Действие пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы

Хомяков, Никита Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Действие пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Действие пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы"

Д1Г

г »

— ! ' ' ¡1 ' ; . „ ,1!... .1

на правах рукописи

ХОМЯКОВ Никита Владимирович

ДЕЙСТВИЕ ИИЩЕВАРИТЕЛЬНОИ ЖИДКОСТИ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003468216

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: Официальные оппопенты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук Б.А. Вызов

доктор биологических наук Н.П. Битюцкий доктор биологических наук A.B. Тиунов

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Защита диссертации состоится ЛЬ _ в 15 часов 30 минут в

аудитории заседании Диссертационного Совета Д 501.002.13 при МГУ

им. М.В. Ломоносова по адресу. 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан «_»_2009г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Г.М. Зенова

Актуальность

Дождевые черви - активные регуляторы жизни микробного сообщества почв. Взаимодействия дождевых червей и микроорганизмов важны для протекания таких почвенных процессов как разложение и трансформация растительных остатков, образование гумуса, формирование пула питательных элементов и микробных сообществ. Широкий спектр этих взаимодействий позволяет говорить о тесной связи червей с микроорганизмами. Предполагается, что микроорганизмы являются основным источником пищи для червей (Edwards, Fletcher, 1988, другие). Дождевые черви воздействуют на микроорганизмы косвенно, модифицируя среду обитания (Тиунов, 2007; Persson, Lohm, 1977; Petersen, Luxton, 1982; Brussaard, 1998; Lavelle, Spain, 2001; Wardle, 2002). Но есть и прямой механизм. Это - пассаж почвы через пищеварительный тракт. Потребляя почву, дождевые черви регулируют рост почвенных микроорганизмов, выедая одни и создавая благоприятные условия для роста других микробных популяций в пищеварительном тракте и в экскрементах. При пассаже меняются состав, обилие и активность микроорганизмов (Третьякова и др., 1996; Вызов, 2005; Тиунов, 2007; Parle, 1963; Hanion, 1981; Fisher et al., 1995; Schönholzer et al., 1999; Tiunov, Scheu, 1999; 2000). Каков биохимический механизм воздействия пищеварительной среды червей на микробные популяции пока не известно.

В последние годы все больший интерес вызывают биологически активные вещества дождевых червей, влияющие нарост микроорганизмов. Они содержатся в целомической жидкости, поверхностном мукусе, в экстрактах из гомогенатов тканей. Выявлены антибактериальная, антигрибная и другие активности (Balamurugan et al., 2006; Fiolka, 2006; Shobha, Kale, 2006; Zhenjun Sun et al., 2006). Можно предположить, что и в пищеварительном тракте у червей есть вещества, действующие на микроорганизмы и являющиеся причиной изменения микробного сообщества при пассаже через пищеварительный тракт. Ранее в кишечной жидкости почвенных многоножек обнаружена селективная активность по отношению к бактериям и грибам. Показано, что переваривание микроорганизмов в кишечнике многоножек начинается с быстрой гибели клеток под действием специфических киллерных агентов, имеющих небелковую природу (Вызов, Рабинович, 1997; Byzov et al., 1998). Подобных исследований для дождевых червей

не проводилось. Эти знания полезны, так как селективный отбор микроорганизмов в кишечнике червей может быть значимым фактором формирования микробных сообществ в почве. С практической точки зрения важно знать, популяции каких микроорганизмов, полезных или вредных, получают преимущество в кишечнике червей.

Цель:

Определение особенностей воздействия пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы.

Задачи:

1. Характеристика микробного сообщества и ферментативной активности пищеварительного тракта дождевых червей Aporrectodea caliginosa.

2. Оценка биологической активности пищеварительной среды червей по отношению к микроорганизмам.

3. Характеристика действующих компонентов пищеварительной жидкости червей.

Научная новизна

Впервые обнаружен эффект быстрой гибели микроорганизмов в пищеварительной жидкости дождевых червей. Предполагается, что это необходимо для эффективной утилизации червями микроорганизмов как пищи. Обнаружена специфичность действия пищеварительной жидкости на микроорганизмы, проявляющаяся на штаммовом уровне, что является новым фактором регуляции биологического разнообразия в почвах.

Впервые исследованы киллерные вещества в пищеварительной жидкости дождевых червей. Доказано, что киллерный агент (ы) является низкомолекулярным органическим веществом небелковой природы.

По ряду характеристик (протеазная и дегидрогеназная активности, доля факультативно анаэробных бактерий) микробное сообщество пищеварительного дождевых тракта червей отличается от почвенного.

Практическая значимость

Полученные данные могут быть использованы для поиска и выделения биологически активных природных соединений с антимикробным действием, для разработки препаратов против патогенных микроорганизмов. Результаты используются в лекционных курсах по общей экологии, экологии почвенных микроорганизмов, почвенной зоологии, биологии почв.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на 8-м Международном симпозиуме по экологии дождевых червей (Краков, 04-09 сентября 2006 г.), на заседаниях кафедры биологии почв.

По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах («Микробиология» и «European Journal of Soil Biology»), труды в сборниках конференция и тезисы.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка упоминаемых в тексте литературных источников. Работа изложена на 111 страницах текста, иллюстрирована 12 рисунками, включает в себя 8 таблиц. Список литературы состоит из 152 наименований, из них 119 зарубежные.

Автор благодарит В.В. Демина и Ю.А. Завгороднюю за помощь в химических анализах и интерпретации результатов, Т.Ю. Нечитайло, П.Н Голышина и Т.Г. Добровольскую за идентификацию бактерий.

Объекты и методы исследования

Почва. Использовали окультуренную дерново-подзолистую почву под бобово-злаковой растительностью с многолетнего опыта кафедры агрохимии МГУ имени М.В.Ломоносова (Московская область, Почвенно-экологический центр МГУ "Чашниково"). Содержание общего углерода в почве - 1,72 %, азота - 0,13 %, рН водной вытяжки - 5,7. В 1989 году была применена известь в дозах, достаточных, чтобы нейтрализовать гидролитическую кислотность. Почва получала в течение 1990-1993 40 т/га органических удобрений (навоз) и минеральные удобрения NiooPsooK-soo в год. В течение 1994-1999 она получила в среднем NmoP-toKioo в год.

Дождевые черви. В работе использовались черви трех экологических групп: компостные - Eisenia fedida (Savigny, 1826), почвенные - Aporrectodea caliginosa (Savigny, ¡826) и норные - Lumbricus terrestrís Linnaeus, 1758. Основным объектом был A, caliginosa, обитающий в горизонте 0-20 см почвы. Червей содержали в почве при 12-15° С.

Микроорганизмы. В работе были использованы бактерии, выделенные из почвы, кишечника и экскрементов червей. Всего выделено 638 штаммов. Бактерии были идентифицированы путем секвенирования фрагментов бактериальных генов I6S рДНК с последующим филогенетическим анализом (работа проведена Т.Ю. Нечитайло в Биотехнологическом центре Брауншвейга, Германия). Они были отнесены к Alphaproteobacteria, Betaproteobateria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Bacilli, Sphingobacteria, Flavobacteria. Микроскопические исследования проводили с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, полученными из коллекции кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

Выращивание бактерий. Бактерии выращивали в пенициллиновых флаконах в жидкой среде R2A следующего состава: дрожжевой экстракт - 0,5 г; пептон - 0,5 г; казаминовые кислоты - 0,5 г; глюкоза - 0,5 г; крахмал - 0,5 г; пируват натрия -0,3 г; двузамещенный фосфорнокислый натрий - 0,3 г; сернокислый магний - 0,05 г; дистиллированная вода, на качалке при 180 об./мин в течение 18-20 часов при температуре 20-22° С. Суспензии отмывали от среды 2-х кратном центрифугированием при 12000 об./мин в стерильной водопроводной воде.

Протеолитическая активность. Культуры из почвы, кишечника и экскрементов червей пересеивали точечной инокуляцией на среду R2A-arap с 2% желатина. На 3-е сутки измеряли величину зоны просветления в результате гидролиза желатина.

Наличие факультативных анаэробов. Для проверки использовали методику Хыо-Лейфсоиа, адаптированную к потоковому анализу. При ферментации глюкозы в анаэробных условиях образуется молочная кислота, рН среды снижается. Закисление среды выявляется по изменению окраски индикатора. В нашем варианте определение происходит в 96-луночных планшетах при соотношении среды Хыо-Лейфсона к вазелиновому маслу = 1:2. Инокулировали ночные культуры из разведения 1:100.

Получение пищеварительной жидкости. Определяли выживаемость бактерий в пищеварительной жидкости червей. Червей предварительно содержали

либо в почве, либо в простерилизованном автоклавированием песке для выяснения влияет ли субстрат, попадающий в пищеварительный тракт, на активность пищеварительной жидкости. Для выделения пищеварительной жидкости червей умерщвляли, погружая в кипяток на 1 сек. Червь размещался на морозильном столике (элемент Пельтье), где охлаждался до минус 16° С за несколько минут. Во время размораживания производили вскрытие червя, извлекали кишечник и/или его содержимое из среднего (сразу за пояском) и заднего отделов кишечника. При этом не допускали повторного замораживания материала. Извлеченную массу центрифугировали при 12000 об./мин в течение 5 мин для осаждения содержимого и частичной стерилизации. Посев супернатанта на R2A-arap не выявил бактерий. Таким образом, была получена пищеварительная жидкость из среднего и заднего отделов кишечника, либо очищенного от почвы, либо заполненного почвой. Кишечную жидкость хранили при -18°С.

Определение выживаемости бактерий. Обезжиренные предметные стекла прожигали над горелкой, помещали в чашки Петри и заливали средой R2A-arap так, чтобы толщина слоя составляла 1,5-2 мм. После застывания среды стекло вырезали из чашки и помещали на стерильную фильтровальную бумагу в чашку Петри.

Готовили разведения суспензий бактерий 10"3 и 10"4, из них производился посев. На агаризованное стекло наносили по 1 мкл суспензии клеток. На высохшие капли культур наносили 2 мкл пищеварительной жидкости при помощи шаговой пипетки Eppendorf. Пищеварительная жидкость впитывалась в агар в течение 20-30 сек. В контроле на суспензию клеток наносили стерильную водопроводную воду. Чашки инкубировали в экскикаторе при температуре 20-22° С. Количество микроколоний подсчитывали через сутки в световом микроскопе при увеличениях х32 и х125. Для вычисления погрешности при нанесении суспензии было проведено тестирование пипетки. Культура бактерий из соответствующего разведения наносилась на стекла в 12-кратной повторности. Ошибка среднего по количеству колоний не превышала 7%.

Расширяя круг тестируемых бактерий, использовали более стандартизированную и точную методику определения жизнеспособности бактерий по их дегидрогеназной активности. В качестве индикатора роста микроорганизмов использовали 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ). Под действием анаэробных дегидрогеназ бесцветный растворимый в воде ТТХ

восстанавливается в нерастворимый в воде 2,3,5-трифенилформазан, имеющий красный цвет. Активность окраски определяли на микропланшетном фотометре Tecan Sunrise при длинах волн 492 или 620 нм. Для сравнения активности культур между собой использовали удельную дегидрогеназную активность (УДА). Это отношение светопоглощения варианта с формазаном к суспензии без индикатора.

Микроскопия клеток. Оценивали морфологические изменения клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae на воздействие пищеварительной жидкости. Дрожжи выращивали на жидком сусле (1:4 = сусло:вода) в течение 18-20 часов. Клетки отмывали водопроводной водой центрифугированием, наносили их суспензию на предметное стекло, добавляли пищеварительную жидкость и через 5 минут экспозиции с жидкостью фотографировали.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Для характеристики веществ, входящих в состав кишечной жидкости, был использован метод гель-фильтрации в варианте высокоэффективной жидкостной хроматографии на Хроматографе Agilent 1100 series, колонка - TSK2000 SW 7,5 мм х 60 см с диодно-матричным детектором. Рабочие пределы колонки - 15-32 мин, X = 280 нм, V пробы = 0,5 мл, 0,1 М фосфатный буфер, 0,1% азид натрия, рН 7,0. Разделение комплекса веществ на компоненты при помощи этого метода позволяет установить их молекулярные массы, концентрацию, долю в составе и получить ультрафиолетовый спектр компонентов.

Фракционирование кишечной жидкости. Было проведено фракционирование кишечной жидкости червей A. caliginosa и для сравнения жидкости из среднего отдела кишечника многоножки Pachyialus flavipes (C.L. Koch, 1847) методом гель-хроматографии нормального давления на геле сефадексе G-25. V пробы = 200 мкл + 3 мл 0,1 М фосфатного буфера. В первой фракции сходят белки с массами >1000 Da, с 1 по 8 фракции - с массами от 1000 до 300 Da, далее сходят вещества, вступавшие в адсорбционные взаимодействия с матрицей геля.

Определение белка по Бредфорду. Проведено определение белка в каждой фракции по Бредфорду (на наличие пептидной связи). Индикатор - бриллиантовый синий, в качестве стандарта использовали человеческий альбумин, V пробы = 100 мкл. Определение проводили на спектрофотометре Specord 50 Analytik Jena, X = 590 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика микробного сообщества и ферментативной активности пищеварительного тракта дождевых червей Aporrectodea caliginosa. Известно, что в кишечнике червей есть зоны с анаэробными условиями (Karsten, Drake, 1997), поэтому все кишечные изоляты были проверены на способность к факультативно-анаэробному росту. Из 360 протестированных штаммов 263 оказались способны к росту в этих условиях (73%). Это косвенно подтверждает возможность наличия ассоциированных с кишечным трактом бактерий.

Для характеристики кишечных бактерий провели сравнительный анализ их протеолитической активности. Предполагали, что если черви питаются микроорганизмами, их пищеварительная среда должна содержать активные протеолитические бактерии, которые используют белковые продукты разрушенных микробных клеток. Из бактерий, выделенных из почвы (91 штамм, 34 таксона), активностью обладают 14 штаммов (15%), наиболее активны представители класса Bacilli. Среди кишечных бактерий (315 штаммов, 43 таксона) активностью обладают 99 штаммов (31%), наиболее активны бациллы и не идентифицированные штаммы. Среди бактерий, выделенных из свежих экскрементов червей (105 штаммов, 39 таксонов) активностью обладают 19 штаммов (18%), наиболее активны бациллы. Таким образом, среди кишечных бактерий больше всего активных протеолитиков. 60% штаммов образую зону более 11 мм (табл. 1). Это может иметь значение для симбионтного пищеварения организма-хозяина - переваривания.

Проверяли дегидрогеназную активность как характеристику общей активности микробных клеток. Установлено, что почвенные изоляты бактерий (267 штаммов) обладают средней удельной дегидрогеназной активностью 2,5 ± 0,5, а кишечные изоляты (201 штамм) и изоляты из экскрементов (170 штаммов) соответственно 3,8 ± 0,3 и 4,0 ± 0,7, т.е. почти в 2 раза выше, чем почвенные бактерии.

Таблица 1. Протеолитическая активность бактерий, выделенных из почвы1, кишечника2 и экскрементов3 дождевых червей_

Класс Общее количество проверенных штаммов Количество штаммов с желатиназной активностью, размер зоны (мм)

0 1-10 11-20 21-30

Actinobacteria 22V22V14"1 19/20/12 0/2/2 3/0/0 0/0/0

Alphaproteobacteria 7/9/4 5/9/2 1/0/2 0/0/0 1/0/0

Bacilli 30/20/34 22/14/23 2/5/5 5/0/5 1/1/1

Betaproteobacteria 6/13/8 6/12/7 0/1/1 0/0/0 0/0/0

Flavobacteria 0/3/2 0/2/2 0/1/0 0/0/0 0/0/0

Gammaproteobacteria 26/60/43 25/56/40 0/4/3 0/0/0 1/0/0

Sphineobacteria 0/4/0 0/4/0 0/0/0 0/0/0 0/0/0

He идентифицированные 0/184/0 0/99/0 0/24/0 0/59/0 0/2/0

Всего проверено штаммов 91/315/105 77/216/86 14/99/19

Активные штаммы, % 85/69/82 15/31/18

Одним из возможных источников питания для червей могут быть гуминовые вещества. Известно, что полифенолоксидазы могут участвовать как в разложении, так и в синтезе гуминовых веществ. Однако полимеризация считается побочным процессом (Тейт 3, 1991). Наличие полифенолоксидаз в пищеварительном тракте может свидетельствовать о способности червей к перевариванию гуминовых веществ. Установлено, что тела червей, кишечник которых очищен от почвы, имеют активность полифенолоксидазы почти в 2 раза меньшую (4,20 ± 0,74 мг пурпургаллина/г биомассы червя в сут.), чем черви, питающиеся почвой (7,62 ± 0,78 мг пурпургаллина/г биомассы червя в сут.). Активность же фермента в кишечной жидкости намного меньше, чем в теле червя (0,95 ± 0,15 мг пурпургаллина/особь в сут.). Итак, собственный вклад пищеварительных ферментов червей в разложение гуминовых веществ невелик, в этом процессе велико участие бактерий, попадающих в кишечник с почвой.

Таким образом, пищеварительная среда червей обладает особенностями по сравнению с почвой. Возможно существование сообщества бактерий кишечного тракта червей. На это указывает высокий процент факультативных анаэробов среди кишечных изолятов; повышенная протеазная и дегидрогеназная активности кишечных изолятов; малый вклад самих червей, и больший - почвенных микроорганизмов, вошедших с пищей, в поддержании полифенолоксидазной

активности, и, как следствие, в модификации гуминовых веществ.

Оценка биологической активности пищеварительной среды червей по отношению к микроорганизмам. Методом агаровых пленок оценивали реакцию почвенных изолятов бактерий на воздействие пищеварительной жидкости. Обнаружены три типа реакции.

1) Культуры, погибающие в результате кратковременного воздействия кишечной жидкости (менее 20 сек.) - численность бактерий падала в несколько раз, а иногда даже на несколько порядков. Это - Arthrobacter sp. (2 штамма), Alcaligenes sp., Bacillus megaterium (2 штамма), Kluyvera ascorbata, Microbacterium sp. Pseudomonas reactans.

2) Большинство проверенных бактерий слабее или нейтрально реагировали -численность микроколоний не менялась. Это - Aeromonas sp. (2 штамма), Agromyces cerinus, Agromyces sp. (2 штамма), Alcaligenes sp., Aminobacter aminovorans (2 штамма), A. niigataensis, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter sp., A. oxydans, Bacillus subtilis (2 штамма), В. licheniformis, В. mojavensis, В. puinilus (2 штамма), В. megaterium, Bacillus sp., Bordetella sp., Brevundimonas diminuta, Delftia acidovorans, Kocuria palustris (2 штамма), Nocardioides sp., Paenibacillus sp. (2 штамма), Pseudomonas proteolytica, P. reactans (3 штамма), P. reactans (2 штамма), Rhodococcus opacus, Streptomyces sp. (2 штамма), Pseudomonas sp. (4 штамма). Staphylococcus aureus, Sphingopyxis witßariensis.

3) Некоторые бактерии даже увеличивали численность КОЕ после действия кишечной жидкости, вероятно, играет роль эффект диспергирования клеток под действием поверхностно активных веществ или стимулирования прорастания клеток (Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 2 штамма). В кишечной жидкости заднего отдела активности не обнаружено.

Таким образом, численность некоторых бактерий падает, но в популяции могут содержаться выжившие клетки, получающие преимущество в сообществе заднего отдела. Провели тестирование культур на выживаемость с более длительным периодом инкубации, сравнимым со временем прохождения субстрата по пищеварительному тракту червей: 2 часа. В результате был выявлен целый ряд чувствительных к воздействию культур, среди которых можно видеть представителей разных таксонов и даже групп. Снова обнаруживается разнообразная реакция от сильного подавления до практического отсутствия воздействия (Рис. 1).

Микроколонии, % контроля О 20 40 60 80 100 120 140

Количество микроколоний 0 100 200

Pseudomonas pulida 429-2 А9

Pseudomonas pulida 304-1 С

Cl зс

Bacillus mojawnsis 317-1 -2 С.

Dl Z7C

Pseudomonas pulida 428-1 ■■■■^^■■¡■^■■i

B1 шшя^^^^^шяш^ш

Pseudomonas sp. 309-2 HHI^HHHi D8

Arthrobacteroxydans 304-2 ' Arlhrobaciersp.430-2 I Bl

Pseudomonas sp. 310-1

□ Нейтральные Н Погибающие □ Стимулирующиеся

Рис. I. Реакция бактерий на воздействие кишечной жидкости дождевых червей Aporrectodea caliginosa в зависимости от времени действия. А - 30 сек.; Б - 2 часа.

Для того чтобы доказать, что биологическая активность связана с веществами кишечником, а не с почвой, червей кормили стерильным песком и нестерильной почвой. Затем выделяли кишечную жидкость и тестировали ее активность по отношению к бактериям, проявившим 3 типа реакции: погибающие, нейтральные, растущие. Существенных отличий в действии жидкости червей, питавшихся почвой и песком, не обнаружено. Следовательно, биологическая активность связана с веществами пищеварительного тракта червей (табл. 2).

Чтобы окончательно исключить почву как один из факторов, влияющих на жизнеспособность микроорганизмов в кишечнике, смешивали стерильную почву с культурой дрожжей и кишечной жидкостью и затем определяли жизнеспособность клеток. Почва не оказала влияния на наличие и степень эффекта, что говорит об

отсутствии или очень незначительной степени сорбции активных веществ кишечной жидкости или химических реакциях между ними и почвой (табл. 3).

Таблица 2. Реакция бактерий на действие кишечной жидкости дождевых червей Aporrectodea caliginosa, содержащихся в почве и на стерильном песке (КОЕ/мкл; З.О.- жидкость заднего отдела кишечника; П.О.- жидкость переднего отдела кишечника)____

Бактерии Контрол ь Песок Почва

З.О. ПО. 3.0. П.О.

Alcaligenes sp. 345-1* 1500 1400 18 1480 23

Arthrobacter sp. 430-1 520 506 48 512 57

Kluyvera ascorbata 303-1 146 153 21 158 18

Pseudomonas sp. 329-1 560 1450 960 1500 1000

Pseudomonas putida 348-1 550 1380 467 1340 450

Pseudomonas sp. 387-1 60 107 65 111 53

Arthrobacter sp. 392-1 156 172 145 162 143

Arthrobacter globiformis 333-1 468 453 445 451 439

Bordetella sp. 341-1 175 210 154 140 162

Delftia acidovorans 335-1 268 258 254 248 240

Pseudomonas sp. 399-2 200 115 176 159 168

Pseudomonas sp. 309-2 98 102 92 106 87

* - жирным шрифтом - чувствительные к действию жидкости из переднего отдела

Таблица 3. Влияние почвы на активность кишечной жидкости на примере реакции дрожжей $ассЬаготусе$ сегехчя'ше

Вариант КОЕ/чашку

Почва + стерильная вода 0,77 ± 1

Почва + стерильная вода + Б. сегеу^ягае 393 ±61

Кишечная жидкость + почва сегеиЧ/ж? 0,11 ±0,33

Кишечная жидкость + 5. сегеушае 0

Затем мы использовали более стандартизированную и точную методику определения жизнеспособности бактерий по дегидрогеназной активности. Наличие киллерного эффекта подтвердилось. Наблюдается тенденция к подавлению роста всех групп бактерий. Активность обнаруживается как в переднем, так и в заднем отделе. Круг тестируемых бактерий был расширен. На Рис.2 представлены средние значения дегидрогеназной активности при воздействии кишечной жидкости для 638-и штаммов. В основном, наблюдается подавление роста всех проверенных таксонов, за исключением представителей А1рЬарго1еоЬас1епа (Рис. 2).

Actinobacteria Alphqjroteobacteria BariHi Gamraproteobaeteria

Не из газифицированные

¡ | - Контроль

Щ - Каяечкаг жкзюп» вгргжгго озелакЕшечнюса червя | | - Конечная жклкоеть laaaroотдела птнявгклчервя

Рис. 2. Изменения удельной дегидрогеназной активности бактерий из разных классов под воздействием кишечной жидкости червя Aporrectodea caliginosa (протестировано 638 штаммов).

Внутри классов наблюдаются различные типы реакций: от подавления активности до стимуляции (Рис. 3).

Отдельного внимания заслуживают различия в реакции бактерий, проявляющиеся на штаммовом уровне (Рис. 3, 4). Механизм не известен, но можно предположить, что действующее вещество (ва) взаимодействует с мембраной, имеющей разный состав у разных штаммов бактерий. Аналогичное показано ранее па примере многоножек и мокриц (Вызов, 2005).

10 т УДА

Actinobacteria

fl г¥1 Л fVl

г-Л rí] í¥i ríl Л

HíLc.

гЛ -л fifi г-Л

гЛ Iii Пп f¥l гП I in ПГ1 rrfl г¥1

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

УДА

Bacilli

гГ Л 4l rrfl гГ m r^i П пЛ II Л гЛ пп

ГГг11Г>1гГттгГ1гЛ

IYI

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Gammaproteobacteria

10 ПУДА

rwi ГЛ ГкП

гПг J1

JkL

^ rtfl Пп

LkJlüJL

m л

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Штаммы

Actinobacteria

1. Agromyces sp. 415-1

2. Agromyces sp. 423-2

3. Arthrohacler globiformis 396

4. A globiformis 395-2

5. A. globiformis 419-1

6. A. axydans 304-2

7. Arthrobacter sp. 392-1

8. Arthrabacler sp. 391-2

9. Kocuria palustris 404-1

10. К. palustris 405-2

11. К. palustris 417-1

12. К. palustris 417-2

13. К. palustris 416-2

14. К. palustris 424-2

15. К. palustris 420-2

16. К. palustris 393-2

17. К. palustris 409-2

18. Microbacterium sp. 423-1

19. Nocardioidcs sp. 385-1

20. Nocardioses sp. 410-1

21. Nocardioides sp. 421 -1

22. Nocardioses sp. 421-2

23. Rhodococcus opacus 404-2

24. Slreptomyces inserts 588-2

25. S. lalerilius 579-2

26. Slreptonn'ces sp. 389-1

27. Streptomyees sp. 406-2

Bacilli

i. Bacillus lichenifonnis 414-2

2. B. liehaniformis 415-2

3. B. lichenifonnis 416-1

4. B. megaterium 401-1

5. li megaterium 407-2

6. H megaterium

7. В. megatcrnmt 413-2

8. 11 megaterium 318-2

9. B. mqfavensis 326-2

10. B. mojuvensis 317-1

11. 11. mojavensis 326-1

12. B. pumilus 403-1

13. B. pumilus 403-2

14. B. putnilus 427-1

15. B. pumilus 427-2

16. B. pumilus 302-2

17. 11. simplex 565-2

18. B. simplex 567-1

19. B. simplex 567-2

20. B. simplex 422-2

21. Bacillus sp. 414-1

22. B. subtilis 386-1

23. B. subtilis 386-2

24. B. subtilis 385-2

25. Pacnibacillus amylolyticus 425-2

26. Poenibacillns sp. 412-1

27. Pacnibacilhts sp. 412-2

Gammaproteobacteria

1. Kluyvera ascorbala 303-!

2. Pseudomonas migulae 398-

3. P. pulida 401 -1

4. P. pulida 402-1

5. P. pulida 325-2

6. P. pulida 429-2

7. P. pulida 428-1

8. pulida 396-1

9. P. pulida 304-1

10. P. pulida 306-1

11. P. pulida 309-1

12. P. pulida 558-1

13. P. pulida 328-2

14. P. reactans 387-2

15. P. reactans 394-2

16. P. reactans 400-2

17. Pseudomonas sp. 399-2

18. Pseudomonas sp. 309-2

19. Pseudomonas sp. 310-1

20. Pseudomonas sp. 310-1

21. I'seudomonas sp. 329-1

22. Pseudomonas sp. 387-1

23. Pseudomonas sp. 311-1

Рис. 3. Реакция почвенных изолятов бактерий па воздействие кишечной жидкости червя Aporrectodea caliginosa. Белые столбики - контроль; черные - после действия кишечной жидкости из среднего отдела; серые - после действия кишечной жидкости из заднего отдела.

Pseudomonas putida

Ко curia palustris

Bacillus pumilus

■ An, v'ooaaer qxi aans

Pseudomonas ¡vacia ns

| ¡ -}!::-: :;:о.*:ь

Щ^Вшкш жтаея шито отзт шнчиш ч^и

Рис. 4. Штаммовые различия в реакции бактерий (удельная дегидрогеназная активность) под действием кишечной жидкости червя Aporrectodea caliginosa.

Проверяли зависимость скорости действия кишечной жидкости от степени ее разбавления. Оказалось, что жидкость теряет свойства быстрого киллерного эффекта при разбавлении больше чем в 2 раза. Это может являться косвенным доказательством небелковой природы действующего вещества, т.к. на активность ферментов такая степень разбавления существенного влияния не должна оказывать. Исчезновение эффекта при разбавлении характерно также для действия детергентов. Под действием жидкости изменяется морфология клеток: размеры и внутреннее содержимое.

Разбавление (доля болы. 3 о)

Живые Мер шые

Рие. 5. Зависимость скорости гибели дрожжей Басскаготусев сеге\ч51ае от степени разбавления кишечной жидкости. Морфология живых и мертвых клеток.

Эта гипотеза была проверена на нескольких чувствительных штаммах бактерий. Кишечная жидкость была подвержена термической обработке, после чего денатурировавшую массу осадили центрифугированием. Это позволило получить пищеварительную жидкость, условно очищенную от белков. Оказалось, что очищенная от белков жидкость также обладает данным эффектом (табл. 4). Можно предположить, что активность связана с небелковыми соединениями, как и у многоножек (Вызов, 2005).

Таблица 4. Проверка наличия термостабильных микробоцидных веществ в кишечной жидкости Eisenia fétida (log КОЕ/мл)

Flavobacterium sp. Promicromonospora sp.

Контроль 10,2 10,4

Нативная кишечная жидкость 2,3 2,5

Прогретая кишечная жидкость 2,7 2,9

Таким образом, впервые обнаружен эффект быстрой гибели почвенных бактерий в пищеварительной жидкости дождевых червей. Кишечная жидкость дождевых червей агрессивна по отношению к микроорганизмам. Реакция бактерий различна - от гибели до стимуляции роста. Реакция бактерий проявляется на штаммовом уровне. Активность обнаружена и в пищеварительной жидкости червей Lumbricus terrestris и Eisenia fétida (данные приведены в диссертации). Действие пищеварительной жидкости, вероятно, связано с веществами небелковой природы. Специфическая реакция почвенных бактерий на пребывание в пищеварительной среде может являться фактором регуляции микробных сообществ.

Характеристика действующих компонентов пищеварительной жидкости червя Aporrectodea caliginosa и Pachyiulus flavipes. Ранее на многоножках показано, что в активной фракции кишечной жидкости преобладает вещество небелковой природы с массой 351 Да (Вызов, 2005). Был использован метод гель-фильтрации в варианте высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разделение комплекса веществ на компоненты при помощи этого метода позволяет установить их молекулярные массы, концентрацию, долю в составе и получить ультрафиолетовый спектр компонентов. На Рис. 6 представлена зависимость оптической плотности при 280 нм от времени схода компонента. Площадь под пиком - это количество вещества в смеси, высота пика это его концентрация. В начале сходят вещества с высокими молекулярными массами. Центр распределения масс лежит в области 58000, 18000, 3000 Да. По характеру их спектров в ультрафиолетовой области можно заключить, что это белковые соединения, т.к. такой тип спектра определяется наличием в их составе тирозина, триптофана и фенилаланина. Позже сходят более низкомолекулярные соединения с массами около 550 и 200 Da, и спектры их далеки по характеру от спектров

предыдущих компонентов. О точной массе веществ, сходящих в этой области, ничего сказать нельзя, т.к. они находятся на границе рабочих возможностей колонки. Эти пики являются адсорбционными. По характеру ультрафиолетовых спектров двух самых крупных из них можно заключить, что это вещества небелковой природы, при этом концентрация их в составе жидкости максимальна.

Для дальнейшего исследования было проведено фракционирование кишечной жидкости червей и многоножки методом гель-хроматографии нормального давления, на геле сефадекс 0-25. В первой фракции сходят белки с массами >1000 Ба, с 1 по 8 - с массами от 1000 до 300 Ба, далее сходят вещества, вступавшие в адсорбционные взаимодействия с матрицей геля. Получено 20 фракций кишечной жидкости.

Проведено определение белка в каждой фракции по Бредфорду (на наличие пептидной связи). Каждая фракция была выпарена и протестирована на дрожжах 8асс\тготусе$ сеге^тае. На Рис. 7 показана зависимость содержания белка и скорости действия кишечной жидкости. По оси X отложены номера фракций. Пунктиром отмечены области 100% гибели клеток (в поле зрения). При действии жидкости из переднего отдела червя область 100% гибели клеток находится в зоне отсутствия белков, а пик скорости воздействия приходится на 12-ую фракцию. Жидкость заднего отдела - область 100% гибели клеток включает в себя фракции, содержащие полипептидные цепи. Пик скорости воздействия приходится на 6-ую фракцию. Жидкость среднего отдела кишечника многоножки - область 100% гибели клеток размыта и занимает с 3 по 16 фракции. Обнаружено две области высоких скоростей гибели, с максимумами вбив 12 фракциях.

Таким образом, наблюдаются общие закономерности в действии кишечной жидкости для червя и многоножки. Высокой активностью обладают одни и те же фракции, не содержащие белка.

25 30

Время. м:ш

Рис. 6. Фракционирование кишечной жидкости червя Aporrectodea caliginosa и многоножки Pachyiulus flavipes методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. А - жидкость из переднего и среднего отделов кишечника А. caliginosa; Б - жидкость из заднего отдела кишечника A. caliginosa; В - жидкость из среднего отдела кишечника Р. flavipes.

Для подтверждения сходного характера воздействия жидкостей червя и многоножки был протестирован ряд почвенных изолятов бактерий. Для более подробного изучения тестировали как молодые, так и культуры большего возраста. Оказалось, что шесть из них реагируют похожим образом. Пять, напротив, проявляют противоположную реакцию.

В целом, можно отметить, что кишечная жидкость многоножки проявляет себя гораздо более агрессивно. А в жидкости червя у некоторых штаммов происходила стимуляция роста.

Возможно, такая разница в реакции обусловлена комплексным воздействием действующих веществ у многоножки. У червя действие веществ разнесены пространственно по отделам пищеварительного тракта, возможно для облегчения выживания сообщества кишечного тракта.

Передними с-редгаш отдел

Задний огдеп

j Apormclodea caliginosa

Я}гибели

N 15 16 17 12 !р 20 Фракции

1)гибели

12 13 Ы 15 15 17 К К И Фр.щт,

Средний отдел

I PachymliLSflavipes 5

g0,35

i 0-30 J 0,25 | 0,20 3 0,15 8 0.10 ¡ 0.05 3 0

la..

.DlMolou—iJ,

D гибели ЗЯ -ЗОН -250

-ж

150

bioo

10 11 12 13 Id 15 16 п

О Оптическая плотность ■ Скорость гибели

Рис. 7. Гибель клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae в зависимости от наличия белка (оптическая плотность при 520 нм) во фракциях кишечной жидкости разных отделов кишечника червя Aporrectodeci caliginosa и многоножки i'achyiulus flavipes. Скорость гибели - отношение времени выживания клеток без кишечной жидкости и в ее присутствии (900 ceic./t)

Aporrectodea caliginosa

Pachyiulusflavipes

Штаммы бактерий Суточные 3-х суточные

культуры

10 11 12

Штаммы бактерий

Суточные 3-х суточные культуры культуры

10 11 12

ИИ Стимуляция роста Ц Подавление роста

Рис. 8. Сравнение активностей кишечных жидкостей червя Aporrectodea caliginosa и многоножки Pachyiulus flavipes по отношению к бактериям (на примере 16 не идентифицированных почвенных изолятов). Отсутствие столбиков - не определяли.

Мы предположили следующий механизм действия киллерного вещества на клеточную мембрану. Киллерное вещество представляет собой детергент следующего вида: гидрофобная цепь с полярными группировками на концах. Агент проникает через поры в клеточной стенке, встраивается в мембрану и разрушает её за счет гидрофобного взаимодействия и расклинивающего действия (Рис. 9).

Мшбрлнаклеткл *

КНЛЛгрНЫЙ аГ«ГГ

Рис. 9. Гипотетический механизм действия киллерного вещества на клеточную мембрану. Киллерное вещество проникает через поры в клеточной стенке и разрушает мембраны за счет гидрофобного взаимодействия и расклинивающего действия (предположительным киллерным агентом жидкости среднего отдела кишечника многоножки РасЬут1№ Ат1рез является

гидроксисульфопальмитиновая кислота -ЗОз-СЦСГЩ^-СОО-, Вызов, 2005).

Таким образом, впервые исследован групповой состав микробоцидных веществ в пищеварительной среде дождевых червей. Действующим веществом жидкости переднего отдела кишечника червя является органическое соединение (я) небелковой природы. Действующими компонентами жидкости заднего отдела, возможно, являются вещества, ассоциированные с полипептидами. Наличие биологической активности у фракций небелковой природы возможно связано с их поступлением из переднего отдела. Характер и структурная композиция действующих веществ у червя и многоножки позволяет говорить, что они имеют одинаковую природу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пищеварительный тракт дождевых червей - особая среда обитания бактерий. Большинство кишечных изолятов - факультативные анаэробы. Протеолитическая и дегидрогеназная активность кишечных изолятов выше в сравнении с почвенными. Таким образом, возможно существование сообщества бактерий кишечного тракта червей. Собственный вклад червей в разложение гумусовых веществ несравнимо мал по сравнению с ассоциированными с ними микроорганизмами.

Впервые обнаружен эффект быстрой гибели почвенных бактерий в пищеварительной жидкости дождевых червей. Кишечная жидкость дождевых червей агрессивна по отношению к микроорганизмам. Реакция бактерий различна -от гибели до стимуляции роста. Реакция бактерий проявляется на штаммовом уровне. Действие пищеварительной жидкости, вероятно, связано с веществами небелковой природы.

Впервые исследован групповой состав микробоцидных веществ в пищеварительной среде дождевых червей. Действующим веществом жидкости переднего отдела кишечника червя является органическое соединение (я) небелковой природы.

выводы

1. Функциональная характеристика кишечных изолятов доказывает существование сообщества бактерий кишечного тракта дождевых червей.

2. Впервые обнаружен эффект быстрой гибели микроорганизмов в пищеварительной жидкости червей, что представляется необходимым для эффективной утилизации микробов как пищи.

3. Обнаружена специфичность действия жидкости на микроорганизмы, что является новым фактором регуляции биологического разнообразия в почвах.

4. Впервые исследованы киллерные вещества в пищеварительной жидкости дождевых червей.

5. Доказано, что киллерный агент является низкомолекулярным органическим веществом (ми) небелковой природы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хомяков Н.В., Харин С.А., Нечитайло Т.Ю., Голышин П.Н., Кураков А.В., Вызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Реакция микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей // Микробиология. 2007. Том. 76, № 1, с. 55-65.

2. Byzov В. A., Khomyakov N.V., Kharin S.A., Kurakov A.V. Fate of soil bacteria and fungi in the gut of earthworms // European Journal of Soil Biology, 2007, Vol. 43, pp. 149-156.

3. Byzov B.A., Khomyakov N.V. The sensitiveness of soil bacteria at the digestive fluid in the gut of the earthworm Aporrectodea caliginosa // Abstracts the 8th International Symposium on earthworm ecology, 4th-9'h September 2006, Krakov, Poland, p. 118.

4. Хомяков H.B. Киллерная активность пищеварительной жидкости дождевых червей по отношению к почвенным микроорганизмам // Тез. докл. Второго Всероссийского конкурса научных студенческих работ к 200-летию Московского общества испытателей природы "Биотехнология - охране окружающей среды". Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова. Издательство ООО "Графикон - принт", Москва-2005 г. с. 352-358.

5. Хомяков Н.В., Добровольская Т.Г. Нечитайло Т.Ю. Голышин П.Н, Вызов Б.А. Судьба бактерий в кишечнике дождевых червей // Материалы Международной научной конференции к 90-летию Ростовского государственного университета (Ростов-на-Дону. 21-22 апреля 2005 г.). "Экология и биология почв". Изд-во "Ростиздат". Ростов-на-Дону 2005 г. с. 523-529.

6. Хомяков Н.В., Вызов Б.А. Микробоцидная активность пищеварительных экстрактов дождевых червей // Тез. докл. 4-го (14) Всероссийского совещания по почвенной зоологии. "Экологическое разнообразие почвенной биоты и биопродуктивность почв". 2005. с. 280-28.

7. Khomyakov N.V., Byzov В.А. The microbicidal activity of the earthworm gut extracts // Abstracts XIVlh International Colloquium on Soil Zoology and Ecology. At the Universite de ROUEN - Mont Saint Aignan. France, 2004. pp. 120.

Заказ № 8/04/09 Подписано в печать 01.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 )) www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хомяков, Никита Владимирович

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 .Роль дождевых червей в почвенных процессах

1.1.Физические процессы

1.2.Химические процессы

2.Взаимодействия микроорганизмов и животных в пищевых цепях

2.1. Особенности питания дождевых червей

2.2.Пищевые предпочтения у дождевых червей по отношению к микроорганизмам

2.3.Уровень потребления микроорганизмов у дождевых червей

2.4.Микроорганизмы как основная и дополнительная пища дождевых червей

2.5.Дрилосфера

3.Активность пищеварительной среды на микроорганизмы

3.1.Судьба микроорганизмов при прохождении пищеварительного тракта дождевых червей

3.2. Ингибирование роста (влияние целомической жидкости червей Eisenia fetida

3.3.Трофическая деятельность дождевых червей и распределение микроорганизмов в почвенном профиле

3.4.Вклад дождевых червей в продукционный процесс почвенных микроорганизмов

3.5.Трофическая деятельность дождевых червей и генетический обмен между бактериями в почве

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Объекты

1.1.Почва

1.2.Дождевые черви

1.3. Микроорганизмы

2.Методы

2.1 .Выращивание бактерий

2.2.Протеолитическая активность

2.3.Наличие факультативных анаэробов

2.4.Получение пищеварительной жидкости 64 2.5.0пределение выживаемости бактерий

2.6.Микроскопия клеток

2.7.Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.8.Фракционирование кишечной жидкости 68 2.9.0пределение белка по Бредфорду

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 69 1.Характеристика микробного сообщества и ферментативной активности пищеварительного тракта дождевых червей Aporrectodea caliginosa 69 2.Оценка биологической активности пищеварительной среды червей по отношению к микроорганизмам 72 3.Характеристика действующих компонентов пищеварительной жидкости червя Aporrectodea caliginosa и Pachyiulus flavipes

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы"

Актуальность

Дождевые черви - активные регуляторы жизни микробного сообщества почв. Взаимодействия дождевых червей и микроорганизмов важны для протекания таких почвенных процессов как разложение и трансформация растительных остатков, образование гумуса, формирование пула питательных элементов и микробных сообществ. Широкий спектр этих взаимодействий позволяет говорить о тесной связи червей с микроорганизмами. Предполагается, что микроорганизмы являются основным источником пищи для червей (Edwards, Fletcher, 1988, другие). Дождевые черви воздействуют на микроорганизмы косвенно, модифицируя среду обитания (Тиунов, 2007; Persson, Lohm, 1977; Petersen, Luxton, 1982; Brussaard, 1998; Lavelle, Spain, 2001; Wardle, 2002). Но есть и прямой механизм. Это - пассаж почвы через пищеварительный тракт. Потребляя почву, дождевые черви регулируют рост почвенных микроорганизмов, выедая одни и создавая благоприятные условия для роста других микробных популяций в пищеварительном тракте и в экскрементах. При пассаже меняются состав, обилие и активность микроорганизмов (Третьякова и др., 1996; Вызов, 2005; Тиунов, 2007; Parle, 1963; Hanlon, 1981; Fisher et al., 1995; Schonholzer et al., 1999; Tiunov, Scheu, 1999; 2000). Каков биохимический механизм воздействия пищеварительной среды червей на микробные популяции пока не известно.

В последние годы все больший интерес вызывают биологически активные вещества дождевых червей, влияющие на рост микроорганизмов. Они содержатся в целомической жидкости, поверхностном мукусе, в экстрактах из гомогенатов тканей. Выявлены антибактериальная, антигрибная и другие активности (Balamurugan et al., 2006; Fiolka, 2006; Shobha, Kale, 2006; Zhenjun Sun et al., 2006). Можно предположить, что и в пищеварительном тракте у червей есть вещества, действующие на микроорганизмы и являющиеся причиной изменения микробного сообщества при пассаже через пищеварительный тракт. Ранее в кишечной жидкости почвенных многоножек обнаружена селективная активность по отношению к бактериям и грибам. Показано, что переваривание микроорганизмов в кишечнике многоножек начинается с быстрой гибели клеток под действием специфических киллерных агентов, имеющих небелковую природу (Вызов, Рабинович, 1997; Byzov et al., 1998). Подобных исследований для дождевых червей не проводилось. Эти знания полезны, так как селективный отбор микроорганизмов в кишечнике червей может быть значимым фактором формирования микробных сообществ в почве. С практической точки зрения важно знать, популяции каких микроорганизмов, полезных или вредных, получают преимущество в кишечнике червей.

Цель

Определение особенностей воздействия пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы. Задачи

2. Оценка биологической активности пищеварительной среды червей по отношению к микроорганизмам.

3. Характеристика действующих компонентов пищеварительной жидкости червей.

Научная новизна

Практическая значимость

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Хомяков, Никита Владимирович

выводы

1. Функциональная характеристика кишечных изолятов доказывает существование сообщества бактерий кишечного тракта червей.

2. Впервые обнаружен эффект быстрой гибели микроорганизмов в пищеварительной жидкости червей, что необходимо для эффективной утилизации микробов как пищи.

4. Впервые исследованы киллерные вещества в пищеварительной жидкости дождевых червей.

5. Доказано, что киллерный агент является низкомолекулярным органическим веществом небелковой природы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

2. Byzov В. A., Khomyakov N.V., Kharin S.A., Kurakov A.V. Fate of soil bacteria and fungi in the gut of earthworms // European Journal of Soil Biology, 2007, Vol. 43, pp. 149-156.

3. Byzov B.A., Khomyakov N.V. The sensitiveness of soil bacteria at the digestive fluid in the gut of the earthworm Aporrectodea caliginosa H Abstracts the 8th International Symposium on earthworm ecology, 41Ь-9Л September 2006, Krakov, Poland, p. 118.

5. Хомяков Н.В., Добровольская Т.Г. Нечитайло Т.Ю. Голышин П.Н,

Вызов Б А. Судьба бактерий в кишечнике дождевых червей //

Материалы Международной научной конференции к 90-летию

Ростовского государственного университета (Ростов-на-Дону. 21-22 апреля 2005 г.). "Экология и биология почв". Изд-во "Ростиздат". Ростов-на-Дону 2005 г. с. 523-529.

7. Khomyakov N.V., Byzov В.А. The microbicidal activity of the earthworm gut extracts // Abstracts XIVth International Colloquium on Soil Zoology and Ecology. At the Universite de ROUEN - Mont Saint Aignan. France, 2004. pp. 120.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые обнаружен эффект быстрой гибели почвенных бактерий в пищеварительной жидкости дождевых червей. Кишечная жидкость дождевых червей агрессивна по отношению к микроорганизмам. Реакция бактерий различна - от гибели до стимуляции роста. Реакция бактерий проявляется на штаммовом уровне. Действие пищеварительной жидкости, вероятно, связано с веществами небелковой природы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хомяков, Никита Владимирович, Москва

1. Атлавините О.П. Влияние дождевых червей на агроценоз. Вильнюс, 1990. 177 с.

2. Атлавините О.П., Ванагас И., Вишняускас А.К. Значение дождевых червей в процессе деструкции органических отходов и трансформации тяжелых металлов в почве и растениях. Деструкция органического вещества в почве. Вильнюс. 1984. С. 10-14.

3. Варне Р., Кейлоу П, Олив П., Голдинг Д. Беспозвоночные. Новый обобщенный подход. М.: Мир. 1992. 583 с.

4. Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К. Экология. Особи, популяции и сообщества. М.: Изд-во Мир. 1989. Т. 1. 667 с.

5. Битюцкий Н.П., Лапшина И.Н., Лукина Е.И., Соловьева А.Н., Пацевич В.Г., Выговская А. А. Роль дождевых червей в минерализации соединений азота в почве// Почвоведение. 2002. № 10. С. 1242-1250.

6. Вызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве. Автореф. дисс. . докт. биол. наук. М.: Изд-во Макс Пресс. 2003. 52 с.

7. Звягинцев Д.Г., Паников Н.С., Горбенко А.Ю. Количественная оценкавлияния беспозвоночных животных на рост микроорганизмов в почве //

8. Почвенная фауна и почвенное плодородие. Труды 9 Международного коллоквиума по почвенной зоологии (под ред. Б.Р. Стригановой). М.: Изд-во Наука. 1987. С. 63-67.

9. Карпачевский Л. О. Почвы как зеркало ландшафта. М.: Изд-во Мысль, 1983.154 с.

10. Козловская JI.C. Роль почвенных беспозвоночных в трансформации органического вещества болотных почв. Д.: Изд-во Наука. JIO. 1976. 211 с. Козловская Л. С. Разложение растительных остатков в почве. М.: Изд-во Наука. 1985. С. 110-131.

11. Кудеяров В.Н. Цикл азота в почве и эффективность удобрений // М.: Изд-во Наука. 1989. 216 с.

12. Манаенков И.В., Зубкова Т.А., Карпачевский Л. О. Механическая прочность почвенных агрегатов разной формы // Почвоведение. 1997. № 12. С. 14381444.

13. Марфенина О.Е. Влияние дождевых червей на микроскопические грибы как деструкторы органических веществ в почве // Деструкция органических веществ в почве. Вильнюс. 1989. С. 104-108.

14. Марфенина О.Е., Игценко И.А. Избирательность дождевых червей по отношению к почвенным микроскопическим грибам // Известия РАН. сер. биологическая. 1997. № 4. С. 504-506.

15. Мирчгтк Т.Г. Почвенная микология. М.: Изд-во МГУ, 1988. 219 с. Мозговая И.Н. Судьба энтомопатогенных бацилл в почве. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. М.: Изд-во МГУ. 2001. 24 с.

16. Олейник А. С., Битюцкий Н.П., Вызов Б.А. Влияние экскретов дождевых червей Aporrectodea caliginosa на дыхание и нитрификацию в почве // Материалы Международной научной конференции "Экология и биология почв". Ростов. 2005. С. 367-371.

17. Стебаев И.В. Зоомикробиологические комплексы в биогеоценозах // Почвенные организмы как компоненты биогеоценоза, М.: Изд-во Наука.1984. С. 3-15.

18. Стриганова Б.Р. Питание почвенных сапрофагов. М.: Изд-во Наука. 1980. 244 с.

19. Стриганова Б.Р., Марфенина О.Е., Пономаренко В.А. Некоторые новые аспекты влияния дождевых червей на почвенные грибы // Известия АН СССР. сер. биология. 1988. № 5. С. 715-719.

20. Тиунов А.В. Влияние дождевых червей Nicodrilus caliginosus на нитрификацию в дерново-подзолистых почвах // Деструкция органического вещества в почве. Вильнюс. 1989. С. 172-176.

21. Тиунов А.В. Применение аппликационного метода для оценки биологической активности в дрилосфере // Известия РАН. сер. биологическая. 1993. № 2. С. 264-270.

22. Тиунов А.В., Добровольская Т.Г., Полянская Л.М. Микробное сообщество стенок нор дождевых червей Lumbricus terrestris L. // Микробиология. 1997. Т. 66. С. 41-420.

23. Aldag R., Graff О. N-fraktionen in Regenwurmlosung und deren ursprungsboden // Pedobiologia. 1975. V. 15. P. 151-153.

24. Anderson J.M. Ecology of Microbial Communities. M. Fletcher, (Ed.),

25. Cambridge University Press, 1987. P. 125-133. Anderson J.M., Bignell D.E. Bacteria in the food, gut contents and faeces of the litter feeding millipede Glomeris marginata // Soil Biol. Biochem. 1980. V. 12. P. 251-254.

26. Appelhof M. Household scale vermicomposting. Workshop on the role of earthworms in the stabilization of organic residues. Kalamazoa. Michigan. 1981. № 1. P. 232.

27. Barley K.P., Jennings A. C. Earthworms and soil fertility // Austr. J. Agric. Res. 1959. N 10. P. 364-370.

28. Barois I., Villemin G., Lavelle P., Toutain F. Transformation of soil structure through Pontoscolex corethrurus (Oligochaeta) intestinal tract // Geoderma. 1993. V. 56. P. 57-66.

29. Bohlen P.J., Parmelee R.W., Allen M.F., Ketterings Q.M. Differential effects of earthworms on nitrogen cycling from various nitrogen-15labelled substrates // Soil Sci. Soc. Amer. J. 1999. V. 63. P. 882-890.

30. Bouche M.B. Action de la faune du sol sur les etats de la matiere organique dans les ecosystems // Humification et biodegradation. G. Kilbertus et al. (eds.). Pierron. 1975. P. 157-168.

31. BrUsewitz G. Untersuchungen uber den Einfluss des Regenwurmes auf Zahl, Art und Leistungen von Microorganismen im Boden I I Naturwissenschaft. 1959. V. 46. N4. P. 155-156.

32. Byzov B.A., Polyanskaya L.M., Vu Nguyen Thanh. Applying of yeasts as growth stimulators for the earthworm Eisenia fetida // Acta Zool. Fennica. 1995. N 196. P. 376-379.

33. Byzov B.A., Chernjakovskaya T.F., Zenova G.M., Dobrovolskaya T.G. Bacterial communities associated with soil diplopods // Pedobiologia. 1996. V. 40. P. 6779.

34. Casalicchio G., Graziano P.L. A comparison of the chemical properties of composts and worm casting from solid municipal waste and sewage sludge // On Earthworm. Selected Symposium and monographs U.Z.I. 2. Mucchi. Modena. 1987. P. 419-457.

35. Citernesi V., Neglia R., Serriti A., Lepidi A.A., Filippi C., Bagnili C., Nuti M.P., Galluzii R. Nitrogen fixation in the gastroenteric cavity of soil animals // Soil Biol. Biochem. 1977. N 9. P. 71-72.

36. Clewell D.B. Movagenetic elements and antibiotic resistance in enterococci // European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 1990. N 9. P. 90-102.

37. Cooke R.C. The ecology of nematode-trapping fungi in soil // Ann. Appl. 1983. V. 50. P. 507-513.

38. Dash N.K., Behera N., Dash M.C. Gut load, transit time, gut microflora and turnover of soil, plant and fungal material by some tropical earthworms // Pedobiologia. 1986. V. 29. P. 13-20.

39. De Ruiter P., Neutel A.-M., Moore J.C. Soil food web interactions and modeling

40. In: Fauna in soil ecosystems. Recycling processes, nutrient fluxes andagricultural production, G. Benckiser, (Ed.). 1997. P. 363-386.

41. Dkhar M.S., Mishra R.R. Microflora in the gut contents of the earthworm

42. Amynthas diffringens Baird.) // J. Phytol. Res. 1991. V. 4. P. 155-159.

43. Domshe K.H., Banse M. Mykologische Untersuchungen Am Regenwurm

44. Exkrementen // Soil Biol. Biochem. 1972. V. 4. P. 31-38.

45. Doube B.M., Ryder M.H., Davoren C.W., Meyer T. Earthworms: a down-under delivery service for biocontrol agents of root disease // Acta Zool. Fenn. 1995. V. 196. P. 219-223.

46. Edwards C.A., Fletcher K.E. Interactions between earthworms and microorganisms in organic matter breakdown // Agriculture, Ecosystem and Environment 1988. V. 24. N 1-3. P. 235-247.

47. Edwards C.A., Lofty J.R. Biology of Earthworms. 1977. Chapman & Hall, London.

48. Ehlers W. Observations on earthworm channels and infiltration on tilled and unfilled loess soil // Soil Sci. 1975. V. P. 242-249.

49. FerruzziK. Manuale del Lombricontrole. Bologna, 1984. 121 p.

50. Guggenberger G., Thomas R.J., Zech W. Soil organic matter within earthworm casts of an anecic-endogeic tropical pasture community, Colombia // Appl. Soil Ecol. 1996. N3. P. 263-274.

51. Haimi J., Huhta V. Effects of earthworms on decomposition process in raw humus forest soil. A microcosm study // Biol. Fertil. Soils. 1990. N 10. P. 178183.

52. Haimi J., Hunta V. Comparison of composts produced from identical wastes by "vermistabilization" and conventional composting // Pedobiologia. 1987. V. 30. P. 137-144.

53. Hanlon R.G.D. Some factors influencing microbial growth on soil animal faeces // Pedobiologia. 1981. V. 21, N 3/4. P. 257-263.

54. Hanlon R.D.G., Anderson J.M. Influence of macroarthropod feeding activities on microflora in decomposing oak leaves // Soil Biol. Biochem. 1980. № 12. P. 255261.

55. Hartenstein R. Assimilation by the earthworm Eisenia foetida // Earthworm Ecology from Darwin to Vermiculture. J.E. Satchell (Ed.). London. New-York. 1983. P. 297-308.

56. Hartenstein R. Earthworm biotechnology and global biogeochemistry //

57. Advanced Ecological Researches. 1986. V. 15. P. 379-409.

58. Hartenstein R., Leaf A.L., Neuhauser E.T. Decomposition of the earthworm

59. Eisenia foetida and assimilation 15 elements from sludge during growth.

60. Comparative Biochemistry and Physiology. 1980. V. 66. P. 187-192.

61. Hartenstein Т.Е., Hartenstein R. Gut load and transit time in the earthworm

62. Eisenia foetida// Pedobiologia. 1981. V. 22. N 1. P. 5-20.

63. Hatanaka K., Ishioka I., Feruichi E. Cultivation of Eisenia foetida using dairywaste sludge cake // In: Earthworm Ecology from Darwin to vermiculture. J.E.

64. Satchell (Ed.). London-New York. 1983. P. 323-329.

65. Hendriksen N.B. The effects of earthworms on dispersal and survival of a bacterium Aeromonas hydrophila // Soil Organisms and Soil Health. Proceeding XII International Colloquium on Soil Zoology. Jyvaskyla. 1992. P. 31.

66. Hoffman J.A., Purdy L.H. Gemination of dwart bunt (Tilleta controversa) teliospores after ingestion by earthworms // Phytopathology. 1964. V. 54. P. 878879.

67. Horner S.G., Abrams B.I. Decomposition of sewage sludge in drying beds and the potential role of the earthworms Eisenia foetida // J.Envir. Quality. 1980. N 9. P. 373-378.

68. Huhta V., Haimi J., Setala H. Role of the fauna in soil processes: techniques using simulated forest floor // Agriculture, Ecosystems and Environment. 1991. V. 34. P. 223-229.

69. Hunter B.A., Johnson M.S., Thompson D.J. Ecotoxicology of cooper and cadmium in a contaminated grassland ecosystem // J. Appl. Ecol. 1987. V. 24. N 2. P. 587-599.

70. Kauschke Е., Mohrig W. The occurrence of bacterioagglunating,i\hemoagglunating and hemolytical compounds in the coelomic fluid of different species of European earthworms (Annelida, Lumbricidae) // Zool. Physiol. Tiere. 1987. V.91.N4. P. 467-477.

71. Keogh R.G. Lumbricid earthworm activities and nutrient cycling in pasture ecosystems // Proceeding of the 2nd Australian Conference on Grassland Invertebrate Ecology. Т.К. Crosby. R.P. Pottinger. (eds.). Government Printer. Wellington. 1979. P. 49-51

72. Academic Press (Harcourt Brace Jovanovich, Publishers), Sydney-Orlando-San

73. Diego-New York-London-Toronto-Montreal-Tokyo. 1985. 411 p.1.e K.E., Pankhurst C.E. Soil organisms and sustainable productivity // Austr. J.

74. Macfadyen A. The contribution of soil fauna to total soil metabolism // Soil Organisms. J. Doeksen, J. Van der Drif, (eds.). North-Holland, Amsterdam. 1963. P. 3-17.

75. Makeschin F. Earthworms (Lumbricidae: Oligochaeta): Important promoters of soil development and soil fertility // Fauna in soil ecosystems. Recycling processes, nutrient fluxes and agricultural production. G. Benckiser (Ed.). 1997. P. 173-223.

76. Marinissen J. C. Y., Dexter A.R. Mechanisms of stabilization of earthworm casts and artificial casts // Biol. Fertil. Soils. 1990. N 9. P. 163-167.

77. Maxwell R. A., Coleman D. C. Seasonal dynamics of nematode and microbialЛbiomass in soils of riparian-zone forests of the Southern Appalachians // Soil Biol. Biochem. 1995. V. 27. N 1. P. 79-84.

78. Mengel K. Turnover of organic nitrogen in soils and its availability to crops // Plant and Soil. 1996. V. 181. P. 83-96.

79. Miles H.B. Soil protozoa and earthworm nutrition. Soil Science. 1963. V. 95. P. 407-409.

80. Mozgovaya I.N., Byzov B.A., Ryabchenko N.F., Romanenko N.D., Zvyagintsev D. G. Nematicidal effects of the entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis in soil 11 Pedobiologia. 2002. V. 46. N 6. P. 558-572.

81. Muscolo A., Bovalo F., Gionfriddo F. Nardi S. Earthworm humic matter produces auxin-like effects on Daucus carota cell growth and nitrate metabolism // Soil Biol. Biochem. 1999. V. 31. N 9. P. 1303-1311.

82. Neuhauser E.F., Kaplan D.L., Malecki M.R., Hartenstein R. Materials supportingweight gain by the earthworm Eisenia fetida in waste conservation systems // Agricultural Wastes. 1980. N 2. P. 43-60.

83. Orazova M.Kh. Semenova T.A., Tiunov A.V. The microfungal community of Lumbricus terrestris middens in a linden (Tilia cordata) forest // Pedobiologia. 2003. V. 47. P. 27-32.

84. Pagliani A. Allevamento intensivo del lumbrico. Edagricile. 1982. 42 p. Parkin T.B., Berry E.C. Nitrogen transformation associated with earthworm casts // Soil Biol. Biochem. 1994. V. 26. P. 1233-1238.

85. Parkin T.B., Berry E.C. Microbial nitrogen transformations in earthworm burrows // Soil Biol. Biochem. 1999. V. 31. P. 1765-1771.

86. Parle J.N. A microbial study of earthworms casts // J. General Microbiol. 1963. V.31.P. 13-22.

87. Parmelee R. W., Crossley Jr. Earthworm production and role in the nitrogen cycle of a no-tillage agroecosystem on the Georgia piedmont // Pedobiologia. 1988. V. 32. P. 353-361.

88. Piearce T.G. Gut contents of some Lumbricid earthworms // Pedobiologia. 1978. V. 18. P. 153-157.

89. Piearce T.G., Phillips M.J. The fate of ciliates in the earthworm gut an in vitro studies //Microbiol. Ecol. 1980. N 5. P. 313-320.

90. Pincince A.B., Donovan J.F., Bates J.E. Vermicomposting of municipal sludge: an economical stabilization alternative // Sludge. 1980. N 3. P. 26-30.f

91. Pokarzhevskii A.D., Zaboev D.P., Ganin G.N., Gordienko S.A. Amino acids inftearthworms: are earthworms ecosystemivorous? // Soil Biol. Biochem. 1997. V. 29, N 3/4. P. 559-567.

92. Ponomareva S.I. The influence of the activity of earthworms on the creation of a stable structure in a sod-podzolized soil // Trudy Pochvennogo Instituta im. V.V. Dokuchaeva. 1953. V. 41. P. 304-378.

93. Reinecke A. J., Venter J.M. Moisture preferences, growth and reproduction of the compost worm Eisenia foetida (Oligochaeta) // Biol. Fertil. Soils. 1987. N 3. P. 135-141.

94. Satchell J.E. Lumbricidae // Soil Biology. A. Burge, F. Raw, (eds.) Academic press. London. 1963. P. 259-322.

95. Satchell J.E. Earthworm microbiology // Earthworm ecology from Darwin to vermiculture. London, New-York. 1983. P. 351-364.

96. Scheu S. The influence of earthworms (Lumbricidae) on the nitrogen dynamics inthe soil litter system of a deciduous forest// Oecologia. 1987. V. 72. P. 197-201.

97. Schdnholzer F., Hanh D., Zeyer J. Origins and fate of fungi and bacteria in the gut of Lumbricus terestris L. studied by image analysis // FEMS Microbiol. Ecol. 1999. V. 28 (3). P. 235-248.

98. Stotzky G., Babich H. Fate of genetically-engineered microbes in natural environments // Recombinant DNA Technology Bulletin. 1984. V.7. N 4. P.163-188.

99. Syers J.K., Sharpley A.N., Kceney D.R. Cycling of nitrogen by surface-casting earthworm in a pasture ecosystem. // Soil Biol. Biochem. 1979. V. 11. P. 181— 185.

100. Tiunov A., Scheu S. Microbial respiration, biomass and nutrient status in burrow walls of Lumbricus terrestris L. (Lumbricidae) // Soil Biol. Biochem. 1999. V. 31.2039-2048.

101. Tiunov A.V. Scheu S. Microfungal communities in soil, litter and casts of Lumbricus terrestris L. (Lumbricidae): a laboratory experiment // Appl. Soil Ecol. 2000. V. 14. P. 17-26.

102. Tiunov A.V., Bonkowski M, Bonkowski M, Tiunov J.A., Scheu S. Microflora, protozoa and nematoda in Lumbricus terrestris burrow walls: a laboratory experiment // Pedobiologia. 2001. V. 45. N 1. P. 46-61.

103. Tracey M V. Cellulase and chitinase of earthworms. Nature. 1951. N 176. P. 776777.

104. Waugh J.H., Mitchell H.J. Effect of the earthworm Eisenia foetida, on sulfur speciation and decomposition in sewage sludge // Pedobiologia. 1981. V. 22. P. 268-275.

105. Wellington, E.M.H., Herron, P.R., Cresswell, N. Gene transfer in terrestial environments and the survival of bacterial inoculants in soil // Monitoring genetically manipulated microorganisms in the environment, C.A. Edwards (ed.). 1993. P. 137-170.

106. ZhangB.G., Li G.T., Shen T.S., WangJ.K., Sun Z. Changes in microbial biomass C, N, and P and enzyme activities in soil incubated with the earthworms Metaphire guillelmi or Eisenia fetida. Soil Biol. Biochem. 2000. V. 32. N 14. P. 2055-2062.

107. Zhang H, Schrader S. Earthworm effects on selected physical and chemical properties of soil aggregates // Biol. Fertil. Soils. 1993. V. 15. N 2. P. 229-234.

Информация о работе

Хомяков, Никита Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Действие пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы