Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ НА ОРГАНОГЕНЕЗ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (SOLANUM TUBEROSUM L.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ НА ОРГАНОГЕНЕЗ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (SOLANUM TUBEROSUM L.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO"



На правах рукописи

ЧУЛУУНБААТАРЫН СУВД

ДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ НА ОРГАНОГЕНЕЗ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (Solanum tuberosum L.) В УСЛОВИЯХ in vitro

Специальность 03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Диссертация выполнена на кафедре физиологии растений Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева (МСХА)

Научный руководитель — Доктор сепьскохозяйственных наук, член-

корреспондент РАСХН, профессор Третьяков H.H. Научный консультант - Доктор биологических наук, профессор Мелик-Саркисов О.С.

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук Кириченко Б.Б., Доктор биологических наук Захарин A.A.

Ведущая организация - Всероссийский научно-исстедовательский

институт картофечьного хозяйства

Защита состоится «_»_2004 г в_час на

заседании диссертационного совета Д 220 043 08 при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адресе 127550, Москва, Тимирязевская ул , 49 Ученый совет МСХА им К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в ЦТ ТВ МСХА Автореферат разослан «_»_2004 г

Ученый секретарь Диссертационного совета — Кандидат биологических наук

Карсункина Н П

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Защита семенного картофеля от вирусных и других болезней, а также сохранение репродуктивных свойств сортов обеспечивается системой безвирусного семеноводства картофеля /СБС/, конечная цель которой -снабжение хозяйств, производящих товарный картофель, безвирусным посадочным материалом.

Усовершенствование системы размножения оздоровленного посадочного материала, включающее несколько этапов, ряд из которых проводится в контролируемых условиях, ведёт к снижению потерь урожая от вирусной инфекции.

В связи с этим разработка эффективных приёмов, интенсифицирующих процессы клонального микроразмножения оздоровленного посадочного материала, которое из-за высоких затрат на энергоресурсы характеризуется высокой себестоимостью конечного продукта - оздоровленного посадочного материала, является главной задачей при переводе семеноводства картофеля на безвирусную основу. -

Метод культивирования in vitro растительных клеток, тканей и органов в настоящее время всё шире используется для селекции, генетических и физиологических исследований/Бутенко, 1994; Мелик-Саркисов, 1995/.

Современное развитие биотехнологических методов вывело безвирусное семеноводство картофеля на уровень самостоятельной отрасли растениеводства. Одним из важнейших факторов для успешного широкомасштабного введения безвирусного картофелеводства в сельскохозяйственную практику является всестороннее изучение физиологии безвирусных растений с целью разработки научно-обоснованных приемов их возделывания.

Результаты научно-исследовательских работ кафедры физиологии растений ТСХА в период 1985-1995 гг. /Каменская др., 1988, 1993; Третьяков, Деменко и др., 1994, 1995; Шогенов и др., 1999/ показали возможность активно влиять на процессы морфогенеза ряда сельскохозяйственных культур /картофель, кукуруза, ягодники/ путём воздействия на клеточную культуру и растения регенеранты электрическими полями, пневматическим давлением и вакуумом. Теоретический и практический интерес представляет использование этих приёмов для улучшения процессов регенерации растений из культуры клеток и тканей, или сомаклонов, полученных на основе генной инженерии, где необходима быстрая регенерация с целью предотвращения нежелательной генетической изменчивости и создания лучших условий для прохождения отдельных этапов морфогенеза.

ЦНо МОХА

JLzl.

Актуальность темы: Для разработки научных основ и внедрения в производство методов электростимуляции, также необходимы дальнейшие исследования самого механизма влияния электростатических полей на биологические объекты

Существенным недостатком предыдущих работ по данной проблеме взаимодействия электрических полей с растениями являлись недостаточное внимание исследователей к вопросам СО; газообмена растений и недооценка биологической роли градиентов БЭП-в как интегральному показателю функциональной активности под действием электрофизических факторов

Вместе с тем, эффект влияния тока на растительный организм носит сложный характер и зависит от множества факторов /Медведев, 1998/, вследствие чего полученные результаты носят зачастую противоречивый характер

В литературе не нашли отражение конкретные рекомендации по выбору оптимальных параметров воздействия, не обоснованны их временные характеристики и онтогенетические аспекты Гакже недостаточно сведений о закономерностях действия тока на интактные растения в оптимальных условиях среды и возможностях его использования дія стимуляции процессов роста и развития в условиях т vitro

Цель и задачи: Целью нашей работы являлось исследование вопросов взаимодействия электрических полей и растения, изучение ответных реакции растительного организма, выяснение физиологических механизмов эффекта электростимуаяции растений в зависимости от характера электрического поля и от особенностей объекта его воздействия

В практическом плане важное значение имеад определение режимов обработки электростатическим полем растении картофеля при регенерации меристем и росте черенков при их клонч-ьном микроразмножении для улучшения морфогенеза растений, что в конечном итоге должно обеспечить более высокий коэффициент размножения

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи 1. Изучить действие электростатических полей разной направленности и разных уровней напряженности на отдельных этапах биотехнологического цикла культивирования растений картофетя в условиях in vitro

2 Изучить влияние электростатических полей на морфофизиологические характеристики пробирочных растений (интенсивность видимого фотосинтеза и темнового дыхания, особенности баланса ССЪ , некоторые биометрические показатели)

3 Изучить влияние электростатических полей на топографию градиентов БЭП и динамику изменения БЭП после снятия воздействия

4. Провести полевую оценку растений, которые на этапе клонального микроразмножения подвергались воздействию электростатических полей. Научны новизна и практическая значимость: В настоящей работе впервые проведены комплексные исследования по применению электростатического поля на отдельных этапах культивирования растений картофеля в условиях in vitro, таких как приживаемость меристем и выход регенерантов, клональное микроразмножение, регуляция каллусогенеза, адвентивного побегообразования на разных типах эксплантов.

Выявлено стимулирующее действие отдельных уровней и направленностей электростатического поля на ряд физиологических процессов: рост и развитие, регенерационные процессы, интенсивность видимого фотосинтеза и темнового дыхания, топографию градиентов БЭП на пробирочных растениях и динамику изменения БЭП после снятия воздействия.

В полевых условиях изучено последействие обработки электростатическим полем растений картофеля на этапе микроразмножения.

Показана высокая воспроизводимость результатов по изучению СО2 газообмена и градиентов БЭП и выявлена корреляция данных показателей при действии электростатических полей разной направленности.

Для регистрации СО2 газообмена применен методический подход позволяющий сохранить целостность пробирочного растения картофеля.

Результаты работы позволяют предложить эффективный способ управления ростом, морфогенезом и регенерационными процессами при помощи постоянного электростатического поля. Полученные данные могут быть использованы на изученных этапах культивирования растений картофеля в условиях in vitro, и включены в технологический процесс в системе безвирусного семеноводства картофеля, а также и на других объектах, культивируемых в условиях in vitro, которые трудно переходят к органогенезу, и где стимулирующий эффект действия электростатического поля может превысить соответствующие показатели у картофеля.

Апробация работы: Материал, изложенный в диссертации, был доложен на конференции молодых ученых МСХА /2002, 2003/, на V съезде Всероссийского Общества Физиологов России /Пенза, 2003/, на IV молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» /Москва, 2004/, отчеты по теме исследований ежегодно заслушивались на научно-методических заседаниях кафедры физиологии растений ТСХА /2002-2004/.

Объем и структура диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа

изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц и 19 рисунков Список цитируемой литературы содержит 208 наименований, в том числе 81 иностранных авторов

Публикации: Основные результаты исследований, обобщенные в диссертации, опубликованы в 6 печатных работах, 2 работы находятся в печати

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объектами исследований служили сорта картофеля селекции ВНИИКХ (Удача, Голубизна, Луговской, Резерв, Ильинский), сорта голландской селекции (Романо, Санте, Конкорд) апробированные и рекомендованные для промышленного производства на территории РФ, и сорта монгольской селекции (Хонгор, С э танго, Шийр-б), признанные перспективными для производства в условиях Монголии Сорта различаются между собой как по происхождению, срокам созревания, так и по другим физиологическим особенностям в полевых условиях, так и по поведению в устовиях пробирочной культуры: скорости роста, реакции на гормональные и внешние условия и тд

Исследования проводили в таборатории физиологии растении МСХА и в лаборатории безвирусных кутьтур ВИИИСБ РЛСЧН ka" апикальные меристемы, гак и микрочеренки культивировала в камере фитотрон" три факторостатных устовиях Температура кутьгивирования в камере '<pi .офон" составляла 22_г2°С, освещенность на уровне растсиий 5 члк, продолжительность светочого дня-16 часов

Все кл -ьгуральные работы провод.пис:, По мето-шке, орисаннои РI Ьутенко, Ф Л Калининым и др рекомендациям к производству безвирусного семенного картофеля, разработа тным табораторией безвирусных культур ВНИИСБ /Мелик-Саркисов и др/ и по методическим указаниям, разработанным на кафедре сельскохозяйственной Сиотехнопогии ТСХА

2. Установка для создания постоянного электростатического ноля и условия проведения опытов.

Электростатическое поле создавали генератором высокого напряжения В-524, размещенного вне камеры и питающегося от сети переменного напряжения 220 вольт, один высоковольтный полюс которого соединялся с токопроводящей пластиной, на которой устанавливаются штативы с пробирками Другой полюс источника тока был соединен с металлической сеткой 2x2 мм, расположенной над нижней пластиной на высоте 25-30 см Напряженность электростатического поля между тастинами зависит от напряженния /£,/ подаваемого на пластины установки в кВ-х и расстоянием /// между пластинами/рис 1/

Воздействие электростатическим полем было постоянным на протяжении -всего пассажа (20-30 дней).

1. источник света;

1

I /- 2. генератор тока

высокого напряжения;

3. пробирки с культивируемыми растениями;

4. токопроводящая нижняя пластина;

5. токопроводящая верхняя сетка с ячейками 2x2 мм; '

6. . штативы для пробирок

ш/ÑuJm j mY¡ ¡ ¡) i i

Рис. 1: Схема установки для создания постоянного электростатического поля

Биоэлектрическую активность пробирочных растений картофеля

регистрировали экстраклеточно с помощью неполярнзующихся

хлорсеребряных электродов ЭВЛ-1М и цифрового pH-METR-a 5170 (Польша).

Измерительный электрод контактировал с поверхностью листа апикальной

мутовки через ватный фитилёк, смоченный водопроводной водой, электрод

i w „ сравнения через переходную насадку контактировал с питательной средой, где

находились корни растения. Для избежания механического воздействия на

ткани контакт осуществляли с помощью специального манипулятора с

микрометрическим механизмом.

Интенсивность СОг газообмена на свету и в темноте определяли

газоанализатором ГОА-4 (0-0,05% С02) по «замкнутому» контуру /Аканов,

1989/, где измеряли изменение концентрации СОг в воздухе после

прохождения его через последовательную цепочку из 4-х пробирок с

вегетирующим микропобегами и выражали в мг/час на 1 гр сухой

растительной массы.

Были проведены 4 лабораторных и 1 полевой опыт. Воздействие ЭСП

разной направленности и уровней напряженности от —10 до +30 кВ/м было

рассмотрено на основных этапах технологического цикла безвирусного

семеноводства картофеля начиная с этапа введения в культуру (выделения

верхушечной меристемы из этиолированных проростков) и до высадки

адаптированных побегов в открытый грунт. Основным опытам предшествовали

предварительные опыты по выбору параметров обработки и экспозиции В опытах определяли показатели приживаемости меристем, общий выход регенератов, определение прироста сырой биомассы каллусной ткани стандартным весовым методом, динамику образования узлов регенерации, конечный выход регенерантов на разных типах эксплантов, интенсивность С02-газообмена, показатели БЭП, топография БЭП и биометрические показатели (высота, количество междоузлий, сырая и сухая биомасса, показатели развития корневой системы) пробирочных растений

Полевой опыт проводился на участке овощной опытной станции им В И Эделыптейна МСХА с 2002-2003 гг При проведении полевого опыта определяли биометрические показатели, содержание хлорофилла /Тарчевский, 1983/ и урожайные данные

Результаты экспериментов обрабатывали с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2000 На графиках и в таблицах представлены средние арифметические данные и стандартное отклонение /Доспехов, 1985, Гатаулин, 1992/

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

/. Влияние электростатических полей на этапе регенерации верхушечной меристемы растений картофеля.

В 1-Й серии ОПЫТОВ изучали влияние Э1еКТрО«-Т4ТИЧеСКОГО поля с уровнями напряженности ЧОкВ/м и -ЮкВ/м на сортах Утача, Готтубизна л Лутовской Приживаемость меристем при действии ЭСП разной направленности составляла в том и другом варианте 108% от контроля, что свидетельствует о том, что действие полей на данный показатечь оказывает незначительный стиму-шрующий эффект В то же время общий выход регенерантов от прижившихся меристем в среднем по трем сортам в варианте с наложением электростатического поля напряженностью + ЮкВ/м составлял 121,5% от контроля, у сортов Голубизна и Луговской 126,4 и 151,5% соответственно

Все полученные регенераты были протестированы на содержание вирусов Наборы для иммуноферментного анализа поливирусов, Y и вируса скручивания листьев картофеля были предоставлены ВНИИ картофельного хозяйства РАСХН Для дальнейших опытов использовался оздоровленный растительный материал

Действие электростатического поля на изолированные апексы влияло на их приживаемость и выход регенератов /таб 1/

Таблица 1.

Действие электростатического поля на приживаемость меристем и выход регенерантов_

Сорта картофеля Уровни напряжённости ЭСП, кВ/м Приживаемость меристем, % В процентном соотношении к контролю Частота выхода регенерантов, % В процентном соотношении к контролю

о Е=+10 кВ/м 93,5 107 54,8 86,7

о я Е=- 10 кВ/м 93,3 107,5 67,4 106,6

Е=0 кВ/м (конт.) 86,8 - 63,2 -

в 1 Е=+10 кВ/м 80 106,7 47,4 126,4

Е=- 10 кВ/м 81,7 108,9 30 80

1 Е=0 кВ/м (конт.) 75 - 37,5 -

'3 Э Е=+10кВ/м 100 111,1 83,3 151,5

* Е=- 10 кВ/м 92,8 103,1 53,7 97,7

Е=0 кВ/м (конт.) . 90 - 55 -

В среднем | по сортам | Е=+10 кВ/м Е=- 10 кВ/м Е=0 кВ/м (конт.) 91.2 89.3 83,9 108,2 108,8 61,8 50,4 51,9 і 121,5 94,8

Во 2-й серии опытов регенерацию меристем стимулировали электростатическими полями положительного значения трех уровней напряженности +5, +10, +15 кВ/м при двух сроках экспозиции: 20 и 30 дней. Исследования проводили на сортах картофеля Ильинский, Романо, Сэлэнгэ и Хонгор. Лучшие результаты получены в варианте +15 кВ/м при 20-дневной экспозиции. Показатели приживаемости меристем и регенерации были в среднем на 8,2 и 12% выше, чем в контрольном варианте +10 кВ/м.

При пассаже в 30 дней выход регенерантов в среднем по 3-м сортам уменьшался.

Использование высоких концентраций гормонов с целью получения большего коэффициента размножения при введении в культуру вызывает такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как изменение морфологии растений, подавление пролиферации пазушных меристем, уменьшение способности побегов к укоренению /Катаева, Бутенко, 1983/.

Таким образом, можно предположить, что для снижения таких нежелательных эффектов применения высоких концентраций гормонов, и в частности цитокининов, на этапе введения в культуру, возможно использование ЭСП положительной направленности.

II. Влияние электростатических полей на этапе клепального микроразмножения.

Электростатическое поле влияло и на регенерацию растений из микрочеренков /таб 21. При воздействии электростатических полей положительного и отрицательного значения потенциала металлической сетки (верхний электрод) на пробирочные микрочеренки /таб 2 и рис 2/ отмечено существенное влияние на биометрические показатели микрочеренков В среднем по трем сортам при напряженности электрического поля -10 кВ/м происходит незначительное увеличение прироста надземной части растений на 8,9% по сравнению с контролем. Также увеличивается и общая длина корней 1-го порядка на 25,5 %, соответственно Многие изменения в биометрических показателях пробирочных растений, очевидно, связаны с изменением гормонального статуса под действием этектростатического поля Изменение гормонального статуса при этектростимулировании было отмечено во многих работах /

Стед>ет отметить, что электростатическое поле напряженностью МО кВ/ч способствовало увеличению прироста фотосингезирующей части растений в значитечьной степени - на 22,8",по сравнению с контролем В го же время рост корней значительно ¡амедлялся и составлял лишь 70,2% от контроля

Ш Корни

Рис 2 Влияние полей разной направленности на рост в длину побегов и корней микропобега картофеля

Растения, выращенные в поле положительной полярности, образуют на 11,1% большее число междоузлий по сравнению с контролем. Это является важным, тк коэффициент размножения при микрочеренковании зависит от количества междоузлий (листочков) на стебле регенеранта В данном варианте (+10 кВ/м) наблюдается также увеличение накопления сухой массы на 34,6% относительно контрольных растений /таб 2/

Прутенская, 1981, Калашникова и др , 2002/

• 10к8/м М0кВ/м

а Надземная часть

Таблица. 2.

Действие электростатического поля

на развитие растений из мик рочеренков

Сорта картофеля Длина побега, см Количество пазушных почек, шт. Сухая масса растений, гр Общая длина корней 1-го порядка, см

I вариант: Е=+10 кВ/м

• Конкорд 8,7±1,2 8,5+1,5 0,023±0,05 50,6+4,2

• Резерв 9,7±0,9 П,2±1,1 0,032+0,06 75,3+6,3

• Шийр-6 8,8±0,7 9,6±1,6 0,040+0,08 82,6+5,2

• Хонгор 10,6±1,1 10+1,8 0,040+0,07 102,8+7,5

• Сэлэнгэ 10,8±0,7 10,7±1,2 0,042+0,03 82,7+8,6

В среднем 9,7±0,9 10±1,4 0,035+0,06 78,8+6,4

В %-х к конт. 122,7 111,1 136,2 70,2

II вариант: Е=-10 кВ/м

• Конкорд 9,4±0,9 4 9,3±1,8 0,026+0,06 126,8+9,8

• Резерв 5,8+0,7 8,2±1,5 0,015+0,07 53,9+4,3

• Шийр-б 8,6+1,2 9+1,3 0,034+0,08 147,6+11,2

• Хонгор 9,8+1,2 9,8±1,б 0,026+0,09 236,3+19,2

• Сэлэнгэ 9,3±0,8 9,7+1,2 0,031+0,05 140+10,6

В среднем 8,6+1 9,2±1,5 0,026+0,07 140,9+11

В %-х к конт. 108,2 102,2 101,5 125,5

III вариант: Е=0 кВ/м (контроль)

• Конкорд 6,5+1,6 7,7+0,7 0,013+0,02 31,3+4,1

• Резерв 6,4+0,9 9,2+1,1 0,019+0,06 /101,4+6,8

• Шийр-6 7,3+0,7 9+1,6 0,031+0,05 152+7,1

• Хонгор 9,5+0,6 8,8+1,4 0,029+0,04 - 119,2+11 Д

• Сэлэнгэ 9,9+0,8 10,3+1 0,038+0,06 -157,5+12,1

В среднем 7,9+0,9 9+1,2 0,026+0,05 • 112,8+8,3

Во второй серии опытов стимулирование роста микрочеренков растений картофеля проводили воздействием электростатического поля напряжённостью +10, +20 и +30 кВ/м /верхний электрод положителен/ на трёх сортах: Санте, Конкорд и Резерв.

Нами получен возрастающий положительный эффект от действия электростатического поля при постепенном увеличении его значения. Длина побега, количество пазушных почек, сырая масса, количество корней 1-го порядка и ряд других показателей были больше при обработке +30,кВ/м в среднем по всем 3-м сортам, и особенно на сорте Резерв.

III. Влияние электростатических полей при регуляции каллу согенеза.

Каллусная ткань для данной серии опытов по изучению регуляции каллусогенеза была получена на двух типах эксплантов- стеблевом и листовом у сортов Удача и Шийр-6 На каллусе полученном на стеблевых эксплантах как на сорте Удача, так и на сорте Шийр-6 большая величина относительного прироста сырой массы отмечена при действии ЭСП Е=+10 кВ/м на 102,5 и 138,6 % соответственно выше, чем в контрольном варианте Тогда как при действии ЭСП Е=-10 кВ/м данный показатель превышал контрольный вариант на 23,6 и 92,5 %, соответственно

При действии ЭСП разной направленности на каллусную культуру, полученную из листовых эксплантов у сорта Удача большее стимулируюшее действие на рост каллуса оказало поле напряженностью Е--10 кВ/м, в то же время ЭСП Е=+10 кВ/м оказывало достаточно высокий эффект стимуляции который на 25,6 % был ниже, чем при действии поля отрицательной направленности

350

Удача (стеб эксп ) Удача (лист эксп) Ш 6 (стеб эксп ) Ш-6 (лист зкеп ) И1-(+10) ■ ЯИ-0 □ Ш1ІК-10)

Рис 3. Величина относительного прироста сырой массы каллусов, /%/ Каллусная ткань, полученная из листовых эксплантов у сорта Шийр-6 при действии ЭСП оказалось несколько иной, чем у сорта Удача Здесь ЭСП Е=+10 кВ/м оказывал большее стимулирующее действие, чем Е^-10 кВ/м, и примерно на 54,6 % был выше

Такая реакция на действие ЭСП разной направленности, очевидно объясняется тем, что в каллусной ткани в недостаточной мере проявляется поляризация ткани и ЭСП возможно действует в качестве как стимулирующего

фОНОВОП) фактора, НО И внешнего раздражителя, дающего толчок к Образованию большей массы КЗЛЛуСНОЙ ШНИ. .

IV. Влияние электростатических полей на процессы прямой регенерации (адвентивного побегообразования) на корневых и стеблевых эксплантах.

После 30 дней пассажа под воздействием электростатических полей экспланты пересаживали на среды соответствующего гормонального состава. Окончательный выход регенератов проводили в конце второго пассажа, в таб. 3 приведены количество регенерантов в процентном соотношении к контролю.

Таблица 3.

_Выход регенерантов в процентном соотношении к контролю_

Уровни напряженности ЭСП

Корни-1

Корни-2

Стебли-1

Стебли-2

Удача

I вариант Е=+10 кВ/м 148,3 146,1 190 157

III вариант Е—10 кВ/м 110,9 114,9 204,4 103,2 Шийр-6

I вариант Е=+10 кВ/м 128,9 130 217,5 169,8

III вариант Е—10 кВ/м 83,3 141,2 202,5 160,7 Романа

I вариант £=+10 кВ/м 121,7 122,3 185,2 265

IIIвариант Е=-10кВ/м цо,3 * 95,4 185,9 , 161

На корневых эксплантах в 5 вариантах из 6-и при воздействии электростатического поля Е = +10 кВ/м выход регенерантов был выше на 21,748,3 %. Электростатическое поле Е = -10 кВ/м оказывало увеличение выхода регенерантов от 10,3 % до 41,2 %, а в 2-х вариантах показатель был ниже контроля.

На стеблевых эксплантах воздействие электростатическими полями по всем вариантам оказало значительное увеличение на выход регенерантов. На среде Стебли-2 содержащей ИУК с зеатином в концентрации 0,2 и 5 мл/л на всех трех сортах показатель выхода регенерантов был выше при воздействии электростатического поля Е = +10 кВ/м по сравнению с полем Е = -10 кВ/м. Тогда как на среде Стебли-1 содержащей зеатин, 6-БАП и НУК в концентрации 2,5, 1 и 0,1 мл/л при воздействии поля Е = +10 кВ/м этот показатель на сорте Удача был ниже, чем при воздействии поля Е = -10 кВ/м. На сорте Шийр-6 на 15% было больше в варианте с воздействием полем Е = +10 кВ/м, по сравнению

с Е - -10 кВ/м, и на сорте Романо оба варианта были равны по выходу регенерантов

При воздействии электростатическими полями на процессы прямой регенерации корневых эксплантов картофеля проявились характерные для этого процесса влияние генотипа (сорта) и состава кучьтуральной среды В ряде случаев отмечен максимальный процент регенерации уже на 20 день экспозиции эксплантов в электростатических полях Наблюдаемое варьирование показатели регенерации в вариантах опыта очевидно объясняется также и гетерогенностью корневых эксплантов растений одной линии (сорта)

Прямая регенерация на стеблевых эксптантах картофеля в оттичие от корневых эксплантов проявляется на 30-й день На среде Стебли-1 у всех трех сортов нами отмечено положитетьное влияние на данный процесс обработки электростатическими полями как положительной, так и отрицательной направленности (полярности)

V. Изучение последействия электростатических полей, как стимулирующего фактора на этапе клонального чиыроразмнозкения, на кл\бнеобразование картофеля в полевых у сшвиях.

Дгя no ienoü оценки использовали растения t артофет,,, пр 'надлежащие к сортам разной спетости и воздечываемых в разных ¡«логических устювияч В ходе по-евого опыта в 2002 году исчользонались растения ьаргефеи сорта Конкорд из опыта по стимутированию роста Mn^pu'i.p.n чов растений картофеля воздействием электростатических потей напряженностью -10 (хокт), 1-20 и +30 кВ/м

Пробирочные растения пересаживали на гидропонику Состав питатетьной среды 15 гр удобрительной смеси Кумиры i ияро и 10 гр Ca(NO;¡); рН среды 6,5 Смену раствора производили через 6 суток При доращивании на гидропонной установке растения картофеля значительно лучше переносили адаптацию к условиям in vivo Наблюдались ускоренный рост корневой системы и надземной массы растений Через две недети растения пересаживали в полевые условия Процент прижившихся растений составил 68 0/о

Анализ реакции растений картофеля на действие ЭСП показал, что число и размеры некоторых морфологических структур обусловлены потенциальной продуктивностью сорта Наряду с этим, наблюдалось достоверное превышение по нескольким показателям у растений, подвергшихся воздействию ЭСП разного уровня напряженности и полярности

Количество стеблевых побегов в варианте с обработкой электростатическим полем напряженностью +20 кВ/м превышало контроль на

13,4%, соответственно сырая масса ботвы - на 26,1% Количество миниклубней, также их общая масса была выше в варианте Е=+20 кВ/м и были соответственно на 13,8 и 19,4% выше контроля Средняя масса миниклубней, диаметр и соответственно количество глазков приходящихся на 1 миниклубень были выше в варианте Е=4-10 кВ/м и составляли соответственно 55,4,20 и 8,5% выше контроля По всем вариантам получены нормально развитые растения

В полевом опыте в 2003 году использовались растения картофеля двух сортов Удача и Романо, которые на этапе микрочеренкования подверглись воздействию электростатических полей напряженностью +10, -10 кВ/м и растения контрольного варианта Пересадка и адаптация к условиям т vivo проводились по той же методике, что применялась в 2002 г Процент прижившихся растений составил 100% В данной серии опытов растения картофеля сорта Удача, которые на этапе микрочеренкования подверглись воздействию ЭСП Е=Н0 кВ'м, образовали большее количество стеблей, отмечен большии грирост биомассы ботвы и, котя общая масса клубней бьпа меньше, чем у контрольных растений, но при этом средняя масса одного клубня превосходит другие варианты Эти ле показатечи у растений, обработанных ЭСП Е=-10 кВ/м быти ненамного выше контрольного варианта

У растений каргофелг ,*ортд Ромгно посте воздействия ЭСП Е-+-10 кВ/м так^е все основные биометрические показатечи такие как высота куста, котичество стебтей В KVtTC И 0'">Ш.Л био\асса 6о~бы существенно превышали соответствующие гокалтеш р .лечи-* контрольного варианта Но здесь надо отметить го, что уветиченле к.. онеоСралоайния у данною сорта произошло не за счет увечи"ения мас-ч одного клубня а за счет уветичения количества клубней

Полевые испытания подтвердили по южитетьный эффект действия электростатического поля на биометрические показатели и продуктивность растений сортов Конкорд, Удача и Шийр-б, полученных методом меристемной культуры

VI. Действие электростатических полей разной направленности (полярности) на интенсивность фотосинтетического и дыхательного газообмена.

Важно было изучить взаимосвязь формирования биомассы с элементами продукционного процесса фотосинтезом и темновым дыханием и выяснить сортовую специфику физиологической реакции растений картофеля на воздействие электростатическим полем

Степень вшш ЭСП на ишшшь дщщщо ц

фотосинтетического газообмена зависела от особенностей сорта, а также

направленности ЭСП /таб. 4./.

Таблица 4.

_ Показатели ССЬ-газообмена пробирочных растений._

Варианты опыта и сорта Р, мг/час на 1 гр сухой раст. массы Ж, мг/час на 1 гр сухой раст. массы ІИ/Р, % Р8, мг/час на 1 гр сухой раст. массы Баланс СОг Средняя сухая масса растения, гр

мг/сутки на 1 гр сухой раст. массы мг/сутки на 1 пробирочное растение

Вариант I (Е=+1вкВ/м)

Удача 6,99±0,373,16±0,82 45,2 10,15±0,91 86,5±9,6 2,31±0,03 0,0267 ± 0,0032

Шийр-6 8,66 ±0,92 2,41 ±0,70 27,8 11,27* 1,27122,4 ± 15,1 2,55±0,05 0,0209 ± 0,0031 .

Романо 2,64 ±0,32 1,88 ±0,26 71,2 4,52 ±0,58 27,2 ±3,1 0,34±0,01 0,0125 ±0,0016

Вариант II (Е=0кВ/м)

Удача 7,10 ± 0,36 3,67 ± 0,63 51,7 10,78 ± 0,70 84,3 ±7,8 1,52±0,02 0,0180 ± 0,0025

Шийр-б 8,90 ±0,71 2,43 ±0,51 27,3 11,44 ± 1,33 122,1 ± 8,8 2,30±0,01 0,0188 ± 0,0012

Романо 1,87 ±0,09 1,90 ±0,29 101,6 3,77 ±0,38 14,7 ±1,1 0,17±0,001 0,0116 ±0,0011

Вариант 111 (Е=-10кВ/м)

Удача 6,23 ± 0,61 4,17 ±0,15 66,9 10,4±0,67 66,3 ± 9,3 1,30±0,02 0,0196 * 0,0025

Шийр-б 9,25±0,753,80±0,35 41,1 13,05±0,81 117,6± 13,4 2,25±0,03 0,0191 ±0,0024

Романо 2,69 ± 0,27 2,14 ±0,33 79,6 4,83 ±0,46 25,8 ±4,4 0,30±0,01 0,0116 ± 0,0011

Эти данные свидетельствуют о том, что на фоне приблизительно одинаковых значений интенсивности фотосинтеза, который поддерживается стационарными условиями выращивания и определенным объемом культуральной среды увеличение веса растений происходит за счет того, что уменьшаются расход углерода на дыхание.

Такую же тенденцию можно отметить, если привести расчет суточного баланса С02 в мг/сутки на 1 гр сухой раст. массы, которая обусловлена связью метаболических процессов, происходящих на свету в течение светлого времени суток, и в темноте ночью, т.е. суточном метаболизме.

При действии ЭСП Е=+10 кВ/м у всех сортов отмечены увеличение в накоплении биомассы за счет уменьшения доли дыхательных затрат от гросс фотосинтеза путем увеличения образования фотосинтезирующей ткани по отношению к корневой массе, и более эффективного расходования фотоассимилятов. При воздействии ЭСП Е=-10кВ/м увеличивалась доля темнового дыхания от фотосинтетического газообмена, что в конечном счете у сортов Удача и Шийр-6 выражаются в угнетении ростовых функций. У сорта

Романе с более растянутым периодом онтогенеза воздействие ЭСП отрицательной направленности в значительной мере стимулировало интенсивность фотосинтеза, что свидетельствует о потенциальных возможностях пробирочных растений данного сорта при более длительных экспозициях стимулировать метаболизм Уровень фотосинтеза возможно лимитировался уровнем корневого питания, различающихся у скороспелых сортов (ограничивающая роль объемов субстрата) В связи с этим возможно уточнение технологии при выборе сроков пересадок для различных сортов, различающихся по скороспелости Раннеспелые сорта в связи с более интенсивными темпами роста после истощения культуральной среды заметно снижают метаболическую активность

Как отмечает Мокроносов /1983/ ведущим фактором продукционного процесса на уровне целого растения являются организация и регуляция донорно-акцепторных отношений, где проявляются все элементы интеграции фотосинтеза и роста, включая эндогенную регуляцию фотосинтеза, транспорт и распределение ассимнлянтов, вторичный метаболизм и функции запасающих органов, гормональную рефляцию

VII. Особенности топографии градиентов биотектрических потенциалов растений картофеля при действии мектростатических полей.

При регистрации топографии ЬЭП у растении всех сортов наблюдается возрастание отрицательной >'ч.чтрополярности от основания к верхушке, а также увеличение э 1ектроотрицательности по всем вариантам опыта с воздействием электростатического поля положительной полярности, т е. когда верхний электрод соединялся t п i юсовым выводом генератора/рис 4/

Разность потенциалов у каждого яруса от базальной части растений к апикальной увеличивается, что связано с тем, что ткани верхних узлов и междоузлий состоят из более молодых, активно функционирующих клеток Наибольшая разность потенциалов отмечена у верхушечной почки и верхнего междоузлия

У всех сортов по вариантам опыта с воздействием электростатическим полем разность потенциалов на узлах одного номера не совпадала, что можно объяснить, тем, что темпы роста у растений неодинаковы Например, на скороспелом сорте Удача градиенты БЭП на всех узлах одного номера после воздействия ЭСП Е-+10 кВ/м были значительно ниже, чем при воздействии ЭСП Е=-10 кВ/м и контрольном вариантах Нижние узлы растений I варианта с воздействием положительного поля состояли из клеток, закончивших рост, тогда как у растений контрольного варианта и III варианта с отрицательным полем соответствующие узлы еще находились на этапе относительного роста.

Надо отметить, что растения контрольного варианта и варианта с отрицательным полем почти соответствовали как по значению градиентов БЭП на узлах одного номера, так и по количеству узлов. Тогда как в I варианте с воздействием положительного поля растения образовали за тот же период экспозиции на два узла больше и значения градиентов БЭП апикальной части намного превышали значения контрольного варианта, и варианта с отрицательным полем. У растений контрольного варианта градиенты БЭП у трех верхних узлов превышали значения соответствующих узлов растений III варианта с воздействием поля отрицательной направленности, что свидетельствует о его угнетающем действии на растения картофеля данного сорта.

Рис. 4. Топография БЭП в зависимости от сортовых особенностей растений картофеля, мВ.

На основании зарегистрированных градиентов БЭП у растений сорта Шийр-6 можно сделать вывод, что отрицательное ЭСП также оказывало угнетающее действие. Данный сорт оказался менее отзывчивым на стимулирующее действие положительного ЭСП, чем сорт Удача.

На позднеспелом сорте Романе у растений контрольного варианта градиенты БЭП на всех узлах без исключения бьши ниже, чем после воздействия ЭСП как положительной, так и отрицательной полярности.

Интересно отметить, что у растений этого сорта под воздействием ЭСП разной направленности градиенты БЭП на всех узлах были одинаковы. Стимулирующее влияние положительного поля подтверждается тем, что у растений данного варианта, образовалось на один узел больше, зарегистрированные градиенты БЭП апикальной части растений намного превышали как контрольный вариант, так и III вариант с отрицательным полем

На пробирочных растениях картофеля, у которых изучалась топография БЭП параллельно также проводилось измерения размеров междоузлий /рис 5 /.

Отмечается асинхронность прохождения этапов органогенеза узлами разных порядков, которая определяет яр>сную изменчивость (разнокачественность) почек вдоль стебля, которая связана с последовательными процессами дифференциации конуса нарастания, формированием органов по спирали, вдоль стебля Пазушные почки и ткани последовательно переходят к росту и растяжению, и чем дальше они продвинулись в развитии, тем быстрее протекают в них процесс роста и paiвития У скороспелых сортов отмечают меньший разрыв в развитии \'етамеров, чему позднеспелых сортов/Куперман, 1977/

Вариант! вариант и Вариант«! Вариант I Вариант И Вариант Вариант Вариант Вариант

< 101 (+10) (0) «К Ю} К+10) 11(0) Ш(-10)

Рис 5 Длина междоузлий, см

Отмечена хорошо выраженная сортоспецифичная реакция на воздействие ЭСП разной направленности. Зарегистрированная топография БЭП

растений картофеля отражает темпы развития и функциональную активность растений после воздействия ЭСП по сравнению с контролем. Очевидно, пробирочные растения, адаптируясь к создаваемым условиям электростатических полей, изменяют метаболизм и некоторые физиологические свойства, что проявляется во внешних морфологических признаках определяющих рост и габитус растений.

При выяснении роли отдельных поляризующих факторов (в наших исследованиях это электростатическое поле) в становлении полярности у растений, необходимо учитывать возможность «метамерной» организации обменных процессов. У растений картофеля в пробирочной культуре при воздействии ЭСП и в контроле наибольшие значения градиентов БЭП отмечены у апикальной части.

VIII. Динамика изменения градиентов биоэлектрических потенциалов при снятии действия электростатических полей.

Было показано влияние электростатического поля на изменения биоэлектрических потенциалов через 0,5 часов после снятия воздействия поля, затем через 1 , 6 и 24 часа. Динамика изменения БЭП после снятия воздействия изображена на полулогарифмической шкале времени. Результаты представленные на графиках дают возможность проследить первоначальный уровень градиентов потенциалов при воздействии полей разной направленности и их динамику в суточном интервале времени.

Проведенные наблюдения выявили генотипические различия по градиентам БЭП при воздействии электростатических полей разной направленности. Так отмечено существенное увеличение градиентов БЭП по скороспелому сорту картофеля Удача и Шийр-6 при выращивании растений в ^ электростатическом поле Е=+10 кВ/м. Реакция позднеспелого сорта Романо ( отличалась менее выраженным стимулирующим действием поля положительной полярности.

Изучение топографии осевых градиентов БЭП растений картофеля подтвердило обоснованность выбора междоузлий средней части побега для микрочеренкования, как наиболее выравненных по темпам развития и качеству регенерантов при последующих пассажах.

Определение динамики изменения БЭП после воздействия электростатического поля показывает относительную устойчивость сложившихся градиентов по всем вариантам опыта с воздействием поля Е=+10 кВ/м. Сорт Удача быстрее восстанавливал БЭП после непродолжительного снижения, чем два других сорта и оказался наиболее отзывчивым на стимулирующее действие электростатического поля. Возможно, динамика БЭП

данного сорта может быть использована для оценки отзывчивости других изучаемых сортов на данный прием стимуляции роста и развития в условиях in vitro

Удача Ш"*'"6

Романе

♦ Вариант I (+10) —Вариант II (0) - -Вариант III (-10)

Рис 6 Динамика изменения БЭП

Повышение градиентов БЭП у скороспелых сортов в электростатическом поле Е-+10 кВ/м коррелировало с

физиологическими и

биометрическими показателями Можно полагать, что более высокий уровень осевых градиентов БЭП способствовал более эффективному СО; газообмену /Сувд и др, 2004/ и стимулированию ростовых

процессов, по сравнению с растениями в контрольном варианте и электростатическом поле Е=-10 кВ/м

В вашей работе использован бесконтактный способ воздействия электростатическими полями разной полярности на ход морфогенеза растений картофеля in vitro. Регенерация пазушных почек, ризогенез, последующее развитие растений проходили на фоне постоянного воздействия электростатических полей /Е=+10 кВ/м, Е=-10 кВ/м/. Бесконтактный способ удобен для объектов, выращиваемых в стерильной культуре, тем, что нет необходимости прямого контакта с растительным объектом, и не нарушается стерильность условий, он более технологичен при выращивании различных объектов растительного материала in vitro.

Диссертационная работа выполнена по проекту федеральной целевой программе «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 гг.» контракт от 31.07.02 г. №£0023/1046.

ВЫВОДЫ.

1. Действие ЭСП разной полярности оказала незначительный стимулирующий эффект на приживаемость меристемы (108% от контроля). В то же время общий выход регенерантов от прижившихся меристем в среднем по сортам в варианте с наложением ЭСП Е=+10кВ/м составлял 121,5% от контроля, у сортов Голубизна и Луговской соответственно 126,4 и 151,5%.

2. При действии ЭСП разной полярности на каллусные ткани были зафиксированы большие различия в интенсивности ростовых процессов на разных типах каллусов. Коэффициент вариации по приросту биомассы каллусной ткани в конце 4-х недельного пассажа на разных сортах и разных типах эксплантов составлял 32-107%.

3. Отмечена интенсификация процесса прямой регенерации на стеблевых и корневых эксплантах картофеля под воздействием ЭСП напряженностью +10 кВ/м и -10 кВ/м, сортовые особенности в реакциях на воздействие электростатических полей. Интенсивность морфогенетических процессов связана с такой характеристикой, как скороспелость или позднеспелость сортов.

4. При действии ЭСП Е=+10 кВ/м у изучавшихся сортов отмечено увеличение накопления биомассы за счет уменьшения доли дыхательных затрат от фотосинтеза, увеличение образования фотосинтезирующей ткани по отношению к корневой массе, более эффективное расходование фотоассимилятов.

5. Топография БЭЛ растений картофеля отражает темпы развития и функциональную активность растений после воздействия ЭСП.

6. Определение градиентов БЭЛ после воздействия ЭСП показывало относительную устойчивость сложившихся градиентов БЭП в вариантах опыта

с воздействием поля Е—НО кВ/м, сорт Удача быстрее восстанавливал БЭП после непродолжительного их снижения, по сравнению с другими сортами Возможно, динамика БЭП данного сорта может быть использована для оценки отзывчивости других сортов на данный прием стимуляции роста и развития в условиях m vitro.

7. Повышение градиентов БЭП у скороспелых сортов в электростатическом поле Е=+10 кВ/м коррелировало с физиологическими и биометрическими показателями Можно полагать, что более высокий уровень осевых градиентов БЭП способствовал эффективному COj газообмену и стимулированию ростовых процессов, по сравнению с растениями в контрольном варианте и электростатическом поле Е--10 кВ/м

8. Отмеченное опережение в развитии опытных растений в начальный период их роста обеспечивает на протяжении всего онтогенеза ускоренное прохождение последующих фенологических фаз Почевые испытания полтверлили положительный эффект действия ЭСП Е -10 кВ/ч на биометрические показатели и продуктивность растений сортов Конкорд, У >ача и Романо порученных методом меристемной культуры

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ t Сувд Ч Сувд Ч, Овчинникова В Н, Паничкин Л А, Акинов Э Н, Третьяков Н Н , Мелик Сг-рдслсов О С Определение стгччлирующего эффекта ЭСП на регенераци меристем и рост черенков при клональном микроразмножении картоне и Solanum п.гыо<г"1 Т '/ Труды научной конференции молодых ученых и специалистов V1CXA 4-6 июня 2002 г, М. (Рукопись депонирована во ВИИИТЭИагропром №18844)

2 Сувд Ч , Овчинникова В Н , Паничкин Л А , Аканов Э Н , Третьяков Н Н , Мелик-Саркисов О С Действие ЭСП на регенерацию меристем и рост черенков картофеля (Solanum tuberosum L )ряда сортов при клональном микроразмножении // Сб тез «V-ый съезд общества физиологов России» Пенза 2003. С 525-526

3 Сувд Ч, Овчинникова В Н, Паничкин Л А, Аканов Э Н, Третьяков Н Н , Мелик-Саркисов ОС Регенерация меристем и рост черенков Solanum tuberosum L при их клональном микроразмножении in vitro под действием электростатического поля // Сельскохозяйственная биология №1, 2004, С 73-77.

4 ЧСувд СОг-газообмен и морфогенез растений картофеля in vitro при действии электростатического поля П IV Молодежная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». М 2004, С 31-32

5. Мелик-Саркисов О.С., Сувд Ч. Промышленное производство безвирусного картофеля // Достижения науки и техники. 2004. №3, С. 13-15.

6. Сувд Ч., Овчинникова В.Н., Третьяков H.H., Мелик-Сакрисов О.С., Шарова А.П. Влияние ЭСП на прямую регенерацию корневых и стеблевых эксплантов картофеля in vitro // Известия ТСХА. 2004. №2. С.68-74.

Объем І 5 п л Зак 266_Тираж ІООзкз

АНО «Издательство МСХА» 127550 Москва у 7 Тимирязевская, 44