Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деструкция гликолей и метанола бактериями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деструкция гликолей и метанола бактериями"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ШКРОЕИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГ1Ш им. Д. 1С. ЗАБОЛОТНОГО

На правах рутописи

СЕДИНА Светлана Анатольевна

ДЕСТРУКЦИЯ ГЛККОЛЕИ И МЕТАНОЛА БАКТЕРИЯМИ Специальность - 03. 00. 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание учета степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

Работа выполнена в отделе технологии биосинтеза ордена Трудового Красного Знамени Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины.

Научные руководителя: член-корреспондент АН Украины

доктор биологических наук В. С. Подгорский

доктор биологических наук В. Е Иванов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

П. 51 Гвоздик

кандидат биологических наук Е, II. Громозова

Ведущая организация: Киевский технологический институт

пищевой промышленности

Защита состоится "_"__1992 г. в _ часов на заседании специализированного совета Д 015.06.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболоткого АН Украины /252143, г. Ккев-143, ул. Заболоткого, 154, Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К Заболотного АН Украины/.

С диссертацией молно ознакомиться в библиотеке Института микробиология и вирусологии им. Д. К. -Заболотного АН Украины.

Автореферат разослан "_"__1952 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Э. А. Коваленко

Актуальность проблемы. Важной задачей современной микробиологии, связанной с разработкой комплекса мер по охране окружающей среды от загрязнения, является изучение процессов жизнедеятельности микроорганизмов - деструкторов органических веществ производственных сточных вод.

В технологических процессах добычи и промысловой подготовки газа расходуются в большом объеме токсические вещества - низкомолекулярные али^тические гликоли - этиленгликоль (ЭГ), дизтиленг-ликоль (ДЭГ) и метанол. Таким образом гликоли и метанол являются основными компонентами сточных вод предприятий газовой промышленности. В настоящее время высококонцентрированные стоки, содержащие гликоли, метанол или их смесь в значительных объемах закачиваются в поглошдющие горизонты или сжигаются. Разработка и внедрение технологий микробиологического обезвреживания высоко- и низкоминерализованных сточных вод на основе специализированных культур микроорганизмов позволит предотвратить загрязнение природной среды токсичными веществами, обеспечит возможность перехода к созданию безотходных технологий в газовой промышленности.

Однако решение ряда технологических проблем биологической очистки производственных сточных вод невозможно без выработки научных основ процессов жизнедеятельности микроорганизмов - деструкторов, изучения фиэиолого-биохимических особенностей их роста и деструкции токсикантов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы эашшчалась в установлении фиэиолого-биохимических закономерностей роста микроорганизмов, использующих гликоли и метанол в качестве единственных источников углерода.

Поставленная цель предполагала решение следующих задач:

1. Поиск, выделение и селекцию микроорганизмов - деструкторов гликолей и метанола.

2. Идентификацию наиболее активных штаммов - деструкторов гликолей и метанола.

3. Исследование физиологических особенностей роста штаммов -активных деструкторов гликолей и метанола.

4. Конструирование ассоциации микроорганизмов, активно усваивающей смесь гликоль-метанол в качестве источника углерода.

Научная новизна. Селекционирована устойчивая ассоциация бактерий, выделенных из почвы, и испольауюшдя диэтиленгликоль в качестве единственного источника углерода Установлены симбиотичес-кие взаимоотношения ассоциантов.

Выделены активные штаммы культур - деструкторов нивкомолеку-лярных алифатических гликолей и метанола. Изучены морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки выделенных культур, определена их таксономическая принадлежность.

Установлены физиологические закономерности роста наиболее активного штамма - деструктора диэтиленгликоля в периодическом режиме культивирования. Впервые определена константа насыщения для роста культуры на среде с диэтиленгликолем. Предложена гипотеза об участии внутриклеточных липаз в процессе деструкции эфирной связи молекулы диэтиленгликоля. Исследовано влияние физико-химических факторов на физиологические показатели роста исследуемого .штамма на среде с диэтиленгликолем.

Показана возможность конструирования ассоциации микроорганизмов, использующей двухкомпонентный субстрат гликоль-метанол в качестве источника углерода.

Практическая значимость. Селекционированная ассоциация, выделенные чистые культуры микроорганизмов - деструкторов низкомолекулярных алифатических гликолей и метанола, а также сконструированная ассоциация, использующая смесь гликоль-метанол в качестве источника углерода могут быть рекомендованы для использования в процессах очистки сточных вод предприятий газовой промышленности.

Результаты по исследованию физиологических и технологических свойств чистых и смешанных культур бактерий - деструкторов гликолей и метанола могут быть использованы при разработке биотехнологий: а) микробиологического обезвреживания сточных вод предприятий газовой промышленности; б) получения сухих форм биопрепаратов на основе живых микроорганизмов, предназначенных для очистки сточных вод, почв, водоемов, загрязненных гликолями и метанолом.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 1-й Всесоюзной конференции "Экология нефтегазового комплекса" (Надым, 1988), Всесоюзном семинаре "Микробиология охраны биосферы" (Киев, 1988), представлены в работе Всесоюзной школы-конференции молодых ученых "Физиология, биохимия и генетика микроорганизмов - фундаментальная основа биотехнологии микроорганизмов"(Алушта, 1990), на Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1991), на конференциях молодых ученых Института микробиологии и вирусологии АН Украины (Киев, 1988, 1989).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 научных работ и имеется положительное решение по заявке на патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 траницах машинописного текста и содержит 15 таблиц и 26 рисун-:ов. Она состоит из введения, обзора литературы, эксперименталь-ой части, заключения, выводов, списка основной использованной :итературы из 277 наименований, в том числе 182 иностранных, п риложения, которое включает положительное решение ВНИИГПЗ по за-вке "Штамм бактерий Pseudomonas pudría - деструктор кизкоюлеку-ярных алифатических гжколей", акт опытно-промышленных испытаний роцесса получения опытной партии биопрепарата на основе микроор-аниэмов деструкторов гликолей.

Материалы и методы исследований. Получение накопительной :ультуры и селекцию ассоциации, адаптированной к диэтиленгликоль-одержащим средам проводили в несколько этапов.

Осуществляли отбор проб почв предприятий газовой промьшлен-ости. Накопительную культуру выращивали в колбах на качалках на одопроводной воде с добавлением 0,3 г/л аммофоса и 4 г/л диэти-:енгликоля. Селекцию биоценоза проводили в течение 1 месяца на .налогичной среде при непрерьшном культивировании накопительной ;ультуры в лабораторном аэротенке с рабочим объемом 1 л и скорос-

ью разбавления 0,02 ч1. Дальнейшую селекцию ассоциации проводили i лабораторном ферментере АНКУМ-2М в режиме непрерывного культи-ирования на среде следующего состава (в г/л ): (NH4)gS04- 3,0,

¡aCI - 0,5, MgS04-0,7, KgHP04- 0,1, KHgPO^l.O (среда N1), ДИЭТИ-

внгликоль - 0,5 или 1,0 г/л; водопроводная вода - до 1 л. Куль-ивирование проводили в следующем режиме: рабочий обьем ферненте-

ia - 5 л, число оборотов мешалки (п) - 800 об/мин, температура 30°С, iH 6,5 - 7,0, расход воздуха 0,5 л /л мин. Для поддержания pH [спользовали 3 Х-ый раствор NaOH.

Получение накопительной культуры микроорганизмов - деструк-'оров метанола проводили в 2 этапа: 1) отбирали образцы почв, 1ечной воды и ила на территории вблизи предприятия газовой про-¡ышленности; 2) смешивали пробы и выращивали накопительную куль-'уру в колбах на качалках на среде следующего состава; в г/л ): LHgP04 - 3,0, KgHP04 - 7,0, NH4N03 - 1,0, MgCI2 - 0,1 (среда N2),

»нцентрация метанола - 0,5 o6Z.

Для выделен-.ш чистых культур бактерий, использовали МПА, и агаризоваиные среды следующего состава (в г/л): агар-агар - 15, КоНР04- 0,5, - 1,0, диэтиленгликоль или метанол - 5 ; сте-

рильная водопроводная вода до - 1 л. Выращивание колоний микроорганизмов проводили при 30°С в течение 3-5 суток в аэробных условиях.

Идентификацию чистых культур проводили по определителю Берги (1957, 1974), а также с использованием оригинальных работ (Хипри-анова ü др. , 1973; Бзстеренко и др. , 1985; Романовская и др. , 1986; Green et al. , 1983).

Для количественного учета микроорганизмов смешанных популяций проводили выоев из бактериальной суспензии методом предельных разведений на МПА и на агариэованные среды с добавлением соответствующего субстрата.

Культивирование ассоциаций, а также чистых культур микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера на среде N2 (pH 7,6) при

25-30°0. Субстраты вносили в концентрации 5 г/л (для гликолей) или 0,5 об% (для метанола).

При исследовании влияния различных концентраций субстрата на физиологические показатели процесса периодического культивирования концентрацию дизтиленгликоля в среде варьировали от 1 до 80 г/л, метанола - от 0,2 до 3 об%.

Влияние концентрации гликолей в среде на удельную скорость роста на физиологические показатели роста изучали в "острых опытах", измеряя начальные скорости процесса культивирован™ (Работ-иова и др., 1979). Концентрацию ди- и этиленгликоля варьировали от 0,06 до 100 г/л. Культивирование осуществляли в течение 1-3

часов в микробиологических пробирках при температуре 25°С на круговой качалке (220 об/мин).

При конструировании ассоциации, использующей смесь диэтилен-гликоль-метанол в качестве источника углерода, проводили ее выращивание на среде N2, содержала диэтиленгликоль (0,5 об. 7.) и метанол (0,5 об.%).

Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности клеточной суспензия (Л =540 нм) с последующим пересчетом на абсолютно сухую биомассу по калибровочному графику.

Величины кинетических констант - константы насыщения К„ и

3

максимальной удельной скорости роста ¡п определяли графическим ме-

тодом (Келети, 1990).

Физиологические показатели процесса периодического культивирования - удельную скорость роста (р), экономический коэффициент по субстрату (Y), метаболический коэффициент (q) определяли общепринятыми методами (Перт, 1978).

Концентрацию гликолей и метанола в культурадьной жидкости определяли на хроматографе "Chrom-5" /ЧССР/.

Составление баланса макроэргических соединений и теоретический расчет выхода биомассы проводились по методике, приведенной з работах В. Н. Иванова (1981, 1987).

Полученные результаты обрабатывали статистически.

ДЕСТРУКЦИЯ ДИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ АССОЦИАЦИЕЙ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ.

Изучение состава ассоциации, использующей диэтиленгликоль в качестве источника углерода. Результаты количественного научения состава ассоциации в зависимости от условий непрерывного культивирования показали доминирование в ее составе пяти бактериальных форм микроорганизмов, условно обозначенных нами АС-1, TS-1, 0С-1, LV-1 и С-1. Установлено, что ассоциация двух культур TS-1 и LV-1 оказалась наиболее устойчивой к изменениям условий среды и доминировала при скорости разбавления равной 0,05 Доминирование культур АС-1 и ОС-2 в условиях относительно низкой скорости разбавления свидетельствует, по-видимому, об их принадлежности к медленнорастущим микроорганизмам. Предполагается, что штаммы TS-1 и С-1 представляют сопутствующую микрофлору и используют в качестве питания продукты неполного окисление диэтиленгликоля. Бактерии, условно обозначенные как LV-1, АС-1, ОС-2 были выделены в чистые культуры после многократных пересевов на агаризованных средах с добавлением диэтиленгликоля в качестве единственного источника углерода.

На основании морфолого-культуральной, физиолого-биохимической и других характеристик выделенные штаммы были отнесены к родам AI с,il i genes, Mycobacterium, Rhodococcus, Achromobacver.

Исследование трофических взаимоотношений в ассоциации. Для изучения механизма деструкции диэтиленгликоля ассоциацией, ее компоненты культивировали на жидких средах, содержащих в качестве источника углерода возможные промежуточные продукты метаболизма диэтиленгликоля. Проведенные исследования показали, что бактерии- деструкторы диэтиленгликоля - Mycobacterium sp. ОС-2,

fihadococcus sp. AC-1, Alcaliasncs paradoxus LV-1 активно усваиве ют зтиленгликоль в качестве единственного источника углерода. Гликолат и глиоксилат с разной степенью активности использовался всеми четырьмя культурами. Кроме того, культуры Alcaliecnes paradoxus LV-1 и Achromobacter iophagus TS-1 активно усваивали глицерат. Ни одна культура не использовала адетальдегид и ацетат в качестве субстрата для роста.

На основании полученных данных можно предположить, что деструкция диэтилеигликоля селекционированной бактериальной ассоциацией происходит через образование этиленгликоля, который в дальнейшем метаболизируется в цикле трикарбоновых кислот по гликоле-вому пути с промежуточным образованием глицериновой кислоты. Ас-социант Actiromobacter iophagus виючается в процесс метаболизма на стадии образования гликолата. Очевидно, основную роль в деструкции диэтилеигликоля смешанной культурой играет ассоциант, идентифицированный как Alcaligencs paradoxus LV-1.

Таблица 1

Показатели роста чистых культур и ассоциации на среде с диэтиленгликолем

Шкроор- Исходная Остаточная Длитель- Удельная X деструк-

организмы конц-ция конц- ция ность куль- скорость ции ДЭГ

ДЭГ, г/л ДЭГ, г/л тивирова- роста,

ния,

сутки ч"1

Alcaligenes 5 0,136*0,006* paradoxus

Mycobacterium 5 0,199*0,013 sp.

Rhodoccus 5 0,075*0,002 sp.

Ассоциация 5 0,120*0,005

2 0,081 97,3

20 0,007 96,9

20 0,008 98,5

2 0,078 97,6

Примечание: * указано среднее арифметическое значение,

* ошибка среднего арифметического.

Результаты периодического кдотивядоанид Hycotetxt-eyiun sp. OO-S, Khotincoccus яр. AC-1, Alcaligcnes [х>ггл1о>лт LY-x, и ассоциации четырех культур представлены в таблице 1. Лссоцианг Mc.il ¡genes p;irru1o;:ur> L.V-1 требует примерно в 10 раз меньше времени для деструкции диэтиленгликолл по сравнению с Nycobncr.<irini3 sp. ОС-" и Rladococcm; sp. /С-f. По-видимому, его присутствие в составе микробного сообгаэства определяет скорость утилизации дигэ-тиленгликоля смешанной культурой.

Таким образом, в результате селекции и адаптации получена устойчивая ассоциация микроорганизмов, испольэукщля диэтиленгликоль в ¡сачестве единственного источника углерода и энергии. Установлено, что в ассоциации доминируют микроорганизмы родов 'fycotixtor 1 и к, Rhodococcus, Alcalidoms, Aahrontobactor. J to (¡их штаммы родов Uycobactcriun и fttxxiocoecus, по-видимому, могут быть отнесены к медленнорастущим формам микроорганизмов, использующим диэтиленгликоль в качестве единственного источника углерода. Наиболее активным деструктором ди- и этиленгликоля является штамм, идентифицированный как Alcaligcnos paradoxus l.V-1. (ВК1Ш В-Б1Б1). Предполагается, что компонент ассоциации, идентифицированный как Achroimbncter iaphagus TS-1, является активным деструктором промежуточных продуктов распада основного субстрата, а метаболизм диэтиленгликоля происходит по гликолевому пути черев образование этиленгликоля на первом этапе деструкции.

Селекционированная ассоциация может быть рекомендована к использованию в процессах доочистки гликольсодержащих сточных вод во второй или последующ« ступенях очистной системы.

ДЕСТРУКЦИЯ ДИЗТШЬЛЛИКОЛЯ ШТАММОМ PSEUDOHONAS PVTIDA IIS-2

В результате скрининга микроорганизмов, изолированных ив концентрированной сточной воды, получен штамм, активно использующий диэтиленгликоль в качестве единственного источника углерода. Па основании результатов, полученных при исследовании морфоло-го-культуральных и физиолого-биохимических признают штамм идентифицирован как Pseudomortas putida биотип Б.

^jM^jjgj^BOiBDjHgojj™. (ЮС) для роста P. piitidit

глиотеилатом. При изучении способности штамма утилизировать предполагаемые продукты первичной деструкции диэтилепглкколя ашю установлено, что бактерии активно попользовали в к/.честяе едичст-

венных источников углерода следующие субстраты : зтиленгликоль, гликолат, глиоксилат, глицграт. Ацетат и ацетальдегид но использовались в качестве ростовых субстратов. Полученные данные позволяют предположить, что деструкция диэтиленгликоля штаммом Р. putida BS-2 вероятнее всего происходит через образование этилен-гликоля, продукты окисления которого поступают в цикл дикарбоно-вих кислот /окисление до COg/ и в цикл трикарбоновых кислот /ассимиляция по пути глиоксилат -> глицерат -> пируват -> ЦТК/ (рис.1)

Схема метаболизма диэтиленгликоля может быть использована для составления баланса ыакрозргических соединений (ЮС) и теоретического расчета выхода биомасы.

Баланс МЭС при ассимиляции углерода диэтиленгликоля в биомассу описывается уравнением:

1Лш2(Р/0)-1/УдТр /1/1

где 1/Ущ,- расход диэтиленгликоля на синтез биомассы, моль/г АСБ;

l/YftTp - 0,095 - расход молей МЭС на синтез 1 г биомассы из

3-фосфоглицерата; Р/0 - фосфорилирующая эффективность окисления восстановительных эквивалентов, моль МЭС/мольС2Ш.

Расход и образование IS3C и восстановительных эквивалентов на этапах 2-глиоксилат -> 3-фосфоглицерат и глицеральдегид-3-фосфат -> 3-фосфоглицерат взаимно (компенсируют друг друга. Величину i/Y^

можно определить из уравнения баланса углерода, вытекающего из стехиометрического уравнения синтеза биомассы (Иванов и др. ,1987):

+0 +N

САо°3-----------> 3CH1,77°0,49N 0,17 /2/

-HgO -COg

l/V^lMOJHb/3 24,3 гАСВ=0,01372 мольДЭГ/гАСБ /3/;

где 24,3 - молекулярная масса "биомоля" биомассы (Иванов, 1981, 1987). Образование МЭС при катаболизме диэтиленгликоля составляет согласно схемам А и Г рис. 1. :

1/Ycat 6(р/0> /4/;

где 1/Ycat - расход диэтиленгликоля на окисление до С02 моль/ /гАСЁ.

В целом баланс МЭС для роста на среде с диэтиленгликолем будет иметь вид:

-Kl/Y^,) 2 (P/0) - 1/Y дтр+ (1/Ycat) 6 (Р/О) = О /В/;

СН-ХНрОН

0 —

1

сн2сн2он

диэтилен-гликоль

С!Ю 2 I -СООН

СН20Н 2 СН20Н

он

сн2он

-г[2н] сно

—

сно

СООН -2 [2^ СООН

этилен-гликоль

♦ N

-со,

гликолат

СООН I

СИОН СНО

[тартроновый полуальдегид]

гликоле-вый альдегид

СООН СНОН

сн2он

глицерат

гликолат

+ АТФ

9Н0 НоО + АДФ СНОП -±-£---------

СН20-® - [2Н] - АТФ

глицеральде-гид-Э-фосфат

СООН

СНОН ----

СН2ОЧ0

3-фосфоглицерат

глиокси-лат

Б

?0011 синтез

СНОН — биомаось.

СН20

3-фосфогли-церат

В

синтез биомассы

СНО I

СООН

+ С1ЦС05 - КоА ?оон

-----2------------^ СНОН

- КоА - ВН ¿н

:"[2Н]

СоОН С--0 ----

глиоксилат

I

СООН малат

СН3С03 - КоА ацетил КоА

сн2

СООН

-СОг,

оксало-ацстат + КоА -51!

- С02 - Щ

СООН С=0

сн3

пируват

[2Н]

+ /Р/0/ АДФ

+ * о —------------ НрО

- /Р/0/ АТФ а

А

I. Предположительная схема основных реакций метаболизма циэти-ленгликоля у У. ри1£-с(а 35-Л'. А - преобразование по глио«оплата; Б - ассимиляция углерода глиоксилата; Г - катаболизм глиоксилата в цикле .ликарбоносых кислот; схемы В и Д необходимы при расчете баланса МЭС (см. в тексте).

откуда

или

Шскольку

(/1/Yan) 2(Р/0) + 1/Y ATP

1/Ycat -----------------------------------------------/6/;

б (Р/О)

1/Ycat = - 0,00457 + О,ОХ583/(Р/О) /7/;

1/Y = 1/Y. . + 1/Y /8/;

ciil CclL '

где 1/Y - величина, обратная выходу /экономическому коэффициенту/ ,

то:

или

Y - 1/С0,01372 - 0,00457 + 0,01583/(Р/О)] /9/;

Y = 1/LO,00915 + 0,01563/(Р/0)] гАСБ/мольДЭГ /10/.

Проводя аналогичные уравнениям /1-10/ выкладки для роста на среде с зтилангликолем, гликолатом и глиоксилатом можно получить уравнения баланса ЮС и значения выхода на этих субстратах. Для роста на среде с этилеигликолем:

(l/Y^MP/O) - 1/Y дтр+ (1/Ycat) 3(Р/О) = 0 /11/;

Y = 1/[ 0,01829 + 0,03167 / (Р/О)] гАСБ/моль ЭГ /12/; Для роста на среде с гликолатом:

¡l/Y^iAP/O) - 1/Y дТр+ /1/Ycat/ 3(Р/0) = 0 /13/;

Y =1Л 0,1829 + 0,03167 / (Р/О)] гАСБ/моль гликолата /14/; Для роста на среде с глиоксилатом:

- l/YÄTp + (1/Ycat) 2(Р/О) - 0 /15/;

Y « VC0,02743 + 0,0475 / (Р/О)] гАСБ/моль глиаксилата /16/;. Сопоставление теоретических зависимостей выхода биомассы от

значения IVO при росте на средах с различными источниками углерода и энергии с полученными экспериментально значениями этого показателя свидетельствует, что: 1/ значение Р/О при росте piitida US-2 на средах с указанными субстратами составляет примерно 2,20 молей МЭС/моль О; 2/ схема метаболизма диэтиленгликоля и баланс ÍÍ3C достаточно полно /с точностью 2 ,ZU отраиаот количественно стехиометрию и энергетику метаболизма дизгиленгликолл,

Гд'яииз концентрации ДЭР из физиологические покааатели про-цэ(; ; 'т-риодического ¡згдьтивнроваиия Р. put i da ßS-l'. Установлено. ;;то .л биомассы шксдаален при исходной концентрации ДЗГ в

-н-

средг - 20 г/л :» составляет 3,08 г ЛСБ/л, при концентрации ДЗГ 00 г/л значение этого показателя в 2,4 раза ниже.

Показатель максимальной удельной скорости роста в экспоненциальной г{я.зо изменяется в широких пределах: от 0,12 ч-1 при концентрации субстрата в среде равной 5-40 г/л до 0,058 ч"1 при исходной концентрации - 80 г/л.

Увеличение концентрации субстрата приводит к значительному еиигднию экономического коэффициента. Так, если при концентрации ДГ>Г 5 г/л его значение составляет 0,32-0.34 г ЛСБ/г ДЗГ, то при ингибнрукщих концентрациях значение этого показателя составляет только 0,04-0,05 гАСБ/гДЭГ. При концентрации ДЭГ в седе 80 г/л значение метаболического коэффициента примерно в 4 раза выше, чем г 'Лпювиях, олг'/м-льных для роста. Оптимальные для роста концент-рапяи ДЭГ находятся з диапазоне 5-40 г/л.

Влияние концентрации ДЭГ и ЗГ на удельную скорость роста. Определение X. для роста putida BS-2 на среде с диэтиленглико-

.тпя. .Чаписимость удельной скорости роста Р. piitida ТЮ-2 от начальной концентрации диэтиленгликоля представлена на рис. 2а. (*,трость роста возрастает с увеличением концентрации субстрата з сред.? до 5 г/ л, Ппгпбирутлдее воздействие субстрата начинает про-лалиться со значений концентрации дизгшюнгликоля больших, чем .10 г/ На рис г.о. представлены данные трех независимых серий гзке-¡!ор;!М',нта по чче.тоговеншо зависимости удельной стрости роста от !«'<.-|>диоЛ кгмцепгрятт диэтиленгликоля в среде в диапазоне г-опцон-.';> -цнп от 0,f-í /;<; :jo г/л (данные представлены в обратных координатах)- Очееилио график зависимости jn от S линеаризуется в icocp-ras l/pi - >/*> с достаточно высокой точностью, что свидетель-рч¡¡/о? о щнп эотчпети уравнения Нопо для описания кинетики окис-нчп« ,чпотплст"!И'.)ля >'■ ¡?/lidit BS-2 в области лимитирующих ксн-«"нт»п\иий, Vc.-wnaiuji^ и К .„определены при концентрациях субстра-

.,» ;о Ь г/л ч рлваы 0,11-0,12 ч"1 и 209 ± 17 мг/л соответственно. »•уЦфййлшт нердолягот шжду значениями обратных величин удельной m¡iwrn pofT'j и концентрации дитиленгликоля (г) составляет

о, она

При ностаювкз аналогичного эксперимента для атяленгликоля п

-'"¡чсотве оуострйга не обнаружена область лимитирования в диапазоне его кемт.трацай в среде от 0,00 до 10 г/л. Ингибирование кз; ;"см субстрата дjn этя.«нгликоля наОлсгаегся при исходных дан-

а)

Рис. 2. Зависимость удельной скорости роста от концентрации ДЭГ в среде (а), зависимость обратных величин удельной скорости роста и концентрации ДЭГ в среде (б).

центрациях его в среде выше 10 г/л.

На рис. 3. экспериментальные данные, полученные при культивировании Р. рийк/а ВБ-г на средах с ДЭГ и ЭГ приведены в координатах 1/р - Э. Если торможение роста бактерий этиленгликолем (кривая 1) соответствовало бы одной из известных моделей субстратного ингнбирования при всех концентрациях згилекгликоля, например модели, описываемой функцией Холцейна (на рисунке прямая А), то при 5*оо экспериментальная кривая приближалась бы асимптотически к прямой А. То, что экспериментальная кривая, круто поднимается ВЕерх, более соответствует известному в ферментативной кинетике неконкурентному торможению скорости реакции для фермента, который подвергается ингибированию субстратом. Можно предположить, что при концентрациях этиленгликоля, лежащих в интервале 10-70 г/л, торможение роста бактерий соответствует субстратному ингибированию, описываемому функцией Холдейна, а при более высоких - ингибирование приобретает иной характер. В соответствии с этим константа ингнбирования для данного интервала концентраций ЭГ составляет 50 г/л (рис. 3).

График, построенный по экспериментальным данным, полученным

11-1

Ни

Рас. 3. Зависимость обратной величины удельной скорости поста Р. В5-2 от инглОирующей концентрации субстрата:

1 - среда с этиленгликолем, 2 - среда с диэтиленгликолем

з результате роста Р. риНба В5-2 на среде с диэтиленгликолем в качестве субстрата (кривая 2 на рис. 3), не имеет прямолинейного участка в области ингибирования избытком субстрата (или он очень незначителен). По-видимому, торможение роста диэтиленгликолем :,ыеет более слолиый характер, чем простое неконкурентное тсрмомэ-:ше, и не подчиняется ни одной нз известных моделей субстратного »:нгибирования. Характер полученных закономерностей, воамоото, объясняется переключением механизмов и мест ингибировання - сна-«эла субстратное ингибирование ферментативного окисления, затем ¿нгибирование окислительного фосфорилировашш в дыхательной цепи (в случае с ЭГ), либо смешанным характером ингибирования, тогда может происходить одновременное торможение в нескольких функциональных местах клеточного метаболизма (в случае с ДЭГ).

Исследование кривых роста Р. риЬШа В.7-2 на средах с А'И- и этиленгликолем. Кривая роста периодической культуры Р. г..;I.:ВЗ-2 на среде с диэтиленгликолем в качестве единственного источника углерода и энергии представлена на рис. 4. а. Длительность лаг-фазы составляет 5-7 часов, экспоненциальной - 6-7 часов, после чего наступает замедление роста, а к 32-33 часу культура переходит в стационарную фазу развития. В экспоненциальной йетзе наблюдается пик удельной скорости роста, который составляет

-l'i

■-.!■

Рис. 4. Динамита роста и деструкции субстрата периодической культурой П. pat ida BS-2 на средах, содержащих ДЭГ (а) и 8Г (б): 1 - биомасса, (ед. ОГО, 2 - удельная скорость роста,

jn, ч , 3 - концентрация субстрата, S, г/л.

0,115 i 0,005 По мере истощения субстрата и накопления продуктов метаболизма удельная скорость роста снижается к в фазе замедления, длительностью около 8 часов, ее значение составляет

0,01- 0,02 ч".1 В стационарной фазе концентрация биомассы достигает максимума и составляет 1,75 d 0,1 г АСБ/л. Время генерации культуры в зкспоненционалыюй фазе культивирования составляет 6,0-6,5 часов. Среднее значение экономического коэффициента, рассчитанного по начальным и конечным значениям для биомассы и субстрата Yep « 0,34 ± 0,01 гАСБ/г дизтиленгликоля. При этом остаточная концентрация дизтиленгликоля составляет 70-100 мг/л, т. е. к 33-му часу культивирования доля использованного бактериями субстрата достигает 98%.

Кривая роста периодической культуры P. put.ida BS-2 на среде с этиленгликолем в качестве единственного источника углерода представлена на рис. 4.6. Даг-период практически отсутствует, экспоненциальная фаза роста длится 7-Q часов. Стационарная фаза достигается к El часу культивирования. Максимальная удельная ско-

рость роста в экспоненциальной фзае составляет 0,20 i 0,005 ч-.1 Максимум концентрации биомассы составляет 1,85 i 0,1 гАСБ/л. Время генерации в экспоненциальной фазе роста 3,5 часа. Среднее значение экономического коэффициента составляет 0,35 i 0,017 гАСБ/г этиленгликоля. Остаточный зтиленгликоль в среде к 21 часу периодического культивирования не определяется.

Высокая удельная скорость роста штамма Р. putida BS-2 на средах с глигсолями в качестве единственных источников углерода, его устойчивость к сверхконцентрациям данных субстратов, а также низкое сродство фермента(ов) первичной деструрции к дар, позволяют с большой степенью вероятности отнести штамм к микроорганизмам, реализующим стратегию r-отбора. Штамм Р. putida BS-2 целесообразно использовать на первой ступени очистки концентрированных сточных вод, содержащих гликоли.

ДЕСТРУКЦИЯ МЕТАНОЛА ШТАММОМ Methylobacterius» sp. i К Из накопительной культуры бактерий-деструкторов метанола выделен штамм, исследование биологических свойств которого позволило отнести его к группе розовоокрашенных факультативных метилот-рофов и идентифицировать как Uethylobacter i un sp. 1K.

Влияние концентрации метанола на показатели роста Nethylotiacteriim sp. 1К в периодической культуре. Повышение исходной концентрации метанола в среде сопровождается изменением ряда физиологических показателей (таблица 2). Так, длительность процесса периодического культивирования при исходной концентрации метанола 0,2 об составляет менее 24 часов и заканчивается с исчерпанием субстрата в культуральной жидкости, в то время как при концентрации 3 об. X метанола в среде к 60 часу культивирования потребляется 59 % от исходного его количества. Максимальная удельная скорость роста Uethylobacteriwn sp. 1К наблюдается при, исходной концентрации субстрата в среде 0,5 - 2,0 об. 7. и состав-

_ и

ляет 0,096 - 0,10 ч . Среднее значение экономического коэффициента по субстрату снижается с 0,50 (при исходной концентрации метанола в среде 0,5 об. X) до 0,13 (при концентрации 3 oOZ).

Штамм Ые thyl obac Le г i ит sp. 1К ( ВКПМ В-5603) может быть использован в качестве основного компонента при создании промышленного биоценоза для процессов очистки сточных вод, содержащих метанол.

Таблина 2

Влияние концентрации метанола на физиологические показатели процесса периодического культивирования /ЯШуС-о^&сигШл. у>. хК

I

ф р. к о к

я ю га

Ен ч •

а: ою <и к о

а Й хн • ою кги

л О

, Ч 1 С-. 1

1 >>« >5 о а

•о : О - к к к * «

К СО Я Кб« И ^ м I

о . о ^ СТ щ О Ж ч о га - О

о - • а <Й «ю ш да о птга X

X со . в? о-1 Р,СВ о о V к пд 3 И О Ей 43

л о ; ся Р1 НЧ1 я ко О О) я ч

ч о I СГ хам - г к«: е-1 й) Л Ру

щ <и . л л а> х х Я Щ Я Е- о>& к >6 ^ 4) сс- и

¡3 ' с; е< ^ я о о к

Ко . С.) о X Е-* Р.О о о X о ч пю О -

Ч О* . о о о ш >,о о О >>

1=113 >> а, <п к кко >>о

к

к -

о е< ю а; х ч э1 щ о Я51 ЧЯИ окь ю>е-а>

н га 0)0 с. н и

0,20 0,5

1,0 1,5 ' 2,0 2,5 3,0

12 24

12 24 36

12 24 36 48 60

12 24 36 48 60

12 24 36 48 60

12 24 36 48 60

12 24 36 48 60

0,084 0,049 0,11 0

0,084 0,096 0,28 0,33 0,21 0

0,092 ■ 0,086 0,041 0,010 0,005 0,63 0,54 0,39 0,24 0,11

0,077 0,093 0,044 0,013 0,006 0,95 0,Ы 0,34 0,25 0,19

0,073 . 0,100 0,036 0,014 0,011 1,30 1,22 1,02 0,81 0,62

0,058 0,088 0,045 0,016 0,009 1,50 1,37 1,23 1,07 0,86

0,049 0,083 0,043 0,016 0,0X4 1,83 1,76 1,63 1,40 1,24

45

0,42 100 0,6Ь£0,03* 0,10

34 Ь8

0,47 100 1,84+0,07 0,059

37

46 61

76

0,33 89 2,53+0,12 0,0Ы

47 66

77 83

0,25 Ь7 2,52+0,09 0,068

35

39 49 60

0,24 69 2,56+0,11 0,070

40 4Ь Ы 57

0,16 66 2,02+0,08 0,11

39

41 46 53

0,13 Ь9 1,17+0,04 0,13

Примечание:

»указано среднее арифметическое значение; +- ошибка среднего арифметического.

ДЕСТРУКДИЯ СМЕСИ ГЛИКОЛЬ-МЕТАНОЛ АССОЦИАЦИЕЙ МИКРООРГАНИЗМОВ.

Изученные штаммы бактерий, использующие гликоли (P. pat i ría BS-2) и метанол {.Hothylobacterium sp. 1K) в качестве единственных источников углерода были использованы для конструирования бинарной ассоциации, способной усваивать доухкошонентный субстрат гликоль-метанол.

Установлено, что средняя удельная скорость роста P. pat ida BS-2 на среде со смесьи субстратов практически не изменялась, и незначительно снижалась для llettiylobacterium sp. lit Присутствие метанола в среде культивирования P. putida BS-2 снижает количество потребленного ДЭГ на 4Х по сравнению с контролем. Влияние ДЭГ на деструкцию метанола Methylobacterium sp. 1К более выражено. Так, если в контрольной среде за 24 часа культивирования концентрация метанола снижалась на 96,6 %, то в присутствии ДЭГ в среде значение этого показателя составило 82,4 %. Наблюдаются незначительные колебания других физиологических показателей - экономического и метаболического коэффициентов. Показатель средней удельной скорости роста P. putida BS-2 в ассоциации в 1,70 раза, a Mothylohacteríum sp. 1К в 1,67 раза ниже значения этого показателя, полученного на среде со смесью субстратов для чистых культур. Значение метаболического коэффициента для P. putida BS-2 в 3,6 рева, а для ftethylobacterlu» sp. 1К в 2,1 раза выше при культивировании в ассоциации, чем в контрольной среде. Потребление диэтиленгликоля в ассоциации достигает 60£, а метанола - 66% от их исходных количеств.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности конструирования ассоциации, использующей в качестве источника углерода двухкомпоиентный субстрат - ДЭГ-метанол. В исследованном диапазоне концентраций смеси ДЭГ-метанол выбор режима культивирования должен определяться в каждом конкретном случае.

Г!Л»ДЫ

Í. Селекционирована ассоциация почвенных бактерий, псполь-гувдан яиэтиленгликоль в ¡тачестве единственного источника углероде. В ассониапии доминируют микроорганизмы родов Alcnl Zlíodoccccus, ftycobactenua, /icliro'zobacter., t/э.тду которыми и »-явлены си/,¡биотические взаимоотношения.

>. Селекшгояировпн высокоактивный игам«, способный попользовать ;i¡¡- и зтш.еигликодь в ютюство единственных источников угле-

рода и идентифицированный как Pseudomonas putida биотип Б.

3. Составлен баланс макроэргических соединений для роста Р. putida BS-2 (ВКШ В-5150) на среде с диэтиленгликолем и продуктами его катаболизма, с помощью которого выявлено фунционирование более двух точек сопряжения окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи Р. putida BS-2.

4. Удельная скорость роста культуры Р. putida BS-2 в диапазоне концентраций диэтиленгликоля в среде от 0,06 до 5 г/л зависит от концентрации субстрата и подчиняется уравнению ¡.(оно. Константа полунасыщения для роста Р. putida BS-2 на среде с диэтиленгликолем составляет 209 * 17 мг/л. Кинетика ингибирования роста штамма высокой концентрацией гликолей имеет сложный характер, приводит к частичному разобщению процессов конструктивного и энергетического метаболиэмов.

5. Выявлены закономерности влияния физико-химических факторов на физиологические хараотеристики процесса культивирования Р. putida BS-2 на среде с диэтиленгликолем. В диапазоне концентраций NaCI от 4 до 8% при полном подавлении роста количество утилизированного диэтиленгликоля составляет ЗОХ от возможного в оптимальных для роста условиях. Штамм не теряет активности по отношению к дизтиленгликолю в присутствии метанола, если концентрации последнего не превышают 5 г/л в среде.

6. Селекционирован кггамм бактерий-активный деструктор метанола, идентифицированный как Kethylobetcterium ар (ВКПМ В-5603). Скорость потребления метанола в диапазоне его концентраций в среде 0,2-3,0 067. составляет 0,051 - 0,130 г' метанола/г АСБ ч.

7. На основе штаммов - активных деструкторов гликолей и метанола Р. putida BS-2 и Uethylabacterium sp. 1К сконструирована бинарная ассоциация, активно деградирующая смесь токсичных веществ - диэтиленгликоля и метанола со скоростью не менее 0,54 г ДЭГ/ г АСБ ч и 0,23 г метанола / г АСБ ч.

№ теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Седина С. А. , Панченко JL П. Нуклеотидный состав ДНК бактерий, окисляющих диэтиленгликоль // Микробиол. «урн. - 1991. - 53, N2. - С. 17-20.

2. Седина С. А. , Иванов В. Н. Состав и метаболическая активность ассоциации бактерий - деструкторов диэтиленгликоля // Микробиол. журн. - 1991. - 53, N3. - С. 30-38.

3. Карпенко В. И. , Евсеев А. Е. , Писарев С. И. , Черншенко

Д. В., Ястремская JL С. , Седина С. А., Иванов В. Н. Очистка промышленных и коммунально-бытовых сточных вод иммобилизованными клетками анаэробных микроорганизмов // Тез. докл. Всесоюв. симп. "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного При-каспия". - Оренбург, 1991. - С. 51.

4. Седина С. А., Иванов В. Н., Подгорский Е С. Бактериальная деструкция гликолей // Микробиол. журн, - 1992. - 64, N1. - С. 117-133.

5. Седина С. А. Деструкция диэтиленгликоля культурой Pseudomonas puttda BS-2 // Микробиол. журн. - 1992. - 54, N1 -С. 61-67.