Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДЕСТРУКЦИЯ ГЛИКОЛЕЯ И МЕТАНОЛА БАКТЕРИЯМИ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ДЕСТРУКЦИЯ ГЛИКОЛЕЯ И МЕТАНОЛА БАКТЕРИЯМИ"

А-ЪОШ

С-б! 2/6/.

ОРДЕНА ЛЕШКА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ . АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ ИМ. Д. К. ЗАБОЛОТНОГО

■ На правах рукописи

СЕДШ1А Светлана Анатольевна

ДЕСТРУКЦИЯ ГЛИКОЛЕЯ И НЕТАШЛА' БАКТЕРИЯМИ Специальность - 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Киев - 1992

Работа выполнена в отделе технологии биосинтева ордена Трудового Красного Знамени Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины.

член-корреспондент АН Украины доктор биологических наук а С. Подгорский

доктор биологических наук ■ Е Е Иванов

доктор биологических наук Е И. Гвоздя к

, кандидат биологических иаук Е. Я Громовова

, Киевский технологический институт пищевой промышленности 1

Защита состоится _"_;_19У2 г. в _часов на заседании специализированного совета Л 016.Сб. 01 по защите диссертация на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины /252143, г. Кие в-143, ул. Заболотного, 154, Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины/.

С диссертацией моимо ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д. к. Заболотного АН Украины.

Автореферат разослан "_"_19С2 г.

Научные руководители;

Официальные оппонентии

Ведущая организация;

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Э. А, Коваленко

Актуальность проблемы. Важной задачей современной микробиологии, связанной с разработкой комплекса мер по охране окружающей среды от аагряанения, является изучение процессов жизнедеятельности микроорганизмов - деструкторов органических веществ производственных сточных вод.

В технологических процессах добычи и промысловой подготовки газа расходуется в большом объеме токсические вещества - низко молекулярные алифатические гликоли - этиленгликоль (ЭГ), диэтиленг-ликоль (ДЭГ) и метанол. Таким образом гликоли и метанол являются основными компонентами сточных вод предприятий гавовой промышленности. в настоящее время вьвококонцектрнрованные стоки, содержаще гликоли, метанол или их смесь в значительных объемах закачивается в поглодающие горизонты иди сжигаются. Разработка и внедрение технологий микробиологического обезвреживания высоко- и низкоминерализованных сточных вод на основе специализированных культур микроорганизмов позволит предотвратить загрязнение природной среды токсичными веществами, обеспечит возможность перехода к созданию безотходных технологий в газовой промышленности.

Однако решение ряда технологических проблем биологической очистки производственных сточных вод невоеможно беа выработки научных основ.процессов жизнедеятельности микроорганивмов - деструкторов, изучения физиолого-биохимических особенностей их роста и деструкции токсикантов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в установлении фиенолого-биохимических закономерностей роста микроорганизмов, использующих гликоли и метанол в качестве единственных источников углерода.

Поставленная цель предполагала решение следующих задач:

1. Поиск, выделение и селекцию микроорганизмов - деструкторов гликолей и метанола.

2. Идентификацию наиболее активных штаммов - деструкторов гликолей и метанола.

3. Исследование фивиологических особенностей роста штаммов -активных деструкторов гликолей и метанола.

4. Конструирование ассоциации микроорганизмов, активно усваивающей смесь гликоль-метанол в качестве источника углерода.

Научная новизна. Селекционирована устойчивая ассоциация бактерий, выделенных из почвы, и использующая диэтиленглиноль в качестве единственного источника углерода. Установлены симбкотичес-кие взаимоотношения ассоциантов.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУ'ПЛЛ ЬпБЛИОТЕКА Моск. сельскохоз. академии

Выделены активные штаммы культур - деструкторов низкомолеку-дяряых алифатических гликолей и метанола. Научены морфологические, культурадьные и физиолога-бнохимиче с кие признаки выделенных культур, определена их таксономическая принадлежность.

Установлены физиологические закономерности роста наиболее активного штамма - деструктора диэтиленгликоля в периодическом режиме культивирования. Впервые определена константа насыщения для роста культуры на среде с диэтиленгликолем. Предложена гипотеза об участии внутриклеточных лнпаз в процессе деструкции эфирной связи молекулы диэтиленгликоля. Исследовано влияние фиаи-ио-химических Факторов на физиологические показатели роста исследуемого жгаыма на среде с диэт ил© нг дико леи.

Показана возможность конструирования ассоциации микроорганизмов, использующей двухкомпонентный субстрат гликоль-метанол в качестве источника углерода.

Практическая значимость. Селекционированная ассоциация, выделенные чистые культуры микроорганизмов - деструкторов риэкомолекулярных алифатических гликолей и метанола, а также сконструированная ассоциация, использующая смесь гликоль-метанол в качестве источника углерода могут быть рекомендованы для использования в процессах очистки сточных вод предприятий газовой промышленности.

Результата по исследованию физиологических и технологических свойств чистых и смешанных культур бактерий - деструкторов гликолей и метанола могут быть использованы при разработке биотехнологий: а) микробиологического обезвреживания сточных вод предприятий газовой промышленности; б) получения сухих форм биопрепаратов на основе живых микроорганизмов, предназначенных для очистки сточных вод, почв, водоемов, загрязненных гликолями и метанолом.

Апробация работы. Основные положения диссертационной.работы доложены и обсуждены на 1-й Всесоюзной конференции "Экология нефтегазового комплекса" (Надым, 1888), Всесоюзном семинаре "кбжро-биология охраны биосферы" (Киев, 1988), представлены в работе Всесоюзной жолы-конференции молодых ученых "Физиология, биохимия и генетика микроорганизмов - фундаментальная основа биотехнологии мккроорганивмов" (Алушта, 1990), на Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1691), на конференциях молодых ученых Института микробиологии и вирусологии АН Украины (Киев, 1988, 1969). ,

Публикации. № результатам исследований опубликовано 5 научных работ и имеется положительное решение по заявке на патент.

Струстура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста и содержит 15 таблиц и 26 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка основной использованной литературы из 277 наименований, в том числе 182 иностранных, и приложения, которое включает положительное решение ВНИИГГО по заявке "11№амм бактерий Раеийомопая риИйа - деструктор низномонокулярных алифатических гликолей", акт опытно-промышленных испытаний процесса получения опытной партии биопрепарата на основе микроорганизмов деструкторов гликолей.

Материалы.и .методы исследований. Получение накопительной культуры и селекцию ассоциации, адаптированной к диэтиленгликоль-содержащим средам проводили в несколько этапов.

Осуществляли отбор проб почв предприятий газовой промышленности. Накопительную культуру выращивали в колбах на качалках на водопроводной воде с добавлением 0,3 г/л аммофоса и 4 г/л диэти-ленгликоля. Селекцию биоценоза проводили в течение 1 месяца на аналогичной среде при непрерывном культивировании накопительной культуры в лабораторном аэротенке с рабочим объемом 1 л и скоростью разбавления 0,02 ч1. Дальнейшую селекцию ассоциации проводили в лабораторном ферментере АНКУМ-2М в режиме непрерывного культи-, вирования на среде следующего состава (в г/Л (ЯН^)¡^ЯЗ^- 3,0,

НаС1 - 0,5, Мг504-0,7, К2НР04- 0,1, КНгР04-1,0 (среда N1), дизтк-

ленгликоль - 0,5 или 1,0 г/л; водопроводная вода - до 1 д. Культивирование проводили в следующем режиме: рабочий оСьем ферментера - 5 л, число оборотов меиалки (п) - 800 об/мин, температура Э0°С, рН 6,5 - 7,0, расход воздуха 0,5 л /л мин. Для поддержания рН использовали 3 Х-ый раствор ИаОН.

Получение накопительной культуры микроорганизмов - деструкторов метанола проводили в £ этапа: 1) отбирали образцы почв, речной воды и ила на территории вблизи предприятия газовой промышленности; 2) смешивали пробы и выращивали накопительную культуру в колбах на качалках на среде следующего составаС в г/л ): КН^РО^ - 3,0. КгНР04 - 7,0, НН^Од - 1,0, МеС1г - 0,1 Середа N2),

концентрация метанола - 0,5 обХ.

Для выделения чисти культур бактерия, использовали МПА, и агаризованнш среды следующего состава (в г/л): агар-агар - 15, KgHP04- 0,5, НК4С1 - 1,0, диэтиленгдиколь или метанол - 5 ; стерильная водопроводная вода до - 1 Л, Шращивание колоний микроорга-

ниемов проводили при 30°С в течение 3-5 суток в аэробных условиях.

Идентификацию чистых культур проводили по определителю Берги (1957, 1974), а также с использованием оригинальных работ (Випри-анова и др., 1973; Нестеронко и др., 1986} Романовская и др., 1986; Green et al. , 1983),

Для количественного учета микроорганизмов смешанных популяций проводили высев на бактериально« суспенвии методом предельных разведений на МПА и на агаривованные среды с добавлением соответствующего субстрата.

Культивирование ассоциаций, а такие чистых культур микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера на среде N2 (pH 7,6) при

25-30°С. Субстраты вносили в концентрации S г/л (для гликолей) или 0,6 обх (для метанола).

При исследований влияния различных концентраций субстрата на фиеиологические показатели процесса периодического культивирования концентрацию диэт иле к гликоля в среде варьировали от 1 до 80 г/л, метанола - от 0,2 до 3 об2.

Влияние концентрации гликолей в среде на удельную скорость роста на физиологические показатели роста иеучади в "острых опытах", ив меряя начальные скорости процесса культивирования (Работ-нова и др., 1979). Концентрацию ди- и этилевгликоля варьировали от 0,06 до 100 г/л. Культивирование осуществляли в течение 1-3

часов в микробиологических пробирках при температуре 25°С на круговой качалке (220 об/мин).

При конструировании ассоциации, использующей смесь диатилек-глимоль-метанол в качестве источника углерода, проводили ее вира-Чтение на среде N2, содержащей дизтиленгликоль (0,5 об.Х) и метанол (0,5 об. S).

Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности клеточной суспензии (Л-540 нм) с последующим пересчетом на абсолютно сухую биомассу по калибровочному графику.

Величины кинетических констант - константы насыщения Kj. и

максимальной удельной скорости роста jn определяли графическим ме-

тодом (Келети, 1990).

Физиологически« показатели процесса периодического культивирования - удельную скорость роста (_|п), экономический коэффициент по субстрату (У), метаболический коэффициент (ц) определяли общепринятыми методами (Парт, 1978).

Концентрацию гликолей и метанола в культуральной жидкости определяли на хроматографе "С11Гот-5" /ЧСФР/.

Составление баланса макроэргических соединений и теоретический расчет выхода биомассы проводились по методике, приведенной в работах В. Н. Иванова (1981, 1937).

Полученные результаты обрабатывали статистически.

ДЕСТРУКЦИЯ ДИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ АССОЦЯАВДЕЯ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ.

Изучение состава ассоциации, испольеуищей диэтиленгдииоль в качестве источника углерода. Результаты количественного изучения состава ассоциации в зависимости от условий непрерывного культивирования показали доминирование в ее составе пяти бактериальных форм микроорганизмов, условно обозначенных нами АС-1, ТБ-1, 00-1, 1ЛМ и С-1, Установлено, что ассоциация двух культур ТЗ-1 и им оказалась наиболее устойчивой к изменениям условия среды и доминировала при скорости разбавления равной 0,05 ч"{ Доминирование культур АС-1 и ОС-2 в условиях относительно нивкой скорости разбавления свидетельствует, по-видимому, об их принадлежности к медленнорастущим микроорганигмам. Предполагается, что штаммы Т5-1 и С-1 представляют сопутствующую микрофлору и используют в качестве питания продукты неполного окислений дизткленгликоля. Вакге-рии, условно обозначенные как , АС-1, ОС-2 были выделены в чистые культуры после многократных пересевов на агариэовшшых средах с добавлением дизтиленгликоля в качестве единственного источника углерода,

На основании морфолого-культуральной, фиеиолого-биохимической и других характеристик выделенные штаммы были отнесены к родам А1сяИе»пез, НусоЬжСеПит, ОТкх*ососсиз, ЛсЬготоЬасгег.

Исследование трофических взаимоотношений в ассоциации. Для изучения механиама деструкции дизтиленгликоля ассоциацией, ее компоненты культивировали на жидких средах, содержащих в качестве источника углерода возможные промелето'шые продукты метаболизма дизтиленгликоля. Проведенные исследования показали, что бактерии-деструкторы дизтиленгликоля - ЫусоЬасСегШт ер. ОС-2,

Jthoctococcus sdl ЛC-i. Alcaliffenes paradoxus LY-i активно усваиьа-от этиленглнколь б качестве единственного источника углерода. Гликолат и глиоксилат с разной степенью активности использовался всеми четырьмя культурами. Кроме того, культуры Alcal 1 въпшв paradoxus LY-1 и AcHromobecter ¡opticus TS-1 активна усваивали ramus дат. Ни одна культура не ис по ль во вала ацетэльдегид и ацетат в качестве субстрата для роста

На основании полученных данных можно предположить, что деструкция диэтиле нгдиколя селекционированной бактериальной ассоциацией происходит черев образование этиленгликоля, который в дальнейшем метаОолиэируется ъ цикле трикарбоновых кислот по гликоле-вому пути с промежуточным ойраеованием глицериновой кислоты Ас-социант Actromobacter iophasvs включается в процесс метаболизма на стали» образования гликолата. Очевидно, основную роль в деструкции диэтнленгликоля смешанной культурой играет аесоциант, идентифиаированньЯ как Alcal t genes paradoxus LV-1.

Таблица l

Показатели роста чистых культур и ассоциации на среде с диэтиленгликолем

Микроор-

Исходная Остаточная Длитель- Удельная X деструк-

органиэмы НОНЦ-Ц1» конц-ция кость куль- скорость шш ДЭГ ДЭГ, г/л ЙЗГ, г/л тивирова- роста, ния,

сутки

AlcaJ Igvntts S о, 136*0,006* paradoxus

MycobttLorium S 0,199*0,013 sp-

RhOdocvus 5 О.ОТЪ Ю.ООС SP-

Ассоциация Б 0,120*0,005

Z 0,081 67,3

20 0,007 96,9

го О,008 98,9

Е 0,078 97, В

Примечание; * укавало среднее арифметическое вначение,

* ошибка среднего арифметического.

Рев^льтаты периодического культивирования kvcotxsctcrtи» sp. ос-г, Rhodacoccas sp. АС-1, Alcmligenes paradoxus LV-t и ассоциации четырех культур представ лени б таблице 1. Ассоцкант Alcal i genes paradoxus LY-1 требует примерно в 10 рав меньше времени для деструкции диэтиленгликоля по сравнению с Mycobacterium sp. ОС-2 и Rhodococcus яр, АС-1. По-видимому, его присутствие в составе микробного сообщества определяет скорость утилизации диэ-тиленгликоля смешанной культурой.

Такиы образом, в результате селекции и адаптации получена устойчивая ассоциация микроорганизмов, использующая диэтиленгликоль в качестве единственного источника углерода и энергии. Установлено, что в ассоциации доминируют микроорганизмы родов Mycobacterium* Rhodacoccas, Alcal t denes, AchromotKycLcr. Из них штаммы родов Mycobacterium и Rhndococcus, по-видимому, могут бить отнесены к медленнорастущим формам микроорганизмов, исполъаущим диэтиленгликолъ в качестве единственного источника углерода. Наиболее активным деструктором ди- и этиленгликоля является штамм, идентифицированный как Alcalteones paradoxus LV-t. (ШГШ В-51Б1). Предполагается, что компонент ассоциации, идентифицированииА как Achromobactttr iophagus TS-1, является активным деструктором промежуточных продуктов распада основного субстрата, а метаболизм диэтиленгликоля происходит по гликолевому пути черев образование этиленгликоля на первом этапе деструкции.

Селекционированная ассоциация может быть рекомендована к использованию в процессах доочистки гликольсодержащих сточных вод во второй иди последующих ступенях очистной системы.

ДЕСТРУКЦИЯ ДИЭТИЛЫТЛИКОЛЯ ШТАММОМ PSEUDOMONAS PUT IDA flS-i В ревультате скрининга микроорганизмов, изолированных иа концентрированной сточной води, получен штамм, активно испольеу»-шу.й диэтилеигликолъ а качестве единственного источника углерода. Из основании результатов, полученных при исследовании морфоло-го-культуральних и физиолого-биохимических признаков штамм идентифицирован 1сак Pseudouonas puttda биотип Б.

Валанс макрозргических соединений (МЗС) для роста P. rxitidu BS-2 на средах о дизтиленгдиколем, атнлекгликолем. глккэдатом и глиоксилатом. При изучении способности штамма утилизировать предполагаемые продукты первично« деструкции диэтнлеиглигдли йшо установлено, что бактерии актин но использовали с качестве едииет-

-в -

пенных источников углерода следующие субстраты : этиленгликоль, глйколат, глиоксилат, глицерат. Ацетат и ацетальдегид ие исполь-вовалисъ в качестве ¡юстовах субстратов. Подученные данные позволяют предьоложить, что деструкция дизтиленгликоля шталюм л

В5-2 вероятнее всего происходит через образование зтилен-гликоля, продукты окисления которого поступают в цикл дикарбоновых кислот /окисление до СОг/ и в цикл трикарбоновых кислот /ассимиляция по пути глиоксилат -> г лидера« -> пируват -> НТК/ (рис.1)

Схема метаболизма дизтнленгликоля можвт бьггь использована для составления баланса макрозргических соединений (ЮС) и теоретического расчета выхода биомасы.

Баланс МЭС при ассимиляции углерода диэтиленгликоля в биомассу описывается уравнением;

Ь'У^Р/ОЫ^р /1/;

где расход дизтиленгликоля на синтез биомассы, моль/г АСЕ;

1/*1дТр « 0,095 - расход шлей ЮС на синтез 1 г биомассы из

З-фосфоглицерата; р/0 - фосфорилирующая эффективность окисления восстановительных эквивалентов, моль КК/мольС 2Н2.

Расход и образование МЭО и восстановительных эквивалентов на этапах 2-глиоксилат -> 3-фосфоглидерах и глицеральдегнд-Э-фосфат -> 3-фосфоглицерат взаимно компенсируют друг друга. Величину 1/У^

»южно определить из уравнения Огиинса углерода, еУтекающего из стехиометрического уравнения синтеза биомассы (Иванов и др. ,1987): +0 ^

сЛс0а-----------> ЗСН1,77°0,49Н 0,17 /2/

-Н^О -00в

1Лап-1моль/3 21,3 гАСБ-0,01372 МОЛЬДЭГ/гАСБ .. /3/;

где Й4,з - молекулярная масса "биомояя" биомассы (Иванов, 1981, 1987), образование МЭС при катаболизме дизтиленгликоля составляет согласно схемам А и Г рис. 1,:

б<г'/0) /4/;

где 1/Уса(. - расход дизтиленгликоля на окисление до С02 ; моль/ /гАСБ.

В целом баланс МЭС для роста на среде с дизтиленглнколем будет иметь вид;

♦и/у г (г/о) - дтр+ (1лгоа1> в (р/о) - о /Б/;

СН2СН?ОН л г ,

i *- ¿ +нго _ иьон снгон *гог+2М 9Н2™ 9да

О -----*-'í I ~ -->—г-2 I ^ -------—[ '

; civ; и -фя] с ко соон -г [гы ссш

CI!¿C?:£OH ¿ ■

лиэтилеи- этилен- гликоле- гликолат глиокси-

глнколь гликоль du Я альде- лат

гид Б

сю ?оон 9ю" ?оон сиитеа

2 ¿ООН■ ------- 'Н0Н кт —«««.асс.

¿но сн2он ch.¿o - ©

гликолат [тартронооый глицерат Э-фо сфогл li-

no л у альде rvi.tj церат

?Н0 НоО * АДФ СООН 3

CHOfl --------— СНСН -------- синтез биомасс и

СН20-® - [2Н] - ATO CH20-<D

глицеральде- Э-фосфогли-

гяд-Э-фосфат церат Г

СТО + CHACOS - КоА gjj¡ _ ¿5" - ¿T

соон ¿Sr IZ cit°

соон

2 ¿ "3 CU)H

глиоксилат \ мальт oneало- пируват

ацетат

ацетат i

+ КоА -5Н I

CHgCÜS - Но л ацетил КоА " С02 ~ N

bul 1 л * /Р/0/ №

|2Н] + к О-------------— НоО

J ¿ - /F/О/ АТФ 2

Рис. X, Предположительная схема основных реанииП метаболизма диэти-лонгликоля у pt^í¿da £3-А- А - преобразование до глиокси-латя; Б - ассимиляция углерода глнокеилата; Г - катаболизм гл и о кс плата в щшле пи к арб оно шх кислот; схемы В и Д нео б копимы при расчете баланса МЭС Сем. в тонете).

-JO-

откуда

(/1/Y^) E(P/0) + 1/Y дтр

1/Yoat -----------------------------------------------/6/i

б С P/O)

ИЛИ

1/Ycat - - 0,00457 + 0,01583/(?/Q) /7/;

Поскольку

1/Y - 1/Y^ + 1/Y cat /8/;

где 1/Y - величина, обратная выходу /экономическому коэ|1фици-

енту/,

то;

Y - 1/[0,01372 - 0,00457 + 0,01583/(Р/0)] /9/;

или

Y - 1Л 0,00915 + 0,01583/(Р/О) 1 гАСБ/МОЛЬДЭГ /10/.

Проводя аналогичные уравнениям /1-ю/ выкладки для роста на среде с этиленгликолем, гликолатом и глиоксилатом можно получить уравнения баланса ШС и значения выхода на этих субстратах. Для роста на среде с этилен гликолем: (l/Y^HF/O) - 1/Y дтр+ (1/Ycat) ЗСР/О) - О /11/;

Y - г/С 0,01829 + 0,03167 / (Р/0)5 гАСБ/моль ЭГ /12/; Для роста на среде с.гликолатом:

Cl/Y^/ÍP/O) - 1/Y дтр+ /1/Ycat/ 3(Р/0) - О /13/;

Y -1/[ 0,1829 + 0,03167 / (Р/0)] гАСБ/моль гликолата /14/; Для роста на среде с глиоксилатом;

- l/YATp + tl/Vcat) 2(Р/0) - 0 /15/;

Y - 1/10,02743 + 0,0475 / (Р/0): гАСБ/моль глйотеилата /16/; Сопоставление теоретических зависимостей выхода биомассы от

значения Р/0 при росте j;a средах с различными источниками углерода и энергии с полученными экспериментально значениями этого показателя свидетельствует, что: 1/ значение р/0 при росте Р. putida BS-г на средах е указанными субстратами составляет примерно 2,20 молей МЭС/моль О; 2/ схема метаболизма диэтиленгликоля и баланс ИЭС достаточно полно /с точностью 2,22/ отразит количественно стехиометрию и энергетику метаболизма диэтиленгликоля.

Влияние концентрации ДЭГ на физиологические показатели процесса периодического культивирования р. put ida BS-Z, Установлено, что ypv^afl биомассы максимален при исходной концентрации ДЗГ в

среде - 20 г/л к составляет 3,06 г АСБ/л, при концентрации ДЭГ 80 г/л значение этого показателя в £,4 раза ниже.

Показатель максимальной удельной скорости роста в экспоненциальной фазе изменяется е широких пределах: от 0,12 ч"1 при концентрации субстрата i среде равной 5-40 г/л до 0,058 ч"1 при исходной концентрации - S0 г/л.

Увеличение концентрации субстрата приводит к значительному снижения экономического коэффициента. Так, если при концентрации ДЭГ 5 г/л его значение составляет 0,32-0,34 г ДСБ/г ДЭГ, то при ингибирующих концентрациях значение этого показателя составляет только 0,04-0,05 гАСБ/гДЭГ. При концентрации ДЗГ в седе 90 г/л значение метаболического коэффициента примерно в 4 раза выше, чем в условиях, оптимальных для роста. Оптимальные для роста концентрации ДЭГ находятся в диапазоне 5-40 г/Л.

Влияние концентрации ДЭГ и 3F на удельную скорость роста. Определение К„. для роста Р. ¿mtJefa BS~Z на среде с сизтиленгликолем. Зависимость удельной скорости роста Р. putida BS-2 от начальной концентрации дизтиленгликоля представлена на рис. 2 а. Скорость роста возрастает с увеличением концентрации субстрата в среде до 5 т/л, Ингибируюцее воздействие субстрата начинает проявляться со значений концентрации дизтиленгликоля больших, чем 40 г/л. На рис. 26. представлены данные трех независимых серий эксперимента по исследованию зависимости удельной скорости роста от исходной концентрации диэтиленгликоля в среде в диапазоне концентраций от 0,06 до 20 г/л Сданные представлены в обратных координатах). Очевидно график зависимости jn от S линеаризуется в координатах 1/jn - l/S с достаточно высокой точностью, что свидетельствует о применимости уравнения Моно для описания кинетики окисления дизтиленгликоля Р. putida BS-Z в области лимитирующих концентраций, Пеличины J^ax и К определены при концентрациях субстрата до 5 г/л и равны 0,11-0,12 ч"1 и 209 ± 17 мг/л соответственно. Коэффициент корреляции между значениями обратных величии удельной скорости роста и концентрации дизтиленгликоля (г) составляет 0.883.

При постановке аналогичного эксперимента для атиленгликоля в качестве субстрата не обнаружена область лимитирования в диапазоне его концентраций а среде от 0,06 до 10 т/л. Ингибирование избытком субстрата для этиленгликоля наблюдается при исходных кон-

а)

б)

в г

« * 30 » 1. ,/•

Рис. 2. Зависимость удельной скорости роста от концентрации ДЭГ в среде (а), зависимость обратных величин удельной скорости роста и концентрации ДЭГ в среде (б).

цент рациях его в среде выше Ш г/л.

На рис. 3. экспериментальные данные, полученные при культивировании Р. ри£.1</а на средах с ДЭГ и ЭГ приведены в коорди натах 1/рт - 5. Если тормокение роста бактерий этиленгдиколем (кривая 1) соответствовало бы одной ив известных моделей субстратного ингибирования при всех концентрациях этиленгликоля, например модели, описываемой функцией Яолдейна (на рисунке прямая А), то при экспериментальная кривая приближалась бы асимптотически к прямой А. То, что экспериментальная кривая, круто подни мается вверх, более соответствует известному в ферментативной кинетике неконкурентному тормояению скорости реакции для фермента, который подвергается янгибированию субстратом. Можно предположить, что при концентрациях этиленгликоля, лежащих в интервале 10-70 г/л, торможение роста бактерий соответствует субстратному янгибированию, описываемому функцией Холдейиа, а при бо.яее высоких - ингибиро'эание приобретает иной характер. В соответствии с этим константа ингибирования для данного интервала концентраций ЭГ составляет 50 г/л (рис. 3).

График, построенный по экспериментальным данным, гэлученниь;

Рис. 3. Зависимость обратной величины удельной скорости роста Р. ри С14а В5-2 от ингибирующай концентрации субстрата: 1 - среда с этиленгликолем, 2 - среда с диэтиленгликолем

в результате роста Р. put^da на среде с диэтилёнгликолем в качестве субстрата (кривая 2 на рис. 3), не имеет прямолинейного участка в области ингибирования избытком субстрата (или он-очень незначителен). По-видиному, торможение роста диэтиле«гликолем имеет более сложный хар-актер, чем простое неконкурентное торшш-ние, к не подчиняется ни одной ив иввестных моделей субстратного ингибирования. Характер полученных закономерностей, возможно, объясняется переключением механизмов и мест ингибирования - сначала субстратное ¡шгнСирование ферментативного окисления, затем ингиОировакие окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи (в случае с ЭГ), либо смешанным х&рагегером ингибировьния, когда может происходить одновременное тормошние в нескольких функциональных местах клеточного метаболизма (8 случае с ДЗГ).

Исследование кривых роста Р. риалв КБ-2 на средах с ди- и этиле нгликолем, Кривая роста периодической культуры Р. ри1Ша В5-2 на среде с д и э г иле нгли колеи в качестве единственного источника углерода и энергии представлена на рис. 4. а. Длительность лаг-фазы составляет 5-7 часов, экспоненциальной - б-? часов, после чего наступает замедление роста, а к 32-33 часу культура переходит в стационарную фаву развития. В экспоненциальной Фазе наблюдается пик удельной скорости роста, который составляет

б)

Е

s %

■S -

Уис.4. Динамика роста и деструкции субстрата периодической культурой Р. ри£1<*а 85-2 на средах, содеркаяда дэг (а) и ЭГ {6)1 1 - биомасса, (ед. ОЛ), 2 - удельная скорость роста,

3 - концентрация субстрата, Б, г/л.

ОД 15 к 0,005 Го шре истощения субстрата и накопления продуктов метаболизма удельная скорость роста снижается и в фаза замедления, длительностью около 8 часов, ее значение составляет

0,01- 0,02 ч"? В стационарной фазе концентрация биомассы достигает .максимума и составляет 1,75 ± 0,1 г ДСБ/л. время генерации культуры в экспоненциоиальиой фаве культивирования составляет 6,0-6,5 часов. Среднее значение экономического коэффициента, рассчитанного по начальным и конечным значениям для биомассы и субстрата Yep - 0,34 ± 0,01 гАСБ/г диэтнленгликоля. При этом остаточная концентрация диэтнленгликоля составляет 70-100 мг/л, т. е. к 33-му часу культивирования доля использованного бактериями субстрата достигает 98Х.

Кривая роста периодической культуры P. putt da BS-2 на среде с этмленгликолем в качестве единственного источника углерода представлена на рис. 4.6. Лаг-период практически отсутствует, экспоненциальная фава роста длится 7-9 часов. Стационарная фава достигается к £1 часу культивирования. Йэксимальная удельная ско-

рость роста в экспоненциальной фазе составляет О,SO i 0,00S ч"* Максимум концентрации биомассы составляет 1,86 ± 0,1 гАСЕ/jl. Бремя генерации в экспоненциальной фазе роста 3,5 часа. Среднее значение экономического коэффициента составляет 0,35 ± 0,017 гАСБ/Г этиленгликоля, Остаточный атиленглииоль а среде к £1 часу периодического культивирования не определяется.

Высокая удельная скорость роста штамма Р. pt.it ida BS-2 на средах с гликолями в качестве единственных источников углерода, его устойчивость к сверхконцентрациям данных субстратов, а также низкое сродство фермента(ов) первичной деструрции к ДЭР, позволяют с больной степенью вероятности отнести штамм к микроорганизмам, реализующим стратегию г-отбора. Штамм Р. putida BS-2 целесообразно использовать на первой ступени очистки концентрированных сточных вод, содержащих гликоля.

ДЕСТРУКЦИЯ МЕТАНОЛА ШТАММОМ HeLbylobocter ium sp. ÍK

Ив накопительной культуры баитерий-деструкторов метанола выделен штамм, исследование биологических свойств которого позволило отнести его к группе роэовоокраиенкых факультативных ыетилот-рофов и идентифицировать как HeLhylobActaríuu sp. tfC.

Влияние концентрации метанолу на пок*ватели роста Hsthylobactorium sp. iK в периодической культуре. Повышение исходной концентрации метанола в среде сопровождается нвменениеы ряда физиологических показателей (таблица 2). Так, длительность процесса периодического культивирования при исходной концентрации метанола 0,2 об X составляет менее 24 часоа и заканчивается с исчерпанием субстрата в культуральной жидкости, в то время как при концентрации 3 об. X метанола в среде к 60 часу культивирования потребляется 59 X от исходного его количества. Максимальная удельная скорость роста IteChjriofaacteriuM ер. ÍK наблюдается при. исходной концентрации субстрата в среде 0,5 - 2,0 об. X и составляет 0,096 - 0,10 4~f Среднее значение экономического коэффициента по субстрату снижается с 0,50 (при исходной концентрации метанола в среде 0,5 об. X) до 0,13 (при концентрации 3 обХ).

Штамм Uethylobacterium sp. tK (ВКЩ В-6603) мохет быть использовал в качестве основного компонента дои создании промыцден-ного биоценоза для процессов очистки сточнмк вод, содержащих метанол.

Та блина 2

Влияние концентрации метанола на Аязиологические,показатели процесса периодического культивирования

21 с в еч • Ь о-о «го ё!. ** »* •• *< Длительность процесса, ч

0,20 12

24

0,5 12

1 24

36

1,0 12

24

36

46

60

1,5 1 12

24

36

48

60

2.0 12

24

36

48

60

2,5 12

24

36

48

60

3,0 12

24

36

48

60

0,084 0,049

0,084 0,096 0,28

0,092 0,086 0,041 0,010 0,006

0,07? 0,093 0,044 0,013 0,006

0,073 0,100 0,036 0,014 0,011

0,068 0,068 0,045 0,016 0,009 0,049 0,083 0,043 О 016 0,014

0,11 45

О 0,42 100 0,65£0,03* 0,10

0,33 34

0,21 58

О 0,47 100 1,84*0,07 О.ОЬ9

0,63 37

0,54 . 46

0 39 61 0,24 76

0,11 0,33 89 2,531:0,12 О.СЫ

0,95 47

0,Ы 66

0,34 77

0,25 . 83

0,19 0,25 67 2,52+0,00 0,069

1,30 35

1^22 39

1,02 49

0,81 60

0,62 0,24 69 . 2,56+0,II 0,070

1,50 40

1,37 45

1.23 51 1,07 57

0,86 0,16 66 2,02*0,08 0,11

1,83 39

1,76 41

1,63 46 '

1 40 ЬЗ

1.24 0,13 59 1,174-0,04 0,13

Примечание: *указано среднее арифметическое значение; £ ошибка среднего арифметического.

ДЕСТРУКЦИЯ СМЕСИ ГЛИКОЛЬ-НЕТ АНОД АССОЦИАЦИЕЙ микрооРГАНизмоа

Изученные »гаммы бактерий, использующие г ли коли (Р. put ida BS-2) и метанол ( kathylobaclerium sp. iК) в качестве единственных источников углерода были использованы для конструирования бинарной ассоциации, способной усваивать двухкомпонентный субстрат гликоль-метанол.

Установлено, что средняя удельная скорость рома Р, putida Д5-2 на среде со смесью субстратов практически не изменялась, и незначительно снижалась для UeíhylOtMctorium sp. 1К Присутствие метанола в среде культивирования Р. putida BS-2 снижает количество потребленного ДЭГ на <12 по сравнению с контролем. Влияние ДЭГ на деструкцию метанола U«Lhy¡obact»riu* яр. 1К более выражено. Так, если в контрольной среде за 24 часа культивирования концентрация метанола снижалась на 95,6 X, то в присутствии дэг в среде значение этого покааателя составило S2,4 X. Наблюдаются невначи-гельные колебания других физиологических покааателей - экономического и метаболического коэффициентов. Покаватель средней удельной скорости роста Р. putida BS-2 а ассоциации в 1,70 раеа, a Hethylobütrtortum sp. 1К в 1,67 раза ниже еначения этого покааателя, полученного на среде со смесью субстратов для чистых культур. Значение метаболического коэффициента для Р. putida BS-2 в 3,6 раза, а для koLhy)obacterlum ар. IX а 2,1 pasa выше при культивировании в ассоциации, чем в контрольной среде. Потребление дизтиленгликоля в ассоциации достигает 60Х, а метанола - 661 от их исходных количеств.

Полученные результаты свидетельствуют о вовмонюсти конструирования ассоциации, использующей в качестве источника углерода двухкомпонентный субстрат - ДЭГ-метанол. В исследованном диапазоне концентраций смеси ДЭГ-метанол выбор режима культивирования должен определяться в каждом конкретном случае.

ВЫВОДЫ

1. Селекционирована ассоциация почвенных бактерий, использующая диатияенгликоль в качестве единственного источника углерода. В ассоциации доминируш микроорганизмы родов AIcílI i gon&s, Rhodococcus, Mycobacter ¡ия, AchrtHnobsctar. , между которыми вывалены с имб йот и чес кие взаимоотношения.

2. Селекционирован высоколотивный штамм, способный использовать ди- и этиленгликоль в качестве единственных источников угле-

рода и идентифицированный как Pseudomonas put Ida биотип Б,

3. Составлен баланс макроаргических соединений для роста Р. puttda BS-2 (ВКПМ В- 6150) на среде с диэти лен гликолем и продуктами его катаболизма, с помощью которого выявлено фунционирование более двух точек сопряжения окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи Р. /Nitida BS-2.

4. Удельная скорость роста культуры Р. putida BS-г в диапазоне концентраций дизтиленгликоля в среде от 0,06 до 5 г/л зависит от концентрации субстрата и подчиняется уравнению Ыэно. Константа полунасыщения для роста Р. puttda HS-2 на среде с дизтилен-гликолем составляет 209 ± 17 мг/л. Кинетика ингибирования роста втамма высокой концентрацией гликолей имеет сложные характер, приводит к частичному разобщению процессов конструктивного и энергетического метаболиэмов.

5. Выявлены закономерности влияния физико-химических факторов на физиологические характеристики процесса культивирования Р. putida BS-2 на среде с диэтиленгликолем. В диапазоне концентраций HaCI от 4 до 8Х при полном подавлении роста количество утилизированного диетиленгликоля составляет ЗОХ от возможного в оптимальных для роста условиях. Штамм не теряет активности но отношении к диэтиленгликолю в присутствии метанола, если концентрации последнего не превышают 5 г/л в среде.

6. Селекционирован штамм бактерий-активный деструктор метанола, идентифицированный как ttethylobactermm sp (ВКПМ В-5603). Скорость потребления метанола в диапазоне его концентраций в среде 0,2-3,0 обЖ составляет 0,051 - 0,130 г метанола/г АСЕ ч.

?., На основе штаммов - активных деструкторов гликолей и метанола Р. iMtlda BS-2 и Uethylobacierium sp. 1К сконструирована бинарная ассоциация, активно деградирующая смесь токсичных веществ - дизтиленгликоля и метанола со скоростью не менее 0,54 г ДЭГ/ г АСБ ч и 0,23 г метанола / г АСБ ч.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1, СединаС.А., Шшченко X П. Нуклеотидный состав. ДНК бактерий, окисляющих диэтиленгликоль // Микробиол. *урк. - 1991. - 53, N2. - С. 17-20.

Й, Седина С. А., Иванов В. К. Состав и метаболическая активность ассоциации бактерий - деструкторов дизтиленгликоля // Мик-росиол. журн, - 1991. - 53, нз. - с.,зо-за. .

3. Карпенко В. И. , Евсеев А. Б., Писарев С. М., Черньшюнко

Д. а . Ястремекая л. с., Седина С. к,, Иванов а Е Очистка промышленных и коммуналъно-бытавьа сточных вод иммобилизованными клетками анавробных микроорганизмов // Tea. докл. Всесоюа. симп. "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Дри-каспия". - Оренбург, 1991. - С. 51.

4. Седина С. А., Иванов Е Н., Подгорский Е С. Бактериальная деструкция гликолей // иикробиол. журн. - 1992. - 54, HI. - с. 117-133.

5. Седина С. д. Деструкция диэтиленглитм культуро« Pseudonorias put Ida BS-2 // Никробиол. хурн. - 1992. - 64, N1 -С, 61-67,

Подписано в печать 22.OI.92r формат 60x5^/16 Еушгя чвсчя, Усл. печ.л. 1,0. Тираж ЮО »кэ. Заказ Ц

Отпечатано Ц70П Кб "ГЬопиашпро^кт" Киев, СакеагаНСКОГО, I