Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Детоксирующие ферменты насекомых при микозах

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Детоксирующие ферменты насекомых при микозах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ СИСТЕМАТИКИ И ЭКОЛОГИИ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

?Г5 ОЯ

СЕРЕБРОВ Валерий Владимирович 1 8 Д£К 20ТГЭ

УДК595.7-12: 612.017

ДЕТОКСИЦИРУЮЩИЕ ФЕРМЕНТЫ НАСЕКОМЫХ ПРИ МИКОЗАХ

Специальность 03. 00. 09 - энтомология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК - 2000

Диссертационная работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Института систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

В.В. ГЛУПОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Л.А. ОСИНЦЕВА

доктор биологических наук, профессор Т.В. ТЕПЛЯКОВ А

Ведущее учреждение:

Томский государственный университет

Защита диссертации состоится Л'..-/... декабря 2000 г. в ........ часов

на заседании Диссертационного совета К 003.14.01. в Институте систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской Академии наук

Отзывы на автореферат диссертации в двух экземплярах просим направлять по адресу: 630091, Новосибирск-91, ул. Фрунзе, 11, Диссертационный совет ИСиЭЖ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИСиЭЖ СО РАН по адресу: 630091, г. Новосибирск, 91, ул. Фрунзе, 11.

Автореферат разослан........ноября 2000 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Ю.А. ХАРИТОНОВ

А ц 6$ б,о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Детоксицирующие ферменты в жизнедеятельности насекомых имеют огромное значение. Они участвуют в формировании резистентности насекомых к инсектицидам, деградации токсичных метаболитов кормового растения и метаболизме различных биологически активных веществ. Среди прочих факторов, на функционирование данных ферментов у насекомых могут влиять инфекционные заболевания [Соколова, Сундуков, 1998; Кольчевская, Кольчевский, 1988; Kucra, 1978; Madziara-Borusiewiez, Kucera, 1978; Shiotsuki, Kato, 1999; Sujak et al., 1978]. Однако исследования в данной области имеют фрагментарный характер и, в основном, касаются неспецифических эстераз и фосфатаз. Кроме того, практически не изучены факторы, приводящие к изменению спектра и активности детоксицирующих ферментов при заражении насекомых энтомопатогенными микроорганизмами, связь данных ферментов с механизмами резистентности насекомых к возбудителям болезней, и, наконец, влияние инфекций, сопровождаемых изменением спектра или/и активности детоксицирующих ферментов, на чувствительность насекомых к инсектицидам. Следует также отметить, что работ по влиянию микозов на спектр и активность детоксицирующих ферментов ранее не проводилось, хотя известно, что энтомопатогенные грибы широко распространены в популяциях насекомых [Hajek, Leger, 1994; Schan et al., 1994; Zieminicka, 1997] и вполне могут быть одним из существенных факторов, влияющих на функционирование данных ферментов. Не исключено, также, что детоксицирующие ферменты, участвуя в деградации токсинов патогена, могут играть весьма значительную роль при формировании резистентности насекомых к возбудителям болезней и, в частности, к энтомопатогенным грибам.

Цель исследования. Целью данной работы явилось изучение влияния микозов на функционирование детоксицирующих ферментов у насекомых и роли данных ферментов при формировании резистентности насекомых к энтомопатогенным грибам.

Задачи исследования.

1. Исследовать влияние микозов на изменение спектра и активности микросомальных монооксигеназ, неспецифических эстераз и глутатион-8-трансфераз;

2. Изучить влияние микозов на изменение чувствительности насекомых к химическим инсектицидам;

3. Определить роль детоксицирующих ферментов при формировании резистентности насекомых к энтомопатогенным грибам.

Научная новизна. Впервые изучено изменение спектра и активности микросомальных монооксигеназ, неспецифических эстераз и глутатин-S-трансфераз у насекомых при микозах. Наиболее существенные изменения зарегистрированы в спектре неспецифических эстераз. Показано, что

3

экспрессия дополнительных изоформ эстераз, регистрируемая у насекомых при инфицировании энтомопатогенными грибами, снижает их чувствительность к инсектицидам. Ингибирование эстераз фосфорорганическими соединениями резко повышает восприимчивость насекомых к микозам. По-видимому, это является одной из причин, обусловливающих синергизм между грибными биопрепаратами и химическими инсектицидами.

Практическая ценность. Результаты, полученные в ходе проведенных исследований, дополняют наши знания о свойствах детоксицирующих ферментов и механизмах резистентности насекомых к энтомопатогенным грибам. В диссертационной работе раскрыты факторы, обусловливающие синергизм биопрепаратов на основе энтомопатогенных грибов и химических инсектицидов и предложены оригинальные подходы к созданию новых препаративных форм биопрепаратов.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы были доложены на отчетной сессии ИСиЭЖ СО РАН 26 апреля 2000 г., на заседании микробиологического общества 10 апреля 2000 г., на конференции "Паразиты в природных комплексах и рисковые ситуации" в июне 1998 г. (г. Новосибирск, ИЭВСиДВ СО РАСХН), на конференции "Взаимоотношения паразита и хозяина" в декабре 1998 г. (г. Москва), на международной конференции "Сохранение и защита горных лесов" в октябре 1999 г. (Кыргызстан, г. Ош). По материалам диссертации опубликовано 3 работы, 2 работы находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 123 листов машинописного текста состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 17 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 252 работы. В приложении приведены сведения о происхождении штаммов энтомопатогенных грибов и статистическая обработка экспериментальных данных.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Т.К. Кальвиш за созданную ей коллекцию энтомопатогенных грибов, некоторые из которых были использованы в экспериментах данной работы, старшему научному сотруднику лаборатории структуры генома ИЦиГ СО РАН к.х.н. Н.М. Слынько за предоставленные для работы реактивы и научные консультации, оказанные при подготовке диссертационной работы, научному сотруднику лаборатории экспертных систем ИХКГ СО РАН к.б.н. A.A. Алексееву - за реактивы для проведения исследований, зав. лаборатории биохимии чужеродных соединений ИМБиБ СО РАМН к.б.н. АЛО. Гришановой и аспиранту Т.В. Зуевой - за возможность проведения некоторых биохимических исследований в их лаборатории. Автор также выражает признательность ведущему научному сотруднику лаборатории патологии насекомых к.б.н. С. А. Бахвалову и старшему научному сотруднику к.б.н. A.B. Ильиных за сделанные ими ценные замечания к диссертационной работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

В данной главе рассмотрены особенности проникновения и развития энтомопатогенных грибов в организме насекомых. Описаны структурные изменения тканей и органов, возникающие у насекомого-хозяина при микозах. Выяснено, что развитие микозов у насекомых заканчивается, как правило, летальным исходом. Начальные этапы болезни характеризуются поражением покровных тканей, а заключительные - колонизацией внутренних органов. Кроме того, прослеживается предпочтение грибом определенных органов и тканей хозяина. Особенности развития патогенов (скорость развития инфекции, места внедрения грибов и т.д.) зависят как от видовых и штаммовых различий насекомых и грибов, так и от условий инфицирования. Проанализировано значение основных факторов вирулентности (ферментов, токсинов и механического разрушения тканей грибными гифами) грибов при микозах. Рассмотрены общие пути деградации ксенобиотиков в организме насекомых и роль наиболее важных для данного процесса ферментов: микросомальных монооксигеназ, неспецифических эсгераз и глугатиои-Б-траисфераз. Помимо деградации различных ксенобиотиков, данные ферменты участвуют в метаболизме биологически активных веществ. Указаны основные факторы (возраст, стадия развития, физиологическое состояние насекомых, интоксикация ксенобиотиками и др.), влияющие на изменение спектра и активности детоксицирующих ферментов. В заключительной части главы приведены сведения по влиянию инфекций на функционирование детоксицирующих ферментов. Отмечено, что накопленные к настоящему времени данные не достаточны для установления закономерностей и факторов, обусловливающих изменение спектра и активности детоксицирующих ферментов при инфекциях.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для работы служили насекомые лабораторных (Gallería mellonella L.) и природных (Hyponomeuta evonymellus L., Aporia crataegih., Leptinotarsa decemlineata Say., Lymantria dispar L.) популяций. Заражение насекомых грибами осуществляли путем нанесения инфекционного материала на листья кормовых растений (перорально-контактно), обмакиванием в суспензию спор с титром 5х108/мл и методом отпечатков по Б.Н. Огаркову [1990].

Гемолимфу у гусениц пчелиной огневки отбирали капилляром через надрезанную ложноножку и помещали в охлажденные до 6-8°С пробирки Эпиндорфа. Чтобы предотвратить меланизацио гемолимфы, на дно пробирок насыпали несколько кристалликов фенилтиомочевины. Для осаждения гемоцитов образцы центрифугировали в течение 5 мин при 1000 g. В

5

дальнейших экспериментах использовали супернатант. Для получения внутренних органов насекомых закрепляли энтомологическими иголками на поверхности восковой пластинки в чашки Петри и заливали 0.1 М Na-фосфатным буфером, pH 7.2 (ФБ), затем делали два продольных надреза по плейритам и извлекали требуемые для работы органы. Гомогенаты целого тела насекомых, или внутренних органов, приготавливали на ФБ из расчета 1 г на 5 мл буфера. Микросомальную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования [Lee, Scott, 1989].

Эстеразную активность определяли по отношению к р-нитрофенилацетату [Prabhakaran et al., 1993] и 1-нафтилацетату [van Asperen, 1962]. Множественные формы эстераз изучали методом электрофореза в 7.5% полиакриламидном геле [Гааль и др., 1982]. Выявление эстеразных зон осуществляли по методу Корочкина с соавторами [1977], используя в качестве субстратов 1-, 2-нафтилацетат и 1-нафтилпропионат. Для типирования эстераз использовали фосфорорганические соединения (10"3 М), соли тяжелых металлов (10"3М), эзерин (10"4 М) и фторид натрия (70"3 М). Глутатион-З-трансферазную активность определяли по отношению к 1-хлор-2,4-динитробензолу [Habig et al 1974], монооксигеназную - по скорости образования р-аминофенола из анилина [Brodie, Axelrod, 1948], количество цитохромов - по методу Т. Омура и Р. Сато [Omura, Sato, 1964], количество белка - по методу М. Бредфорда [Bradford, 1979].

Обработку насекомых инсектицидами проводили топикальным методом. Расчет величины LD50 осуществлялся методом пробит-анализа [Ашмарин, Воробьев, 1962]. Синергисты использовали в нелетальных дозах, нанося их за 30 мин до обработки инсектицидами. При изучении влияния микозов на чувствительность насекомых поступали следующим образом. Насекомых сначала инфицировали M.anisopliae, а затем, через 48 ч, обрабатывали инсектицидами. Учет гибели насекомых проводили через 24-48 ч после нанесения инсектицидов. Экспериментальные данные обрабатывали дисперсионным анализом по Б.А. Доспехову [1985].

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Подбор штаммов энтомопатогенных грибов

Для заражения насекомых были использованы коллекционные штаммы энтомопатогенных грибов. В процессе работы была изучена вирулентность 5 штаммов МеШгЫаит шйзорИае, 15 штаммов Веаихепа ba.ssia.na и 8 штаммов РаесИотусез ¡и.то$о-го$еи$. Восприимчивость насекомых изменялась как от видовых и возрастных особенностей насекомого, так и от штамма и вида энтомопатогенного гриба. Например, при контактном инфицировании гусеницы 1 -2-го возраста непарного шелкопряда были высоко восприимчивы к большинству коллекционных штаммов грибов М.атзорНае и В.Ьа$з1апа. Менее чувствительны к грибам оказались гусеницы 3-4-ого возраста и, практически, нам не удалось вызвать микоз у гусениц старше 5-го возраста.

6

Для личинок колорадского жука, гусениц боярышницы, пчелиной огневки и черемуховой моли возрастные различия были менее значительными.

Перорально-контактный способ заражения оказался практически неэффективным (погибали единичные особи с признаками микоза) для личинок колорадского жука и гусениц пчелиной огневки и значительно уступал по эффективности контактному способу заражения для личинок черемуховой моли. У гусениц непарного шелкопряда при скармливании листьев березы, обработанных грибами, резко повышалась чувствительность к микозам (заражались гусеницы не только 1-2-ого возраста, но и 5-6-ого возраста). Для инфицирования боярышницы использовали штамм Р-72 М.атхорНае. 1Л"5о этого штамма составило 4-6 суток. Характеристика вирулентных свойств остальных штаммов приведена в табл.1.

Таблица 1

Характеристика вирулентных свойств штаммов грибов при контактном инфицировании насекомых

Гриб Гибель гусениц, сут Характеристика штамма по вирулентности

вид штамм начало 1Л50 ЬТюо

Вирулентность штаммов по отношению к гусеницам 2-3-го возраста ¿.¿враг

М.атюр1ше Р-72 3-5 6-8 - средневирулентный

44 * * * невирулентный

В.Ьазхгапа 4-88 * * * невирулентный

СШ-98 8-10 - - слабовирулентный

Вирулентность штаммов по отношению к гусеницам 5-го возраста О.тпеИопеИа

М.атзорИае Р-72 2-3 3-4 5-6 высоковирулентный

85-69 2-3 4-5 5-7 высоковирулентный

44 * * * невирулентный

МаН * * * невирулентный

В.Ьаз11апа 4-88 2-3 3-5 6-7 высоковирулентный

110-70 3-4 5-6 7-8 средневирулентный

Р./итою-гозеш 1-26 4-5 6-7 8-9 средневирулентный

Кп 7-9 9-12 - слабовирулентный

Вирулентность штаммов по отношению к гусеницам 3-4-го возраста Н.еуопутеНш

М.ашзорНае Р-72 2-3 3-4 5-6 высоковирулентный

В.Ьа$$1апа 4-88 6-8 - - слабовирулентны й

Вирулентность штаммов по отношению к личинкам 3-4-го возраста Ь-йесетИпеМа

М.атхорИае Р-72 2-3 3-4 5-6 высоковирулентный

В.Ьа$$1апа 4-88 2-3 3-5 6-7 высоковирулентный

Р./итою-гояеш 1-26 4-5 6-7 8-9 средневирулентный

Примечание. "-" означает, что заражение данным штаммом не приводило к 50%- или 100%-ной гибели насекомых; "*" - отсутствие гибели насекомых. Заключение о степени вирулентности штамма делалось путем сопоставления его 1Л50, ЬТюо (времени, за которое погибает 50% и 100% инфицированных особей, соответственно) и начала гибели насекомых с аналогичными показателями других штаммов. Для каждого вида насекомого классификация была независимой.

3.2. Внешние признаки проявления микозов у насекомых

При закладке экспериментов по токсикологии крайне важно было отобрать гомогенные группы, состоящие исключительно из интактных и инфицированных насекомых. Для этого необходимо было изучить внешние признаки проявления микозов у насекомых на начальной стадии болезни.

В результате работы было установлено, что достаточно надежным и наиболее удобным критерием является локальная пигментация кутикулы. Появление черных пятен обнаруживалось у всех видов насекомых, за исключением гусениц черемуховой моли и непарного шелкопряда при контактно-пероральном заражении (при контактном заражении у непарного шелкопряда пигментацию регистрировали). В последнем случае первым внешним признаком проявления болезни было обрастание ложноножек мицелием энтомопатогенных грибов. Локальная пигментация у насекомых регистрировалась также и при механическом повреждении кутикулы. При этом образование черных точек наблюдалось и у черемуховой моли. Было установлено, что между временем появления пятен и вирулентностью штамма (LT50) существует тесная прямая зависимость (коэффициент корреляции для гусениц пчелиной огневки составил 0.91±0.17 при Р=0.05). При инфицировании гусениц пчелиной огневки высоковирулентными штаммами гриба M.anisopliae Р-72 и 85-69, пигментация начиналась через 46 ч после нанесения конидий, а при заражении гусениц высоковирулентным 4-88 и средневирулентным 110-70 штаммами B.bassiana - через 10-14 и 2030 ч, соответственно. Средневирулентный штамм 1-26 индуцировал данную реакцию у насекомых через 48-60 ч, а слабовирулентный Pfn - через 96120 ч. Невирулентный штамм 44 M.anisopliae не приводил к формированию пигментных пятен. Здесь' необходимо отметить, что единственным исключением оказался штамм МаН M.anisopliae. При инфицировании гусениц этим штаммом через 24-48 ч мы регистрировали появление черных точек на покровах, однако, гибели насекомых не происходило.

Локальная пигментация кутикулы, регистрируемая при микозах, связана с образованием меланина [Bernado, 1968] и обусловлена повреждением покровов гифами [Bogus, Szczepanik, 2000] и токсинами гриба [Vey et al., 1993], чем, вероятно, и объясняется тесная прямая зависимость между вирулентностью штамма и началом времени пигментации. Отсутствие пигментных пятен у инфицированных гусениц черемуховой моли связано, возможно, с тем, что энтомопатогенные грибы проникают в организм гусениц черемуховой моли преимущественно через кишечник или ротовые органы.

3.3. Влияние микозов на спектр и активность неспецифических эстераз

В результате работы было установлено, что количество изоформ у насекомых варьирует. Так, в гемолимфе интактных особей пчелиной огневки было зарегистрировано 4-6 зон с эстеразной активностью (рис. 1а), в жировом теле - 6. Намного разнообразнее оказался спектр гомогенатов насекомых. У черемуховой моли обнаружено 9-12 (рис. 16), непарного

8

шелкопряда - 6-11 (рис. 1 в), боярышницы - 5-9 (рис. 1г) и колорадского жука - 4-5 изоформ.

К К Г Г КК гг TT if Г Г к Г Г

, , -у

N» а тте '

" " rnmmi

а

б

в

г

Рнс. 1. Спектр неспецифических эстераз гемолимфы гусениц G.mellonella (а), гомогенатов целого тела гусениц H.evonymellus (б), Ldispar (в) и A.crataegi (г): к- интактные насекомые, г- насекомые, инфицированные энтомопатогенными грибами; "*", "**" обозначена изоформа Ез H.evonymellus и Е7 Ldispar, соответственно.

Инфицирование гусениц чешуекрылых энтомопатогенными грибами сопровождалось изменением спектра неспецифических эстераз. Так, у непарного шелкопряда были обнаружены две дополнительные изоформы в средней части спектра (рис. 1в), у боярышницы - одна дополнительная изоформа (рис. 1г). Эстеразный спектр жирового тела пчелиной огневки при микозах не изменялся, тогда как в гемолимфе было отмечено появление в нижней части спектра трех дополнительных эстераз (рис. 1а). Кроме того, в гомогенатах пчелиной огневки исчезала эстераза в нижней части спектра, а у непарного шелкопряда отмечено снижение активности изоформы Е7. У гусениц пчелиной огневки, одновременно с появлением дополнительных эстераз в гемолимфе, регистрировали резкое повышение суммарной эстеразной активности (рис. 2). Высоковирулентные штаммы M.anisopliae Р-72, 85-69 и B.bassiana 4-88 индуцировали повышение эстеразной активности через 12-48 ч, средневирулентные B.bassiana 110-70 и P.fumoso-roseus 1-26 -через 96-144 ч и слабовирулентный P.fumoso-roseus Pfn - через 192 ч. Невирулентные штаммы M.anisopliae МаН и 44 по-разному влияли на спектр и активность неспецифических эстераз. Первый, подобно вирулентным штаммам, индуцировал изменения в эстеразном комплексе гемолимфы через 24-48 ч после обработки им насекомых, а второй не обладал такой способностью. В целом, коэффициент корреляции, рассчитанный между временем начала индукции дополнительных изоформ эстераз и LT50, оказался равным 0.89±0.21 (при Р=0.05). Изменение спектра эстераз и их активности происходило у насекомых, на кутикуле которых были зарегистрированы черно-бурые пятна.

Для того, чтобы определить, специфична ли экспрессия эстераз, наблюдаемая при микозах, мы изучили влияние различных факторов на

О.О -,-1-1-,---

3 12 24 48 96 192

Время после обработки гусениц грибами, ч

1,0

£ о,б

0,2

3 12 24 48 96 144 192

Время после обработки гусениц грибами, ч

Рис. 2. Изменение эстеразной активности гемолимфы гусениц С.теИопеИа при микозах: к- контроль (шгтактные насекомые); 1,2- гусеницы, инфицированные средне-вирулентным 110-70 (I) и вьгсоковирулентным 4-88 (2) штаммами В.Ьа$$1апа\ 3, 4, 5-гусеницы, инфицированные невирулентными 44 (3), МаН (4) и высоковирулентным Р-72 (5) штаммами М.атзорИае; 6, 7 - гусеницы, инфицированные слабовирулентным 1Тп (6) и средневирулентным штаммами 1-26 (7) штаммом Р./ито$о-го5еи5\ * обозначены точки, достоверно отличающиеся от контрольных на 5%-ном уровне значимости по НСРо5=0.165.

0.0

спектр этих ферментов. Было установлено, что у гусениц пчелиной огневки и непарного шелкопряда индукция дополнительных изоформ регистрируется при механическом повреждении интегументов, резком охлаждении насекомых и обработке децисом. При голодании насекомых изменений в комплексе эстераз не происходило. Различные типы корма (искусственная питательная среда, листья березы) также не оказали заметного влияния на спектр и активность эстераз непарного шелкопряда. Заражение грибами личинок колорадского жука и гусениц черемуховой моли не сопровождалось изменением спектра и суммарной эстеразной активности, хотя отмечено, что у черемуховой моли при микозах происходит резкое усиление активности изоформы Ез. Аналогичные изменения у этого насекомого также были зарегистрированы и при отравлении децисом. Механическое повреждение покровов колорадского жука и черемуховой моли не отражалось на спектре неспецифических эстераз.

Инфицирование и последующее развитие энтомопатогенных грибов в организме насекомых сопровождается сильнейшим разрушением тканей и органов насекомого-хозяина. Вероятно, поэтому регистрируются одинаковые изменения в спектре эстераз как при микозах, так и при механическом

И

повреждении интегументов. Индукцию дополнительных эстераз при отравлении инсектицидами и замораживании-оттаивании также можно объяснить повреждением различных клеток тела организма, в первую очередь - гиподермы. Необходимо отметить, что последний фактор оказался неодинаково эффективным для разных видов насекомых. Так, чтобы вызвать индукцию эстераз у пчелиной огневки, необходима была 30-ти минутная продолжительность периода охлаждения при —4°С. Для гусениц 2-го возраста непарного шелкопряда минимальная экспозиция при этой же температуре должна была составлять 50-60 мин. Охлаждение в течение 1.5 ч гусениц черемуховой моли не приводило к изменениям эстеразного спектра. Вероятно, повреждающее действие холода напрямую зависит от холодостойкости и образа жизни насекомых.

В целом, данные, полученные нами по изменению спектра неспецифических эстераз насекомых, совпадают с литературными. Так, Г.К.Андросов и М.И.Алиева [1980], изучая эстеразы пчелиной огневки, обнаружили, что инъекция культуральной жидкости В.Ьаззшпа в гемоцель гусеницам вызывает увеличение белковых зон, обладающих эстеразной активностью. Вероятно, в данном случае основным фактором, приводящим к изменению спектра эстераз, также является механическое повреждение покровов насекомого во время инъекции культуральной жидкости в гемоцель. Следует отметить, что изменение спектра и активности эстераз при повреждении тканей отмечают и другие исследователи. Причем, характер изменений в комплексе эстераз аналогичен изменениям, вызванным инфекцией [БЬ^иИ, Ка1о, 1996]. По-видимому, это связано с тем, что повреждение тканей характерно для большинства инфекций, что с одной стороны, обусловливает одинаковые изменения в спектре и активности неспсцифических эстераз при различных видах инфекций, а с другой -позволяет организму насекомого адекватно реагировать на заражение вне зависимости от природы патогена.

Таким образом, микозы у насекомых сопровождаются изменением спектра и активности эстераз. Изменения в спектре эстераз при микозах обусловливаются повреждением покровных тканей гифами и/или токсинами гриба. Принимая во внимание широкую субстратную специфичность и многофункциональное значение неспецифических эстераз в организме насекомых, вполне закономерно предположить, что экспрессируемые при микозах эстеразы помимо деградации токсичных продуктов метаболизма энтомопатогенных грибов могут быть связаны с репарационными процессами и метаболизмом биологически активных веществ.

3.4. Типирование неспецифическнх эстераз

Для биохимической характеристики неспецифических эстераз широко используется ингибиторная специфичность. В результате работы было установлено, что активность экспрессируемых при микозах эстераз у пчелиной огневки полностью подавлялась метафосом, у непарного шелкопряда - фторидом натрия, метафосом, ИБФ, ЗДБ-трибутилтритио-

12

фосфатом и ДЦВФ, у боярышницы - фторидом натрия, метафосом и диазиноном. Из результатов ингибиторного анализа следует, что индуцибельные эстеразы наиболее близки по ингибиторной специфичности к карбоксилэстеразам.

3.5. Влияние микозов на спектр и активность глутатион-в-трансфераз и микросомальных монооксигеназ

Дифференциальный спектр СО-воссгановленного цитохрома Р450 у гусениц пчелиной огневки был типичным для данного фермента. Он не изменялся при инфицировании энтомопатогенным грибом М.атэорНае (штаммы Р-72 и МаН), резком охлаждении (при -4°С в течение 30 мин) и механическом повреждении кутикулы. Количество цитохрома Р450 также не различалось между вариантами опыта и составляло, в среднем, 106±32 пикомоль/мг белка. Однако, несмотря на то, что цитохром Р450 стабильно регистрировался в гомогенатах насекомых, обнаружить монооксигеназную активность нам не удалось.

Удельная глутатион-8-трансферазная активность оказалась высокой в гомогенатах колорадского жука и пчелиной огневки (1.4±0.4 и 5.3±0.7, соответственно). В гемолимфе, напротив, она была крайне низкой (0.114±0.101). Различные виды микозов, механическое повреждение кутикулы и резкое охлаждение не влияли на суммарную активность данных ферментов. Необходимо отметить, что некоторым исключением явился высоковирулентный штамм Р-72 М.атзорИае, который через сутки после инфицирования гусениц пчелиной огневки приводил к 2-3-х кратному повышению глутатион-8-трансферазной активности (0.114±0.101, по сравнению с 0.38±0.140 у интактных насекомых) в гемолимфе. Однако, из-за высокой вариабельности данного признака и низкой активности фермента, повышение оказалось статистически недостоверным на 5%-ном уровне значимости.

3.6. Изменение чувствительности О.те11опе11а к инсектицидам при микозах

В качестве инсектицидов в работе были использованы дельтаметрин и коммерческий препарат фуфанон (57%-ный концентрат эмульсии малагиона). Эти инсектициды имеют в своей молекуле сложноэфирную связь и разрушаются в организме насекомых неспецифическими эстеразами, поэтому вполне закономерно предположить, что повышение общей эстеразной активности гемолимфы у гусениц пчелиной огневки должно приводить к снижению чувствительности насекомых к инсектицидам. Чувствительность к дельтаметрину составила 1,8±0.2 мкг/г для интактных гусениц и 2.1±0.2 мкг/г для гусениц, зараженных грибом М.атюрИае (указано значение ЬО50 при РЮ.05). Полученное в эксперименте незначительное снижение чувствительности было статистически недостоверным. Возможно из-за того, что нарушение целостности покровов при микозах усиливает скорость проникновения инсектицида в организм, а

13

это, как правило, повышает контактную токсичность большинства инсектицидов [Welling, Paterson, 1985]. Напротив, существенные различия были установлены для фосфорорганического препарата фуфанон. Полулетальная доза малатиона (действующие вещество препарата фуфанон) для интактных гусениц составила 1.4+0.7 мг/г. Для инфицированных гусениц рассчитать LD50 нам не удалось, поскольку даже не разведенный препарат (5.7 мг/г) вызывал не более, чем 30%-ную гибель. При использовании ингибиторов детоксицирующих ферментов были получены результаты (табл. 2), которые показывают, что у обработанных ингибитором неспецифических эстераз 8,8,8-трибутилтритиофосфатом (ТБТФ) гусениц пчелиной огневки резко возрастает чувствительность к малатиону. Это свидетельствует о том, что деградация малатиона у интактных и инфицированных гусениц пчелиной огневки осуществляется карбоксилэстеразами. Если принять во внимание, что экспрессируемые при микозах эстеразы также являются карбоксилэстеразами (глава 3.4.), то вполне вероятно, что повышение толерантности к фуфанону у инфицированных гусениц обусловливается повышением активности данных ферментов. Необходимо, однако, отметить, что ТБТФ не вызывал полного угнетения эстераз, в том числе и экспрессируемых при микозах. Вероятно, при более сильном ингибировании эстераз синергитический эффект был бы более выражен. Применение ингибитора микросомальных монооксигеназ пиперонилбутоксида (ППБ) не приводило к снижению или повышению токсичности малатиона. Вероятно, это связано либо с минимальным вкладом монооксигеназ в деградацию малатиона, либо с тем, что дезапкилирование (сопровождается снижением токсичности) и десульфирование (сопровождается повышением токсичности) инсектицида с одинаковой интенсивностью протекает в организме гусениц пчелиной огневки, а ППБ в равной степени ингибирует эти процессы. Возможно, что в деградации малатиона у гусениц пчелиной огневки принимают участие глутатион-S-трансферазы, суммарная активность которых также увеличивается при микозах (глава 3.5.).

Таблица 2

Влияние ингибиторов эстераз и монооксигеназ на токсичность малатиона для гусениц 5-го возраста G. mellonella

Ингибиторы Гибель гусениц, %

ТБТФ ППБ Интактиые Инфицированные

- - 50120 1015

+ • 70±23 55+25

- + 60120 15+15

Примечание. "+" означает, что при обработке гусениц инсектицидами ингибиторы не применяли и применяли, соответственно. Насекомых обрабатывали фуфаноном в 1.4 мг/г по действующему веществу - малатиону. Расход ингибиторов составил 0.1 мкл/г.

3.7. Возможные причины синергизма между биопрепаратами на основе энтомопатогснных грибов и химическими инсектицидами

Рассматривая роль экспрессируемых эстераз при микозах (глава 3.3.), мы предположили, что они могут участвовать в деградации грибных метаболитов или репарационных процессах, т.е. непосредственно связаны с механизмами резистентности насекомых к эптомопатогенным грибам. Вполне закономерно предположить, что ингибирование этих ферментов, например, фосфорорганическими инсектицидами, должно обусловить снижение резистентности насекомых к возбудителям микозов. Действительно, при совместном использовании возбудителя зеленой мускардины M.anisopliae и фосфорорганического инсектицида актелика в дозах, близких к LD50, было зарегистрировано увеличение гибели гусениц черемуховой моли на уровне аддитивного эффекта (рис. 3). Проведенные исследования спектра неспецифических эстераз гусениц черемуховой моли показали, что актелик in vivo снижает активность большинства эстераз, за исключением Ei и Ег (рис. 4). Однако из-за высокой токсичности актелика для черемуховой моли весьма сложно сделать однозначный вывод о причинах, обусловливающих повышение гибели насекомых. Кроме того, высокая вирулентность M.anisopliae также оказалась нежелательным признаком, поэтому, чтобы подтвердить, что причиной синергизма между энтомопатогенными грибами и инсектицидами является снижение эстеразной активности, были использованы менее токсичные для черемуховой моли фосфорорганическис соединения ЙДБ-трибутилтритио-фосфат (ТБТФ), ИБФ и ДЦВФ, а инфицирование насекомых осуществляли слабовирулентным 4-88 и невирулентным НК5 штаммами B.bassiana. При использовании этих ингибиторов были обнаружены те же эффекты, что и с актеликом (рис. 5). Так, обработка насекомых ингибиторами эстераз на 7487% и 22-91% увеличивала количество погибших насекомых при инфицировании их слабовирулентным 4-88 и невирулентным НК5 штаммами, соответственно. Необходимо отметить, что увеличение процента погибших особей не зависело от интенсивности подавления эстераз ингибиторами. Так, при использовании для заражения невирулентного штамма НК5 синергизм увеличивался в следующем ряду: ДЦВФ < ТБТФ < ИБФ, тогда как способность ингибировать эстеразы - ДЦВФ < ИБФ < ТБТФ (разница между ингибиторами была статистически достоверной на 1%-ном уровне значимости) (см. рис. 4). При использовании для заражения слабо-вирулелтного штамма 4-88 статистически достоверных различий между ингибиторами обнаружено не было. Необходимо отметить, что эксперименты по влиянию актелика и фосфорорганических ингибиторов эстераз проводили с разными популяциями черемуховой моли (из п. Краснообск и из п. Нижняя Ельцовка, соответственно). В результате работы были обнаружены популяционные различия по спектру эстераз гусениц. Принимая во внимание высокую вариабельность спектра эстераз черемуховой моли, крайне сложно определить обусловлен ли наблюдаемый

100% 1 80% ■ 60% -40% -20%

0%

0,0005 0,0010 0,0050

Доза акгелика мкл/особь

□ 1

ES32

ЕИЗ

Рис.3. Гибель гусениц Н.еуопутеИш при обработке фосфорорганическим инсектицидом актеликом (1), инфицировании грибом М.шиюрИае (3) и совместной обработке грибом и актеликом (2).

*, ** - точки, достоверно отличающиеся от контрольных (без обработки ингибиторами) на 5%-ном и 1%-ном уровнях значимости, соответственно (для рис. 3, 5).

К К А А

aMÉfc Шк-

4 ш

ti

к к 1 1 2 2 3 3

Рис. 4. Влияние in vivo фосфорорганических соединений на спектр неспецифических эстераз гусениц H.evonymellus: а - насекомые из п. Краснообск, 1999 г., б - насекомые из п. Нижняя Ельцовка, 2000 г.; к- интактные насекомые; А- гусеницы, обработанные актеликом (10"3 мкл/особь), 1 - гусеницы, обработанные ИБФ (3 мкг/особь); 2 - гусеницы, обработанные ДЦВФ (0.75 мкг/особь); 3 - гусеницы, обработанные ТБТФ (Змкг/особь). Экспозиция после обработки ингибиторами - 48 ч.

Штаммы грибов

р, ¡¡И* 1,' Ш,

Рис. 5. Влияние фосфорорганических ингибиторов неспецифических эстераз (ИБФ, ТБТФ, ДДВФ) на гибель гусениц Н.еуопутеНия, инфицированных слабовирулентным (488) и невирулентным (НКз) штаммами гриба В.Ьает'ала: 1 - гибель гусениц, инфицированных грибами (без обработки ингибиторами), 2-4 - гибель гусениц, обработанных ингибиторами эстераз ТБТФ (2), ДДВФ (3), ИБФ (4) и инфицированных грибами.

нами синергизм с ингибированием определенных изоформ, или гораздо важнее для его проявления снижение суммарной эстеразной активности.

Таким образом, свойство фосфорорганических пестицидов ингиби-ровать карбоксилэстеразы служит одной из причин, обусловливающих синергизм между грибными биопрепаратами и химическими инсектицидами, что может быть использовано для создания новых препаративных форм грибных биопрепаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оригинальные исследования, проведенные в данной работе, а также литературные данные [Соколова, Сундуков, 1998; Кольчевская, Кольчевский, 1988; МасЫага-Вопшете1е2, Кисега, 1978; Бщак ег а1., 1978], позволяют говорить о том, что инфекционные заболевания - один из существенных факторов, определяющих активность и спектр детоксицирующих ферментов у насекомых. В частности, нами установлено, что инфицирование энтомопагогенными грибами гусениц пчелиной огневки, боярышницы, непарного шелкопряда и черемуховой моли приводит к

изменению спектра и активности неспецифических эстераз и глутатион-S-трансфераз. Изменение активности детоксицирующих ферментов является неспецифической реакцией насекомых и обусловливается повреждением покровных тканей. Другие авторы также отмечают, что повреждение тканей различных органов приводит к изменениям в спектре и активности детоксицирующих ферментов, аналогичным тем, что регистрируются при инфекциях [Shiotsuki, Kato, 1999; Sujak et al., 1978; Mourya et ed., 1995]. По-видимому, повреждение тканей (механическое или химическое) - наиболее общий признак при инфекционном процессе, что, с одной стороны, обусловливает одинаковые изменения при различных инфекциях, а с другой -позволяет насекомым адекватно реагировать на инфицирование патогенами в независимости от их природы.

Механизмы резистентности насекомых к энтомопатогенным микроорганизмам, в основном, изучены с точки зрения элиминации патогена из организма зараженного насекомого. В частности, при микозах отмечена важная роль фагоцитоза, инкапсуляции и меланизации кутикулы [Vey, Götz, 1986; Leger et al., 1988b]. Механизмы же, связанные с детоксикацией метаболитов патогена или токсичных продуктов, образующихся при разрушении тканей хозяина, практически не исследованы, хотя роль токсинов в грибном патогенезе весьма значительна. Например, неоднократно отмечалось, что гибель насекомого происходит задолго до проникновения гриба во внутренние органы насекомого [McCauley et al., 1968; Pekrul, Grula, 1979; Thorvilson et al., 1985]. По-видимому, повышение активности детоксицирующих ферментов при микозах и других инфекциях [Madziara-Borusiewiez, Kucera, 1978; Sujak er al., 1978; Mourya et al., 1995] - это ответная реакция насекомого на интоксикацию организма токсичными метаболитами патогена или продуктами распада тканей хозяина. Подтверждением участия индуцибельных ферментов в детоксикационных процессах может служить зарегистрированное нами снижение чувствительности к пиретроидам и фосфорорганическим инсектицидам у инфицированных грибами гусениц пчелиной огневки. О связи эстераз с механизмами резистентности к энтомопатогенным грибам может также свидетельствовать резкое повышение восприимчивости насекомых к возбудителям микозов при обработке фосфорорганическими ингибиторами эстераз.

Таким образом, увеличение активности детоксицирующих ферментов -один из универсальных механизмов, обеспечивающих резистентность насекомых не только к ксенобиотикам, но и к возбудителям инфекционных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Инфицирование гусениц G.mellonella, A.crataegi, Ldispar энтомопатогенными грибами M.anisopliae, B.bassiana и P.fumoso-roseus Приводит к изменениям спектра и активности неспецифических эстераз. При микозах у гусениц G.mellonella наблюдается появление 3-х новых изоформ в гемолимфе и исчезновение одной в гомогенатах целого тела. Эстеразный спектр жирового тела этого насекомого при микозах оставался без изменений. Отмечено, что появление дополнительных изоформ эстераз

вызывает резкое повышение суммарной эстеразной активности гемолимфы. Инфицирование гусениц L.dispar сопровождается появлением 2-х новых изоформ и снижением активности изоформы Е7. У гусениц A.crataegi также зарегистрирована индукция дополнительной эстеразы.

2. При микозах у гусениц H.evonymellus не обнаружено изменение эстеразного спектра. Однако наблюдалось повышение активности изоформы Ej.

3. Установлено, что изменение спектра неспецифических эстераз при микозах у насекомых обусловлено повреждением покровных тканей.

4. Индуцибельные эстеразы наиболее близки по свойствам к карбоксилэстеразам. Их активность у пчелиной огневки in vitro полностью подавлялась метафосом, у непарного шелкопряда - фторидом натрия, метафосом, ИБФ, ЗД5-трибутилтритиофосфатом и ДДВФ, у боярышницы - фторидом натрия, метафосом и диазиноном. Кроме того, ИБФ и ДДВФ частично снижали активность индуцибельных эстераз у пчелиной огневки.

5. При заражении личинок L.decemlineata энтомопатогенными грибами не обнаружено изменение спектра и активности неспецифических эстераз.

6. Для интактных и инфицированных гусениц G.mellonella и A. crataegi не установлено существенных различий по содержанию и спектру цитохрома Р450.

7. У инфицированных грибами гусениц G.mellonella в 5 раз снижается чувствительность к фосфорорганическому препарату фуфанон, что обусловлено повышением общей эстеразной и гутатион-З-трансферазной активности гемолимфы.

8. У инфицированных грибами гусениц G.mellonella зарегистрировано 5-ти кратное снижение чувствительности к фосфорорганическому препарату фуфанон, что, вероятно, обусловлено повышением активности неспецифических эстераз и глутатион-Б-трансфераз гемолимфы.

9. Обработка гусениц H.evonymellus фосфорорганическими ингибиторами эстераз приводит к резкому повышению восприимчивости насекомых к энтомопатогенным грибам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крюкова H.A., Серебров В.В. Изменение ферментативной активности в гемолимфе и гемоцитах Gallería mellonella при заражении энтомопатогенным грибом Metarhizium anisopllae // Паразиты в природных комлексах и рисковые ситуации. -Новосибирск, 1998. -С.81-83.

2. Серебров В.В. Изменение спектра эстераз гемолимфы чещуекрылых при микозах.// Взаимоотношения паразита и хозяина: Тез. докл. конф. 8-10 декабря 1998. -М., 1998. -С. 59.

3. Серебров В.В., Киселев A.A., Глупов В.В., Бахвалов В.В. Факторы, влияющие на эффективность биопрепаратов на основе энтомопатогенных грибов// Сохранение и защита горных лесов. - Ош (Кыргызстан), 1999. -С.23-24.

4. Серебров В.В., Алексеев A.A., Глупов B.C. Изменение активности и спектра эстераз гемолимфы гусениц вощинной моли Gallería mellonella L. (Lepidoptera; Pyralidae) при микозах// Известия РАН. Серия биологическая (в печати).

5. Борисов Б.Б., Серебров ВВ., БойковаИ.В., Новикова И.Н. Энтомопато-генные аскомицеты и дейтеромицеты// Патогены насекомых: структурно-функциональные аспекты (Под ред. В.В. Глупова) -М.: Круглый год, 2000 (в печати).