Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие ионизирующего излучения и пептидного биорегулятора эпиталона на кинетику роста и функциональную морфологию саркомы М-1

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Действие ионизирующего излучения и пептидного биорегулятора эпиталона на кинетику роста и функциональную морфологию саркомы М-1"

ФОМИНА Наталья Константиновна

ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ПЕПТИДНОГО БИОРЕГУЛЯТОРА ЭПИТАЛОНА НА КИНЕТИКУ РОСТА И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ МОРФОЛОГИЮ САРКОМЫ М-1

03 00 01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск - 2007

1 9 ИЮП

003064284

Работа выполнена в лаборатории радиационной патоморфологии ГУ «Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук»

Научный руководитель: кандидат медицинских наук

Южаков Вадим Васильевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Курпешев Оразахмет Керимбаевич,

доктор биологических наук Спирин Евгений Викторович

Ведущая организация: ГУ — Российский онкологический научный центр им Н Н Блохина РАМН

Защита состоится « 25 » сентября 2007 г в И00 часов на заседании диссертационного совета Д 001 011 01 в ГУ «Медицинский радиологический научный центр РАМН» (249036, г Обнинск, ул Королева, д 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Медицинский радиологический научный центр РАМН»

Автореферат разослан « у »

Учекьгй секретарь диссертационного совета

Палыга Г Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одной из актуальных задач современной радиобиологии и онкологии является поиск оптимальных методов лечения злокачественных новообразований, оценка эффективности их действия и изучение механизмов индивидуальной чувствительности опухолей к лечебным воздействиям

До настоящего времени одним из основных способов лечения в онкологии остается лучевая терапия Главной задачей лучевой терапии является уничтожение максимального числа опухолевых клеток при наименьшем поражении окружающих нормальных тканей [Ярмоненко С П , Вайнсон А А , 2004] Несмотря на совершенствование методов лучевой терапии и достижения в области онкологической радиобиологии, прогнозировать реакцию опухолей на радиационное воздействие достаточно сложно Особое внимание уделяется возможностям применения в лучевой терапии радиомодифицирующих веществ, способных повышать эффективность радиационного воздействия на злокачественные опухоли до, во время и после облучения

Одним из перспективных современных направлений является биотерапия опухолей с применением регуляторных пептидов [Анисимов В Н , Хавинсон В X,1993, Хавинсон ВХ, Анисимов ВН, 2003] Ранее полученные нами данные об ингибирующем действии синтетического биорегулятора э питал она на пролиферативную активность клеток свидетельствуют о целесообразности испытания этого пептида в качестве потенциального противоопухолевого препарата [Хавинсон В X и др , 2001]

Благодаря открытиям в области клеточной и молекулярной биологии злокачественного роста появилась возможность применения в радиобиологических исследованиях различных маркеров, отражающих пролиферативную активность, функциональное состояние и гибель опухолевых клеток Применение этих чувствительных методов требует стандартизации количественной оценки морфофункциональных показателей для анализа кинетических параметров ответа новообразований на облучение при разработке схем лучевой и комбинированной терапии на экспериментальных моделях опухолевого роста

В последние годы важный аргументированный блок для описания биологических явлений на количественном уровне, являющийся необходимой предпосылкой для математических моделей динамических структур и процессов в клетке, обеспечивает компьютерный анализ изображений

Цель н задачи исследования

Целью данного диссертационного исследования является изучение структурно-функциональных особенностей экспериментальной опухоли саркомы М-1 при радиационном повреждении и введении синтетического пептида - эпиталона с использованием компьютерного анализа микроскопических изображений

В соответствии с указанной целью были сформулированы и последовательно решены следующие задачи

1 Изучить параметры кинетики роста саркомы М-1 на фоне действия гамма-облучения, при введении эпиталона и при их сочетанном воздействии

2 Исследовать основные закономерности действия гамма-излучения и эпиталона на морфо-функциональные характеристики саркомы М-1

3 По критериям пролиферативной активности и индуцированной гибели опухолевых клеток оценить возможность применения эпиталона в комплексных методах терапии злокачественных новообразований

Научная новнзна работы

Впервые по материалам морфо-функциональных исследований, основанных на применении высокочувствительных методов гистохимии, иммуногистохимии и морфометрии, создана количественная база данных для быстрорастущей соединительно-тканной опухоли саркомы М-1

На основе данных компьютерного анализа в периферической зоне, определяющей рост опухолей, рассчитана фракция пролиферирующих клеток по индексу РСЫА и уровень спонтанной гибели по индексу апоптоза, а также изучены параметры пролиферативной активности и индуцированной гибели опухолевых клеток при действии ионизирующего излучения, синтетического пептида - эпиталона и их сочетанном применении

Установлено, что пептидный биорегулятор «эпиталон» замедляет рост саркомы М-1, а морфологическим эквивалентом ингибирующего действия препарата является развитие некроза опухолей и усиление апоптотической гибели опухолевых клеток Согласно результатам проведенных исследований, по механизму действия, эпиталон можно отнести к классу модификаторов биологических реакций, а его основной эффект, по-видимому, реализуется через сосудистое русло опухолей

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволили выяснить особенности действия ионизирующего излучения и пептидного препарата на радиорезистентную опухоль саркому М-1 Эти сведения свидетельствуют о противоопухолевой активности эпиталона, что открывает возможность его применения в комплексных методах противоопухолевой терапии

Метод количественной оценки морфо-функциональных параметров экспериментальной опухоли саркомы М-1 показал принципиальную возможность его использования в комплексном исследовании радиорезистентных опухолей для объективизации диагностики и разработки критериев прогноза Новые данные о действии гамма-излучения и пептидного биомодулятора на клеточное микроокружение, пролиферативную активность и апоптоз клеток саркомы М-1 могут быть использованы как базовые для дальнейших экспериментальных исследований

Результаты исследований показали, что автоматизированные методы компьютерного анализа изображений позволяют стандартизировать количественную оценку экспрессии маркеров, используемых в онкорадиобиологии, и расширяют возможность получения объективных данных, необходимых для оценки дисбаланса между процессами пролиферации и индуцированной гибели при разработке схем лучевой и комбинированной терапии на экспериментальных моделях опухолевого роста

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Компьютерный анализ микроскопических изображений позволил установить основные закономерности действия гамма-облучения и синтетического пептида «эпиталона» на функциональную морфологию саркомы М-1

2 Радиационно-индуцированный апоптоз является важным фактором, который обеспечивает результативность действия гамма-облучения на радиорезистентную форму экспериментальной опухоли - саркому М-1

3 Пептид «эпиталон» достоверно замедляет рост саркомы М-1 Вместе с тем, на фоне деструктивных изменений в паренхиме опухолей, вызванных гамма-облучением, значимый аддитивный онкомодифицирующий эффект эпиталона не регистрируется

Апробация и реализация результатов исследования

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на V Всероссийском съезде онкологов (Казань, 2000), IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), международной междисциплинарной конференции «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» («НБИТТ-21») (Петрозаводск, 2002), Международном экологическом форуме «Окружающая среда и человек» (Санкт-Петербург, 2003), Всероссийской конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005) Результаты диссертации используются в научно-практической работе ГУ МРНЦ РАМН

Диссертация апробирована на научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ МРНЦ РАМН 7 03 2007 г (протокол № 223)

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы Текст диссертации изложен на 162 страницах, включающих 47 рисунков и 2 таблицы Список литературы содержит 281 источник, из них отечественных —96, зарубежных — 185

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Работа выполнена на 90 самцах белых беспородных крыс в возрасте 3-х мес, имеющих массу тела 180 - 200 г В качестве объекта исследования использовали перевиваемый штамм саркомы М-1 На 11 сут после перевивки 60 животных с опухолевыми узлами правильной формы были распределены на 4 группы по 15 крыс 1 - контроль, 2 - у-облучение опухолей в дозе 30 Гр, 3 -введение эпиталона, 4 - у-облучение опухолей в дозе 30 Гр + введение эпиталона Животные с «нестандартными» опухолями были дополнительно включены в 1 и 2 группы для изучения особенностей гистоархитектоники саркомы М-1 в экспоненциальной фазе роста и определения степени лучевой инактивации опухолевых клеток через 3 ч, 1 и 3 сут после у-облучения

Размеры опухолей определяли 2-3 раза в неделю и рассчитывали их объем по формуле эллипсоида Коэффициент роста опухолей определяли по формуле КРО = (Vt35- Vti6)/Vtie, где Vt35 и Vt\6- объемы опухолей на 35 и 16 сут после имплантации

Местное однократное у-облучение опухолей животных 2-й и 4-й групп выполнено на кобальтовой установке «Луч» при мощности дозы 0,8 Гр/мин Облучение проведено на 16 сут роста опухолей Острые JIPK над опухолью оценивали на 10 сут после у-облучения по упрощенной системе баллов На 18 сут роста саркомы животным 3-й и 4-й групп начали вводить эпиталон К этому сроку средний объем опухолей в контрольной группе достиг 1 см3 Препарат вводили внутрибрюшинно по 0,5 мкг на животное семь дней подряд

По динамике и дивергенции линий роста опухолей в испытуемых группах был определен срок для гистологического изучения саркомы На 26 сут роста опухолей (10 сут после у-облучения во 2-й и 4-й группах, 2 сут после окончания введения эпиталона в 3-й и 4-й группах) в каждой группе было отобрано по 5 крыс Выведение животных из опыта и выделение опухолей проведено под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) Кусочки опухолей фиксировали 24 ч кислой жидкостью Буэна для светомикроскопических исследований и по Карновскому для электронной микроскопии Обезвоженный материал заливали, соответственно, в парапласт и эпон

Микротомные срезы толщиной 7 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma) Общую гистологию саркомы изучали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином и по Ван-Гизон Тучные клетки селективно окрашивали 1% раствором толуидинового синего (Fluka) в 0,5 М НС1 при рН 0,5 [Enerback L et al, 1986] Ультраструктурные исследования проводили в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL) на ультратонких срезах, контрастированных уранилацетатом и цитратом свинца Тип клеток идентифицировали способом серийных полутонких - ультратонких срезов Полутонкие срезы окрашивали по методу Humphrey, Pittman (1974)

Иммуногистохимические исследования проводили с использованием мышиных моноклональных антител к PCNA (1 50, Calbiochem), серотонину (1 15, DAKO) и АБП набора для выявления мышиных иммуноглобулинов (Vectastain) Адгезионную связь клеток саркомы с базальной мембраной эндотелия сосудов и их способность к локальной инвазии изучали с помощью кроличьих антител к ламинину и БСП комплекса для кроличьих иммуноглобулинов (Sigma) Для изучения перифокального иммунного ответа применяли набор для выявления крысиных иммуноглобулинов (BioGenex)

Функциональную активность опухолевых клеток изучали методом импрегнации ядрышковых организаторов в модификации [Мамаев Н Н и др , 1984] Апоптотические клетки визуализировали на препаратах, импрегнированных по методу Мозера [Moser В А , 1995]

Морфометрические исследования выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений IMSTAR (Франция) с применением прикладных компьютерных лицензионных программ Morphostar-2 и Colquant-2 Для каждого животного подсчет соответствующих структур проводили в 10-20 визуальных тестовых полях по трем срезам каждой исследуемой опухоли Аг для ядер опухолевых клеток и определения индекса PCNA составляла 0,5 мм2 и включала не менее 2000 опухолевых клеток в препаратах контрольной группы Ат для AgNOR = 0,3 мм2 и включала не менее 1000 ядрышковых организаторов Индекс апоптоза и митотический индекс подсчитывали в 60 полях при иммерсионном увеличении микроскопа Общая тестируемая площадь включала не менее 1000 ядер опухолевых клеток

Параметры роста опухолей определяли по 10 животным В 1-й и 3-й группах опухоли измеряли до гибели всех крыс, во 2-й и 4-й -на протяжении 8 недель Для изучения скорости прироста опухолей за определенный период времени вычисляли среднюю геометрическую G(ti.tn) V(tn) в

интервале времени ti-tn Скорость роста опухолей определяли по коэффициенту а из уравнений линий тренда Vt = V0 + at

Для статистической обработки полученных результатов использовали t-тест Стьюдента для малых выборок и непараметрический U-критерий Манн-Уитни

Результаты исследования и обсуждение

По нашим данным, для саркомы М-1 характерна выраженная зональная неоднородность количественной плотности опухолевых клеток, их пролиферативной активности по PCNA и апоптотической гибели Так, в участках солидного строения содержание апоптотических структур заметно выше, а интенсивность иммуноокрашивания ядер клеток саркомы на PCNA почти на 20% ниже по сравнению с опухолевыми клетками, которые располагаются в зоне роста новообразований и группируются вокруг отдельных сосудов По-видимому, апоптотическая гибель клеток саркомы М-1 и синтез

ядерного антигена пролиферирующих клеток достаточно чувствительны к концентрации поступающего в клетки кислорода, тек гипоксии

В связи с выраженным полиморфизмом гистоструктуры исследуемого штамма опухоли, нами были определены унифицированные критерии выбора тестовых полей для сравнительного анализа изучаемых параметров в подопытных группах, что, на наш взгляд, позволило добиться максимальной стандартизации полученных результатов (табл 1)

Таблица 1

Количественные характеристики исследованных параметров саркомы М-1 в контрольных и подопьгтных группах

Группы и срок исследован ия Ыок/ мм2 1рСКА (%) 1мит (%) 1дпопт (%) $яо мкм2 Ряо (%)

1-я (контроль), 16-18-е сут, п=3 4117±12 5 81,0±5,9 2,30±0,2 1 0,29±0,08 2,69+0,09 7,59+0,2 1

1-я (контроль), 26-е сут, п=5 4220180 76,5±2,6 2,2810,0 9 0,2810,03 2,7010,08 7,4010,1 8

2-я (у- облучение), 3 ч, п=3 4020±96 68,0±1,5 0,55±0,1 0 2,29±0,20 р2. <0,05 2,75+0,07 6,02+0,2 0

2-я (у- облучение), 1-е сут, п=3 3503±15 4 р2>1 < 0,05 69,3±3,0 (-) 1,97+0,24 р2, < 0,05 3,21+0,05 5,63+0,1 9

2-я (у- облучение), 3-й сут, п=3 1993±14 7р21 < 0,05 85,7±3,0 (-) 1,93+0,15 р2, < 0,05 3,29+0,04 р2. < 0,05 5,61+0,2 1

2-я (у- облучение), 10-е сут, п=5 3560±20 5 Р2 1 < 0,05 62,3+3,9 Р2 1 < 0,05 2,ЗШ,0 6 1,50+0,18 р21 <0,01 3,1010,02 р2,1 < 0,05 5,9010,1 4 Р2 1 < 0,01

3-я (действие 4230112 0 74,512,7 1,8910,1 1 0,67+0,13 Рз.1 <0,05 2,8010,03 7,3810,1 7

эпиталона), п=5

4-я (У облучение + эпиталон), п=5 3320+19 0 Р42> 0,05 61,1+3,8 2,07±1,1 6 Р42> 0,05 1,30+0,12 р42>0,05 2,98+DJO Р4 2 > 0,05 5,10+0,2 0 Р42> 0,05

(-) - большая часть митозов представлена патологическими формами

В конце экспоненциальной фазы роста саркомы М-1 в периферической зоне паренхимы, определяющей рост опухолей, плотность опухолевых клеток составляет 4200 ± 80 на 1 мм2, митотический индекс опухолевых клеток определен в 2,28 ± 0,09%, а индекс апоптоза почти на порядок ниже - 0,28 ± 0,03% По индексу соотношения (1с = 8,2) митотическая активность опухолевых клеток в 8 раз выше, чем их гибель путем апоптоза

По существующим представлениям основные закономерности скорости роста определяются балансом размножения, гибели и элиминации опухолевых клеток [Райхлин HT и др , 1996] Согласно современным представлениям идеальными маркерами пролиферации являются белки, постоянно присутствующие в клетке во всех фазах митотического цикла и быстро исчезающие при его завершении Поэтому в настоящее время для оценки пролиферативного статуса опухолевых клеток применяют иммуногистохимическое выявление ядерных белков (циклинов), принимающих участие в подготовке клеточного деления [Iatropoulos M J , Williams G M , 1996] При изучении клинического материала с этой целью наиболее часто применяется антиген Ki-67 [Пожарисский КМ и др, 2005] В экспериментальных исследованиях широкое распространение получил PCNA [Южаков В В и др, 2005, Conolly KM, Bogdanffy M S, 1993] Этот дополнительный белок к 8 и е полимеразам ДНК появляется в ядрах делящихся клеток в середине G, периода, максимальная экспрессия происходит в S фазе и постепенно снижается к концу периода G2 Фактически, иммунолокализация этого циклина позволяет выявить всю фракцию пролиферирующих клеток Полученные нами данные показали, что в саркоме М-1 фракция пролиферирующих клеток по индексу PCNA составляет 76,5 ±2,6%

Следует полагать, что при интегральной оценке степени прогрессии злокачественных новообразований учет фактора «потери» клеток является не менее важным, чем их способность к размножению Для опухолей основными факторами «потеря» являются некроз и апоптоз Полученные нами данные по митотическому и апоптотическому индексам отличаются от результатов других авторов [Абросимов АЮ, Скоропад ВЮ, 1991] Вариабельность этих показателей объясняется принципиально иным методологическим подходом, выбранным нами для изучения функциональной морфологии этой опухоли, и унифицированной системой подсчета клеток

По-видимому, для саркомы М-1, широко используемой в радиобиологических исследованиях, достаточно большое значение имеют и другие полученные нами результаты Так, несмотря на выраженный экспансивный характер роста саркомы М-1, признаков инвазии в сосуды и прорастания опухолевыми клетками соединительнотканной капсулы мы не обнаружили, что свидетельствует о невысокой склонности этого штамма к метастазированию Кроме того, отсутствие выраженной перифокальной воспалительной и иммунной реакции предполагает, что клетки саркомы М-1 обладают, по-видимому, высокой толерантностью к защитным иммунным реакциям организма

В целом, наши результаты показали, что саркома М-1 представляет низкодифференцированную соединительнотканную опухоль с высоким пролиферативным потенциалом и низким уровнем спонтанного апоптоза Судя по зонам ядрышковых организаторов, высокая функциональная активность опухолевых клеток направлена на интенсификацию процессов размножения

По существующим представлениям в интерфазных ядрах зоны ядрышковых организаторов представляют участки активной транскрипции рРНК [Morales A et al, 1996] В последние годы метод AgNOR для изучения зон ЯО предлагают применять для прогностической оценки эффективности предоперационной радиотерапии опухолей [Kinoshita Y et al, 1996] Многие исследователи ограничиваются определением лишь количества ядрышковых орга-шзаторов в ядре, производя подсчет среднего числа гранул серебра на одно ядро Однако есть данные и об измерении площади зон ядрышковых организаторов с использованием систем компьютерного анализа [Турбин Д А , Перевощиков А Г, 1998] Нами был введен дополнительный интегральный показатель, отражающий процентное содержание области ЯО в ядре Так в контроле в клетках саркомы М-1 средняя площадь одной зоны ЯО составила 2,7 ±0,08 мкм2, при интегральном содержании в ядре - 7,4 ±0,18%

Сравнительная оценка роста опухолей в группе контрольных животных и после гамма-облучения в дозе 30 Гр (рис 1,а) показала, что в течение первой недели после облучения наблюдается довольно быстрая частичная регрессия опухолей с последующим также достаточно быстрым увеличением их объемов в течение 2-4 сут Полученные результаты согласуются с данными литературы, согласно которым ускоренная репопуляция новообразований в первое время после ремиссии или регрессии объясняется двумя моментами увеличением пролиферативного пула опухолевых клеток в связи с реоксигенацией и в ряде случаев - снижением продолжительности клеточного цикла [Ярмоненко С П , Вайнсон А А , 2004] По-видимому, определенную роль в быстром увеличении размеров опухолей играет и отек в зоне облучения Именно в этот период в зоне радиационного воздействия начинает формироваться картина лучевого дерматита

Наши результаты изучения опухолей в ранние сроки после гамма-излучения показали, что индуцированная ионизирующей радиацией гибель опухолевых клеток идет по «стандартной схеме», однако лучевая инактивация саркомы М-1 достаточно низкая Так, однократное гамма-облучение в дозе 30 Гр привело лишь к частичной регрессии и последующему быстрому возобновлению роста опухолей при полном восстановлении их объемов к 10 сут после облучения К 3 сут после облучения количественная плотность морфологически жизнеспособных опухолевых клеток в тестовой зоне снизилась только в 2 раза (табл 1) При этом пролиферативная активность клеток, избежавших лучевой инактивации, сохранилась очень высокой (1рсыА составил 85,7%) Объяснить достаточно низкий уровень лучевой инактивации саркомы М-1, по-видимому, можно исходя из того, что значительную часть опухолевой популяции в этом опухолевом штамме составляют гипоксические клетки Активизация в этот период зон ЯО свидетельствует о направленности биосинтетических процессов на репарацию поврежденных структур выживших опухолевых клеток Усиление пролиферативной активности клеток на 3 сут после облучения, возможно, обусловлено эффектами реоксигенации -распределением кислорода среди меньшего числа клеток и увеличением доступа кислорода к ранее гипоксическим клеткам

Ч\ 111111111111111111111111111111

10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50

Рис

10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54

Рост саркомы М-1 в контрольной и подопытных группах По оси абсцисс - срок после имплантации опухолей, сут, по оси ординат - объем опухолей, см3 а - рост опухолей в контроле и после облучения в координатах логарифмической шкалы, б — индивидуальная реакция опухолей

на гамма-облучение в дозе 30 Гр, в - рост опухолей в контроле и после введения эпитапона, г - рост саркомы М-1 после облучения и сочетанного применения гамма-облучения и последующего введения эпитапона

Полученные нами данные о снижении числа делящихся опухолевых клеток и существенном увеличении апоптотических клеток через 3 ч после у-облучения в дозе 30 Гр и динамике их изменений в последующие сроки в целом совпадают с данными литературы Однако обращает внимание сохранение высокой пролиферативной активности клеток саркомы М-1 по индексу РСЫА Последнее предполагает, что синтез этого циклина достаточно резистентен к действию ионизирующей радиации даже после подведения больших доз

На наш взгляд, установленный факт, что эффективность однократного гамма-облучения зависит от объема опухоли на момент лучевого воздействия (рис 1,6, 2,6), подтверждает роль фракции гипоксических клеток в радиочувствительности саркомы М-1 Однако не исключено, что низкая радиочувствительность саркомы М-1 обусловлена не только фракцией гипоксических клеток По нашим последним данным [Южаков В В и др , 2005] в клетках саркомы М-1 определяется интенсивная ядерная экспрессия мутантного гена р53, который может оказывать существенное влияние на радиорезистентность этого опухолевого штамма Возможно, что наличие мутантного гена р53 обуславливает и столь низкий уровень спонтанной апоптотической гибели клеток саркомы М-1

Рис 2 Влияние объема опухолей на темп их роста в экспоненциальной фазе а - в контроле, б - при действии у-облучения в дозе 30 Гр По оси абсцисс - объем опухолей, по оси ординат - коэффициент роста опухолей

В последние годы особенно активно ведутся поиски новых средств комбинированной противоопухолевой терапии с использованием не только цитотоксических, но и не цитотоксических препаратов [Olie R et al, 2000, Kim К et al, 2002, Post D et al, 2003] В этой связи обращает внимание интерес исследователей к изучению различных аспектов действия на организм регуляторных пептидов [Хавинсон В X и др , 2003, Лабунец И Ф и др , 2004,

Коркушко О В и др, 2004] В частности, показана эффективность использования некоторых пептидов в коррекции радиационных иммунодефицитов, а также ингибирующий эффект эпиталона на пролиферативную активность клеток радиочувствительных органов [Смирнов ВС и др , 1992, Хавинсон ВХ и др , 2001], что позволило предполагать наличие противоопухолевой активности данного препарата

Действительно, по нашим данным (рис 1,в, табл 2) эпиталон достоверно замедляет рост саркомы М-1 При этом ингибирующий эффект сохраняется примерно в течение 2 недель после окончания курса введения препарата Кроме того, использование эпиталона увеличило среднюю продолжительность жизни животных на 20% В результате она составила 44,9 ± 2,7 сут (Р, < 0,04, Ри = 0,04) Результаты комплексного исследования показали, что на фоне введения эпиталона пролиферативная активность опухолевых клеток остается столь же высокой, как и в контрольной группе (табл 1) Следовательно, по показателям пролиферативной активности, объективно регистрируемое замедление темпа роста саркомы М-1 не связано с прямым цитостатическим действием этого препарата на опухолевые клетки Морфологические признаки развития некроза опухолей свидетельствуют о специфическом механизме действия, который, по-видимому, может реализоваться через микроциркуляторное русло

Таблица 2

Параметры роста опухолей, лучевые реакции кожи и продолжительность жизни животных в контрольной и подопытных группах __

Группа животных 0(28-35) (см3) С£(28-40) ЛРК (баллы) Т 1 жив (сутки)

1 (контроль) 14,73+1 01 п = 6 1,34 п = 3 — 37,4+2,3 п= 10

2 (у-облучение в дозе 30 Гр) 0,8+0,15 п = 8 0,08 п = 8 2,0 ±0,3 п= 15 >60 п= 10

3 (эпиталон) 10,89± 1,20 п = 8 Р31 <0,05 0,88 п = 7 — 44,9 ±2,7 п= 10 Р3,, <0,05

4 (у-облучение + эпиталон) 0,9 ±0,14 п = 8 Р4,2 > 0,05 0,08 п = 8 1,3 ±0,3 п= 15 Р42 = 0,07 >60 п = 10

По нашим данным характерной чертой препаратов после введения эпиталона является появление вокруг сосудов многочисленных клеток, которые окрашиваются толуидиновым синим и дают положительную иммуногистохимическую реакцию на серотонин В отдельных участках их количественная плотность достигает 90 на 1 мм2 площади паренхимы опухоли

При использовании метода серийных полутонких - ультратонких срезов эти клеточные элементы были идентифицированы как тучные клетки

Результаты электронно-микроскопического исследования

свидетельствуют, что после введения эпиталона основные события развертываются в периваскулярной строме При этом появляются многочисленные моноциты, являющиеся, как известно, предшественниками макрофагов, и наряду с естественными киллерами, активированными Т-лимфоцитами и тучными клетками, обладающие противоопухолевой цитотоксичностью Не исключено, что в «пусковой механизм» сосудисто-стромальных изменений в саркоме М-1, регистрируемых после введения эпиталона, вовлечены вазоактивные медиаторы и, следует полагать, прежде всего, биологически активный амин - серотонин Ранее проведенные исследования [Хавинсон ВХ и др, 2001, 2003] показали, что эпиталон оказывает модулирующее действие на синтез серотонина в энтерохромаффинных клетках - основных депо его содержания в организме

По данным компьютерного анализа в 3-ей группе животных апоптотическая гибель клеток саркомы М-1 увеличилась практически в 2 раза Оалопт составил 0,67 ± 0,13%) В настоящее время факторы, присутствие или отсутствие которых инициирует запуск генетически запрограммированной смерти клеток, изучены достаточно хорошо [Schwartzman R А , Cidlowski J А , 1993] К числу таких факторов относится и гипоксия Однако в данном случае объяснить увеличение гибели опухолевых клеток путем апоптоза только за счет нарастающей гипоксии, по-видимому, нельзя Количественный подсчет пролиферативной активности и апоптотической гибели клеток проводили на смежных полях серийных гистологических срезов Между тем существуют убедительные иммуногистохимические доказательства, что в зонах гипоксии пролиферативный потенциал опухолевых клеток снижается [Raleigh et al, 1995, Kennedy AS et al, 1997] Если бы зарегистрированное нами увеличение индекса апоптоза было обусловлено только гипоксией, то и пролиферативная активность клеток саркомы должна была снизиться Поэтому, на наш взгляд, апоптоз, индуцированный после введения эпиталона, может быть обусловлен активизацией клеток микроокружения опухолей, которые обладают прямым цитотоксическим действием, в частности, тучных клеток и моноцитов

При иммуноокрашивании препаратов на ламинин явных изменений в экспрессии и характере контурирования стенки сосудов после введения эпиталона мы не обнаружили Однако обратило на себя внимание появление признаков периваскулярного отека и гипоксии прилегающих к сосудам опухолевых клеток

По данным комплексного анализа (рис 1,г, табл 2) на фоне выраженных радиационных эффектов терапевтическое действие эпиталона практически полностью нивелируется По-видимому, в условиях радиационного повреждения сосудистой сети, подавленной неоваскуляризации и развития

гипоксии в опухолях отсутствует структурно-функциональная основа дл; проявления действия испытуемого препарата Судя по механизму действия эпиталон, усиливая некроз паренхимы опухолей, создает предпосылки для повышения фракции гипоксических клеток, являющихся, как известно, наиболее резистентными к лучевой терапии Поэтому использовать этот препарат в традиционных схемах радиотерапии злокачественных новообразований, на наш взгляд, неоправданно

Тем не менее, мы не случайно обратили внимание на снижение выраженности JIPK (табл 2) в группе животных, леченых эпиталоном Известно, что в патогенезе ранних лучевых реакций ведущим является острое нарушение гемодинамики в здоровых тканях, преимущественно функционального характера Несмотря на некоторую субъективность визуальной оценки радиационной травмы по кожным лучевым реакциям, отмеченная тенденция к снижению остроты их проявления свидетельствует о перспективности испытания этого пептида как модификатора биологических реакций для коррекции воспалительных процессов

выводы

1 Использование компьютерного анализа изображений при морфофункциональном исследовании реакции радиорезистентной крысиной опухоли саркомы М-1 на воздействие ионизирующей радиации и пептидного препарата «эпиталон» позволило количественно охарактеризовать клеточные проявления повреждений опухоли, связанные с индукцией апоптоза и торможением пролиферативной активности

2 Саркома М-1 представляет опухоль с высокой пролиферативной активностью и низким уровнем спонтанного апоптоза опухолевых клеток По данным компьютерного анализа микроскопических изображений в периферической зоне, определяющей рост опухолей, фракция пролиферирующих клеток по индексу РСЫА составляет 76,5%, а уровень спонтанной гибели по индексу апоптоза - 0,28%

3 Индивидуальные колебания эффективности однократного локального гамма-облучения в дозе 30 Гр на саркому М-1 обусловлены объемом опухоли в период воздействия В период пострадиационного роста саркомы индекс PCNA снижается на 18,6%, в то время как индекс апоптоза увеличивается в 5 раз Полученные данные соответствуют представлениям, что радиационно-индуцированный апоптоз является одним из важных факторов, обеспечивающих эффективность лучевой терапии опухолей

4 Введение синтетического тетрапептида эпиталона крысам после подкожной трансплантации саркомы М-1 приводит к торможению роста опухолей По показателям пролиферативной активности объективно регистрируемое торможение роста не связано с прямым цитостатическим действием этого препарата на опухолевые клетки Морфологические признаки развития некроза опухолей и усиление в два раза индекса апоптоза опухолевых клеток свидетельствуют о специфическом механизме действия эпиталона, который, возможно, реализуется через сосудистое русло и клетки микроокружения опухолей

5 Согласно результатам сравнительного гистологического, иммуногистохимического и компьютерного анализа аддитивный онкомодифицирующий эффект эпиталона не регистрируется, по-видимому, из-за наличия выраженных деструктивных изменений в паренхиме опухолей, вызванных гамма-облучением

6 Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что метод компьютерного анализа изображений позволяет стандартизировать количественную оценку экспрессии маркеров, используемых в онкорадиобиологии, а также расширяет возможность получения объективных данных, необходимых для оценки коррекции дисбаланса между процессами пролиферации и индуцированной гибели опухолевых клеток при разработке схем лучевой и комбинированной терапии на экспериментальных моделях опухолевого роста

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Южаков В В , Хавинсон В X , Курилец Э С , Кветной И М , Фомина Н К Функциональная морфология саркомы М-1 в «норме» и после гамма-облучения // Высокие технологии в онкологии Мат-лы V Всероссийского съезда онкологов (Казань, 4-7 октября 2000 г) - Ростов н/Д Изд-во РГМУ, Изд-во РНИОИ, 2000 -Том 1 -С 237-240

2 Южаков В В , Фомина Н К , Кузнецова М Н Морфо-кинетические параметры саркомы М-1 без воздействия и после гамма-облучения // IV Съезд по радиационным исследованиям (Москва, 20-24 ноября 2001 г) Тезисы докладов - Москва, 2001 -Т 2 - С 500

3 Хавинсон В X , Южаков В В, Кветной И М , Малинин В В , Попучиев В В , Фомина Н К Иммуногистохимический и морфометрический анализ действия вилона и эпиталона на функциональную морфологию радиочувствительных органов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины-2001 -Т 131, №3 -С 338-346

4 Южаков В В , Хавинсон В X , Кветной И М , Фомина Н К , Кузнецова М Н Кинетика роста и функциональная морфология саркомы М-1 у ннтактных крыс и после гамма-облучения // Вопросы онкологии - 2001 -Т 47, №3 -С 328-334

5 Южаков В В, Фомина Н К Применение компьютерного анализа микроскопических изображений в экспериментальной онкорадиобиологии // Материалы междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» («НБИТТ-21») — Петрозаводск, 27-29 июня 2002 -С 40-41

6 Yuzhakov V V , Fomina N К , Konovalov S S , Kvetnoy I M , Khavinson V Kh Inhibition effect of epitalon on sarcoma M-l in rats // Environment and human health, The complete Works of International Ecologic Forum June 29 — July 2, 2003, St Petersburg -P 555-556

7 Фомина H К, Южаков В В Компьютерный анализ микроскопических изображений для изучения пролиферативной активности и апоптоза опухолевых клеток в экспериментальной онкологии // Всероссийская конференция «Радиобиологические основы лучевой терапии» 19-20 апреля 2005 Изд Российского университета дружбы народов - Москва -2005 -С 67

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АБП метод — метод авидин-биотин-пероксидазного комплекса,

БСП метод — метод биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса,

КРО — коэффициент роста опухолей,

JIPK — лучевые реакции кожи,

OK — опухолевые клетки,

ТК — тучные клетки,

ЯО — ядрышковые организаторы;

AgNOR — метод изучения ЯО селективным окрашиванием ядер клеток

коллоидным раствором нитрата серебра, PCNA — Proliferating Cell Nuclear Antigen (ядерный антиген

пролиферирующих клеток) Основные стереологнческне и статистические параметры ST — тестовая площадь 1 поля (мм2),

Ат — общая тестируемая площадь (площадь среза) (мм2) = ST х количество полей,

А, — общая площадь сечений структуры i (мм2),

р —- объемная плотность структур i (интегральный показатель содержания

структур в объеме ткани (%)) = А,/Ат; S, — средняя площадь сечения структуры i (мкм2), Ns — общее число сечений структур i на площади среза,

N, — количественная плотность (число сечений структур i на единицу площади

среза) = NS/AT; lanonr — индекс апоптоза (%) = NanonT/Nwep х 100, 1мит — митотический индекс (%) = NM„T/I4„4ep х 100, 1С — индекс соотношения = 1М11Т/ 1япопт; Ipcna — индекс PCNA (%) = Nccna^«.^ х 100, t — срок после имплантации опухоли (сутки), V — объем опухолей (см3),

Цц- ш) — коэффициент, отражающий скорость роста опухолей в интервале времени ti-tn,

ТЖ11В — продолжительность жизни животных после имплантации опухолей (сутки),

п — количество животных в группе,

Заказ 1950 Тираж 100 Объем 1 п л Формат 60x841/i6 Печать офсетная

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл , г Обнинск, ул Комарова, 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фомина, Наталья Константиновна

Перечень сокращений и условных обозначений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Биологические основы лучевой и комбинированной терапии злокачественных новообразований

1.2. Онкогенный статус и функциональная морфология опухолей

1.3. Компьютерный анализ микроскопических изображений в биологии и медицине: эволюция взглядов и современное состояние вопроса

Глава 2. Материал и методы исследования

Результаты собственных исследований

Глава. 3. Результаты исследования кинетики роста опухолей

3.1. Контрольная группа (1 группа)

3.2. Действие ионизирующей радиации (2 группа)

3.3. Действие эпиталона (3 группа)

3.4. Действие радиации и эпиталона (4 группа) 61 Иллюстрации к главе 3.

Глава 4. Результаты морфофункциональных исследований и компьютерного анализа микроскопических изображений

4.1. Контрольная группа (1 группа)

4.1.1. Функциональная морфология саркомы М-1 в экспоненциальной фазе роста (результаты предварительного исследования)

4.1.2. Контрольный срок исследования

4.2. Действие ионизирующей радиации (2 группа)

4.2.1. Функциональная морфология саркомы М-1 в ранние сроки после гамма-облучения (результаты предварительного исследования)

4.2.2. Контрольный срок исследования

4.3. Действие эпиталона (3 группа)

4.4. Действие радиации и эпиталона (4 группа) 85 Иллюстрации к главе 4.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие ионизирующего излучения и пептидного биорегулятора эпиталона на кинетику роста и функциональную морфологию саркомы М-1"

Актуальность проблемы

Одной из актуальных задач современной радиобиологии и онкологии является поиск оптимальных методов лечения злокачественных новообразований, оценка эффективности их действия и изучение механизмов индивидуальной чувствительности опухолей к лечебным воздействиям.

До настоящего времени основными способами лечения в онкологии остаются лучевая терапия и химиотерапия.

Главной задачей лучевой терапии является уничтожение максимального числа опухолевых клеток при наименьшем поражении окружающих нормальных тканей [Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А., 2004]. Методы лучевой терапии разных видов опухолей разрабатываются на основе экспериментального обоснования и клинической апробации. Рациональный выбор разовых доз и режима фракционирования определяется с учетом радиочувствительности опухолевых клеток, их способности к восстановлению от сублетальных повреждений, степени опухолевой гипоксии и фракции гипоксических клеток, выраженности процессов реоксигенации после облучения и толерантности нормальных тканей. Несмотря на совершенствование методов лучевой терапии и достижения в области онкологической радиобиологии, прогнозировать реакцию опухолей на радиационное воздействие достаточно сложно. Известно, что одни и те же опухоли одинакового гистологического строения, размера и локализации, подвергнутые совершенно идентичному облучению, у разных больных регрессируют различным образом [Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А., 2004]. Поэтому в настоящее время уделяется особое внимание возможностям применения в лучевой терапии радиомодифицирующих веществ, способных повышать эффективность радиационного воздействия на злокачественные опухоли до, во время и после облучения.

Большинство используемых в химиотерапии препаратов не обладают высокой избирательностью действия на неопластические клетки и оказывают побочное влияние на нормальные органы и ткани [Urushizaki I., 1990]. Как правило, механизм действия противоопухолевых препаратов основан на ингибировании ими различных этапов обмена нуклеиновых кислот клетки, либо связан с подавлением процессов митоза. При этом, угнетая пролиферацию быстро делящихся опухолевых клеток, химиотерапевтические агенты одновременно оказывают токсическое воздействие на здоровые ткани, главным образом, на органы лимфопоэза, кроветворения и эпителий желудочно-кишечного тракта.

Одним из перспективных современных направлений является биотерапия опухолей с применением регуляторных пептидов [Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х.,1993; Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н., 2003]. Ранее полученные нами данные об ингибирующем действии синтетического биорегулятора эпиталона на пролиферативную активность клеток свидетельствуют о целесообразности испытания этого пептида в качестве потенциального противоопухолевого препарата [Хавинсон В.Х. и др., 2001].

Следует отметить, что объективная оценка изменения морфо-функциональных параметров опухолей при изучении эффективности сочетанного действия ионизирующего облучения и лекарственных препаратов с целью разработки и оптимизации схем лечения злокачественных новообразований имеет немаловажное значение.

В настоящее время мощной и всеобъемлющей частью системного анализа в клеточной биологии, патологии и медицине является морфометрия. В условиях патологии количественная морфофункциональная оценка органов и тканей существенно затрудняется, поскольку возникает необходимость учитывать влияние дополнительных факторов. Особенно большие трудности вызывает количественная оценка опухолевого роста [Автандилов Г.Г., 2002].

Благодаря открытиям в области клеточной и молекулярной биологии злокачественного роста появилась возможность применения в радиобиологических исследованиях различных маркеров, отражающих пролиферативную активность, функциональное состояние и гибель опухолевых клеток. Применение этих чувствительных методов требует стандартизации количественной оценки морфофункциональных показателей при анализе кинетических параметров ответа новообразований на облучение и оценке коррекции дисбаланса между процессами пролиферации и апоптоза при разработке схем лучевой и комбинированной терапии на экспериментальных моделях опухолевого роста.

В последние годы важный аргументированный блок для описания биологических явлений на количественном уровне, являющийся необходимой предпосылкой для математических моделей динамических структур и процессов в клетке, обеспечивает компьютерный анализ изображений.

Компьютерное формирование изображений можно рассматривать как часть системного анализа в биологии, который может привести к идентификации новых принципов клеточной регуляции, а количественные методы исследования обладают огромным потенциалом в биологических и медицинских исследованиях [Kitano, 2002; Laitakari J., 2003].

Цель и задачи исследования

Очевидно, что для объективной оценки возможности сочетанного применения лучевой терапии и лекарственных препаратов в онкологии требуется детальное изучение механизмов их действия на клеточном уровне.

Целью данного диссертационного исследования является изучение структурно-функциональных особенностей экспериментальной опухоли саркомы М-1 при радиационном повреждении и введении синтетического пептида - эпиталона с использованием компьютерного анализа микроскопических изображений.

В соответствии с указанной целью были сформулированы и последовательно решены следующие задачи:

1. Изучить параметры кинетики роста саркомы М-1 на фоне действия гамма-облучения, при введении эпиталона и при их сочетанном воздействии.

2. Исследовать основные закономерности действия гамма-излучения и эпиталона на морфо-функциональные характеристики саркомы М-1.

3. По критериям пролиферативной активности и индуцированной гибели опухолевых клеток на основе сравнительного компьютерного анализа микроскопических изображений оценить возможность применения эпиталона в комплексных методах терапии злокачественных новообразований.

Научная новизна работы

Впервые по материалам морфо-функциональных исследований, основанных на применении высокочувствительных методов гистохимии, иммуногистохимии и морфометрии с помощью системы компьютерного анализа изображений, создана количественная база данных для быстрорастущей соединительно-тканной опухоли саркомы М-1.

На основе данных компьютерного анализа в периферической зоне, определяющей рост опухолей, рассчитана фракция пролиферирующих клеток по индексу PCNA и уровень спонтанной гибели по индексу апоптоза, а также изучены параметры пролиферативной активности и индуцированной гибели опухолевых клеток при действии ионизирующего излучения, синтетического пептида - эпиталона и их сочетанном применении.

Установлено, что пептидный биорегулятор «эпиталон» при отдельном и совместном действии с ионизирующей радиацией замедляет рост саркомы М-1, а морфологическим эквивалентом ингибирующего действия препарата является развитие некроза опухолей и усиление апоптотической гибели опухолевых клеток. Согласно результатам проведенных исследований, по механизму действия, эпиталон можно отнести к классу модификаторов биологических реакций, а его основной эффект реализуется через сосудистое русло опухолей.

Практическая значимость работы

Полученные в ходе исследований результаты позволили выяснить особенности действия ионизирующего излучения и пептидного препарата на радиорезистентную экспериментальную опухоль саркому М-1. Полученные сведения свидетельствуют о противоопухолевой активности эпиталона, что открывает возможность его применения в комплексных методах противоопухолевой терапии.

Метод количественной оценки морфо-функциональных параметров экспериментальной опухоли саркомы М-1 на основе компьютерного анализа микроскопических изображений показал принципиальную возможность его использования в комплексном исследовании радиорезистентных опухолей для объективизации диагностики и разработки критериев прогноза. В перспективе, новые данные о действии гамма излучения и пептидного биомодулятора эпиталона на клеточное микроокружение, пролиферативную активность и апоптоз клеток саркомы М-1 могут быть использованы как базовые для дальнейших экспериментальных исследований, связанных с использованием модификаторов биологических реакций в комплексной терапии резистентных форм злокачественных новообразований.

Результаты проведенных исследований показали, что автоматизированные методы компьютерного анализа изображений позволяют стандартизировать количественную оценку экспрессии маркеров, используемых в онкорадиобиологии, и расширяют возможность получения объективных данных, необходимых для оценки коррекции дисбаланса между процессами пролиферации и индуцированной гибели при разработке схем лучевой и комбинированной терапии на экспериментальных моделях опухолевого роста.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Компьютерный анализ микроскопических изображений позволил установить основные закономерности действия гамма-облучения и синтетического пептида «эпиталона» на функциональную морфологию саркомы М-1.

2. Радиационно-индуцированный апоптоз является важным фактором, который обеспечивает результативность действия гамма-облучения на радиорезистентную форму экспериментальной опухоли - саркому М-1.

3. Пептид «эпиталон» достоверно замедляет рост саркомы М-1. Вместе с тем, на фоне деструктивных изменений в паренхиме опухолей, вызванных гамма-облучением, значимый аддитивный онкомодифицирующий эффект эпиталона не регистрируется.

Связь с научно-исследовательской работой Центра

Диссертационная работа является научной темой, выполненной по основным планам НИР на 2001-2005 ГУ-Медицинского радиологического научного Центра РАМН № гос. регистрации 01.9.90. 002859 и № гос. регистрации 01.200.2 02922.

Апробация и реализация результатов исследования

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: V Всероссийском съезде онкологов (Казань,

2000); IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001); международной междисциплинарной конференции «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» («НБИТТ-21») (Петрозаводск, 2002); Международном экологическом форуме «Окружающая среда и человек» (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов докладов:

1.Южаков В.В., Хавинсон В.Х., Курилец Э.С., Фомина Н.К., Кветной И.М. Функциональная морфология саркомы М-1 после гамма-облучения // Высокие технологии в онкологии: Мат-лы V Всероссийского съезда онкологов. Казань, 4-7 октября 2000 г. Том 1. Ростов н/Д: Изд-во РГМУ, Изд-во РНИОИ, 2000. - С. 237-240.

2. Южаков В.В., Фомина Н.К., Кузнецова М.Н. Морфо-кинетические параметры саркомы М-1 без воздействия и после гамма-облучения // IV Съезд по радиационным исследованиям (Москва, 20-24 ноября 2001 г.): Тезисы докладов. - Москва, 2001. - Т. 2.-С. 500.

3. Хавинсон В.Х., Южаков В.В, Кветной И.М., Малинин В.В., Попучиев В.В., Фомина Н.К. Иммуногистохимический и морфометрический анализ действия вилона и эпиталона на функциональную морфологию радиочувствительных органов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2001. - Т. 131, № 3. - С. 338-346.

4. Южаков В.В., Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Фомина Н.К., Кузнецова М.Н. Кинетика роста и функциональная морфология саркомы М-1 у интактных крыс и после гамма-облучения // Вопросы онкологии - 2001. -Т. 47,№3.с. 328-334.

5. Южаков В.В., Фомина Н.К. Применение компьютерного анализа микроскопических изображений в экспериментальной онкорадиобиологии // Материалы междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» («НБИТТ-21»), - Петрозаводск, 27-29 июня 2002. -С. 40-41.

6. Yuzhakov V.V., Fomina N.K., Konovalov S.S., Kvetnoy I.M., Khavinson V.Kh. Inhibiting effect of epithalon on sarcoma M-l in rats // Intern. Ecol. Forum: Environment And Human Health Saint Petersburg, Russia June 29th -July 2nd, 2003.-P. 555-556.

7. Фомина H.K., Южаков B.B. Компьютерный анализ микроскопических изображений для изучения пролиферативной активности и апоптоза опухолевых клеток в экспериментальной онкологии // Радиобиологические основы лучевой терапии: Всероссийская конференция. Тезисы докладов. М.: Изд-во РУДН, 2005. - С. 67.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка литературы.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Фомина, Наталья Константиновна

выводы

1. Использование компьютерного анализа изображений при морфофункциональном исследовании реакции радиорезистентной крысиной опухоли саркомы М-1 на воздействие ионизирующей радиации и пептидного препарата «эпиталон» позволило количественно охарактеризовать клеточные проявления повреждений опухоли, связанные с индукцией апоптоза и торможением пролиферативной активности.

2. Саркома М-1 представляет опухоль с высокой пролиферативной активностью и низким уровнем спонтанного апоптоза опухолевых клеток. По данным компьютерного анализа микроскопических изображений, в периферической зоне, определяющей рост опухолей, фракция пролиферирующих клеток по индексу PCNA составляет 76,5%, а уровень спонтанной гибели по индексу апоптоза - 0,28%.

3. Индивидуальные колебания эффективности однократного локального гамма-облучения в дозе 30 Гр на саркому М-1 обусловлены объемом опухоли в период воздействия. В период пострадиационного роста саркомы индекс PCNA снижается на 18,6%, в то время как индекс апоптоза увеличивается в 5 раз. Полученные данные соответствуют представлениям, что радиационно-индуцированный апоптоз является одним из важных факторов, обеспечивающих эффективность лучевой терапии опухолей.

4. Введение синтетического тетрапептида эпиталона крысам после подкожной трансплантации саркомы М-1 приводит к торможению роста опухолей. По показателям пролиферативной активности, объективно регистрируемое торможение роста не связано с прямым

131 цитостатическим действием этого препарата на опухолевые клетки. Морфологические признаки развития некроза опухолей и усиление в два раза индекса апоптоза опухолевых клеток свидетельствуют о специфическом механизме действия эпиталона, который, возможно, реализуется через сосудистое русло и клетки микроокружения опухолей.

5. Согласно результатам сравнительного гистологического, иммуногистохимического и компьютерного анализа аддитивный онкомодифицирующий эффект эпиталона не регистрируется, по-видимому, из-за наличия выраженных деструктивных изменений в паренхиме опухолей, вызванных гамма-облучением.

6. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что метод компьютерного анализа изображений позволяет стандартизировать количественную оценку экспрессии маркеров, используемых в онкорадиобиологии, а также расширяет возможность получения объективных данных, необходимых для оценки коррекции дисбаланса между процессами пролиферации и индуцированной гибели опухолевых клеток при разработке схем лучевой и комбинированной терапии на экспериментальных моделях опухолевого роста.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фомина, Наталья Константиновна, Обнинск

1. Абраменко И.В., Фильченков А.А. Прогностическое значение апоптотического и пролиферативного индексов при солидных новообразованиях // Онкология. 2002. - Т. 4, № 3. - С. 165-170.

2. Абросимов А.Ю., Скоропад В.Ю. Морфологическая характеристика клеток саркомы Ml до и после облучения // Мед. радиол. 1991. - Т. 36, № 11.-С. 43-47.

3. Абросимов А.Ю. Спонтанная и индуцированная облучением гибель опухолевых клеток // Вопр. онкол. 1992. - Т. 38, № 5. - С. 515-527.

4. Автандилов Г.Г. Морфометрия в патологии М.: Медицина, 1973. -248 с.

5. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990.-384 с.

6. Автандилов Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии. Москва, 1996. - 256 с.

7. Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская морфометрия. М.: РМАПО, 2002.-278 с.

8. Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия. Ленинград: Наука, 1977. -296 с.

9. Э.Акимов А.А., Иванов С.Д., Хансон К.П. Апоптоз и лучевая терапия злокачественных новообразований // Вопросы онкологии. 2003. -Т. 49, №3.-С. 261-269.

10. Ю.Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Роль пептидов эпифиза в регуляции гомеостаза: 20-летний опыт исследования // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т. 113, вып. 6. - С. 752-762.

11. Ариэль Б.М., Ковальский Г.Б. Возможности использования стереологического метода в патологической гистологии и гистохимии // Архив патологии. 1974. - Т. 36, № 3. - С. 75-79.

12. Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи. М.: Медицина, 1975. -191 с.

13. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды, функционально-непрерывная совокупность // Биохимия. 1986. - Т. 51, № 4. - С. 531545.

14. Бродский В.Я. Итоги и перспективы количественных цитохимических исследований // Введение в количественную цитохимию. М., 1969. - С. 5-20.

15. Быстрые нейтроны в онкологии / Под ред. проф. Л.И.Мусабаевой. -Томск: Изд-во НТЛ, 2000. 188 с.

16. Вейбель Э.Р. Морфометрия легких человека. М.: Медицина, 1970. - с.

17. Э.Воробьев Е.И., Степанов Р.П. Ионизирующие излучения и кровеносные сосуды. М.: Энергоатомиздат, 1985. - 296 с.

18. Головин Д. И. Ошибки и трудности гистологической диагностики опухолей. Л.: Медицина, 1982. - с.

19. Горбунова В.А. Новые направления в лекарственном лечении злокачественных опухолей: опухолевый ангиогенез и антиангиогенные препараты // Медицинская радиология и радиационная безопасность. -2003.-Т. 48, №6.-С. 29-42.

20. Гундарева Л. В. Изменение плоидности ядер эпителиальных клеток предстательной железы в процессе канцерогенеза // Диагностическая медицинская морфометрия. М.: РМАПО, 2002. - С.

21. Дубенская Л.И., Баженов С.М. Белки, ассоциированные с зонами ядрышкового организатора: практическое применение в онкоморфологии и связь с биологическими особенностями опухоли // Арх. патологии. 1992. - Т. 54, № 4. - С. 40-43.

22. Дубровский А.Ч., Клюкина Л.Б. Зоны организаторов ядрышка и митотическая активность неходжкинских лимфом // Арх. пат. 1997. -Т. 59, № 1. - С. 25-30.

23. Изотов Б.М. Зависимость реакции кожи животных при локальном облучении от дозы и характера ее фракционирования // Мед. радиол. -1981.-Т. 26, № 8.-С.61-65.

24. Каракулов Р.К., Пелевина И.И. Пролиферативная активность как фактор прогноза лучевой реакции опухолей человека // Мед. радиол. -1986.-Т. 31, № 12.-С.22-24.

25. Кветной И.М., Южаков В.В. Окрашивание ткани эндокринных желез и элементов АПУД-системы // Микроскопическая техника: Руководство / Ред.: Д.С.Саркисов, Ю.Л.Перов. М., Медицина, 1996. - С. 375 - 418.

26. Клоков Д.Ю., Заичкина С.И. Методы автоматического анализа клеток и их применение в радиобиологических исследованиях // Радиац. биология. Радиоэкология. 2000. - Т. 40. № 1. - С. 15-22.

27. Коган Е.А., Угрюмов Д.А. Соотношение процессов пролиферации и клеточной гибели в немелкоклеточном раке легкого с железистой дифференцировкой на разных стадиях опухолевой прогрессии // Архив патологии. 2002. - Т. 64, № 1. - С. 33-37.

28. Коган Е.А., Игнатова В.Е., Унанян A.JL, Сидорова И.С. Соотношение процессов пролиферации и апоптоза в разных гистологических типах лейомиомы матки // Архив патологии. 2005. - Т. 67, № 4. - С. 32-36.

29. Козин С. В., Фурманчук А.В. Особенности кровоснабжения опухолей и их роль при лучевой терапии, гипертермии и гипергликемии // Мед. радиол. 1986.-Т. 31,№ 12.-С.76-83.

30. Коноплев В.П. Перевиваемые опухоли // Модели и методы экспериментальной онкологии. -М.: Медгиз, 1960. С. 144-162.

31. Коноплянников А.Г., Ключ В.Е. Биологические эффекты и медицинское применение низкочастотных импульсных ЭМП // Фундаментальные науки и альтернативная медицина /1-й Межд. симпозиум 22-25 сентября 1997. Пущино, 1997. - С. 59.

32. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. -2000.-Т. 65.-С. 5-33.

33. ЗЭ.Корнеев И.А. Прогностическое значение индекса пролиферации Ki-67 в переходноклеточном раке почечной лоханки и мочеточника // Вопросы онкологии. 2005. - Т. 51, № 2. - С. 211-215.

34. Кублик Л.Н., Эйдус Л.Х., Ярмоненко С.П. Анализ радиочувствительности саркомы М-1 методом варьирования режима облучения // Вопр. онкол. 1969. - Т. 15, № 5. - С. 64-72.

35. Лобанов С.А. Значение опухолевой гетерогенности в метастазировании // Вопр. онкол. 1992. - Т. 38, № 4. - С. 396-405.

36. Лычев В.А., Южаков В.В., Савина Н.П. Некоторые радиобиологические аспекты терапии опухолей излучением Cf // Мед. радиол. 1979. - № 9.-С. 3-9.

37. Мазурик В.К., Мороз Б.Б. Проблемы радиобиологии и белок р53 // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. - Т. 41, № 5. - С. 548572.

38. Мамаев Н.Н., Мамаева С.Е., Либуркина И.Л., Козлова Т.В., Медведева Н.В., Макаркина Г.Н. Активность ядрышковых организаторов нормальных и лейкозных клеток костного мозга человека // Цитология. -1984.-Т. 26, №1.-С. 46-51.

39. Мардынский Ю.С. Современные проблемы повышения эффективности лучевой терапии. IV российская онкологическая конференция. 21-23 ноября 2000 г., Москва.

40. Миль Е.М., Корман Д.Б., Мышлякова О.В., Микаэлян С.Г. Содержание белка р53 в сыворотке крови больных распространенным ракоммолочной железы и его изменение при химиотерапии // Вопросы онкологии. 2006. - Т. 52, № 2. - С. 159-163.

41. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Молекулярные механизмы биорегуляции генетической активности и клеточного метаболизма // Тез. докл. XVIII Всесоюз. съезда терапевтов. М.: Медицина, 1981. - Т. 1. - С. 78-80.

42. Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г., Липчина Л.П., Эмануэль Н.М. Кинетика роста солидной лимфосаркомы NKLy при воздействииразличных доз ионизирующего излучения // Изв. АН СССР. 1968. № 1. -С. 99-108.

43. Пелевина И.И., Саенко А.С. Радиобиологические предпосылки прогнозирования реакции опухолей на радиационное воздействие // Мед. радиол. 1986. - Т.31, № 12. - С. 3-10.

44. Пожарисский К.М., Самсонова Е.А., Тен В.П., Максимова Н.А., Урманчеева А.Ф. Иммуногистохимический профиль эндометриоидной аденокарциномы тела матки: ER, PR, HER-2, Ki-67 и их прогностическое значение // Архив патологии 2005. - Т. 67, № 2. - С. 13-17.

45. Пожарисский К.М., Леенман Е.Е. Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний // Арх. пат. 2000. - Т. 62, №5. - С. 3-11.

46. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы: Пер. с англ. М.: Мир, 1987. - 74 с.

47. Попучиев В.В., Сафинова Л.Ш., Чумакова Н.К., Кветной И.М., Молотков А.О. Компьютерный анализ микроскопических изображений надпочечников при интоксикации хлорорганическими соединениями // Бюл. эксп. биол. и мед. 1998. - Т. 128 № 12. - С. 666-668.

48. Радиация и патология: Учеб. Пособие/А.Ф. Цыб, Р.С. Будагов, И.А. Замулаева и др.; Под общ. ред. А.Ф. Цыба М.: Высшая школа, 2005. -341 с.

49. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Пробатова Н.А., Смирнова Е.А., Тупицын Н.Н., Шолохова Е.Н. Ядрышковый организатор как маркер степени злокачественности и прогноза неходжкинских злокачественных лимфом // Архив патологии. 1996. - Т. 58, № 4. - С. 22-28.

50. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Пробатова Н.А., Смирнова Е.А. Аргирофильные белки областей ядрышковых организаторов маркеры скорости клеточной пролиферации // Архив патологии. - 2006. - Т.68, № 3,-С. 47-51.

51. Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н. Регуляция и проявления апоптоза в физиологических условиях и в опухолях // Вопросы онкологии. 2002. -Т. 48, №2.-С. 159-171.

52. Райхлин Н.Т., Смирнова Е.А., Перевощиков А.Г. Апоптоз и его роль в механизмах регуляции роста опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью // Арх. пат. 1996. - Т. 58, № 2. - С. 3-8.

53. Смирнов B.C., Хавинсон В.Х., Яковлев Г.М., Новиков B.C. Коррекция радиационных иммунодефицитов. СПб. - 1992.

54. Сутягин П.В., Калинина Е.Е., Пылаев А.С. Морфофункциональная организация синусо-предсердного узла сердца крыс // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 2005. - Т. 139, № 2. - С. 227-230.

55. Турбин Д.А., Перевощиков А.Г. Статистический анализ при оценке диагностической и прогностической значимости областей ядрышковыхорганизаторов в эпителиальных опухолях толстой кишки // Арх. патологии. 1998. - Т. 58, № 4. - С. 19-23.

56. Федосенко К.В., Ковальский Г.Б. Пролиферация и апоптоз эпителия при раке предстательной железы, в перитуморозной зоне и при доброкачественной гиперплазии // Архив патологии. 2003. - Т. 65, № З.-С. 18-20.

57. Фильченков А.А. Терапевтическое использование модуляторов апоптоза в онкологической практике: реалии и перспективы. Труды научно-практической конференции "Онкология-ХХГ', Киев, 9-10 октября 2003 г.

58. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения. СПб.: Фолиант, 2001. - 160 с.

59. Хавинсон В.Х., Южаков В.В., Кветной И.М., Малинин В.В., Попучиев

60. B.В., Фомина Н.К. Иммуногистохимический и морфометрический анализ действия вилона и эпиталона на функциональную морфологию радиочувствительных органов //. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001а. - Т. 131, № 3. - С. 338-346.

61. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Попучиев В.В., Южаков В.В., Котлова JI.H. Влияние пептидов пинеальной железы на нейроэндокринные взаимосвязи после пинеалэктомии // Архив патологии. 20016. - Т. 63, № З.-С. 18-21.

62. C.С. Пептидэргическая регуляция гомеостаза. СПб.: Наука, 2003. - 198 с.

63. Хансон К.П., Животовский Б. Д. Молекулярные механизмы радиационной гибели клеток // Вестн. АМН СССР. 1990. - № 2. - С. 34-39.

64. Холодова Ж.Л., Лысенко О.Н, Стрижова Н.В. Плоидометрическая характеристика степени дисдифференцировки аденокарцином матки // Диагностическая медицинская морфометрия М.: РМАПО, 2002. - С.

65. Шабад Л.М., Блох М.И. Новый перевиваемый штамм саркомы М-1 // Бюлл. экспер. биол. мед. 1947. - Т. 24, № 10. - С. 7-12.

66. Шацева Т.А., Мухина М.С. Антиген Ki-67 в оценке опухолевой пролиферации. Его структура и функции // Вопросы онкологии. 2004. -Т. 50,№2.-С. 157-164.

67. Южаков В.В., Райхлин Н.Т., Кветной И.М., Яковлева Н.Д., Курилец Э.С., Манохина Р.П. Современные методы изучения функциональной морфологии эндокринных клеток // Арх. пат. 1996. - Т. 58, № 2. - С. 21-28.

68. Южаков В.В., Каплан М.А., Кветной И.М. Функциональная морфология опухолей при действии лазерного и ионизирующего излучения // Физическая медицина. 1993. - Т. 3, № 1-2. - С. 5-13.

69. Южаков В.В., Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Фомина Н.К., Кузнецова М.Н. Кинетика роста и функциональная морфология саркомы М-1 у интактных крыс и после гамма-облучения // Вопросы онкологии. 2001. -Т. 47, №3.-С. 328-334.

70. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака // Российский биотерапевтический журнал. 2002. - Т. 1, № 3. - С. 5-14.

71. ЭЗ.Ярилин А.А. Основы иммунологии. -М.: Медицина, 1999. -608 с.

72. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А., Календо Г.С., Рампан Ю. И. Биологические основы лучевой терапии опухолей. М., Медицина, 1976.-272 с.

73. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А., Козин С.В. Прогнозирование реакции опухоли на облучение и индивидуализация применения радиомодифицирующих агентов // Мед. радиол. 1986. - Т. 31, № 12. -С. 11-15.

74. Эб.Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных. -М.: Высшая школа, 2004. 560 с.

75. Aaltomaa S., Lipponen P., Papinaho S., Kosma V.M. Mast cells in breast cancer // Anticancer Res. 1993. - V. 13, N 3. - P. 785-788.

76. Arun K.S., Huang T.S., Blostein S.D. Least square fitting of two 3D point sets // Transactions of Pattern Analysis and Machine Intelligence. 1987. - N 9. -P. 698-700.

77. Axelrod D., Koppel D.E., Schlessinger J., Elson E., Webb W.W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics // Biofhys. J. 1976. - N 16. - P. 1055-1069.

78. Balkwill F.R., Lee A., Aldam G., Moodie E., Thomas J.A., Tavernier J., Fiers W. Human tumor xenografts treated with recombinant human tumor necrosis factor alone or in combination with interferons // Cancer Res. 1986. -V. 46.-P. 3990-3993.

79. Bartsch C., Bartsch H. Unidentified pineal substances with anti-tumor activity // In: The Pineal Gland and Cancer / Eds.: D.Gupta, A.Attanasio, RJ.Reiter. London:Tubingen: Brain Res. Promotion, 1988. - P. 369-376.

80. Bartsch C., Bartsch H. The role of melatonin in malignant disease // Wiener Klinische Wochenschrift // 1997. -V. 109, N 18. P. 722-729.

81. Beaudouin J., Gerlich D., Daigle N., Eils R., Ellenberg J. Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina // Cell. -2002.-N108-P. 83-96.

82. Berns G.S., Berns M.W. Computer-based tracking of living cells // Exp. Cell. Res.- 1982.-N 142.-P. 103-109.

83. Blask D.E. The pineal: an oncostatic gland? // In: The Pineal Gland / Ed.: R.J.Reiter. Raven Press, New York, 1984. - P. 253-284.

84. Bodey В., Bodey B. Jr., Siegel S.E., Kaiser H.E. Failure of cancer vaccines: the significant limitations of this approach to immunotherapy // Anticancer Res. 2000. - Vol. 20, N 4. - P. 2665-2676.

85. Boehm Т., Folkman J., Browder Т., O'Reilly M.S. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance // Nature. -1997. Vol. 390, N 6658. - P. 404-407.

86. Bolus N. E. Basic Review of Radiation Biology and Terminology // J. Nucl. Med. Technol. 2001. - V. 29. - P. 67-73.

87. Bookstein F.L. Principal warps: thin-plate splines and the decomposition of deformations // Transactions of Pattern Analysis and Machine Intelligence. -1989.-Nil.-P. 567-585.

88. Bornfleth H., Edelmann P., Zink D., Cremer Т., Cremer C. Quantitative motion analysis of subchromosomal foci in living cells using four-dimensional microscopy // Biophys. J. 1999. - N 77. - P. 2871-2886.

89. Bosman F.T., Havenith M.G., Visser R., Cleutjens J.P.M. Basement membranes in neoplasia // Progr. Histochem. Cytochem. 1992. - V. 24, N 4. -P. 1-89.

90. Brem S. Angiogenesis and Cancer Control: From Concepts to Therapeutic Trial // Cancer Control. 1999. - Vol. 6, N 5. - P. 436-458.

91. Britten R.A., Peters L.J., Murray D. Biological factors influencing the RBE of neutrons: implications for their past, present and future use in radiotherapy //Radiat. Res.-2001.-Vol. 156,N2.-P. 125-135.

92. Browder Т., Butterfield C.E., Kraling B.M., Shi В., Marshall В., O'Reilly M.S., Folkman J. Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer // Cancer Res. 2000. -Vol. 60,N7.-P. 1878-1886.

93. Burke F. Cytokines (IFNs, TNF-alpha, IL-2 and IL-12) and animal models of cancer // Cytokines Cell Mol. Ther. 1999. - Vol. 5, N 1. - P. 51-61.

94. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L., Green S., Fiore N., Williamson B. An endotoxin induced serum factor that causes necrosis of tumours // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. - V. 72. - P. 3666-3669.

95. Cater D.B., Grigson C.M.B., Watkinson D.A. Changes of oxygen tension in tumours induced by vasoconstrictor and vasodilator drugs // Acta Radiol. -1962.-V. 58,N6.-P. 401-434.

96. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. 1994. - N 263.-P. 802-805.

97. Chen H., Swedlow J.R., Grote M., Sedat J.W., Agard D.A. Handbook of biological confocal microscopy // Handbook of Biological Confocal Microscopy. Ed. Pawley J.B. Plenum Press, New York. 1995. - P. 197-209.

98. Cline H.E., Lorensen W.E., Ludke S., Crawford C.R., Teeter B.C. Two algorithms for the three-dimensional reconstruction of tomograms // MuL Phys. 1988. - N 15. - P. 320-327.

99. Colletier Ph.J., Ashoori F., Cowen D. et al. Adenoviral-mediated p53 transgene expression sensitizes both wild-type and null p53 prostate cancer cells in vitro to radiation // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2000. - Vol. 48. -P. 1507-1512.

100. Columbano A., Ledda-Columbano G.M., Rao P.M., Rajalakshmi S., Sarma D.S.R. The occurrence of cell death (apoptosis) in preneoplastic and neoplastic liver cells: a sequential study // Amer. J. Pathol. 1984. - V. 116. -P. 441-446.

101. Conti A., Maestroni G.J.M. The clinical neuroimmunotherapeutic role of melatonin in oncology // J. Pineal Res. 1995. - V. 19, N 3. - P. 103-110.

102. Coppola D., Catalano E., Nikosia V. Significance of p53 and Bcl-2 protein expression in human breast ductal carcinoma // Cancer Control. 1999. -Vol. 6,N2.-P. 181-187.

103. Corti A., Marcucci F. Tumour necrosis factor: strategies for improving the therapeutic index // J. Drug Tardet. 1998. - V. 5. N 6. - P. 403-413.

104. Danuser G., Tran P.T., Salmon E.D. Tracking differential interference contrast diffraction line images with nanometre sensitivity // Microsc. -2000.-N198.-P. 34-53.

105. Denecamp J., Hill S.A., Hobson B. Vascular occlusion and tumour cell death // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1983. - V. 19. - P.271-275.

106. Derenzini M., Trer'e D., Pession A., Montanaro L., Sirri V., Ochs R.L. Nucleolar function and size in cancer cells // Am. J. Pathol. 1998. - V. 152, N5.-P. 1291-1297.

107. Dewey W.C., Ling C.C., Meyn R.E. Radiation-induced apoptosis: relevance to radiotherapy // Ibid. 1995. - Vol. 33. - P. 781-796.

108. Durand R.E. The influence of microenvironmental factors during cancer therapy // In Vivo. 1994. - Vol. 8, N 5. - P. 691-702.

109. Durbay В., Breton C., Delic J. et al. In vitro radiation-induced apoptosis and early response to low dose radiotherapy in non-Hodgkin's lymphomas // Radiother. Oncol. 1998. - Vol. 46. - P. 185-191.

110. Edidin M., Zagyansky Y., Lardner T.J. Measurement of membrane protein lateral diffusion in single cells // Science. 1976. - N 191. - P 466-468.

111. Eils R., Gerlich D., Tvarusko W., Specter D.L., Misteli T. Quantitative imaging of pre-mRNA splicing factors in living cells // Mol. Biol. Cell. -2000.-N 11.-P. 413-418.

112. Eils R, Athale C. Computational imaging in cell biology. // J Cell Biol. -2003.-V. 161, N3.-P. 477-481.

113. Enerback L., Miller H.R.P., Mayrhofer G. Methods for the identification and characterization of mast cells by light microscopy // Mast cell differentiation and heterogeneity / Eds. A.D.Befiis et al. Raven Press, New York, 1986.-P. 405-416.

114. Farram E., Nelson D. Mouse mast cells as anti-tumor effector cells // Cell. Immunol. 1980. - V. 55, N 2. - P. 294-301.

115. Faugeras O. Three-Dimensional Computer Vision MIT Press, Cambridge, MA. 1993. - 695 p.

116. Fedorowski A., Steciwko A., Rabczynski J. Low-frequency electromagnetic stimulation may lead to regression of Morris hepatoma in buffalo rats // J Altern Complement Med. 2004. - Vol. 10, N 2. - P. 251260.

117. Ferrant M., Nabavi A., Macq В., Jolesz F.A., Kikinis R., Warfield S.K. Registration of 3-D intraoperative MR images of the brain using a finite-element biomechanical model // IEEE Trans. Med. Imaging. 2001. - N 20. -P. 1384-1397.

118. Fidler I.J., Wilmanns C., Staroselsky A., Radinsky R., Dong Z., Fan D. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment // Cancer Metastasis Rev. 1994. - Vol. 13, N 2. - P. 209-222.

119. Freitas I., Baronzio G.F. Neglected factors in cancer treatment: cellular interactions and dynamic microenvironment in solid tumors // Anticancer Res. 1994. - Vol. 14, N ЗА. - P. 1097-1101.

120. Galand P., Degraef C. Cyclin/PCNA immunostaining as an alternative to tritiated thymidine pulse labelling for marking S phase cells in paraffin sections from animal and human tissues // Cell & Tissue Kinetics. 1989. -V. 22,N5.-P. 383-392.

121. Galli S.J. New insights into "The riddle of the mast cells": microenvironmental regulation of mast cell development and phenotypic heterogeneity // Lab. Invest. 1990. - V. 62, N 1. - P. 5-33.

122. Gasparini G. The rationale and future potential of angiogenesis inhibitors in neoplasia // Drugs. 1999. - Vol. 58. - P. 17-38.

123. Gebhard M., Eils R., Mattes J. Segmentation of 3D objects using NURBS surfaces for quantification of surface and volume dynamics // Conference on Diagnostic Imaging and Analysis (ICDIA). Shanghai, China, 2002. - P. 125130.

124. Gerdes J., Shwab U., Lemke H. et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation // Int. J. Cancer. 1983. - Vol. 31. - P. 3-20.

125. Gerlich D., Beaudouin J., Gebhard M., Ellenberg J., Eils R. Four-dimensional imaging and quantitative reconstruction to analyse complex spatiotemporal processes in live cells // Nat. Cell Biol. 2001. - N 3. - P. 852-855.

126. Gerlich D., Beaudouin J., Kalbfiiss В., Daigle N., Eils R., Ellenberg J. Global chromosome positions are transmitted through mitosis in mammalian cells // Cell. 2003. - N 112. - P. 751-764.

127. Germain F., Doisy A., Ronot X., Tracqui P. Characterization of cell deformation and migration using a parametric estimation of image motion // IEEE Trans. Biomed. Eng. 1999. - N 46. - P. 584-600.

128. Gordon J.R., Burd P.R., Galli S.J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines // Immunol. Today. 1990. - V. 11, N 12. - P. 458-464.

129. Guilak F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus // Biomech. 1995. -N 28. - P. 1529-1541.

130. Gutterman J.U. Biologic therapy of human cancer // Cancer (Suppl.). -1992. Vol. 70, N4. - P. 906-908.

131. Hermens A.F., Barendsen G.W. Changes of cell proliferation characteristics in a rat rhabdomiosarcoma before and after X-irradiation // Europ. J. Cancer. 1969. - V. 5. - P. 173-189.

132. Heun P., Laroche Т., Shimada K., Furrer P., Gasser S.M. Chromosome dynamics in the yeast interphase nucleus // Science. 2001. - N 294. - P. 2181-2186.

133. Hopfl G., Ogunshola O., Gassmann M. HIFs and tumors causes and consequences // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Сотр. Physiol. - 2004. - Vol. 286.-P. 608-623.

134. Howell W.M., Black D.A. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a one step method // Experientia. 1980. - V. 36, N8. - P. 1014-1015.

135. Humphrey C.D., Pittman F.E. A simple methylene blue azure II - basic fuchsin stain for epoxy embedded tissue sections // Stain Technol. - 1974. -V. 49.-P. 9-14.

136. Hunt G. The role of laminin in cancer invasion and metastasis // Expl. Cell Biol. 1989. - V. 57. - P. 165-176.

137. Iatropoulos M.J., Williams G.M. Proliferation markers // Exp. Toxicol. Pathol. 1996. - V. 48, N 2-3. - P. 175-181.

138. Inoue S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy // Cell Biol. 1981. - N 89. - P. 346-356.

139. Jahne B. Digital Image Processing. Springer Verlag, New York. - 2002.

140. Kaminski M., Auerbach R. Tumor cells are protected from NK-cell mediated lysis by adhesion to endothelial cells // Int. J. Cancer. 1988. - V. 41.-P. 847-849.

141. Kerbel R.S. Tumor angiogenesis: past, present and the near future // Carcinogenesis. 2000. - Vol. 21, N3. - P. 505-515.

142. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Curris A.R. Apoptosis: basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer. 1972. - V. -26. - P.239-257.

143. Kerr J.F.R., Winterford C.M., Harmon B.V. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy // Cancer. 1994. - V. 73. - P. 2013-2026.

144. Kiselev S.M., Lutsenko S.V., Severin S.E., Severin E.S. Tumor Angiogenesis Inhibitors // Biochemistry (Moscow). 2003. - Vol. 68, N. 5. -P. 497-513. Translated from Biokhimiya. - 2003. - Vol. 68, N. 5. - P. 611631.

145. Kitano H. Computational systems biology // Nature. 2002. - N 420. - P. 206-210.

146. Konig К., So P.T., Mantulin W.W., Tromberg В J., Gratton E. Two-photon excited lifetime imaging of autofluorescence in cells during UVA and NIRphotostress // Microsc. 1996. -N 183. - P. 197-204.

147. Kreuser E.D., Wadler S., Thiel E. Biochemical modulation of cytotoxic drugs by cytokines: molecular mechanisms in experimental oncology // Recent Results Cancer Res. 1995. - Vol. 139. - P 371-382.

148. Laitakari J. Computer-assisted quantitative image analysis of cell proliferation, angiogenesis and stromal markers in experimental and laryngeal tumor development. PhD work. - Oulu University, 2003. - 98 p.

149. Lauria de Cidre L., Sacerdote de Lustig E. Mast cell kinetics during tumor growth // Tumour Biology. 1990. - V. 11, N 4. - P. 196-201.

150. Lavallee S., Szeliski R. Recovering die position and orientation of free-form objects from image contours using 3d distance maps // T-PAML 1995. - N 17.-P. 195-201.

151. Leek R.D., Landers R.J., Harris A.L., Lewis C.E. Necrosis correlates with high vascular density and focal macrophage infiltration in invasive carcinoma of the breast // Br. J. Cancer. 1999. V. 79. N 5-6. P. 991-995.

152. Leek R.D., Kaklamanis L., Pezzella F., et al. Bcl-2 in normal human breast and carcinoma, association with oestrogen receptor-positive, epidermal growth factor receptor-negative tumors and in situ cancer // Br. J. Cancer. -1994.-Vol. 69.-P. 135-139.

153. Liekens S., De Clercq E., Neyts J. Angiogenesis: regulators and clinical applications // Biochemical Pharmacology. 2001. - Vol. 61. - P. 253-270.

154. Liotta L.A. Tumour invasion and metastases role of the extracellular matrix // Cancer Res. - 1986. - V. 46. - P. 1-7.

155. Loew L.M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields // Bioelectromagnetics. 1992. N 1. -P. 179-189.

156. Long SJ. Biotherapy: enlisting the immune system in cancer treatment // AACN Clin. Issues. 1996. - Vol. 7, N 3. - P. 370-377.

157. Lowe S.W., Lin A.W. Apoptosis in cancer // Carcinogenesis. 2000. - Vol, 21, N3.-P. 485 495.

158. Lutsenko S.V., Kiselev S.M., Severin S.E. Molecular mechanisms of tumor angiogenesis // Biochemistry (Mosc). 2003. - Vol. 68, N 3. - P. 286-300.

159. Maintz J.B., Viergever M.A. A survey of medical image registration // Med. Image Anal. 1998. - N 2. - P. 1-36.

160. Manda Т., Nishigaki F., Mori J., Shimomura K. Important role of serotonin in the antitumor effects of recombinant human tumor necrosis factor-a in mice // Cancer Res. 1988. - V. 48, N 15. - P.4250-4255.

161. Marshall W.F., Straight A., Marko J.F., Swedlow J., Dernburg A., Belmont A., Murray A.W., Agard D.A., Sedat J.W. Interphase chromosomes undergo constrained diffusional motion in living cells // Cell. Biol. 1997. - N 7. - P. 930-939.

162. Meyn R.E., Stephens L.C., Ang K.K. et al. Heterogeneity in the development of apoptosis in irradiated murine tumours of different histologies //Ibid. 1993. - Vol. 64. -P. 583-591.

163. Mitiche A., Bouthemy P. Computation and analysis of image motion: a synopsis of current problems and methods // Int. J. Comf. Vis. 1996. - N 19.-P. 29-55.

164. Moller A., Grabbe J., Czarnetzki B.M. Mast cells and their mediators in immediate and delayed immune reactions // Skin Pharmacol. 1991. - V. 4, Suppl l.-P. 56-63.

165. Moller M., Ravault J.P., Cozzi B. The chemical neuroanatomy of the mammalian pineal gland: Neuropeptides // Neurochem. Intern. 1996. - V. 28,N l.-P. 23-33.

166. Morales A., Schwint A.E., Itoiz M.E. Nucleolar organizer regions in a model of cell hyperactivity and regression // Biocell. 1996. - V. 20, N 3. -P. 251-258.

167. Moser B. A silver stain for the detection of apoptosis at the light microscope // Micr. & Anal. 1995. - V. 37. - P. 27-29.

168. Muratani M., Gerlich D., Janicki S.M., Gebhard M., Eils R., Spector D.L. Metabolic-energy-dependent movement of PML bodies within the mammalian cell nucleus // Nat. CellBiol. 2002. - N 4. - P. 106-110.

169. Muschel R.J., Soto D.E., McKenna W.G. et al. Radiosensitization and apoptosis // Oncogene. 1998. - Vol. 17. - P. 3359-3363.

170. Nakano H., Shinohara K. Correlation between unirradiated cell TP53 protein levels and radiosensitivity in MOLT-4 cells // Radiat. Res. 1999. -Vol. 151.-P. 686-693.

171. Nathan В., Gusterson В., Jadayel D., et al. Expression of Bcl-2 in primary breast cancer and its correlation with tumor phenotype // Ann. Oncol. 1994. -Vol. 5.-P. 409-414.

172. Neri В., Brocchi A., Carossino A.M., Cinineri G., Gemelli M.T., Tommasi M.S., Cagnoni M. Effects of melatonin administration on cytokine production in patients with advanced solid tumors // Oncology Reports. 1995. - V. 2, N 1.-P. 45-47.

173. Panzer A., Viljoen M. The validity of melatonin as an oncostatic agent -Mini Review //J. Pineal Res. 1997. - V. 22, N 4. - P. 184-202.

174. Parwaresch M.R., Horny H. -P., Lennert K. Tissue mast cells in health and disease //Path. Res. Pract. 1985. - V. 179. - P.439-461.

175. Phair R.D., Misteli T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging // Nat. Rev. Mol. CellBiol. 2001. - N 2. - P. 898-907.

176. Platani M., Goldberg I., Lamond A.I., Swedlow J.R. Cajal body dynamics and association with chromatin are ATP-dependent. Nat. Cell Biol. 2002. -N4.-P. 502-508.

177. Polak J.M., Van Noorden S. (Eds.) Immunocytochemistry, practical applications in pathology and biology. John Wright & Sons, 1983. - 396 p.

178. Ponder B.A.J. Cancer genetics // Nature. 2001. - Vol. 411. - P. 336-341

179. Post D., Khuri F., Simons J., Van Meir E. Replicative oncolytic adenoviruses in multimodal cancer regimens // Hum. Gene Ther. 2003. -Vol. 14.-P. 933-946.

180. Powis G., Kirkpatrick L. Hypoxia inducible factor-la as a cancer drug target // Mol. Cancer Ther. 2004. - Vol. 3. - P. 647-654.

181. Qian H., Sheetz M.P., Elson E.L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems // Biophys. J. 1991. - N. 60. -P. 910-921.

182. Raleigh J.A., Zeman E.M., Calkins D.P., McEntee M.C., Thrall D.E. Distribution of hypoxia and proliferation associated markers in spontaneous canine tumors // Acta Oncol. 1995. - V. 34, N 3. - P. 345-349.

183. Raybaud-Diogene H., Fortin A., Morency R. et al. Markers radioresistance in squamous cell carcinomas of the head and neck: A clinicopathologic and immunohistochemical study // J. Clin. Oncol. 1997. - Vol. 15. - P. 10301038.

184. Relkin R. The pineal and human disease // In: Annual Research Reviews, The Pineal / Ed.: R.Relkin. Lundsdale House, Hornby, Lancaster, 1976. -V. l.-P. 76-79.

185. Rella W., Lapin V. Immunocompetence of pinealectomized and simultaneously pinealectomized and thymectomized rats // Oncology. 1976. -V. 33.-P. 3-6.

186. Rohr K. On 3D differential operators for detecting point landmarks -Imageand Vision Computing. 1997. - N 15. - P. 219-233.

187. Romijn H.J. Minireview: the pineal, a tranquillizing organ? // Life Sci. -1978.-V. 23.-P. 2257-2274.

188. Ryan H.E., Poloni M., McNulty W., Elson D., Gassmann M., Arbeit J.M., Johnson R.S. Hypoxia-inducible factor-1 is a positive factor in solid tumor growth // Cancer Research. 2000. - Vol. 60. - P. 4010-4015.

189. Sarraf C.E., Bowen I.D. Kinetic studies on a murine sarcoma and analysis of apoptosis // Br. J. Cancer. 1986. - V. 54. - P. 989-998.

190. Sarraf C.E., Bowen I.D. Proportions of mitotic and apoptotic cells in a range of untreated experimental tumours // Cell Tiss. Kinet. 1988. - V. 21. -P. 45-49.

191. Schatten W. E., Bursen J. L. Effect of altering blood flow on necrosis in tumors // Neoplasma. 1965. - V. 12. - P. 435-440.

192. Schmitt A., Love S.W. Apoptosis and therapy // J. Pathol. 1999. - Vol. 187.-P. 127-137.

193. Schwartzman R.A., Cidlowski J.A. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of programmed cell death // Endocrine Reviews. 1993. -V. 14, N2.-P. 133-151.

194. Sekar R.B., Periasamy A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations // Cell Biol. -2003.-N 160.-P. 629-633.

195. Sheridan M.T., West C.M.L. Ability to undergo apoptosis does not correlate with the intrinsic radiosensitivity (SF2) of human cervix tumor cell lines // Int. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2001. - Vol. 50. - P. 503-509.

196. Shrivastav S., Joines W.T., Jirtle R.L. Effect of 5-hydroxytryptamine on tissue blood flow and microwave heating of rat tumors // Cancer Res. 1985. -V. 45, N 7. - P.3203-3208.

197. Siggia E.D., Lippincott-Schwartz J., Bekiranov S. Diffusion in inhomogeneous media: theory and simulations applied to whole cell photobleach recovery // Biophys. J. 2000. - N 79. - P. 1761-1770.

198. Silvestrini R., Veneroni S., Daidone M.G., et al. The Bcl-2 protein: a prognostic indicator strongly related to p53 protein in lymph node-negative breast cancer patients // J. Natl. Cancer Inst. 1994. - Vol. 86. - P. 499-504.

199. Sittel C., Ruiz S., Volling P., Kvasnicka H.M., Jungehulsing M., Eckel H.E. Prognostic significance of Ki-67 (MIB1), PCNA and p53 in cancer of the oropharynx and oral cavity // Oral. Oncol. 1999. - Vol. 35, N 6. - P. 583589.

200. Sohmura Y., Nakata K., Yoshida H., Kashimoto S., Matsui Y., Furuichi H. Recombinant human tumor necrosis factor-II. Antitumor effect on murine and human tumors transplanted in mice // Int. J. Immunopharmacol. 1986. - V. 8.-P. 357-368.

201. Szeliski R. Video mosaics for virtual environments // IEEE Computer Graphics and Applications. 1996. - N 16. - P. 22-30.

202. Тарр Е. The pineal gland in malignancy // In: The Pineal Gland / Ed.: RJ.Reiter. CRC Press, Boca Raton, Florida, 1982. - V. III. - P. 171-188.

203. Terzopoulos D., Piatt J., Fleischer K. Heating and melting deformable models // The Journal of Visualization and Computer Animation. 1991. - N 2.-P. 68-73.

204. Thomas C., DeVries P., Hardin J., White J. Four-dimensional imaging: computer visualization of 3D movements in living specimens // Science. -1996.-N273.-P. 603-607.

205. Tomanek R.J., Schatteman G.C. Angiogenesis: new insights and therapeutic potential // Anat. Rec. 2000. - Vol. 261, N 3. - P. 126-135

206. Tvarusko W., Bentele M., Misteli Т., Rudolf R., Kaether C., Spector D.L., Gerdes H.H., Eils R. Time-resolved analysis and visualization of dynamic processes in living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - N 96. - P. 7950-7955.

207. Ueda Т., Aozasa K., Tsujimoto M., Yoshikawa H., Kato Т., Ono K., Matsumoto K. Prognostic significance of mast cells in soft tissue sarcoma // Cancer. 1988. -V. 62, N 11. -P.2416-2419.

208. Urushizaki I. Palliative therapy in cancer 5. Side effects by anticancer drugs and their treatments // Gan to Kagaku Ryoho (Japanese J. Cancer & Chemotherapy). 1990. - V. 17, N 9. - P. 1959-1969.

209. Uttenweiler D., Veigel C., Steubing R., Gotz C., Mann S., Haussecker H., Jahne В., Fink R.H. Motion determination in actin filament fluorescence images with a spatio-temporal orientation analysis method //Biophys. J. 2000. - N 78. - P. 2709-2715.

210. Vacca A., Ribatti D., Pellegrino A., Dammacco F. Angiogenesis and anti-angiogenesis in human neoplasms. Recent developments and the therapeutic prospects // Ann. Ital. Med. Int. 2000. - Vol. 15, N 1. - P. 719.

211. Vazquez J., Belmont A.S., Sedat J.W. Multiple regimes of constrained chromosome motion are regulated in the interphase Drosophila nucleus // Curr.Biol. 2001. - N 11. - P. 1227-1239.

212. Wachsberger P., Burd R., Dicker A.P. Tumor Response to Ionizing Radiation Combined with Antiangiogenesis or Vascular Targeting Agents. Exploring Mechanisms of Interaction // Clinical Cancer Research. 2003. -Vol. 9.-P. 1957-1971.

213. Wang R.F. Human tumor antigens: implications for cancer vaccine development // J. Mol. Med. 1999. - Vol. 77, N 9. - P 640-655.

214. Weibel E.R., Kistler G.S., Scherle W.F. Practical stereological methods for morphometric cytology // J. Cell Biol. 1966. - V. 30. - P. 23-38.

215. Weidner N., Sempl J.P., Welch W.R., Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis correction in invasive breast carcinoma // N. Engl. J. Med. -1991.-Vol. 324.-P. 1-8.

216. White N.S. Visualization systems for multidimensional CLSM images // Handbook of Biological Confocal Microscopy. Ed. Pawley J.B. Plenum Press, New York. - 1995. - P. 211-254.

217. Williams C.D., Markov M.S., Hardman W.E., Cameron I.L. Therapeutic electromagnetic field effects on angiogenesis and tumor growth // Anticancer Res. 2001. - Vol. 21, N 6A. - P. 3887-3891.

218. Wright S.J., Centonze V.E., Strieker S.A., DeVries P.J., Paddock S.W., Schatten G. Introduction to confocal microscopy and three-dimensional reconstruction // Methods CellBiol. 1993. - N 38. - P. 1-45.

219. Wyllie A.H. Cell death // Int. Rev. Cytol. 1987. - Suppl. 17. - P. 755785.

220. Wyllie A.H. Apoptosis // Atlas of Sci.: Immunol. 1988. - V. 1, N. 3-4.-P. 192-196.

221. Yasmeen A., Berdel W.E., Serve H., Muller-Tidow С. E- and A-type cyclins as markers for cancer diagnosis and prognosis // Expert Rev. Mol. Diagn., 2003. Vol.3, N5. -P.617-633.

222. Zhang Y., Berger S.A. Ketotifen reverses MDR1-mediated multidrug resistance in human breast cancer cells in vitro and alleviates cardiotoxicity induced by doxorubicin in vivo // Cancer Chemother. Pharmacol. 2003. -Vol. 51,N5.-P. 407-414.