Деградация этилендиаминтетраацетата аэробными бактериями

Капаруллина, Елена Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Деградация этилендиаминтетраацетата аэробными бактериями
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деградация этилендиаминтетраацетата аэробными бактериями"

□03484237

На правах рукописи

КАПАРУЛЛИНА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

ДЕГРАДАЦИЯ ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРААЦЕТАТА АЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2009

003484237

Работа выполнена в лабораториях радиоактивных изотопов и физиологии микроорганизмов Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН и в Пущинском государственном университете, г. Пущино.

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт

Защита состоится «27» ноября 2009 г. в 930 час. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской Академии Наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Схрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, а также с авторефератом на сайте института www.ibpm.ru.

Автореферат разослан «19» октября 2009 г.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Н.В. Доронина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, С. Н. Дедыш кандидат биологических наук, А. Ю. Аринбасарова

фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) -синтетический хелатирующий агент группы аминополикарбоксильных кислот, широко применяется благодаря способности образовывать стабильные он б водорастворимые комплексы с ионами

двух- и трехвалентных металлов (ЕеН,

поступает в окружающую среду (Nowack, Van Briesen, 2005; Дедюхина с соавт., 2007, 2008). В результате комплексообразования с ЭДТА металлы переходят в раствор из трубопроводов, ила и донных осадков рек и водоемов, что приводит к загрязнению питьевой воды и потенциально угрожает здоровью людей. Поэтому закономерен интерес исследователей к деградации ЭДТА.

Известны два способа разрушения ЭДТА: физико-химический (фотолиз, озонирование) и микробиологический, причем второй способ разложения считается наиболее эффективным. Тем не менее, к началу нашей работы было выделено лишь несколько смешанных и чистых культур бактерий - деструкторов ЭДТА, которые, однако, не были идентифицированы (Noertemann, 1992; Miyzaki, Suzuki, 1997; Kluener et al., 1998; Young et al., 2001; Witschel, 1999; Bucheli-Witschel et al., 2001; Сатрутдинов с соавт., 2003; Chistyakova et al., 2003, 2005; Chen et al., 2005; Imada et al., 2005). Хотя был охарактеризован первый фермент деградации ЭДТА - ФМН-зависимая ЭДТА монооксигеназа у штаммов DSM9103 и BNC1, (Witschel et al., 1997; Noertemann, 1999; 2005; Bohuslavek et al., 2001), a y штамма BNC1 секвенирован геном, общая картина метаболических превращений ЭДТА до сих пор остается фрагментарной. Все вышеизложенное определило актуальность таксономического и физиолого-биохимического исследования новых деструкторов ЭДТА.

Цель н задачи исследования. Цель работы - таксономическая и физиолого-биохимическая характеристика новых штаммов аэробных деструкторов ЭДТА. Для достижения поставленной цели решались следующие осповные задачи: 1. Определить таксономическое положение четырех новых деструкторов ЭДТА и известного штамма DSM 9103.

1988; Wolf, Gilbert, 1992; Potthoff-Karl ct al., 1996; Sillanpaa, 1997; Weilenmann et al., 2004). В 2000 г суммарное мировое производство ЭДТА достигло 2-105 тонн, при этом 70-80% потребленного ЭДТА

Рис. 1. Структура ЭДТА (а) и его комплекса с металлами (б) (Egli, 2001).

2. Изучить физиолого-биохимические свойства облигатного деструктора ЭДТА, штамма LPM-4.

3. Провести сравнительный этимологический анализ путей первичного и центрального метаболизма ЭДТА у новых штаммов-деструкторов.

4. Разработать систему олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена ЭДТА монооксигеназы.

Научная новизна работы. Расширено представление о биоразнообразии аэробных деструкторов ЭДТА. Методами полифазной таксономии установлена принадлежность четырех штаммов к новому роду и двум видам Chelativorans gen. nov.: штаммы LPM-410, LPM-6 и DSM 9103 отнесены к виду C.multitrophicus gen.nov., sp.nov., а облигатный деструктор ЭДТА штамм LPM-4 классифицирован как C.oligotrophicus gen.nov., sp.nov. Штамм LPM-5 идентифицирован как новый вид Stenotrophomonas chelatiphaga sp.nov.

Сравнительный энзимологический анализ показал, что первичное окисление осуществляется монооксигеназами, отщепляющими ацетильные группы от ЭДТА с поглощением кислорода и образованием глиоксилата и аммония. Обнаружены различия в зависимости монооксигеназ разных штаммов от кофакторов (ФАД или ФМН). Показано, что продукт оксигенирования ЭДТА - глиоксилат, вовлекается в метаболизм через глиоксилатный и глицератный пути. Обнаружено, что, в отличие от других деструкторов ЭДТА, ограниченно-факультативный штамм LPM-6 и облигатный штамм LPM-4 имеют разомкнутый цикл Кребса, т.к. у них отсутствует активность а-кетоглутаратдегидрогеназы и активности ферментов гликолиза (6-фосфофруктокиназы и альдолазы фруктозо-1,6-бисфосфата). У облигатного деструктора обнаружено ингибирование некоторых ферментов углеводного метаболизма ЭДТА, накопление полифосфатов в клетках, растущих на ЭДТА, и последующее расходование при потреблении глюкозы, что, отчасти, объясняет двухфазное использование смеси ЭДТА+глюкоза.

Научно-практическое значение. Детально охарактеризованы пять штаммов- деструкторов ЭДТА, которые могут быть использованы на очистных сооружениях, биофильтрах и биосенсорах. Показано, что способность штамма C.oligotrophicus LPM-4 к деградации ЭДТА не снижается в присутствии Сахаров и органических кислот.

Разработана система олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации бактериального гена монооксигеназы ЭДТА - етоА, позволяющая оценивать степень распространения деструкторов этого поллютанта в различных биотопах, минуя длительную и сложную процедуру выделения чистых культур.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 2-ой и 3-ей межрегиональных конференциях молодых ученых (Саратов, 2004, 2006), Всероссийских молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005, 2007), International Symposium on Environmental Biotechnology (Leipzig, 2006), Российской школе-конференции «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино-Тула, 2006), 10-й Путинской школе конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), 2-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), 1-ом Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» с международным участием (Казань, 2008), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2003-2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 9 тезисов. Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лабораториях радиоактивных изотопов и физиологии микроорганизмов в рамках плана научно-исследовательских работ УРАН ИБФМ РАН по теме «Взаимодействие микроорганизмов и растений в процессах деградации углеводородов нефти и микробной трансформации соединений металлов» (№ Госрегистрации 01.2.007 08216).

Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам УРАН ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н., проф. Ерошину В.К., д.б.н., проф. Вайнштейну М.Б., д.ф-м.н. Минкевичу И.Г. к.б.н. Чистяковой Т.И., к.б.н. Дедюхиной Э.Г., к.б.н. Сатрутдинову А.Д., ст.лаб. Зиновкиной Л.Д., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Трилисенко Т.В., д.б.н. Меденцеву А.Г., н.с. Кошелеву А.В., к.б.н. Окуневу О.Н., к.б.н. Ивановой Е.Г., к.б.н. Бесчастному А.П., д.б.н. Хмелениной В.Н., к.б.н. Торгонской М.А. и к.б.н. Медведковой К.А., асп. Федорову Д.Н., н.с. Лысанской В.Я., а также к.б.н. Лысенко A.M. (ИНМИ РАН), д.б.н. Осипову Г.А. (Академическая группа ак. Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва).

Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям - д.б.н. Дорониной Н.В. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 06-04-49580-а и Госконтракта 02.740.11.0296.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,

заключения, выводов и списка литературы, включающего 191 ссылку, содержит 29 таблиц и 39 рисунков.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследований служили штаммы-деструкторы ЭДТА, выделенные к.б.н. Чистяковой Т.И. (лаборатория физиологии микроорганизмов УРАН ИБФМ РАН), а также типовые штаммы коллекции лаборатории метилотрофии, Всероссийской коллекции микроорганизмов (УРАН ИБФМ РАН, г.Пущино), DSMZ (Германия, Брауншвейг).

Культивирование бактерий. Деструкторов ЭДТА выращивали на минеральной среде, содержащей 1г/л ЭДТА при 29°С и рН 7.0-7.2 (Egli et al., 1988). Исследование влияния температуры на физиологические характеристики штамма LPM-4 осуществляли в режиме рН-ауксостата на ферментере Ultroferm LKB 1601 (Швеция). Периодическое культивирование штамма LPM-4 на среде с ЭДТА и глюкозой проводили в колбах и на установке АНКУМ, общим объемом 10 л при (t = 33°С; рН = 7; р02 = 40 %). Оптическую плотность культуры определяли на приборе Specol 221 (Германия) при 546 нм с пересчетом на вес сухой биомассы по калибровочной кривой. Концентрацию ЭДТА определяли на хроматографе HPLC (Waters, UK) (Kluener et al., 1998), ионы аммония определяли с помощью ионселективного электрода «3kom-NH4» иономера (Экотест-120, ИЭЛРАН НЛП ЭКОНИКС). Потребление органических кислот анализировали на хроматографе HPLC (Waters, UK), с колонкой Arninex НРХ-87, 300 mm х 7.8 mm (BIO RAD) при 210 нм. Концентрацию глюкозы определяли с помощью набора «Глюкоза ФС ДДС 100» (Диакон, Россия). Aminobacter aminovorans ВКМ-2058Т выращивали на среде «К», содержащей (г/л): КН2Р04 - 2; (NHO2SO4 - 2; NaCl - 0.5; MgS04 • 7Н20 - 0.025; FeS04 • 7Н20 - 0.002; рН 7.2 с добавлением 0.3 % метиламина при при 29°С в колбах объемом 0.75 л с 200 мл среды на качалке (180 об/мин). Stenotrophomonas maltophilia ВКМ В-591т выращивали на среде 5.5, содержащей (г/л): аминопептид - 60; гидролизат казеина - 5; дрожжевой экстракт 1; экстракт сои - 30; агар - 20; рН 8.0, а также на 2% триптон-соевом агаре. Mesorhizobium loti DSM 2626т выращивали на среде, содержащей (г/л): маннит - 10, дрожжевой экстракт - 1, почвенный экстракт - 200 мл, рН 7.0. Почвенный экстракт готовили, суспендируя 80 г садовой почвы в 200 мл дистиллированной воды, добавляли 0.2г Na2C03 и автоклавировали при 1 атм 1 час, затем добавляли в среду. Электронно-микроскопические исследования проведены в лаборатории Структурно-функциональной адаптации микроорганизмов УРАН ИБФМ РАН по описанным методикам (Reynolds, 1963).

Физиолого-биохнмические свойства штаммов - деструкторов ЭДТА изучали общепринятыми методами (Герхардт, 1984). Значения ц, Y*/,, q вычисляли по известным формулам (Перт, 1978). Активность ферментов в бесклеточных экстрактах определяли описанными методами (Elliot et al., 1955; Kornberg, Horecker, 1955; Dixon, Kornberg, 1959; McFadden et al., 1960; Ornston, Ornston, 1969; Blackmore, Quayle, 1970; Meers, Tempest, 1970; Carls, Hanson, 1971; Robinson, Labow, 1971, Wood, 1971; Walsh et al., 1976; van Dijken, Quayle, 1977; Логинова, Троценко, 1979; Levering et al., 1984; Witschel et al., 1997). Содержание белка определяли модифицированным методом Лоури (Schacterle and Pollack, 1973). Анализ жирнокислотного состава клеток проведен д.б.н. Г.А.Осиповым (Академическая группа Исакова Ю.Ф., РАМН, г.Москва). Состав убихинонов определен с.н.с. Б.П. Баскуновым и к.х.н. В.М. Аданиным. Фосфолипидный состав и содержание полифосфатов в клетках деструкторов анализировали стандартными методами (Говорухина, Троценко 1989; Вагабов с соавт., 1998). Молекулярио-гслетические методы. ДНК выделяли модифицированным методом (Wilson, 1997). ГЦ моль% определяли по температуре плавления ДНК на спектрофотометре "Pye Unicam". ДНК-ДНК гибридизацию проводили методом реассоциации (De Ley, 1970). ПЦР-амплификацию и секвенирование гена 16S рРНК проводили стандартными методами (Lane, 1991). Ген niflí амплифицировали ПЦР, используя разработанные праймеры (Федоров с соавт., 2008). ПЦР-амплификацию проводили на ДНК термоциклере Hybaid (Англия).

Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы осуществляли на колонках с использованием набора «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» (Promega, США), согласно инструкции фирмы - производителя. Секвенирование ПЦР - фрагментов проводили при помощи наборов BigDye® Terminator vl.l и капиллярного анализатора ABI PRISM® (Applied Biosystems, США).

Филогенетический анализ проводили с помощью пакета программ BLAST [http://ncbi.nfm.nih.gov], CLUSTAL W [http://www.gencbee.msu.su/clustal], TREECON (Van de Peer and DeWachter, 1994), MEGA4 (Tamura et al., 2007). Анализ нуклеотидных последовательностей, их трансляцию в амипокислотные последовательности осуществляли при помощи программ VectorNTI®Advance v.9.0 и GeneRuner3.05. Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ. Синтез праймеров осуществлен фирмой «Синтол» (Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Биоразнообразие и особенности аэробных бактерий- деструкторов ЭДТА

Электронно-микроскопические исследования показали, что штаммы ЬРМ-4 (рис. 2 а), ЬРМ-410 (рис. 2 б), ЬРМ-5 (рис. 2 в), а также ЬРМ-6 (рис. 2 г) представлены палочковидными бактериями, клетки которых имеют грамотрицательный тип строения клеточной стенки. Клетки штамма ЬРМ-4 неподвижны, тогда как у штаммов ЬРМ-410, ЬРМ-5, ЬРМ-6 они подвижны и обладают полярными жгутиками (рис. 2 б, в, г). Все новые изоляты растут на среде, содержащей 1 г/л ЭДТА в качестве единственного источника углерода, азота и энергии.

Общие и дифференцирующие признаки исследуемых деструкторов приведены в табл. 1.

Установлено, что штамм ЬРМ-4 не растёт на богатых средах (МПА, ГКА) и на синтетических средах с сахарами, спиртами, органическими кислотами, аминокислотами, метилированными аминами. Следовательно, штамм ЬРМ-4 является облигатным деструктором ЭДТА. Напротив, штаммы ЬРМ-410 и ЬРМ-5 являются факультативными деструкторами, поскольку используют широкий спектр углеродных субстратов (табл. 1). Ограниченно-факультативным является штамм ЬРМ-6, поскольку, помимо ЭДТА, использует только галактозу, сукцинат и глицерин.

1.1. Влияние температуры на физиологические характеристики роста (|1т„, У^, ц) штамма ЬРМ-4 на среде с ЭДТА.

В режиме рН-ауксостата исследовали влияние температуры на физиологические характеристики штамма ЬРМ-4. Показано, что культура росла с Цтах = 0.095 ч-1 в диапазоне температур 32-34°С. Наибольшее значение выхода клеток по массе (Уда = 0.22) наблюдали в диапазоне 30-32°С, которое снижалось при температурах 20 и 40°С. Повышенная температура (40°С) не оказала необратимого влияния на удельную скорость роста и выход клеток Ухи, так как оптимальные значения этих параметров восстанавливались при переходе к оптимальному режиму. Удельная скорость потребления ЭДТА Яз (г ЭДГА/г клеток-ч) достигала наибольшего значения 0.446 ч'1 при 34°С. Доля энергии субстрата, перешедшая в биомассу (энергетический выход клеток), имела наибольшее значение 0.314 в интервале 30-32°С.

Рис.2. Морфология и ультраструктура клеток деструкторов ЭДТА. а - ЬРМ-4; б - ЬРМ-410; в - ЬРМ-5; г - ЬРМ-6. ж-жгутик; нм-наружная мембрана.

_____________

Табл. 1. Общие и дифференцирующие признаки штаммов-деструкторов ЭДТА

Свойства LPM-4 LPM-410 LPM-5 LPM-6

Размеры клеток, мкм 0.4-0.5 х 1.0-2.0 | 0.6-0.8x1.0-3.0 I 0.5-0.7 х 0.8-1.31 0.6-0.7x1.0-1.3

Морфология клеток Палочки

Тип клеточной стенки Грамотрицательные

Жгутикование - + + +

Оксидаза, каталаза, + + + +

образование индола

Уреаза, гидролиз Tween 80, - - - -

выделение H2S

Гидролиз крахмала, - + + -

разжижение желатины

Пептонизация казеина в - + + -

молоке

Восстановление NO3' в NO2' - + - -

Тип деструкции ЭДТА облигатный факультативный ограниченно-

факультативный

Источники углерода и

энергии: ЭДТА + + + +

Нитрилотриацетат - + + -

Этилендиаминдисукцинат + - -

Глиоксилат - - -

Глюкоза + + -

Фруктоза - + -

Арабиноза + + -

Галактоза - + +

Ксилоза, мальтоза, манноза + + -

Сахароза - - -

Рамноза + - -

Саркозин, дульцит - - -

Органические кислоты:

Фумарат - - -

Сукцинат + + +

Малат - + -

Ацетат, пируват + + -

Аминокислоты:

L-глутамат, L-аспартат, - - - -

L-глицин, L-валин,

L-триптофан, бетаин

L-аланин, L-серин - + - -

Спирты и амины:

Этанол, метанол - - - -

Глицерин - - + +

Moho-, ди- и триметиламин - - - -

Потребность в витаминах биотин - - биотин, тиамин

Температурный оптимум, °С 32-34 28-30 28-37 28-37

Оптимум рН для роста 6.8-7.2 6.8-7.2 5.5-8.5 6.8-7.2

Оптимум NaCl для роста, (%) 1.5 1.5 2.5 1.5

ГЦ ДНК, мол% 60.8 65.4 68.3 63.2

2. Влияние Сахаров и органических кислот на рост штамма ЬРМ-4.

2.1. Метаболические особенности облигатного деструктора штамма ЬРМ-4

при росте на смеси ЭДТА и глюкозы

При периодическом культивировании штамма ЬРМ-4 на смеси ЭДТА и глюкозы обнаружено, что сначала потреблялся ЭДТА (рис. 3). Глюкоза не

метаболизировалась клетками в течение 48 ч (кривая 5, рис. 3) и начинала использоваться только после значительного снижения концентрации ЭДТА (кривая 4). Максимальная удельная скорость роста культуры отмечена в фазе потребления ЭДТА и составляла

о.1 ä

0,01

Время, сутки

Рис. 3. Рост штамма ЬРМ-4 на среде с ЭДТА и глюкозой. Биомасса: 1 - контроль (ЭДТА), 2 -опыт (ЭДТА+глюкоза); потребление ЭДТА: 3 - контроль; 4 -опыт: 5-потоебление глюкозы.

0.061 ч", она была несколько ниже при использовании глюкозы и составляла 0.053 ч"1. Концентрация биомассы, образованной из ЭДТА и глюкозы, составила 0.256 г/л и

0.263 г/л, соответственно.

Итак, при росте деструктора на смеси ЭДТА с глюкозой происходило двухфазное использование этих субстратов (кривая 2, рис. 3). Во второй фазе роста наблюдали прирост биомассы.

Исследовали влияние различных концентраций Mg2+3flTA на активность ферментов ассимиляции глюкозы (гексокиназы и дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата) в экстрактах клеток, выращенных на ЭДТА. Обнаружено, что активность гексокиназы снижалась на 79%, а глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы -на 26% при внесении 4 мМ Mg2+3flTA, вероятно, вследствие связывания Mg2+ или изменения конформации фермента.

Ранее, рентгеноструктурный анализ элементного состава клеток штамма DSM 9103, выращенных на ЭДТА, выявил наличие в электронноплотных включениях таких элементов, как фосфор, магний и кальций (Witschet et ab, 1999). Примечательно, что при потреблении ЭДГА штаммом ЬРМ-4 на ультратонких срезах клеток также обнаружены темные электронноплотные включения, сходные с полифосфатными гранулами (рис. 4 а), которые отсутствовали у клеток, использующих глюкозу (рис. 4 б).

Рис. 4. Ультраструктура клеток штамма ЬРМ-4 при

использовании смеси ЭДТА и глюкозы. Фазы использования (а) ЭДТА, (б) глюкозы. Длина масштабной метки 1 мкм.

Общее содержание полиР в клетках в фазе утилизации глюкозы снижалось почти в 5 раз, по сравнению с таковым при росте клеток на ЭДТА (табл. 2).

Табл. 2. Содержание ортофосфата (РО полифосфатов (полиР) (мкмольР/г сухой биомассы) в клетках штамма ЬРМ-4 при выращивании на смеси ЭДТА и глюкозы

Фракция Фаза потребления Фаза потребления

ЭДТА глюкозы

Pi 5660 1343

I Кислоторастворимая фракция полиР 916 156

II Щелочерастворимая фракция полиР 13 3

III Кислото- щелоченерастворимая 18 31

фракция полиР

Сумма полиР 947 190

Это свидетельствует об активном использовании полиР в качестве донора макроэргического фосфата при образовании глюкозо-6-фосфата. Более того, штамм ЬРМ-4 обладает ферментами метаболизма полиР — полифосфаткиназой, активность которой снижалась при росте клеток на глюкозе, полиР глюкокиназой, а также аденилаткиназой. Последняя играет важную роль в регенерации АТФ (2АДФ<->АТФ+АМФ).

Полученные результаты дают основание заключить, что ингибирование ферментов метаболизма глюкозы (гексокиназы и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы) высокими концентрациями ЭДТА является одной из причин двустадийного роста облигатного деструктора штамма ЬРМ-4 на смеси ЭДТА с глюкозой. Поскольку глюкоза не может служить единственным и достаточным источником энергии, полиР, накапливающиеся в процессе роста клеток на ЭДТА, используются в качестве дополнительного источника энергии для потребления этого сахара.

2.2. Влияние органических кислот на рост штамма ЬРМ-4 и деградацию ЭДТА.

Исследовали влияние органических кислот цикла Кребса (сукцината, фумарата, малата, цитрата, изоцитрата), а также ацетата, в присутствии ЭДТА на рост штамма ЬРМ-4.

При росте бактерий на смеси ЭДТА с сукцинатом (0.93 г/л) сначала потреблялся ЭДТА и только при значительном снижении его концентрации в ростовой среде (О.бг/л) начинал использоваться сукцинат. При этом наблюдали прирост биомассы по сравнению с контролем (1 г/л ЭДТА) и отсутствие влияния сукцината на деградацию ЭДТА. Причем как в опыте, так и в контроле ЭДТА потреблялся полностью. Аналогичную закономерность наблюдали при выращивании клеток на смесях ЭДТА с другими органическими кислотами (фумаратом, манатом). Однако в присутствии высоких концентраций цитрата и изоцитрата (1 г/л) ингибировался рост клеток и потребление ЭДТА, хотя ацетат (1.2 г/л) использовался почти одновременно с ЭДТА. Следовательно, штамм LPM-4 можно использовать на очистных сооружениях, поскольку присутствие органических кислот и Сахаров не снижало способности штамма к деградации ЭДТА.

3. Идентификация деструкторов ЭДТА

3.1 Хемо- и генотаксономические характеристики и филогенетическое положение штаммов LPM-4, LPM-410, LPM-6 и DSM 9103.

В фосфолипидном составе клеток выявлены нейтральные (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилмонометилэтаноламин, дифосфатидилэтаноламин) и отрицательно заряженные (фосфатидилглицерин, фосфатидилсерин и кардиолипин) фосфолипиды. Основной хинон дыхательной цепи у новых деструкторов ЭДТА - убихинон Qio. Показано, что при росте на ЭДТА у штаммов LPM-4, LPM-6 и DSM 9103 доминировали октадеценовые (Ci8:i), гексадекановая (Cis;o) и октадекановая (Cig:o) жирные кислоты. Присутствовали также эйкозадиеновые и цикло-нанодекановые кислоты. У клеток факультативных деструкторов ЭДТА, выращенных на триптон-соевом агаре, преобладали гексадеценовые (Ci6i) жирные кислоты и повышалась доля гексадекановых кислот. При росте штамма LPM-410 на средах с глюкозой и триптон-соевом агаре сохранялся примерно одинаковый уровень додекановых (Ci2o), гексадекановых и октадекановых кислот, но полностью отсутствовали циклопропановые жирные кислоты. Отмечено также, что у штамма DSM 9103 доминирующими жирными кислотами на триптои-соевом агаре являются разветвленные кислоты С^оатеизо и Ci7;oairrch305 110 отсутствовали гидрокси- и циклопропановые жирные кислоты. Таким образом, обнаружено существенное изменение состава жирных кислот при росте исследуемых штаммов на ЭДТА, по сравнению с другими субстратами (глюкоза или триптон-соевый агар). В составе

полиаминов изучаемых деструкторов ЭДТА доминировал 5}ти-гомоспермидин, а также присутствовали небольшие количества путресцина и спермидина.

Показано, что содержание ГЦ в ДНК штаммов LPM-4 и DSM 9103 составляет 60.8 и 63.1 мол.%, соответственно, у штамма LPM-410- 65.4 мол.%, у штамма LPM-6 - 63.2 мол.%. Исследуемые штаммы принадлежат к классу Alphaproíeobacteria. По данным секвенировапия гена 16S рРНК, штаммы LPM-4 и DSM 9103 имеют сходство 99.3%. Однако проведенная ДНК-ДНК гибридизация выявила низкий (37%) уровень гомологии, что свидетельствует о их принадлежности к разным видам одного рода. У штаммов LPM-410 и LPM-6 на основании секвенирования гена 16S рРНК выявлен высокий уровень гомологии между собой и ранее выделенными факультативными деструкторами ЭДТА -штаммами BNC1 и DSM 9103 (99.9%), тогда как с облигатным штаммом LPM-4 99.2 - 99.3%. По данным секвенирования гена 16S рРНК, новые деструкторы ЭДТА оказались наиболее близки представителям родов Aminobacter (94.8 -95.9%), Mesorhizobium (94.2 - 96.9%) и Pseudaminobacter (95.0 - 95.7%) (рис. 5). Уровень ДНК-ДНК гомологии штаммов DSM 9103 и LPM-4 с типовой культурой Aminobacter aminavorans DSM 7048т составил только 10 и 11%, соответственно, что подтверждает принадлежность исследуемых штаммов к другому таксону. Новые изоляты отличаются от представителей рода Mesorhizobium по физиологии, отсутствию гранул 111Ь и неспособности фиксировать атмосферный азот, так как не имеют nifHD генов нитрогеназы. Наконец, в отличие от исследуемых штаммов, представители родов Mesorhizobium и Aminobacter являются плеоморфными палочками.

По совокупности изученных свойств штаммы LPM-4, DSM 9103, LPM-410, LPM-6 отнесены к новому роду, для которого предложено название -Chelativorans gen.nov. [Che.la' ti.vorans. N.L. n. chelatum, хелат; L. part. adj. vorans, поедать, использовать; N.L. mase. n. Chelativorans, бактерия, использующая хелаты с металлами] и двум видам - Chelativorans oligotrophies LPM-4 sp. nov. (типовой штамм LPM-4T = BKM В-2395т = DSM 19276х) (o.li.go.tro'phicus. Gr. adj. oligos, мало; Gr.adj. trophicos, потребляющая; N.L. masc.adj. oligotrophia^ бактерия, утилизирующая небольшое количество ростовых субстратов) и Chelativorans multitrophicus DSM 9103, LPM-410, LPM-6 (типовой штамм DSM 9103х = BKM B-2394T) (mu.lti.tro'phicus. L. adj. multus, много; Gr.adj. trophicos, потребляющая; N.L. masc. adj. multitrophicus бактерия, утилизирующая многие ростовые субстраты). Типовой вид Chelativorans multitrophicus.

Полный диагноз новых таксонов приведен в диссертации.

0.02

100

100 [ Aminobacter aminovorans DSM 6450 (AJ011762) Aminobacter aminovorans DSM 7048T (AJ011759) Mesorhizobium loti ATCC 33669T CD 14514^ Wj Mesorhizobium plurifarium LMG 11892 (Y14158) Mesorhizobium amorphae ACCC 19665 (AF041442)

711-Pseudaminobacter salicylatoxidans BN12 (AF072542)

100 ,—Deflwibacter Itisatiae DSM11099 (AJ132378) Aquamicrobium defluvium DSM 11603 (Y15403)

[-Chelativorans oligotrophiais LPM-4T (EF457242) 50 Chelativorans multitrophicus DSM 9103T (EF457243) Chelativorans multitrophicus LPM-410 (FJ167675) Chelativorans multitrophicus LPM-6 (FJ 167676) Chelativorans multitrophicus BNC1 DSM 6780 (NC_008254) 100 I Sinorhizobium fredü ATCC3 5423т П) 1451

1 Sinorhizobium americanum CFNEI 156T (AF506513)

-Agrobacterium tumefaciens C4 (AF508093)

Rhizobium galegae ATCC 43677T (D11343)

69| 100 I-Rhizobium tropici CIAT 899T(U898321

fOOj-Rhizobium leguminosarum ATCC 10004T (AY509899) Rhizobium etli CFN 42 (U28916)

100 I-Azospirilium lipoferum ATCC 29707 (М5906П

Azospirillum brasilense ЛТСС 29145 (AY324110)

Escherichia coli 0157:117 (АУ513502)

Рис. 5. Филогенетическое положение деструкторов ЭДТА среди представителей Alphaproteobacteria, основанное на сравнении нуклеотидиых последовательностей гена 16S рРНК.

Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционным расстоянием). Корень определен включением последовательности Е. coli в качестве внешней группы. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrapw-анализа 100 альтернативных деревьев.

3.2. Хсмо- и генотаксономнческне характеристики и филогенетическое положение штамма LPM-5, факультативного деструктора ЭДТА.

По данным секвенирования гена ]6S рРНК, штамм LPM-5 принадлежит к классу Gammaproteobacteria и наиболее близок представителям рода Stenotrophomonas: S. maltophilia LMG 958т = VKM В-591т (98.6%), S. acidaminiphila AMX 19T (97.0%), S. nitritireducens DSM 12575T (97.2%), S. rhizophila e-plOT (98.3%) (рис. 6). Содержание ГЦ в ДНК составляет 68.3 мол.%. Доминирующий убихинон -Qg.

0.1,

95 74 59 96

100

- Stenotrophomonas humi R-327291 (AM403587)

- Pseudomonaspictorum АТСС 23328т (AB021392)

- Stenotrophomonas nitritireducens L2T (AJ 012229)

- Stenotrophomonas terrae R-32768T (AM403589) Stenotrophomonas acidaminiphila AMX19T (AF273080)

- Stenotrophomonas koreensis TR6-01T (AB166885) Г Stenotrophomonas maltophilia IAM 12423T (AB2945S3)

Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5T (EU 573216) ~ Stenotrophomonas rhizophila e-pl0T (AJ293463)

- Stenotrophomonas dokdonensis DS-16T (DQ178977)

—Pseudoxanthomonas broegbernensis В1616/1 (AJ012231)

- Luteimonas mephitis B1953/27.11 (AJ012228)

- Escherichia coli 0157:H7 (АУ513502)

Рис. 6. Филогенетическое положение Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5 , основанное на сравнении нуклеотидной последовательности 16S рДНК среди представителей родов Stenotrophomonas, Luteimonas и Pseudoxanthomonas. Показаны bootstrap значения выше 45%. Дерево построено относительно последовательности 16S рЩ1К Escherichia coli 0157:Н7 (АУ513502).

В отличие от представителей рода Stenotrophomonas, имеющих различную осмотолерантность (3-5% NaCl), штамм LPM-5 ингибируется концентрациями NaCl выше 2.5 % и не способен расти при 4°С. Использует ксилозу в качестве источника углерода и энергии; не способен восстанавливать цитраты до нитритов; не обладает антифунгальной активностью и липазой. У штамма LPM-5 при росте на среде с ЭДТА и на триптон-соевом агаре обнаружены существенные отличия в фосфолипидном составе клеток, которые, вероятно, связаны с перестройкой клеточных мембран. Анализ состава жирных кислот выявил, что клетки штаммов LPM-5 и S.maltophilia ВКМ В-591т, выращенные на триптон-соевом агаре, имеют

близкий жирнокислотный профиль с преобладанием гексадеценовой (Ci6:iW7) и изопентадекановой (Cus) кислот. ДНК-ДНК гибридизация методом ДНК реассоциации выявила 51% гомологии штамма LPM-5 с типовой культурой S. maltophilia LMG 958Т=ВКМ В-591т. В целом, проведенный полифазный анализ позволил предложить для штамма LPM-5 новый видовой эпитет «chelatiphaga» (che.la' ti.pha'ga Gr.n. chele клешня; N.L. v. chelato образующий клешневидные комплексы с катионами, т.е хелаты; Gr. v. phagein поедать, потреблять; N.L. adj. chelatiphaga бактерия, потребляющая хелаты). Полный диагноз Stenotrophomonas chelatiphaga sp. nov. приведен в диссертации.

4. Пути первичного и центрального метаболизма ЭДТА у новых деструкторов

4.1. Экзометаболиты деградации ЭДТА.

При выращивании исследуемых штаммов на ЭДТА в среде обнаружены два промежуточных продукта деградации: глиоксилат (13-30 мкМ) и ионы аммония (40-80 мг/л), а также нингидринпозитивное вещество, тогда как ЭДТА не окрашивается нингидрином. ТСХ и аминокислотный анализ с метчиками аминокислот показали, что это соединение, содержит аминогруппу, и, возможно, является этилендиамином.

4.2. Пути ассимиляции углерода и азота у деструкторов ЭДТА. 4.2.1. Первый фермент деградации ЭДТА.

Полярографические измерения скорости поглощения кислорода отмытыми клетками выращенных на ЭДТА штаммов LPM-4 и LPM-410 показали, что они потребляют кислород в присутствии ЭДТА. Следовательно, первый этап разложения ЭДТА катализирует оксигеназа. Анализ продуктов разложения ЭДТА экстрактами клеток исследуемых штаммов выявил, что одним из первых продуктов деградации является глиоксилат. Реакция разложения ЭДТА зависела от НАДН2 и стимулировалась ФМН у штаммов LPM-4 и LPM-6, а не ФАД или рибофлавином. Итак, первым ферментом деградации ЭДТА у исследуемых штаммов является монооксигеназа, подобная той, которая была обнаружена у штамма DSM 9103 (Witschel et al., 1997). Штамм LPM-5 обладает ФАД-стимулируемой ЭДТА-монооксигеназой, тогда как монооксигеназа ЭДТА у штамма LPM-410 не стимулируется флавинами. Кроме того, показано, что ЭДТА-монооксигеназы у штаммов LPM-4, LPM-410 и LPM-5 активны в широком диапазоне рН, в отличие от известного штамма DSM 9103, у которого активность монооксигеназы ЭДТА отсутствовала при рН 6.0 и 9.0 (Witschel et al., 1997). Это существенно отличает первый фермент деградации ЭДТА у новых деструкторов.

Наиболее высокая активность монооксигеназы у штаммов LPM-4 и LPM-410 выявлена при pH 8.0, а у штамма LPM-5 - при pH 7.4.

4.2.2. Разработка системы олигонуклеотидных праймеров на ЭДТА-монооксигеназу.

В настоящее время внимание исследователей привлекают так называемые «функциональные гены», анализ которых позволяет оценить распространение различных групп микроорганизмов в биотопах. К таким функциональным генам можно отнести ген етоА, кодирующий А субъединицу (монооксигеназу) ферментного комплекса деградации ЭДТА (Witschel et al., 1997; Payne et al., 1998). Поскольку список бактерий - дестукторов ЭДТА весьма ограничен, объем выборки включал последовательности етоА у штамма BNC1 (AFI76664) и гена птоА деградации нитрилотриацетата у Aminobacter aminovorans АТСС 29600 (L49438). Были выбраны наиболее консервативные участки гена ЭДТА монооксигеназы, что позволило создать системы праймеров [один обратный - Е rev (5 '-GGCKAYCTGMTYCGGCGT-3') и два прямых Е fori (5'-CCKGTSRTYGTYCAGGCAG-3'), Е for2 (5'-CGGCTGGAAYGYGGTCАС-3')] для амплификации генов етоА размером около 750 п.н. для Е for2- Е rev и 460 п.н. для праймеров Е fori- Е rev. ДНК из чистых культур деструкторов ЭДТА (Chelativorans oligotrophicus LPM-4, Chelativorans multitrophicus DSM 9103, С. multitrophicus LPM-410, С. multitrophicus LPM-6 и Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5) использовали для проверки праймеров. В качестве негативного контроля использовали ДНК E.coli. Используя систему Е for2 - Е rev со всеми пробами ДНК, получили ампликоны длиной 750 п.н. Все выделенные ДНК имели 99.5100% гомологию между секвенированными нами фрагментами генов етоА и етоА у штамма BNC1 (DSM 6780).

В итоге, было подтверждено, что полученные ПЦР-фрагменты соответствуют генам етоА, трансляция которых в аминокислотную последовательность позволила построить филогенетическое дерево, на котором все новые и ранее известные деструкторы ЭДТА (DSM 9103 и BNC1) из классов Alpha- и Gammaproteobacteria объединены в один кластер. Следовательно, предложенная система праймеров способна успешно выявлять фрагменты гена етоА у прокариот различных классов.

4.3. Активность ферментов метаболизма углерода и азота в бесклеточных экстрактах деструкторов ЭДТА

Результаты энзимологического анализа исследуемых штаммов, выращенных на ЭДТА, приведены в табл. 3.

Табл. 3. Активность ферментов в экстрактах клеток деструкторов ЭДТА

Кофакторы Активность, нмоль/ мин/ мг белка

Ферменты

ЬРМ-4 ЬРМ-410 ЬРМ-5 ЬРМ-6

1 2 3 4 5 6

надн2 80 61 16 36

Монооксигеназа эдта надн2, фмн 156 50 17 52

надн2> фад 81 24 29 27

Изоцитратлиаза 4 6 2 2

Малатсинтаза 91 1444 840 139

Глиоксилаткарболигаза tпф,mg2+ 10 н.о. н.о. н.о.

Глиоксилатредуктаза надн2 23 15 19 11

Глицераткиназа атф 109 267 80 0

Оксипируватредуктаза надн2 надфн2 0 69 513 0 0 160 0 105

Пируваткиназа 152 804 643 52

Пируватдегидрогеназа на/г 9 9 80 100

Цитратсинтаза 63 681 965 735

Изоцитрат над* 0 2122 0 0

дегидрогеназа надф+ 118 2570 1148 1105

а-Кетоглутарат- над+ 0 9 2 0

дегидрогеназа

надн2 0 508 0 1007

Малатдегидрогеназа надфн2 надф 87 0 0 0 965 0 0 0

над" 0 168 0 50

Гексокиназа атф 90 305 63 105

Глюкозо-6-фосфат над+ 0 0 0 0

дегидрогеназа надф+ 12 280 26 100

6-фосфоглюконат над+ 0 684 0 0

дегидрогеназа надф+ 12 171 16 100

6-фосфофрукгокиназа АТФ, ФФн 0 2 2 0

Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза надн2 0 411 607 0

Фруктозо-1,6-бисфосфатаза надф+ 38 20 3 11

КДФГ- альдолаза 4 10 12 2

надн2 0 663 103 129

Аланиндегидрогеназа нддфн2 0 0 115 201

Глутаматдегидрогеназа надн2 надфн2 0 14 0 0 0 0 0 0

Глутаматсинтаза надн2 надфн2 0 14 14 14 41 0 96 128

Глутаминсинтетаза АТФ, 2+ 8 40 14 5

Известно несколько путей вовлечения продукта оксигенирования ЭДТА -глиоксилата, в центральный метаболизм: малат-синтазой, глицератный (через тартроновый полуальдегид) и 3-оксиаспартатный, катализируемый альдолазой эритро-р-гидроксиаспартата. Показано, что у исследуемых штаммов глиоксилат метаболизируется через глиоксилатный (изоцитратлиаза и малатсинтаза) и глицератный пути (глиоксилаткарболигаза) (табл. 3). Облигатный деструктор штамм LPM-4 и ограниченно-факультативный штамм LPM-6 не имеют активности а-кетоглутаратдегидрогеназы (по-видимому, цитратный цикл дефектен по этому ферменту) и ферментов гликолиза (6-фосфофруктокиназы и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы). Напротив, у факультативных деструкторов LPM-410 и LPM-5 обнаружены активности а-кетоглутаратдегидрогеназы, фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы, фруктозо-1,6-бисфосфатазы и КДФГ-альдолазы.

У всех изучаемых штаммов выявлены активности гексокиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (табл. 3). Следовательно, ассимиляция глюкозы у этих штаммов происходит через гликолитический и пентозофосфатный пути.

Аммоний ассимилируется восстановительным аминированием а-кетоглутарата или пирувата, а также через глутаматный цикл (глутаматсинтаза и глутаминсинтетаза). Далее перераспределение азота осуществляется в реакциях трансаминирования.

У штаммов LPM-4 и LPM-410 наблюдается разнообразие ферментов карбоксилирования: найдены активности пируваткарбоксилазы, ФЕП -карбоксилазы и ФЕП - карбоксикиназы.

Используя праймеры на оксидазу иминодиацетата IdaA5 - IdaA3 (Liu et al., 2001), мы показали, что IdaA штаммов BNC1 и LPM-4 имеют 99.7% сходства. Это свидетельствует об участии ИДА оксидазы у штамма LPM-4 в окислении этилендиаминдиацетата до глиоксилата и этилендиамина.

На основании полученных энзимологических данных предложена схема путей первичного и центрального метаболизма у облигатного деструктора ЭДТА штамма LPM-4 (рис. 7).

НДДНг НАД

НАДН2 НАД*

Этилендиаминтетраацетат ФМНН2-

ФМН

лиоксилат

Этилендиаминтриацетат ФМНН2-

ФМН

02-

н2о— _

у ^__/лиоксилат -

НАДН2

НАД НАДН2

Этилендиам

ФАДН2-

02-

чндиацетат ^-►Глиоксилат'

ФАД

Этилендиаминмоноацетат уФАДН,^

I Глиоксилат

НАД* Этилендиамин

»С02

Тартроновый полуальдегид НАДН; НАД*

^ наднг

Глицерат

АТФ— АДФ~}

3-фосфоглицерат I

Фосфоенолпируват-

АДФ-^| АТФ

Пируват -

НАД*—ОСО, ДЦФ НАДН2 АТФ '

НАДО НАДФН2

V >

Оксипируват

Ацетил-КоА

АТФ ЫН4*-

Цитрат

{ Глиоксилат Изоцитрат

надф* — надфн2—-а

СОг

а-Кетоглутарат

гпн; НАДФН2

Серии

ГЛИОКСИЛАТ

Глутамин -Глутамат«—'

Оксалоацетат ( ^

^ надфнг надф* Малат \

Фумарат ;

Сукцинат

Пируват Алании

Глутамат а-Кетоглутарат

НАДФ* Глутамат

Рис. 7. Схема путей первичного и центрального метаболизма ЭДТА у облигатного деструктора СкеЫмогат о^о(горИки5 ЬРМ-4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методами полифазной таксономии новые штаммы-деструкторы ЭДТА классифицированы как представители двух видов нового рода Chelativorans (С. oligotrophicus LPM-4 и С. multitrophicus LPM-410 и LPM-6) и нового вида Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5. Известные деструкторы ЭДТА, штаммы DSM 9103 и BNC1 отнесены к новому роду и виду Chelativorans multitrophicus.

С. oligotrophicus LPM-4 является облигатным, а штамм С. multitrophicus LPM-6 - ограниченно-факультативным деструкторами ЭДТА, тогда как С. multitrophicus DSM 9103, LPM-410 и Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5 используют это соединение факультативно.

Показано, что первым ферментом деградации ЭДТА у изучаемых штаммов являются монооксигеназы, зависимые от НАДН2 и стимулируемые ФМН/ФАД или не зависимые от флавинов. Выяснение сущности выявленных отличий в кофакторах, а также возможное участие этилендиамина в качестве интермедиата деградации ЭДТА, представляет самостоятельный интерес.

Нами показано, что первичные продукты деградации ЭДТА - глиоксилат и ионы аммония, далее вовлекаются в центральный метаболизм. Глиоксилат метаболизируется с участием малатсинтазы через глиоксилатный шунт и глицератный путь. Факультативные деструкторы ЭДТА имеют замкнутый цикл Кребса, в отличие от облигатного штамма LPM-4 и ограниченно-факультативного штамма LPM-6, у которых ЦПС разомкнут на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы и отсутствуют ферменты гликолиза (6-фосфофруктокиназа и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза). Очевидно, что обнаруженные метаболические дефекты являются одной из причин облигатной и ограниченно-факультативной зависимости от ЭДТА. Напротив, факультативные деструкторы LPM-410 и LPM-5 обладают активностями а-кетоглутаратдегидрогеназы, фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы, фруктозо-1,6-бисфосфатазы и КДФГ-альдолазы. Из этого следует, что данные штаммы ассимилируют глюкозу гликолитическим и пентозофосфатными путями.

NH/ ассимилируется путем восстановительного аминирования пирувата или а-кетоглутарата и в реакциях трансаминирования. В анаплеротической фиксации С02 у штаммов LPM-4 и LPM-410 участвуют: пируваткарбоксилаза, ФЕП-карбоксилаза и ФЕП-карбоксикиназа.

На основании результатов энзимологического анализа предложена схема путей первичного и центрального метаболизма ЭДТА для наиболее детально изученного деструктора С. oligotrophicus LPM-4.

Выявленные существенные различия в жирнокислотном и фосфолипидном профилях клеток исследуемых факультативных деструкторов при росте на ЭДТА и триптон-соевом агаре свидетельствуют о значительной перестройке клеточных мембран.

Особый интерес представляет способность С. о1що1горЫсш ЬРМ-4 к двухфазному росту на смеси ЭДТА+глюкоза. Предполагается, что при этом глюкоза используется в качестве дополнительного источника углерода. Возможно, рост культуры на глюкозе после исчерпания ЭДТА в среде обусловлен использованием энергии накопленных полиР, уровень которых снижался во второй фазе роста. Обнаруженное ингибирование гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы ЭДТА может быть одной из причин двухфазности роста С. oligotrophicus ЬРМ-4 на смеси ЭДГА с глюкозой.

Установлено, что потребление ацетата клетками С. о^о1горЫси$ ЬРМ-4 происходило практически одновременно с использованием ЭДТА, тогда как сукцинат, фумарат, малат и цитрат потреблялись после значительного снижения концентрации ЭДТА в среде.

Разработанная нами система праймеров, позволяющая получать фрагменты гена етоА длиной около 750 п.н., оказалась эффективной для выявления искомого гена у прокариот - деструкторов ЭДГА.

Кроме того, исследуемые деструкторы представляют интерес для сравнительного изучения молекулярных и регуляторных аспектов метаболизма ЭДТА у бактерий, а также в качестве агентов биоремедиации окружающей среды при создании специфических биофильтров и биосенсоров.

выводы

1. Методами полифазной таксономии пять штаммов-деструкторов ЭДТА идентифицированы как представители двух видов нового рода Chelativorans -

С. oligotrophicus LPM-4, С. multitröphicus LPM-410, LPM-6, DSM 9103 и нового вида Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5.

2. Определены параметры роста штамма LPM-4 в режиме рН-ауксостата: |imlK= 0.095 ч"1 при 32-34 °С, выход массы клеток от массы субстрата Yx/s=0.22, энергетический выход трО.314. Показано, что, в отличие от факультативных деструкторов ЭДТА, С. oligotrophicus LPM-4 использует глюкозу и органические кислоты (сукцинат, фумарат, малат, цитрат) только после снижения концентрации ЭДТА в среде, однако ацетат используется почти одновременно.

3. Установлено, что первичными продуктами деградации ЭДТА являются глиоксилат, ионы аммония и этилендиамин. Основными путями вовлечения глиоксилата в метаболизм являются глиоксилатный и глицератный пути.

4. Обнаружено, что облигатный деструктор ЭДТА С. oligotrophicus LPM-4 и ограниченно-факультативный С. multitröphicus LPM-6, в отличие от факультативных, не имеют активности а-кетоглутаратдегидрогеназы, 6-фосфофруктокиназы и альдолазы фруктозо-1.6-бисфосфата, что является одной из причин неспособности расти на органических кислотах и сахарах. Выявлено ингибирование гексокиназы и глокозо-6-фосфатдегидрогепазы ЭДТА в экстрактах клеток штамма LPM-4. Обнаружено накопление и последующее использование полифосфатов при двухфазном росте штамма LPM-4 на среде с ЭДТА и глюкозой.

5. Показано, что исследуемые штаммы ассимилируют аммонийный азот путем восстановительного аминирования а-кетоглутарата или пирувата, а также через глутаматный цикл с последующим трансаминированием огранических кислот.

6. Впервые разработана система олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации бактериального гена ЭДТА монооксигеназы етоА, позволяющая оценить степень распространения деструкторов этого поллютанта в различных биотопах.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1. Chistyakova T.I., Dedyukhina E.G., Satroutdinov A.D., KaparuUina E.N., Gavrish E.Yu., Eroshin V.K. EDTA-dependent bacterial strain / Process Biochemistry. 2005. V. 40. №2. P. 601-605.

2. Сатрутдинов А.Д., Чистякова Т.И., Дедюхина Э.Г., Капаруллина E.H., Ерошин B.K. Штамм бактерий, характеризующийся потребностью в ЭДТА / Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. №5. С. 535-540.

3. Доронина Н.В., Капаруллина E.H., Вайнштейн М.Б., Троценко IO.A. Особенности метаболизма облигатного деструктора этилендиаминтетраацетата / Микробиология. 2006. Т.75. №3. С. 420-423.

4. Minkevich I.G., Satroutdinov A.D., Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Kaparullina E.N., Koshelev A.V., Okunev O.N. The effect of temperature on bacterial degradation of EDTA in pH - auxostat / World J. Microbiol. Biotechnol. 2006. V 22. №11. P.1205-1213.

5. Капаруллина E.H., Федоров Д.Н., Доронина HB., Троценко Ю.А. Система олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации бактериального гена монооксигеназы этилендиаминтетраацетата emoA / Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т.44. №4. С. 399-403.

6. Kaparullina Е„ Doronina N„ Chistyakova Т., Trotsenko Yu. Stenotrophomonas chelatiphaga sp. nov, a new aerobic EDTA-degrading bacterium / Syst. Appl. Microbiol. 2009. V.32. № 3. P.-157-162.

7. Doronina N.V., Kaparullina E.N., Trotsenko Yu.A., Nörtemann В., Bucheli-Witschel M, Weilenmann H-U., Egli T. Chelativorans multitrophicus gen.nov., sp.nov. and Chelativorans oligotrophicus sp.nov., aerobic, EDTA-degrading bacterium / Int. J. Syst-MMcrobiol. 2009. D01.10.1099/ijs.0.003152-0 http://ijs.sgmjournals.org.

Тезисы:

1. Капаруллина E.H., Чистякова Т.Н., Сатрутдинов А.Д., Гавриш ЕМ. Бактериальный штамм, разрушающий ЭДТА / II Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия с окружающей средой». 26-28 октября 2004 г. Саратов. Материалы конференции. Изд-во: «Научная книга». 2004. С.42.

2. Капаруллина E.H. Метаболизм углерода и азота у облигатного деструктора ЭДТА / Актуальные аспекты современной микробиологии. Тезисы

Всероссийской молодежной школы - конференции. 1-3 ноября 2005 г. Москва. Изд-во: «МАКС-Пресс». 2005. С.37-38.

3. Doronina N.V., Kaparullina E.N., Trotsenko Yu.A. Metabolic features of obligate aerobic EDTA destructor / International Symposium on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006. Book of Abstracts. 9-14 July 2006. UFZ Center for Environmental Research Leipzig-Halle in the Helmholtz Association. Leipzig, Germany. P.294.

4. Капаруллина E.H., Асадуллина H.P. Метаболизм углерода и азота у облигатного и факультативного деструкторов ЭДТА / Биология - наука XXI века. 10-я Пущинская школа - конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН. 17-21 апреля 2006 г. Сборник тезисов. Пущино. ОНТИ ПНЦ РАН. 2006. С. 195.

5. Капаруллина E.H. Пути метаболизма ЭДТА у аэробных бактерий / III Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия с окружающей средой». 10-12 октября 2006 г. Саратов. Изд-во: «Научная книга». 2006. С. 12.

6. Капаруллина E.H. Физиолого-биохимические аспекты биодеградации этилендиаминтетраацетата Chelaíovorus oligotrophus LPM-4. Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии». 28 октября - 3 ноября 2006 г. Пущино. Сборник статей. 2006. С. 44-46.

7. Капаруллина E.H., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Облигатный и факультативный деструкторы ЭДТА: метаболические аспекты / Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ: материалы 2-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием. (Иркутск, Россия), 10-15 сентября 2007 г. Иркутск. Изд-во: Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 2007. С. 97.

8. Капаруллина E.H., Федоров Д.Н. Новый бактериальный деструктор этилендиаминтетраацетата / III Всероссийская молодежная школа — конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции 22-23 ноября 2007 г. Москва. Изд-во: «МАКС-Пресс» 2007. С. 43-45.

9. Капаруллина E.H. Stenotrophomonas chelatiphaga - новый факультативный деструктор этилендиаминтетраацетата / 1-й Всероссийский конгресс студентов и аспирантов -биологов «Симбиоз Россия-2008» с международным участием. 6-10 июля 2008 г. Казань. Изд-во: «КГУ». 2008. С. 50-53.

Подписано в печать:

13.10.2009

Заказ 2691 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 да.'т.аШогеГекИ.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Капаруллина, Елена Николаевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общая характеристика комилексонов

1.1. Классификации комилексонов

1.2. Важнейшие представители комплексонов

1.3. Комплексообразование АПК

1.3.1. Комплексообразование ЭД ГА

1.3.2. Комплексообразование HTA

1.4. Комплексоны естественного происхождения

1.5. Применение комплексонов

1.6. АПК в окружающей среде

1.6.1. ЭДТА и HTA в водоемах и донных отложениях

1.6.2. ЭДТА и HTA в грунтовой и питьевой воде

1.6.3. Уровень ЭДТА и HTA в сточных водах

1.6.4. Экологические риски применения хелатов

Глава 2. Разложение аминополикарбоксилатов

2.1. Абиотические методы разложения АПК

2.2 Разложение АПК микроорганизмами

2.3. Биохимические пути деградации ЭДТА и HTA

2.3.1. Деградация HTA

2.3.2. Деградация ЭДТА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы методы

3.1. Объекты исследований

3.2. Культивирование бактерий

3.2.1. Периодическое культивирование

3.2.2. Непрерывное культивирование. рН-ауксостат

3.3. Исследование ультраструкгуры клеток

3.4. Определение скорости потребления кислорода

3.5. Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств

3.6. Получение бесклеточных экстрактов

3.7. Определение активности ферментов

3.8. Определение фосфолипидного состава клеток

3.9. Определение жирнокислотного состава в системе Шерлок

3.10. Выделение и идентификация изопреноидных компонентов

3.11. Определение фосфорсодержащих соединений в клетках деструкторов

3.12. Определение концентрации ЭДТА и биомассы

3.13. Определение концентрации ионов аммония

3.14. Определение содержания органических кислот

3.15. Определение концентрации глюкозы

3.16. Определение индола

3.17. Определение аминокислотного состава

3.18. Выделение ДНК

3.19. ПЦР-амплификация и секвенирование гена 168 рРНК

3.20. ПЦР-амплификация т/НЭ генов

3.21. Разработка олигонуклеотвдных праймеров для детекции и амплификации етоА гена

3.22. Определение нуклеотидного состава ДНК

3.23. ДНК-ДНК гибридизация

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Биоразнообразие и особенности аэробных бактерий -деструкторов ЭДТА

4.1. Морфология и физиолого-биохимические свойства штаммов

4.2. Потребность штаммов в источниках углерода и энергии

4.2.1. Влияние источника углерода, азота и энергии на рост штамма ЬРМ-4 63 4.2.1.1. Метаболические особенности облигатного деструктора штамма ЬРМпри росте на смеси с ЭДТА и глюкозой

4.2.2. Влияние органических кислот на рост штамма ЬРМ-4 и деградацию ЭДТА

4.2.3. Влияние органических кислот (цикла Кребса и ацетата) на эффективность роста штамма ЬРМ

4.3. Рост штамма ЬРМ-4 расти на средах с органическими кислотами и сульфатом аммония

4.4. Влияние температуры на физиологические характеристики роста (¡атах, Ух/э, г|) штамма ЬРМ-4 на среде с ЭДТА

4.5. Потребности штаммов- деструкторов ЭДТА в витаминах

4.6. Антибиотикоустойчивость деструкторов ЭДТА

Глава 5. Идентификация деструкторов ЭДТА

5.1. Хемо- и генотаксономические характеристики и филогенетическое положение штаммов LPM-4, LPM-410, LPM-6 и DSM

5.2. Описание нового рода Chelativorans gen. nov.

5.2.1. Описание Chelativorans multitrophicus sp. nov.

5.2.2. Описание Chelativorans oligotrophicus sp. nov.

5.3. Хемо- и генотаксономические характеристики и филогенетическое положение штамма LPM

5.3.1. Описание Stenotrophomonas chelaiiphaga sp. nov.

Глава 6. Пути первичного и центрального метаболизма ЭДТА у новых деструкторов

6.1. Экзометаболиты деградации ЭДТА

6.2. Определение активности дыхания

6.3. Пути ассимиляции углерода и азота у деструкторов ЭДТА

6.3.1. Первый фермент деградации ЭДТА

6.3.2. Разработка системы олигонуклеотидных праймеров на ЭДТА-монооксигеназу

6.3.2.1. Выбор и конструирование праймеров

6.3.2.2. Проверка праймеров

6.3.3. Активность ферментов метаболизма углерода и азота в бесклеточных экстрактах клеток деструкторов ЭДТА

6.4. Участие оксидазы иминодиацетата в деградации ЭДТА

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деградация этилендиаминтетраацетата аэробными бактериями"

Актуальность проблемы. Эти ленд нами нтетраацстат (ЭДТА) - синтетический хелатирующий агент группы аминополикарбоксильных кислот, широко применяется благодаря способности образовывать стабильные водорастворимые комплексы с ионами двух- и трехвалентных металлов (Egli, 1988; Wolf, Gilbert, 1992; Potthoff-Karl et al., 1996; Sillanpaa. 1997; Weilenmann et al., 2004). В 2000 г суммарное мировое производство ЭДТА достигло 2-105 тонн, при этом 70-80% потребленного ЭДТА поступает в окружающую среду (Nowack, Van Briesen, 2005; Дедюхина с соавт. 2007, 2008). В результате комплексообразования с ЭДТА металлы переходят в раствор из трубопроводов, ила и донных осадков рек и водоемов, что приводит к загрязнению питьевой воды и потенциально угрожает здоровью людей. Поэтому закономерен интерес исследователей к деградации ЭДТА.

Известны два способа разрушения ЭДТА: физико-химический (фотолиз, озонирование) и микробиологический, причем второй способ разложения считается наиболее эффективным. Тем не менее, к началу нашей работы было выделено лишь несколько смешанных и чистых культур бактерий деструкторов ЭДТА, которые, однако, не были идентифицированы (Noertemann. 1992; Miyzaki, Suzuki, 1997; Kluener et al., 1998; Young et al., 2001; Witschel, 1999; Bucheli-Witschcl et al., 2001; Сатрутдинов с соавт., 2003; Chistyakova et al., 2003, 2005; Clien et al., 2005; Imada et al„ 2005). Хотя был охарактеризован первый фермент деградации ЭДТА - ФМН-зависимая ЭДТА монооксигеназа у штаммов DSM9103 и BNC1, (Witschel et al., 1997; Noertemann, 1999: 2005; Bohuslavek et al., 2001), а у штамма BNC1 секвенирован геном, общая картина метаболических превращений ЭДТА до сих пор остается фрагментарной. Все вышеизложенное определило актуальность таксономического и физиолого-биохимического исследования новых деструкторов ЭДТА.

Цель и задачи исследования. Цель работы - таксономическая и физиолого-биохимическая характеристика новых штаммов аэробных деструкторов ЭДТА. Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Определить таксономическое положение четырех новых деструкторов ЭДТА и известного штамма DSM 9103.

2. Изучить физиолого-биохимические свойства облигатного деструктора ЭДТА, штамма

LPM-4.

3. Провести сравнительный энзимологический анализ путей первичного и центрального метаболизма ЭДТА у новых штаммов-деструкторов.

4. Разработать систему олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена ЭДТА монооксигеназы.

Научная новизна работы. Расширено представление о биоразпообразии аэробных деструкторов ЭДТА. Методами полифазной таксономии установлена принадлежность четырех штаммов к новому роду и двум видам Chelalivorans gen. по v.: штаммы LPM-410, LPM-6 и DSM 9103 отнесены к виду C.mullilrophicus gen.nov., sp.nov., а облигатный деструктор ЭДТА штамм LPM-4 классифицирован как C.oligotroplricus gen.nov., sp.nov. Штамм LPM-5 идентифицирован как новый вид Stenotrophomonas chelatiphaga sp.nov.

Сравнительный энзимологический анализ показал, чго первичное окисление осуществляется монооксигеназами, отщепляющими ацетильные группы от ЭДТА с поглощением кислорода и образованием глиоксилата и аммония. Обнаружены различия в зависимости мопооксигеназ разных штаммов от кофакторов (ФАД или ФМН). Показано, что продукт оксигенпрования ЭДТА - глиоксилат, вовлекается в метаболизм через глиоксилатный и глицератпын пуги. Обнаружено, что, в отличие от других деструкторов ЭДТА, ограниченно-факультативный штамм LPM-6 и облигатный штамм LPM-4 имеют разомкнутый цикл Кребса, т.к. у них отсутствует активность а-кетоглутаратдегидрогеназы и активности ферментов' гликолиза (6-фосфофруктокиназы и альдолазы фруктозо-1,6-бисфосфата). У облигатного деструктора обнаружено ингибирование некоторых ферментов углеводного метаболизма 4мМ ЭДТА, накопление полифосфатов в клетках, растущих на ЭДТА, и последующее расходование при потреблении глюкозы, что, отчасти, объясняет двухфазное использование смеси ЭДТА+глюкоза.

Практическая значимость. Детально охарактеризованы пять штаммов-деструкторов ЭДТА, которые могут быть использованы на очистных сооружениях, биофилырах п биосенсорах.

Показано, что способность штамма C.oligotrophicus LPM-4 к деградации ЭДТА не снижается в присутствии Сахаров и органических кислот.

Разработана система олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации бактериального гена монооксигеназы ЭДТА — етоА, позволяющая оценивать степень распространения деструкторов этого поллютанта в различных биотопах, минуя длительную и сложную процедуру выделения чистых культур.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 2-ой и 3-ей межрегиональных конференциях молодых ученых (Саратов, 2004, 2006), Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005, 2007), International Symposium on Environmental Biotechnology (Leipzig, 2006), Российской школе-конференции «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино-Тула, 2006), 10-й Пущинской школе конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), 2-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), 1-ом Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» с международным участием (Казань, 2008), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2003-2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 9 тезисов. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 191 ссылку, содержит 29 таблиц и 39 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Капаруллина, Елена Николаевна

выводы

1. Методами полифазной таксономии пять штаммов-деструкторов ЭДТА идентифицированы как представители двух видов нового рода Chelativorans

С. oligotrophicus LPM-4, С. multitrophicus LPM-410, LPM-6, DSM 9103 и нового вида Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5.

2. Определены параметры роста штамма LPM-4 в режиме рН-ауксостата: 0.095 ч"1 при 32-34 °С, выход массы клеток от массы субстрата Yx/s=0.22, энергетический выход г| составил 0.314. Показано, что, в отличие от факультативных деструкторов ЭДТА, С. oligotrophicus LPM-4 использует глюкозу и органические кислоты (сукцинат, фумарат, малаг, цитрат) только после снижения концентрации ЭДТА в среде, однако ацетат используется почти одновременно.

3. Установлено, что первичными продуктами деградации ЭДГА являются глиоксилат, ионы аммония и этилендиамин. Основными путями вовлечения глиоксилата в метаболизм являются глноксилатный и глицератный пути.

4. Обнаружено, что облигатный деструктор ЭДТА С. oligotrophicus LPM-4 и ограниченно-факультативный С. multitrophicus LPM-6, в отличие от факультативных, не имеют активности а-кетоглутаратдегидрогеназы, 6-фосфофруктокиназы и альдолазы фруктозо-1.6-бисфосфата, что является одной из причин неспособности расти на органических кислотах и сахарах. Выявлено ингибировапие гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы ЭДТА в экстрактах клеток штамма LPM-4. Обнаружено накопление и последующее использование полифосфатов при двухфазном росте штамма LPM-4 на среде с ЭДТА и глюкозой.

6. Впервые разработана система олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации бактериального гена ЭДТА монооксигеназы етоА, позволяющая оцепить степень распространения деструкторов этого поллютанта в различных биотопах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С. oligotrophicus LPM-4 является облигатным, а штамм С. multitrophicus LPM-6 -ограниченно-факультативным деструкторами ЭДТА, тогда как С. multitrophicus DSM 9103, LPM-410 и Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5 используют это соединение факультативно.

Показано, что первым ферментом деградации ЭДТА у изучаемых штаммов являются монооксигеназы, зависимые от НАДН2 и стимулируемые ФМН/ФАД или не зависимые от флавинов. Выяснение сущнос ги выявленных отличий в кофакторах, а также возможное участие этилендиамина в качестве интермедиата деградации ЭДТА, представляет самостоятельный интерес.

Нами показано, что первичные продукты деградации ЭДТА - глиоксилат и ионы аммония, далее вовлекаются в центральный метаболизм. Глиоксилаг метаболизируется с участием малатсинтазы через глиоксилатный шунт и глицсратньш путь. Факультативные деструкторы ЭДТА имеют замкнутый цикл Кребса, в отличие от облигатного штамма LPM-4 и ограниченно-факультативного штамма LPM-6, у которых ЦТК разомкнут на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы и отсутствуют ферменты гликолиза (6-фосфофруктокиназа и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза). Очевидно, что обнаруженные метаболические дефекты являются одной из причин облигатной и ограниченно-факультативной зависимости от ЭДТА. Напротив, факультативные деструкторы LPM-410 и LPM-5 обладают активностями а-кетоглутаратдегидрогеназы, фруктозо-1.6-бисфосфатальдолазы, фруктозо-1,6-бисфосфатазы и КДФГ-альдолазы. Из этого следует, что данные штаммы ассимилируют глюкозу глпколитическим и пентозофосфатпыми путями.

NH4+ ассимилируется путем восстановительного аминнрования пирувата или а-кетоглутарата и в реакциях трансаминирования. В анаплеротической фиксации СОо у штаммов LPM-4 и LPM-410 участвуют: пируваткарбоксилаза, ФЕП-карбоксилаза и ФЕП-карбоксикиназа.

На основании результатов энзимологического анализа предложена схема íiyieií первичного и центрального метаболизма ЭДТА для наиболее детально изученного деструктора С. oligotrophicus LPM-4.

Выявленные существенные различия в жирнокислотном и фосфолипидном профилях' клеток исследуемых факультативных деструкторов при росте на ЭДТА и триптон-соевом агаре свидетельствуют о значительной перестройке клеточных мембран.

Особый интерес представляет способность С. oligotrop¡ucus I Л'М-4 к двухфазному росту на смеси ЭДТА+глюкоза. Предполагается, что при этом глюкоза используется в качестве дополнительного источника углерода. Возможно, рост культуры на глюкозе после исчерпания ЭДТА в среде обусловлен использованием энергии накопленных полиР, уровень которых снижался во второй фазе роста. Обнаруженное ингибирование гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы ЭДТА может быть одной из причин двухфазности роста С. оГщои-орЫст ЬРМ-4 на смеси ЭДТА с глюкозой.

Установлено, что потребление ацетата клетками С. о1що1горЫси5 ЬРМ-4 происходило практически одновременно с использованием ЭДТА, тогда как сукцинат, фумарат, малат и цитрат потреблялись после значительного снижения концентрации ЭДТА в среде.

Разработанная нами система праймеров, позволяющая получать фрагменты гена етоА длиной около 750 п.п., оказалась эффективной для выявления искомого гена у прокариот - деструкторов ЭДТА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Капаруллина, Елена Николаевна, Пущино

1. Аколъзин П.А., Герасимов В.В. Коррозия конструкционных материалов ядерных и тепловых энергетических установок. М.: Высшая школа. 1963. 350 с.

2. Бек М. Химия равновесий реакций комплексообразования. М.: Мир. 1973. 145 с.

3. Босоло Ф. Химия координационных соединений. М.: Мир. 1966. 145 с.

4. Вагабов В.М., Трилисенко JI.B., Щипанова И.Н., Сибельдииа II.А., Кулаев И.С. Изменение длины цепи неорганических полифосфатов в зависимости от стадии роста Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. 1998. Т.67. №.2. С. 188-193.

5. Герхардт Ф. и др. (под.рсд). Методы общей бактериологии. М.: Мир. 1984. 264с.

6. Говорухина Н.И., Троцеико Ю.А. Фосфолипидный состав метилотрофных бактерий // Микробиология. 1989. Т. 58. № 3. С. 405-411.

7. Дегли С., Николъсон Д. Метаболитичсские пути. М.: Мир. 1973. 310 с.

8. Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.П., Миикевнч И.Г. Биодеградация ЭДТА // Вес шик биотехнологии и физико-химической биологии. 2007. №2. С. 40-49.

9. Дедюхина Э.Г., Салмов Н., Чистякова Т.П., Минкевич И.Г., Вайниппеин М.Б. Бактериальный штамм облигатный деструктор ЭДТА и перспективы его использования для очистки воды // Вода: химия и экология. 2008. №2. С. 31-34.

10. Дятлова Н.М., ТемкипаВ.Я., Колпакова ЫД. Комплексоны. М.: Химия. 1970. 416 с. И. Дятлова И. А f., Темкипа В.Я., Колпакова М.Д. Комплексоны и комнлексопагыметаллов. М.: Химия. 1988. 545 с.

11. Ерошин В.К. Основы материально-энергетического баланса роста микроорганизмов. Пущино.: НЦБИ АН СССР. 1980. 415 с.

12. Колоус В., Павличек 3. Биофизическая химия. М.: Мир. 1985. 450 с.

13. Кулаев И.С, Белозерский А.Н., Крицкий М.С., Кокурина H.A. О полифосфатах плодовых тел шампиньонов и строчков //Докл. АН СССР. 1960. Т. 130.С. 667-670.

14. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Кулаковская Т.В. // Высокомолекулярные неорганические полифосфаты: биохимия, клеточная биология, биотехнология/ М.: Научный мир. 2005.216 с.

15. Логинова Н.В., Троцеико Ю.А. Карбоксилазы пирувата и фосфоенолпирувата у метилотрофов // Микробиология. Т.42. №2. С. 202-207.

16. А1арусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко U.K., Гальченко Ф.В. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов niJH различных таксономических групп прокариот // Микробиология. 2001. Т.70. №1. С. 86-91.

17. Минкевич ИГ. Материально-энергетический баланс живой клетки // Прикл. биохим. микробиол. 1996. Т.32. № 1. С.100-109.

18. Мутафов С.Б. Минкевич И.Г., Ерошин В.К. рН ауксостат: теория и практика. Методические рекомендации. Пущино.: ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1985. 40 с.

19. Нетрусов А.И, Егорова М.А., Захарчук Л.М и др. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для студентов высш.учебных заведении / под. ред. Нетрусова А.И. М.: «Академия». 2005. 608 с.

20. Патент № 5 252 483 США, МКИ C12S001/00. Degradation of ferric chelates by a pure culture of A grobacterium sp.

21. Патент № 5 364 786 США, МКИ C12N001/20. Pure culture of Agrobacterium sp. which degrades ferric chelates.

22. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. 1978. 332 с.

23. Порой-Коненц М.А., Полынова Т.Н. Координационная химия. М.: Химия. 1984. 725 с.

24. Пришбл Р. Комплексоны в химическом анализе. М.: Иностранная литература. 1960. С. 23.

25. Ратнер Е.Н., Ушаков В.М.,Фихте Б.А. Устройство для экструзионнон дезинтеграции микроорганизмов. Под ред. Фихте Б.А. Пущино. 1972. С. 240-246.

26. Сатрутдинов А.Д., Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.Н., Минкевич И.Г., Ерошин В.К. Исследование микробной деградации ЭД ГА // Микробиология. 2003. №1. С. 97 102.

27. Федоров Д.Н., Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Новая система вырожденных олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации nifHD генов // Микробиология. 2008. Т. 77. С. 286-288.

28. Яцимирский КБ. (под ред.) Биологические аспекты координационной химии. Киев.: Наукова Думка. 1979. 360 с.

29. Akiyama M., Crooke Е., Romberg A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 31. P. 22556-22561.

30. Alder A.C., Siegrist IL, Gujer IV., Giger W. Behaviour of NT A and EDTA in biological wastewater treatment // Water Res. 1990.V.24. P. 733-742.

31. Alarcôn E, J. Decap, G. Vidal. Resistance of diethylenetriaminepentaacetic acid to anaerobic biodégradation// Electronic J. Biotechnol. 2005. V. 8. №.3. P. 308-313.

32. Anderson R.L., Bishop E.B., Campbell R.L. A review of the environmental and mammalian toxicology of nitrilotriacetic acid // Crit. Rev. Toxicol. 1985. V. 15. P. 1-102.

33. Andreev, L.V., Galchenko V.F. Phospholipid composition and differentiation of methanotrophic bacteria//J. Liq. Chromatogr. 1983. V.6. P. 2699-2707.

34. Babay P.A., Emilio C.A., Ferreyra R.E., Gautier E.A., Gettar R.T., Litter M.I. Kinetics and mechanism of EDTA 'photocatalytic degradation with Ti02 under different expiremental conditions // Int. J. Photoenergy. 2001. V. 3. P. 193-199.

35. Belly R.T., Lauff J. J., Goodhue C.T. Degradation of ethylenediaminetetraacetic acid by microbial populations from an aerated lagoon // Appl. Microbiol. 1975. V.29. P. 787-794.

36. Blackmore M.A., Ouayle J.R. Microbial growth on oxalate by a route not involving glyoxylate carboligase // Biochem. J. 1970. V.118. P. 53-59.

37. Bohuslavek J; Payne J W; Liu Y; Bolton H; Xun L. Cloning, sequencing, and characterization of a gene cluster involved in EDTA degradation from the bacterium BNC1 / Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67. №2. P.688-695.

38. Bolton II., Girvin D.C., Playmale A.E., Harvey S.D., Workman D.G. Degradation of metal-nitrilotriacetate complexes by Chelatobacter heintzii II Environ. Sei. Technol. 1996. V.30. P. 931-938.

39. Brauch H.J., Schullerer S. Verhalten von Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und Nitrilotriacetat (NTA) bei der Trinkwasseraufbereitung 11 Vom Wasser. 1987. V.69. P. 155164.

40. Brauch II.J., Kuhn W. Organishe Spurenstoffe im Rhein und bei der Trinkwasseraufbereitung//Wasser Abwasser. 1988. V.129. P. 189-196.

41. Bucheli-Witshel M., Egli T. Environmental fate and microbial degradation of aminopolycarboxylic acids//FEMS Microbiol Rev. 2001.V.25. P. 69-106.

42. Budesinsky M., Budzikiewics H., Prochazka Z, Ripperger IL, Romer A., Scholz G. Schreiber K. Nicotianamine, a possible phytosiderophore of general occurrcncc // Phytochemistry. 1980. V.19. P. 2295-2297.

43. Carls R.A., Hanson R.S. Isolation and characterization of tricarboxylic acid cycle mutants of Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 1971. V. 106. P. 848-855.

44. Casdorph HR. EDTA chelation therapy, efficacy in arteriosclerotic heart desease // J. Holistic Medicine. 1981. V.3. №1. P. 53-59.

45. Chen S.C., Chen S-L., Fang H.Y. Study on EDTA-degrading bacterium Burkholderia cepacia YL-6 for bioaugmentation. // Bioresource Technology. 2005. V.96. P. 1782-1787.

46. Chistyakova T.I., Belikova V.L., Satroutdinov A.D., Dedyukhina E.G., Eroshin V.K. A novel EDTA-degrading Pseudomonas sp.ll World J. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.19. P. 977-980.

47. Chistyakova T.I., Dedyukhina E.G., Satroutdinov A.D., Kaparullina E.N., Gavrish E.Yu. Eroshin V.K. EDTA-dependent bacterial strain // Proc. Biochem. 2005. V.40. № 2. P. 601605.

48. Collins M.D. Analysis of isoprenoid quinines. In: Methods in Microbiology, (ed. Gottschalk G), New York, Acad. Press. 1985. V. 18. P.329-366.

49. Cripps R.E. and Noble A.S. The microbial metabolism of nitrilotriacetate // Biochem. J. 1972. V.130. P. 31-32.

50. Cripps R.E., Noble A.S. The metabolism of nitrilotriacetate by a Pseudomonad II Biochem. J. 1973. V.136. P. 1059-1068.

51. De Ley ./., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridisation from renaturation rates // Eur. J. Biochem. 1970. V.12. P. 133-142.

52. Desa R.J. Putrescine oxidase from Micrococcus rubens. Purfication and properties of the enzyme // J. Biol.Chem. 1972. V. 247. №17. P. 5527-5534.

53. Dietz F. Gewasserbelastung durch EDTA — eine neue Herausforderung an den Gewasserschutz // Korrespondenz Abwasser. 1985. V.ll. P. 988-989.

54. Dietz F. Neue Messergebnisse über die belastung von trinkwasser mit EDTA II Wasser Abwasser. 1987. V.128. P. 286-288.

55. Dixon G.H., Kornberg H.L. Assay for key enzymes of glyoxylate cycle // Biochem. 1959. V.72. P. 3-11.

56. Doherty D. L-glutamate dehydrogenase (yeast). In: Methods Enzymol. V.XXVII A. P.850.

57. Drechsel, IL, Metzger, J., Freund, S., Jung, G., Boelaert, J.R. Winkelmann. G. Rhizofcrrin a novel siderophore from the fungus Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis // BioMctals 1991. V. 4. P. 238-243.

58. Egli T., Weilenmann H.U., El-Banna T., Aiding G. Gramm-negative, aerobic, nitrilo-triacetate-utilizing bacteria from wastewater and soil // Syst. Appl. Microbiol. 1988. V.10. P. 297-305.

59. Egli T. Biodegradation of metal-complexing aminopolycarboxylic acids // J. Biosci. Bioeng. 2001. V.92. P. 89-97.

60. Eklund,B, Bruno,E, Lithner,G, Borg,H. Use of ethylenediaminetetraacetic acid in pulp mills and effects on metal mobility and primary production // Environ. Toxicol. Chem. 2002. V. 21. №5. P. 1040-1051.

61. Elliot W.H. Glutamine synthesis // Metods Enzymol. 1955. V.2. P. 337.

62. Firestone M.K., Tiedje J.M. Biodegradation of metal-nitrilotriacetat complexes by a Pseudomonas specics // Appl. Environ. Microbiol. 1975. V.29. P. 758-764.

63. Firestone M.K., Tiedje J.M. Pathway of degradation of nitrilotriacetate by a Pseudomonas species // Appl. Environ. Microbiol. 1978. V.29. P. 955-961.

64. Ferris F.G., Beveidge T.J, Doyle R.J. Metallic ion interactions with the outer membrane of Gram-negative bacteria // J. Metal Ions and Bacteria. 1989. V.102. P. 295-323.

65. Focht D.D., Joseph H.A. Bacterial degradation of nitrilotriacetic acid // Can. J. Microbiol. 1971. V.17. P. 1553-1556.

66. Frimmel F.H., Grenz R., Kordick E., Dietz F. Nitrilotriacetat (NTA) und Ethylendiamintetraacetat (EDTA) in Fliesgewassern der Bundesrepublik Deutschland II Vom Wasser. 1989. V.72. P. 175-184.

67. Gibt s R.G., Morris J.G. Assay and properties of ß-hydroxyaspartate aldolase from Micrococcus denitrificans // Biochim. Biophys. Acta. 1964. V.85. P.501-503.

68. Gilbert E., Hoffmann-Glewe S. Ozonation of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) in aqueous solution, influence of pH value and metal ions // Water Res. WATRAG 1990. V. 24. №1. P. 39-44.

69. Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetric estimation of indole-acetic acid // Plant Physiol. 1951. V. 26. P. 192-195.

70. Gordon G.F. Oral chelation with EDTA // J. Holistic. Medicine. 1986. V.8. №1. P. 79-80.

71. Gschwind N. Biologischer Abbau von EDTA in einem Modellabwasser II Gas- WasserFach Wasser Abwasser. 1992.V.133. P. 546-549.

72. Haberer K. Rheinwasser als Rohstoff fur die Grundwasseranreichterung in Wiesbaden II Wasser Abwasser. 1991. V.132. P. 60-64.

73. Hamana K., Minamisawa K. & Matsuzaki S. Polyamines in Rhizobium, Bradyrhizobium. Azorhizobium and Agrobacterium II FEMS Microbiology Letters 1990. V.71. P. 71-76.

74. Henneken L„ Noertemann B., Hempel D.C. Influence of physiological conditions of EDTA degradation // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.44. P. 190 179.

75. Heintz W. Ueber dem Ammoniaktypus angehoerige saeuren. // Annal. Chem. Pharm. 1862. V.122. P. 257-294.

76. Heyer J., Galchenko V. F., Dunfield P. F. Molecular phylogeny of type II methane-oxidizing bacteria isolated from various environments // Microbiology (UK). 2002. V. 148. №9. P. 2831-2846.

77. Hugenschmidt, S., Planas-Bohne, F., Taylor D. On the toxicity of low doses of tetrasodium-ethylene-diaminetetraacetate (Na-EDTA) in normal rat kidney (NRK) cells in culture // Arch. Toxicol. 1993. V.67. P. 76-78.82. http://www.versene.com

78. Iavanovich I.D., Majkie-Singh N. Kinetic assay of monoamine oxidase with 2,2-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) as chromogen // Fresenius' J.Anal.Chem. V.324. №34. P. 307.

79. Imada C, Harada Y, Kobayashi T, Hamada-Sato N, Wafanabc E. Degradation of ferric chelate of ethylenediaminetetraacetic acid by bacterium isolated from deep-sea stalked barnacle // Mar. Biotechnol. (NY) 2005. V.7. P. 21-25.

80. Jarvis B.D.V., Pankhursl C.E., Patel J.J. Rhizobium loti, a new species of legume root nodule bacteria// Int. J. Syst. Bacteriol. 1982. V. 32. P. 378-380.

81. Kaki K., Yamaguchi H., Iguchi Y., Teshima M., Shirakashi T., Kuriyama T. Isolation and characteristics of nitrilitriacctate-degrading bacteria // J. Ferment. Technol. 1986. V.64. P. 103-108.

82. Kari F.G. Umweltverhalten von Ethylendiamintetraacctat (EDTA) unter spezieller

83. Berücksichtigung des photochemischen Abbaus. 1994. Ph.D. Thesis No 10698. Swiss Federal Institute of Technology. Zürich.

84. Kari F.G., Giger W. Modeling the photochemical degradation of ethylendiamintetraacetate in the river Glatt. // Environ. Ski. Technol. 1995. V.29. P. 2814 2827.

85. Kari F.G., Giger W. Speciation and fate of ethylendiamintetraacetate (EDTA) in municipal wastewater treatment // Water Res. 1996. V.30. P. 122-134.

86. Kawai S., Takagi S. and Ojima K. Application of phytosiderophore to plant cell cultures and production of phytosiderophore by iron defciency stressed plant cell cultures // j. Plant Nutr. 1992. V. 15. P. 1613-1624.

87. Kämpfer P., Neef A., Salkinoja-Salonen M.S., Busse, H-J. Chelatobacter heintzii is a later subjective synonym of Aminobacter aminovorans II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 835-839.

88. Kechrid Z., Amamra S., Dahdouh F., Bouzerna N. The effect of CaNa2-EDTA on metabolism of zink and carbohydrate as well as some biochemical factors in experimental diabetes // Iranian J. Publ. Health. 2007. V.36. №1. P. 15-21.

89. Keutmann H.T., Potts J.T., Jr. Improved recovery of methionine after acid hydrolysis using mercaptoethanol // Anal. Biochem. 1969. V. 29. P. 175-185.

90. Klopp R., Patsch B. Organische Komplexbildner in Abwasser, Oberflachenwasser und Trinkwasser, dargesselt am Biespiel der Rliur // Wasser Boden. 1994. V.8. P. 32-37.

91. Kluener T., Heimeken L., Gehle M, Bruggenthies A., Norteman B., Hempel D.C. Katabolismus von Ethylendiamintetraacetat (EDTA). Bioforum. 1994. V.17. P. 284-288.

92. Kluener T., Norteman B., Hempel D.C. Metabolism of EDTA and its metal chelates by whole cells and cell-free extracts of strain BNC1 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V.49. P. 194-201.

93. Kluener T. Chemie und Biochemie des microbielle EDTA-Abbaus: Ph.D. Thesis Universitat-Gesamlthochschule Paderborn. Paderborn. 2000.

94. Knobel H.R., Egli T., Van den Meer J.R. Cloning and Characterization of the Genes Encoding Nitrilotriacetate Monooxygenase of Chelatobacter heiuzii ATCC 29600 // J. Bacteiol. 1996. V.178. № 21. P. 6123-6132.

95. Koenen I. Bestimmung von EDTA-Ersatzstoffen auf Aminopolycarbonsaurebasis. PhD. Thesis TH Aachen. Germany. 1997.

96. Konetschny-Rapp S., Jung G., Meiwes J., Zaehner H. Staphyloferrin A: a structurally new siderophore from staphylococci // Eur. J. Biochem. 1990. V.191. P. 65-74.

97. Komb erg A., Horecker B.L. Glucosc-6-phosphate dehydrogenase. In: Methods Hnxymol. 1955. V.l. P. 323.

98. Kornberg A. Inorganic polyphosphate: toward making a forgotten polymer unforgettable // J. Bacteriol. 1995. V.177. №3. P.491-496.

99. Kramer D.N., Klein N. Baselice R.A. Quantitative determination of glyoxylic acid // Anal. Chem. 1959. V.31. P. 250.

100. Kulaev I.S., Vagabov V.M. Polyphosphate metabolism in microorganism// Adv. Microbial. Physiol. 1983. V. 24. P. 83-171.

101. Langford C.H., Wingham M., Sastri V.S. Ligand photooxidation in copper(II) complexes of nitrilotriacetic acid// Environ. Sci. Technol. 1973. V.7. P. 820-822.

102. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing // In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Edited by E. Stackebrandt and M. Goodfellow. Chichester: Wiley. 1991. P. 115-175.

103. Lauff J.J., Steele D.B., Coogan L.A., Breitfeller J.M. Degradation of the ferric chelate of EDTA by a pure culture of an Agrobacterium sp. I! Appl. Environ. Microbiol. 1990. V.56. P. 3346 -3353.

104. Levering P.J., Dijukhuizen L., Harder W. Metabolic regulation in the facultative methylotroph Arthrobacter PI. Growth on primary amines as carbon and energy source // Arch Microbiol. 1984. V. 139. P. 188-195.

105. Liu Y., Louie T. M., Payne J., Bohuslavck J., Bolton Jr IL, Xun L. Identification, purification, and characterization of iminodiacetate oxidase from the EDTA-degrading bacterium BNC1 //Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 2. P. 696-701.

106. Lockhart H.B., Blakeley R.V. Aerobic photodegradation of Fc(lll)-(ethylenedinitrilo)tetraacetate (ferric EDTA) // Environ. Sci. Technol. 1975. V.9. P. 10351038.

107. Macaskie L.E. The application of biotechnology to the treatment of wastes produced from the nuclear fuel cycle: biodégradation as a means of treating radionucleade-containing streams // Crit. Rev. Biotechnol. 1991. V.ll. P. 41-112.

108. Martell A.E., Smith, R.M. Critical Stability Constants // Plenum Press. New York. 1974. V. 1 : Amino Acids.

109. Manville I, Moser R. Recent developments in the care workers exposed to lead // AMA Atrch. Indust. Health. 1955. V. 12. P. 528-538.

110. McArdell C.S., Stone A.T. and Tian J. Reaction of EDTA and related aminopolycarboxylate chelating agents with Co (III)OOH (Heterogenite) and Mn(IIl)OOH (Manganite) // Environ. Sci. Technol. 1998. V. 32. P. 2923-2930.

111. McDonaldI.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for mcthanotrophs and methylotrophs // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. № 8. P. 3218-3224.

112. McFadden B.A., HowesW.V. The determination of glyoxylie acid in biological systems // Acta Biol. Chem. 1960. V.l. P. 240-248.

113. Means J.L., Alexander C.A. The environmental biochemistry of chelating agents and recommendations for the disposal of chelated radioactive wastes // Nucl. Chem. Waste Manag. 1981. V. 2. P. 183-196.

114. Meers J.L. Tempest D.W. Glutamine (amide):a-oxyglutarate aminotransferase oxidoreductase (NADP) an enzyme involved in biosyntesis of glutamate by some bacteria //.I. Gen. Microbiol. 1970. V.64. P. 187-194.

115. Majer J., Springer V., Kopecka B. New complexones. VIII. Ethylenediamino-N,N P-disuccinic acid and investigation of its heavy metal complexes by spectrophotometry // Chem. Zvesti. 1966. V.20. P. 414-422.

116. Aleiwes J., Fiedler H.-P., Haag H., Zaehner H. Konetsehny-Rapp S. Jung G. Isolation and characterization of staphyloferrin A, a compound with siderophore activity from Staphylococcus hyicus DSM 20459 // FEMS Microbiol. Lett. 1990. V.67. P. 201-206.

117. Minkevich I.G.,Satroutdinov A.D., Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Eroshin V.K. Degradation of EDTA by chemostat culture of bacterial strain DSM 9103 // Process Biochcm. 2003. V.38. P. 1559-1564.

118. Miyzaki II, Suzuki S., Imada K. Isolation and characterization of a bacterium that decomposes (ethylendiaminetetraacetate) ferrate (III) complex // Environ. Sci. 1997. V.10. P.257-262.

119. Motekaitis R., CoxIIl X.B., Taylor P., Martell A.E., Miles B. Tvedt TJ. Thermal degradation of EDTA chelates in aqueous solution // Can. J. Chem. 1982. V. 60. №10. P. 1207-1213.

120. Natarajan P. and Endicott J.F. Photoredox behavior of transition metal-ethylenediaminetetraacetate complexes. A comparison of some group VIII metals // J. Phys. Chem. 1973. V. 77. P. 2049-2054.

121. Neilson J. W., Artiola J. F., Maier R. M. Characterization of Lead Removal from Contaminated Soils by Nontoxic Soil-Washing Agents // J. Environ. Qual. 2003. V. 32. P. 899-908.

122. Neal J.A., Rose N.J. Stereospecific ligands and their complexes. I. A cobalt(III)complex of ethylenediaminedisuccinic acid // Inorg. Chem. 1968. V.7. P. 2405-2412.

123. Nôrtemann B. Total degradation of EDTA by mixed cultures and a bacterial isolate // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P.671-676.

124. Nôrtemann B. Biodégradation of EDTA // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V.51. P. 751-759.

125. Nowack B., Xue LI., Sigg L. Influence of natural and anthropogenic ligands on metal transport during infiltration of river water and ground water // Environ. Sci. Technol. 1997. V.31.P. 866-872.

126. Nishikiori T., Okuyama T., Naganawa T., Takita T., Hamada M., Takenchi Aouyagi T., Umezawa H. Production by actinomycetes of (S,S)-N,N'-ethylenediamine -disuccinic acid, an inhibitor of phospholipase C // J. Antibiot. 1984. V.37. P. 426-427.

127. Olszwer E, Carter J. EDTA chelation therapy in chronic degenerative disease // Medical hypotheses. 1988. V. 27. P. 41-49.

128. Ornston L.N., Ornston M.K. Regulation of glyoxylate metabolism in E. coli II J. Bacteriol. 1969. V. 98. P. 1089-1106.

129. Oviedo C., Rodriguez J. EDTA: The chelating agent under environmental scrutiny // Quim. Nova. 2003. V.26. №6. P. 901-905.

130. Palumbo A.V., Lee S.Y., Borman P. The effect of media composition on EDTA degradation by Agrobacterium sp. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V.45/46. P. 811-822.

131. Payne J. W., Bolton H., Campbell J. A., Xun L. Purification and characterization of EDTA monooxygenase from the EDTA-degrading bacterium BNC1 // J. Bacteriol. 1998. V.180. №15. P. 3823-3827.

132. Palleroni N. Bradbury J.F. Stenotrophomonas, a new bacterial genus for Xanlhomonas maltophilia (Hugh 1980) Swings et al. 1983 II J. Syst. Evol. Bacteriol. 1993. V.43. P. 606 -609.

133. Potthoff-Karl B., Greindl T., Oftring A. Sinlhese abbaubarer Komplexbildner und ihre Reinigungsformulierungen // SOEFW-J. 1996. V.122. P. 392-397.

134. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy II J. Cell. Biol. 1963. V.17. P. 208-212.

135. Robinson W.G, Labow R. L-Serine dehydratase (Escherichia coli) // Methods Enzymol. 1971. Y.17B. P. 356-360.

136. Satroutdinov A.D., Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Witschel M., Minkevich I.G., Eroshin V.K., Egli T. Degradanion of metal-EDTA complexes by resting cells of the bacterial strain DSM-9103 // Environ. Sei. Technol. 2000. Y.34. P. 1715-1720.

137. Schacterle L.B., Pollack R.L. A simplified method for the quantitative assay of small amounts of protein in biological material // Anal. Biochem. 1973. V. 51. P. 654-655.

138. Sehr oeder H.A. A practical method for the reduction of plasma cholesterol in man 11 Chronic Deseases. 1956. V.4. P. 461-468.

139. Schwarzenbach G. Der Chelateffect// Helv. Chim. Acta. 1952. V.35. №7. P. 2344-2359.

140. Seliverstov A.F., Ershov B.G., Lagunova Yu.A., Morozov P.A., Kamrukov A.S., Shashkovskii S.G. Oxidative degradation of EDTA in aqueous solution under UV irradiation // Radiochemistry (Russian translation of Radiokhimiya) 2008. V. 50. P. 70-74.

141. Siegrist II., Alder A., Gujer W., Giger W. Behaviour of the organic complexing agents NTA and EDTA in activated sludge treatment // Wasser Abwasser. 1988. V.68. P. 101109.

142. Sillanpaa M. Environmental fate of EDTA and DTPA // Rev. Environ. Contam. Toxicol. 1997. V.152. P. 85-111.

143. Skidmore W.D., Entenman C. Two-dimensional thin-layer chromatography of rat liver phosphatides 11 J.Lipid Research. 1962. V.3. № 4. P. 471-475.

144. Smith M.J., Neilands J.B. Rhizobactin, a siderophore from Rhizobium meliloti // J. Plant. Nutr. 1984. V. 7. P. 449-458.

145. Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids //Anal. Chem. 1958. V.30. P. 1190-1206.

146. Stolzberg R.J., Hume D.N. Rapid formation of iminodiacetate from photochemical degradation of Fe(III) nitrilotriacetate solutions // Environ. Sei. Technol. 1975. V.9. 654656.

147. Suss H.U. Nimmerfroh N.F. Peroxide bleaching technology review. In: Proceedings North Caroline State Emerging Technologies Seminar (8-10 March 1993, Raleigh, USA). 1993. P. 167-173.

148. Suzuki Y., Koyama N. Uptake and degradation of EDTA by Escherichia coli II Biodegradation. 2008. DOI 10.1007/sl0532-008-9197.

149. Takagi S.-I. Production of phytosiderophores. In: Iron Chelation in Plants and Soil Microorganisms. Barton L. et al. (ed.). Academic Press. Inc. London. 1993. P. 111-131.

150. Tamura K, Dudley J\ Nei M & Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. 2007. 10.1093/molbev/msm092.

151. Thieken A., Winkelmann G. Rliizoferrin: A complexone type siderophore of the Mucoralcs and Entomophtorales (Zygomycetes) 11FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 94. P. 37-42.

152. Thomas R.A.P., Law lor K, Bailey M, Macaski L.E. Biogegradation of metal-EDTA complexes by an enriched microbial population // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P. 1319-1322.

153. Tiedje J.M., Mason B.B., Warren C.B., Malek E.G. Metabolism of nitrilotriacctate by cells of Pseudomonas species // Appl. Microbiol. 1973. V.25. P. 811-818.

154. Toste A.P. and Lechner-Fish T.J. Chemo-degradation of chelating and complexing agents in a simulated, mixed nuclear waste // Waste Manag. 1993. V. 13. P. 237-244.

155. Uetz T., Schneider R., Snozzi M., Egli T. Purification and characterization of a two -component monooxygenase that hydroxylates nitrilotriacetate from "Chelatobacter" strain ATCC 29600 //J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 1179-1188.

156. Uetz T., Egli T. Characterization of an inducible, membranebound iminodiacetate dehydrogenase from Chelatobacter heintzii ATCC 29600 // Biodegradation. 1993. V.3. P. 423-434.

157. Uetz T., Egli T. Characterization of an inducible membrane-bound iminodiacetate dehydrogenase from Chelatobacter heintzii ATCC 29600 // Biodegradation. 1993. V.3. P. 423-434.

158. Van Groenestijn J.W., Deinema M.H., Zehnder A.J.B. ATP production from polyphosphate mAcinetobacter strain 21 OA // Arch. Microbiol. 1987. V. 148. P. 14-19.

159. Van Groenestijn J.W., Bentvelsen M.M.A., Deinema M.H., Zehnder A.J.B. Polyphosphate-degrading enzymes in Acinetobacter spp. and activated sludge // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V.55. P. 219-223.

160. Van Dijken J. P., Quayle J.R. Fructose metabolism in four Pseudomonas species // Arch. Microbiol. 1977. V.114. P. 281-286.

161. Van der Peer, Y., De Wachter, R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // CABIOS. 1994. V. 10. P. 569-570.

162. Vuillenmier S., Ivos N., Dean M., Leisinger T. Sequence variation in dichloromethane dehalogenases/glutathione S-transferases // Microbiology (UK). 2001. V.147. №3. P. 611619.

163. Walsh D.A., Cooper R.H., Denton R.M., Bridges B.J., Randle P.S. Elementary reactionsof the pig heart pyruvate dehydrogenase complex // Biochem. J. 1976. V.157. P. 41-67.

164. Weilenmann H-U., Engeli B., Bucheli-Witshel M., Egli T. Isolation and growth characteristics of an EDTA-degrading member of the a-subclass of Proteobacteria H Biodégradation. 2004. V. 15. P. 289-301.

165. Weil-Malherbe, Green H. The catalytic effect of molybdatc on hydrolysis of organic phosphoric bonds// Biochem. J. 1951. V.49. P. 286-292.

166. Wilkinson S.G. Cell walls of Pseudomonas species sensitive to ethylendiamintetraacetic acid // J. Bacteriol. 1970. V. 104. P. 1035-1044.

167. Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria // Current Protocols in Molecular Biology. N.Y: Wiley. 1997. 2.4.1-2.4.5.

168. Witschel M., Weilenmann H.-U., Egli T. Degradation of EDTA by a bacterial isolate. 54th Annual Meeting of the Swiss Society of Microbiology. Lugano. Switzerland// Abstract book. 1995. p. 146.

169. Witschel M., Nagel S., Egli T. Identification and characterization of the two-enzyme system catalyzing the oxidation of EDTA in the EDTA-degrading bacterial strain DSM 9103 // J. Bacteriol. 1997. V.179. P. 6937- 6943.

170. Witschel M. Biochemical and physiological characterisation of a bacterial isolate able to grow with EDTA and other aminopolycarboxylic acids. PhD thesis Diss' ETH№ 12967, 1999. Swiss Federal Institute of Technology, Zurich.

171. Witschel M., Egli T., Wehrli E., Zehnder A., Spycher M. Transport of EDTA into cells of the EDTA-degrading strain DSM 9103 // Microbiology (UK). 1999. V. 154. P. 973-983.

172. Wolf K, Gilbert P.A., Hutzinger O. EDTA-ethylenediaminetetraacetic acid// The Handbook of Environmental Chemistry. Springer. Berlin. 1992. V.3. P. 241-259.

173. Wood W.A. Assay of enzymes representative of metabolic pathways // Methods Microbiology. 1971. V. 6A. P. 421.

174. Xue LL, Sigg L., Kari F.G. Speciation of EDTA in natural waters: exchange kinetics of Fe — EDTA in river water // Environ. Sci. Technol. 1995. V.29. P. 59-68.

175. Yuan Z, VanBriesen J.M. The formation of intermediates in EDTA and NTA biodégradation // Environ. Engineering Science. 2006. V. 23. P. 533-544.

176. Zhang H., Herman J.P., Bolton IL., Zhang Z., Clark S., Xun L. Evidence that bacterial ABC-type transporter imports free EDTA for metabolism // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 7991-7997.

Информация о работе

Капаруллина, Елена Николаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Деградация этилендиаминтетраацетата аэробными бактериями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы