3 1

¡Личинки IV возр. (127, 0+-29Д . 339,9+-76,2 !

¡Кмаго летней |

¡генерации,- самцы 1230,1 +-50, 3 339,3+-73,2 46б.2+-83,в |

I самки 1 |193,в+-£9,1 1 312, 7+-81,5 461,31-64,1 I . ______]

л Доверительный интервал среднего ( Р-0,05 )

Vfi таблицы видно, что содержание цитохрома Р-450 у перези-моьаеядах имаго в целом несколько превышает этот показатель для-имаго летней генерации. Содержание цитохрома Р-450 у личинок 1, 11 III возрастов практически не различается между собой и лш. у личинок IV возраста достоверно выше. Содержание цитохрома Б5, который, как предполагается, является донором электрона для цитохрома Р- 450, в целом было несколько выше ио сравнению с имаго летной генерации. Содержание этого фермента у личинок всех ьограстсь было практически на одном уровне и достоверно не отличалось от этого показателя для имаго летней генерации.

Нам удалось определить скорость деметилирования аминопирина у имаго колорадского жука. Активность этих ферментов у перезимовавшего имаго в ¡¡«лом так»? несколько выше по сравнению с имаго летней генерации. У личинок вредителя монооксигенаэная активность не была выявлена. В ряде публикаций такие сообщалось о неудачных попытках изучить монооксигеназную активность на личиночной стадии развития колорадского жука (Rose, Brindley 1985; -Леонова и др. , 1986).

Активность эстераз и глутатион -S- трансфораз в онтогенезе колорадского жука. Результаты экспериментов по изучению активности глутатион -S- трансфераз представлены на рис.1. Видно, что в целом активность глутатион -S- трансфераз у перезимовавших у.таго несколько вше, чем у имаго летней генерации. Что ¡касается активности глутатион -S- трансферазы у личинок колорадского куга, то существенных различий мекду ними не обнаружено.

Результаты экспериментов по изучению активности эстераз представлены на рисунке Z. При сравнении активности эстераз перезимовавших имаго с имаго летней генерации, видно, что в отличие от всех выше рассмотренных ферментов, имаго летней генерации показали достоверно более высокий уровень активности этих ферментов, чем перезимовавшие имаго. Кроме того, активность эстераз у личинок достоверно возрастала с' увеличением возраста. Личинки II, III и IY возраста показали активность эстераз в 2,1, 4,3 и 6,2 раза выше, чем личинки I возраста. Полученные нами данные хороню согласуются с результатами других авторов, полученными как на этом же виде. (Леонова и др. , 1986), так и на других видах насекомых (Одинцов, 197Я;. Леонова и др. , 1987).

300. 200 100.

. нМ/мин/мг *,<злки

1

7

8

Рис.1. Активность глутатион-З-трансфераз в онтогенезе колорадского жука, ^перезимовавшие самцы, 2-иорезкмоваЕшие самки, 3-личинки 1 возраста, 4-личинки ¡1 возраста, 5-личишси Ш возраста, 6-личннки 1У возраста, 7-самци летней генерации, 8-самки летной генерации.

2С0С1 160С 1200 80 4са

¡¡М/мин/мг белка

1

2

8

Рис.2. Активность эстераз на разных стадиях развития колорадского яука, 1-перезимовавшие самцы, 2-перезимовавшие самки, З-личинки 1 позраста, 4-личинки Я возраста, 5-личпнки Ш возраста, , 6-личишси 17 возраста, 7-самцм летней генерации, 0—самки .я^тчей генерации.

В литературе (Hurkova, 1968; Forgash, 1981; Амирханов и др. , 1990) имеются данные о несколько большей чувствительности перезимовавших имаго по сравнение с имаго летней генерации, d связи с чем мы могли бы ожидать большей активности ферментов де-токеикации у имаго летней генерации. Полностью наши ожидания оправдались только в отноыенш! эстераз. По соей видимости, отмеченные в литературе различия в чувствительности перезимовавших имаго и имаго летней геаераили ойьясняются прежде всего физиологическими факторами, и лишь во вторую очередь активностью ферме нтсв детоксикат.

Анализ множественных молекулярных <'орм эстераа в онтогенезе колорадского >ука. Большинство ферментов существуй." со множестве форм. Во являются исключением и эстераз«, число и каталитическая активность которых различается как у разных видов (jshaaya,. Casida, 1984; Motoyáma et al., 1984 и др.), так и па разных стадиях онтогенеза (Down, i Sparks, 1934, 1937). В связи с зтим, а такж с тем, что эстеразы являются одной из основных групп ферментов детоксикации, большой интерес представляет изучение множественных молекулярных форм эстераз на разных стадиях развития колорадского кука. Результаты представлены на рис. 3. Видно, что у личинок колорадского ¿-ука обнаружена 21 зона, способная гидро-лизовать 1-кафтилацетат. В отличии от личинок, у имаго отмечено 23 зоны. Полученные нами данные выгодно отличаются от результатов других авторов (Рославцева и др.» 1990; Соломеиникова и др.', 1990), т.к. выявлено значительно большее число зон, что, видимо, объясняется методическими различиями при проведении электрофоре-тических исследований.

Таким образом, у колорадского жука наблюдается значительные половые и онтогенетические различия в содержании цитохрома Р-450, цитохрома В5, активности микросомальных монооксигеназ, глутатион -S- трансфераз; неспецифических эстераз, а так*» в спектрах изозимов эстераз. Считаем возмогшим использовать полученные результаты как базу для проведения мониторинга резистентности вредителя к инсектицидам с использованием биохимических методов.

"г -

р;

20-23

13-19

1-12

Рис

л и ч и н к и и р.1 а г о

1 в. П в. Ш в. 1У в. самцы самки

,3. Множественные молекулярные формы эстераз на разных стадиях развития колорадского жука.

- 14 -

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ ФЕРМЕНТОВ ДЕТОКСИКАЦИИ НА

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА НА РАЗЖГЧНЫХ СТАДИЯХ ОНТОГЕНЕЗА.

Для выяснения вклада различных ферментных систем в детокси-к&цто инсектицидов, а также для научения механизмов резистентности, обычно используют метод ингнбиторного анализа с использованием соединений, специфически тормозящих активность ферментов детоксикации и, в сочетании с инсектицидами, усиливающих токсичность последних. По степени усиления токсичности судят о вкладе той или иной ферментной системы в детоксикацию инсектицида.

Изменение активности инсектицидов из класса пиретроидоь под действием ингибиторов ферментов детоксикации в онтогенезе колорадского жука. По литературным данным известно,'что ь детоксикации инсектицидов из класса пиретроидов основная роль принадлежит микросомальным монооксигеназам и неспецифическим зстеразам (Plapp, 1076; Casida, Ruzo, 1980; Opparioorth, 1985) поэтому пи-ретроиды испытывеишсь с ППБ и ТБТФ. Результаты экспериментов представлены в таблице 4. Из представленных результатов видно, что влияние ППБ на инсектицидную активность практически всех пиретроидов было значительно сильнее, чем ТВТФ, что свидетельствует о большем вкладе микросомальных монооксигеназ в детоксикацию пиретроидов по сравнению с неспецифичеекими эстеразами. Что касается влияния ингибиторов ферментов детоксикации на чувствительность разных стадий развития колорадского хука к ииретрои-дам, то из таблицы 4 видно, что наблюдается возрастание коэффициентов синергизма о увеличением возраста личинок и максимум приходится на имагинальную стадию.

Влияние ингибиторов Ферментов детоксикации на активность хлорорганических, .фоофорорганических инсектицидов и нереистокся-нов. По литературным данным (Oppenoorth, 1985), в детоксикации хлороргаяических инсектицидов принимают участие микросомальные монооксигеназы -и глутатион -S- транеферазы. Эстеразы не участвуют в этом процессе в связи с отсутствием в молекулах этих соединений эфирных связей. Поэтому инсектициды из этого класса испи-тывались лишь с ППБ и ДЭМ

Результаты экспериментов представлены в таблице 5. Видно, что ППБ практически не влиял па токсичность гамма-изомера ГХЦГ.

Таблица 4. .

Влияние ингибиторов ферментов детоксикации на активность .инсектицидов из класса гшретроидов

Г"............ I Инсектицид 1 .............. ■ ■ | Стадия | развития 1 1 I• Коэффициент синергизма | ! - — ----------------1 • ■ .......1 1 ППБ ! ТБТФ | I 1 1

IПерметрин I лич. ! 1 возр. 1.5 1.2 I

I лич. IУ возр. 1.5 2,0 I

I имаго 3,0 3,1 I

¡Циперметрин I лич. I; возр. 1.6 1,4- |

I лич. 1У возр. 3,3 1,5 |

| имаго 4,1 2,4 |

¡Фенвалерат I лич. !! возр. 1.7 1,3 1

| лич. IУ возр. 2,1 1.5 |

| имаго 4,7 3,2 |

| Лямбда-цига- I лич. 11 возр. 1,7 . 1.4 !

|лотрин I личЛУ возр. • 2,1 1,5 |

[ имаго 3,0 2,1 I

| Вифенат | лич. I1 возр. 1,3 1.3 |

I лич. 1У возр. 2,1 1.6 |

| имаго 3,3 2.2' |

¡Этофеннрокс | лич. 11 возр. 1.5 1.2 |

I лич. ¡У воз р. 1,7 1,6 |

1............................. | имаго 2,6 2.1 I . . ....... 1

Таблица Б.

Влияние ингибиторов ферментов детоксикации на активность инсектицидов из классов хлор-, фосфорорганических инсектицидов и нереистокоинов

-1--

!-;-г

Инсектицид

Стадия ! развития Н

Козффициент синергизма

ППВ

| ТЗТФ | ДЭМ

1ДДТ 1........ | лич. 11 возр. . 1,2 — 1,6 |

! ЛИЧ. IV возр. 1,2 -- 1,6 |

| имаго 1,3 2,0 |

|Гамма-изомер ! | лич. 11 возр. 0,9 1,3 I

|ГХЦГ | лич. 1У возр. 1.0 -- 1,3 !

| имаго 1,1 -- 0,9 |

|Фокеш 1 ............. ! лич. 11 возр. 1.0 1,4 1,1 !

| лич. П возр. 0,4 3,3 1,4 I

! имаго 0,7 3,7 1.6 I

¡Трихлорфон 1 ! лич. П возр. 0,9 1,0 ^ .1 1

1 лич. !У возр. 1,2 1,3 1,4 !

| имаго ! 1,1 1,5 1,2 1

(Венсултап* г — | лич. I! возр. 0,8 0,7 0,7 !

| лич. ! У возр. 0,8 1.4 1.6 I

| имаго 1.2 2,7 0,9 !

1 .....'. .. .......... .1....................... . 1

* кишечно-контактная обработка инсектицидом

Ш' также очень незначительно смнергизироьадся этим ингибитором на всех стадиях развития колорадского жука, что может свидетельствовать о незначительной^детоксикации этих инсектицидов микро-.оомальными монооксигеназами. дам по сравнению с ГОШ показал больший эффект с ДЦТ, чем с гамма-изомером ГШ1. По всей видимости, глутатнон -5- трансферазы играют нестолько большую роль,

по сравнению с микросомальними монооксигеназами, в детоксикации хлорорганических инсектицидов, в частности, ДДТ.

По данным многих авторов, в метаболизме фосфорорганических инсектицидов принимают участие как микрссомаль'ные монооксигена-зы, так и неспецифические зстеразы с глугатион - 3- трансфэраза-ми (Уа?1Лот1, 1983; ОррепооНЬ, 1985), Поэтому для анализа вклада каждой из этих ферментных систем в метаболизм фогяит и трих-лорфона нами были использованы ППБ, ТБТФ и ДЭМ. Как видно из таблицы 5, наибольший синергизм на всех стадиях развития колорадского -пука фоксим показал с ТБТФ, ДЭМ уступал по этому показателю ТБТФ, что свидетельствует о том, что процесс детоксикацин фокеима идет наиболее интенсивно с участием неспецифических эс-тераз. ППБ не проявил синергизма с фоксимом, а на личинках IV возраста и имаго даже наблюдался антагонизм. Интерпретация этих результатов должна идти с учетом особенностей метаболизма фокеима с участием микросомальных монооксигеназ. Участие этих ферментов в метаболизме фокеима, который является производным тиофос-форной кислоты, мотет приводить как к снюкению токсичности этого инсектицида за счет ведущих к детоксикации химических превращений, так и к метаболической активации гиофосфата в более токсичную окссновую форму ( Р==Б --> Р--0 ). Отсюда следует, что инги-бирование микросомальных ' шнооксигеиаз ППБ ведет ¡сак к снижению детоксикации, так и к снижпию активации и конечный результат' определяется наложением этих двух процессов. Что касается влияния ингибиторов ферментов детоксикации на активность трихлорфо- ' на, то из таблицы 5 видно, что лишь ТБТФ немного повышает активность этого инсектицида. Отсутствие синергизма с ППВ и ДЭМ свидетельствует о незначительности вклада микросомальных монсюк-сигеназ и глутатион-Б-трансфераз в детокстсацию трихлорфона у колорадского жука.

В связи с тем, что бенсултап показал ярко выраженное кишечное действие, эксперименты проводили при кишечно-контактной обработке инсектицидом. В связи с отсутствием в литературе ¡сагах-либо сообщений о метаболизме этого инсектицида мы оценивали роль всех трех групп ферментов. Из таблицы 5 видно, что наибольший синергизм получен с ТБТФ. Однако этот эффект обусловлен скорее всего не ингибиротанием эстераз как детоксициругацих фэршн-

тов, а влияние на какие-то иные процессы, так как в молекуле бенсултапа отсутствует эфирная связь. Отсутствие синергизма с ППБ и ДЭМ может быть одним из обьяснений (наряду с отличным от остальных классов инсектицидов механизмом действия) его высокой эффективности против популяций насекомых, в частности колорадского куга, резистентных к фосфор- и хлорорганическим инсектицидам ( Бакаь 1984 ).

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что башкирская популяция колорадского жую по реакции на действие испытанных инсектицидов из различных химических классов может быть отнесена к чувствительной. Выявлено, что наибольшей инсектицидной активностью в отношении колорадского лука обладают инсектициды из класса пиретроидов и бенсултап,

' причем в процессе онтогенеза вредителя наблюдается стабильное снижение чувствительности к этим инсектицидам. Внутри класса пиретроидов инсектицидная активность убывает в ряду лямбда-цига-лотрин-бифенат-циперметрин-фенвалерат-этофенпрокс-перметрин.

2. Высокий уровень природной чувствительности'башкирской популяции вредителя к использованным инсектицидам позволил предложить производству двухкратное снижение норм применения пирот-роидов от официально рекомендованных. В связи с возрастанием требований к экологической безопасности в защите растений предлагается попользовать для контроля чноленнности толорадского жука такие инсектициды, ■ как этофенпрокс, лямбда-цигалотрин, бифе-нат и бенсултап.

3. Выявлены значительные половые и онтогенетические различия в содержании и активности основных ферментов детоксикации колорадского жука. Особенно наглядно эти изменения наблюдаются в содержании цитохрома Р-450 и активности эстераз. При изучении множественных молекулярных форм эстераз у личинок вредителя выявлена 21 форма, а у имаго 23 Форш, что почти в 2 раза больше, чем было известно ранее. Это свидетельствует о большей чувствительности используемого нами метода.

4. Токсикологическим методом показано ведущее значение в детоксикации пиретроидов у колорадского жука микросомальных мо-нооксигеназ. Меньшая роль принадлежит неспецифическим эстеразам.

Летоксикацпя фсксима и трихлерфонз происходит преимущественно с участием неспепифических эстераз, тогда как детоксикация ДДТ идет преимущественно с участием глутатион-Б-трансфераз. Влияние ингибиторов ферментов детоксикации на инсектицидную активность гамма-изомера ГХЦГ не установлено.

5. Полученные результаты токсикологических и биохимических экспериментов, проведенных на чувствительной к инсектицидам популяции колорадского жука,- предлагается использовать в качестве базовых для мониторинга резистентности вредителя как в республике Башкортостан, так и в сопредельных регионах.

Основное содержание диссертации издолю но в следующих работах:

1. Поскряков A.B. Байкал - новый инсектицид против колорадского зиука // Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов: Тез. докл. конф. мол. ученых. - Уфа, 1987.-

С. 50.

2. Поскряков A.B. , Архавитина M.R , Амирханов Д. В. Роль ок-сидаз и эстераз в (формировании резистентности насекомых к пирет-роидам и ингибиторам синтеза хитина // Насекомые в биогеоценозах Урала: Информационные материалы. - Свердловск: УрО АН СССР, 1989.

- С. 55.

3. Амирханов Д. В. , Мигранов М. Г., Поскряков А. В., Черникова 0. П. Снижение норм применения пиретроидов для борьбы с колорадским луком // Экологические проблемы агропромышленного комплекса Башкирской АССР: Гез. докл. респ. конф. - Уфа, 1989. - С. 70. .

4. Амирханов Д. В. , ?<!игранов 21 Г., Поскряков -А. В. Оптимизация борьбы с колорадским жуком в условиях Южного Урала // Селекционно-генетические, физиолого-биохимические и технологические аспекты интенсификации производства картофеля: Тез. докл.-Уфа, 1989.- С. 135-137.

5. Поскряков А. В. , Амирханов Д. В.. Эффективность банкола в борьбе с колорадским яуком // Агрохимия.- 1991,- M 5.-С. 120-124.

6. Поскряков А. В., Салтыкова Е. С... Ферменты детоксикации инсектицидов в онтогенезе колорадского жука // Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов: Тез. докл. научн. конф. мол. ученых. - Уфа, 1991. - С. 25.

7.. Поскряков А. В. , Амирханов Д. В. Влияние ингибиторов фер-

ментов детоксикации на активность инсектицидов в онтогенезе колорадского жука // Современное полож-ние с резистентностью вредителей, возбудителей болезней растений и сорняков к пестицидам: Тез. докл. 8 совещ. - Уфа, 1992.- С. 33-35.

8. Поскряков A.B.., Салтыкова Е.С. , Амирханов Д. В. Активность ферментов детоксикации в онтогенезе колорадского жука // Современное положение с резистентностью вредителей, возбудителей болезней растений и сорняков к пестицидам: Тез. докл. 8 совещ. - Уфа, 1992.- С. 31-33.

9. Поскряков А. В., Амирханов Д. В. Использование синергистов для изучения роли ферментов детоксикации инсектицидов на. примере колорадского гиука // Агрохимия.- 1992,- N 1.- С. 123-128.

10. Поскряков А. В., Салтыкова Е. с., Амирханьв Д. В. Биохимические механизмы толерантности колорадского жука к инсектицидам ' в онтогенезе /У Тр. X сьезда ВЭО /в печати/.

УОП БНЦ УрО АН СССР ¡ак 215т»р.100