Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Chlorella pyrenoidosa 82Т как тест-объект в биологических испытаниях

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Chlorella pyrenoidosa 82Т как тест-объект в биологических испытаниях"

На правах рукописи

Дедов Александр Викторович

Chlorella pyrenoidosa 82Т как тест-объект в биологических испытаниях

(Специальность 03.00.12 - Физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 1998

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского Науш

Центра Российской Академии Наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук

Чураев Р.Н.

Научный консультант - доктор биологических наук

Кудоярова Г.Р.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Кабиров Р.Р., - кандидат биологических наук, с.н.с. Чемерис А.В.

Ведущая организация -

Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.

Защита диссертации состоится 1998 г. в 14

на заседании диссертационного совета К 064.13.09 при

Башкирском государственном университете по адресу:

450074, г. Уфа, ул. Фрунзе 32, ауд. 332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского

государственного университета

Автореферат разослан 1998 г.

ФУ

Учёный секретарь диссертационного совета ^ З^Т^ Кузяхметов Г.1

Актуальность. Зелёные водоросли, благодаря своему сходству с высшими расте-шями по физиологии и метаболизму, являются хорошим модельным объектом. Они этличаются быстротой ответных реакций, неприхотливостью и компактностью, что является очень удобным для проведения опытов с миллионами особей в малом объёме Зиопробы. За более чем 70-летний период применения микроводорослей в научных исследованиях, произошли некоторые изменения в технике культивирования, методах анализа, используемом оборудовании. Появились новые области биологических испытаний. такие как биологический мониторинг загрязнений природной среды (Израэль, 1984), поиск высокоэффективных регуляторов роста растений (Жирмунская, 1980) и другие, требующие использования удобных тест-объектов, к которым определенно можно отнести зелёные микроводоросли.

Необходимость решения новых задач, а также возникшая п последнее время тенденция ускорения проведения научных исследований и увеличения их экономической эффективности связана с усовершенствованием методов работы с культурами тест-объектов и направлении уменьшения экономических затрат, повышения количества испытаний, их оперативности и таких метрологических характеристик как точность,-достоверность, воспроизводимое! ь.

Зачастую в качестве тест-объектов используют случайные, не идентифицированные и мало изученные виды водорослей, что затрудняет воспроизведение получаемых результатов и, следовательно, препятствует широкому распространению и стандартизации методик. В то же время, во многих коллекциях культур растительных клеток имеются паспортизованные штаммы водорослей, которые могут отвечать этим требованиям. Например, термофильный штамм зелёной водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. 82 Т может быть перспективным тест-объектом в решении широкого спектра задач физиологии растений.

Цель настоящей работы - оценка возможности применения термофильного штамма зелёной водоросли Chi. pyrenoidosa 82 Т в качестве удобного тест-объекта в разнообразных биологических испытаниях, позволяющего стандартизировать условия проведения опытов и повысить степень их воспроизводимости. Достижение цели было обеспечено постановкой и решением следующих задач: ♦ Стандартизация условий выращивания штамма путём изучения влияния условий проведения эксперимента

на физиологические характеристики этого штамма с применением соответствующег оборудования. ♦ Доказательство физиологической значимости регистрируемых харак теристик по результатам изучения реакции культуры клеток данного штамма на воз действие известных физиологически активных веществ. ♦ Поиск способов снижен» изменчивости результатов биологических испытаний, обусловленной изменение; чувствительности тест-объекта к токсикантам. ♦ Доказательство возможности приме нения данного тест-объекта в биологических испытаниях путем изучения гербицидно активности химических соединений, рострегулирующего действия фототрансформ! рующих плёнок Полисветан, оценки действия известных мутагенов.

Научная новизна. ♦ Использование штамма Chi. pyrenoidosa 82Т в качеств тест-объекта позволило впервые установить, что под влиянием специфического ипп битора нециклического фотЪфосфорилирования днурона полностью снимается рост стимулирующее действие плёнки Полисветан. Анализ спектра переизлучения плёпк Полисветан в сочетании с изучением ростовой реакции клеток хлореллы на действи диурона позволяют считать, что механизм ее известного рострегулирующего действи связан с активированием фитохромом фотосинтсзирующей системы клетю ♦ Предложен новый подход к оценке мутагенности физических и химических фаюч ров, основанный на определении количества клеток, способных расти па селективно среде с диуроном в результате мутации гена psb А. ♦ Продемонстрированы особешк сти и различия кривых роста суспензионной периодической культуры клеток хлоре; лы, построенных на основе регистрации различных характеристик: оптической пло* ности, концентрации клеток и концентрации биомассы.

Практическая ценность. ♦ Изучение влияния физиологически аетивных соед| нений на морфофизиологические характеристики штамма Chi. pyrenoidosa 82 Т пок; зало его хорошую отзывчивость на воздействия биологически активных факторе химической и физической природы, что служит рекомендацией для его применения качестве тест-объекта при индивации как новых биологически активных соединеии! способных влиять на рост растений, так и присутствия токсичных для растения ш ществ и мутагенов в окружающей среде. ♦ Предложен способ повышения воспроизв< димости биотестов за счет введения в схему опыта, помимо контрольной и опытной эталонной пробы, что позволяет нивелировать изменения чувствительности тес

-4-

эьекта к токсичности пробы, которая существенно зависит от фазы развития тест-эъекта и воздействия внешних факторов. ♦ Проведена классификация 20 типов фото-эансформирующих плёнок Полисветан по их рострегулирующей активности. ♦ редложены экспресс-методы оценки оптической плотности и интенсивности фото-интеза суспензионных культур водорослей. ♦ Разработаны оригинальные конструкции роллерных многоместных биореакторов для выращивания биопроб тест-объекта.

Апробация. Результаты исследований представлены на: ♦ Втором Всесоюзном ъезде общества физиологов растений (Минск, 24 - 29 сентября 1990 г.); ♦ семинаре Этдела внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофпых биосинтезов -¡нститута физиологии растений АН СССР (Москва, 12 июля 1989 г.); ♦ 9 Конгрессе rESPP, (Брно, Чехия, 3-8 июля 1994 г.); ♦ X конференции по экстракции (Уфа, 14 -8 ноября 1994 г.); ♦ 2-й научно-практической конференции "Проблемы экологиче-жого мониторинга"' (Уфа, 16 - 19 октября 1995 г.); ♦ Втором ежегодном симпозиуме Общества физиологов растений РАН "Физико-химичекские основы физиологии расте-1ий" (Пенза, 5 - 8 февраля 1996 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, а также результатов, их обсуждения и выводов. Работа пложена на 120 стр. машинописного текста, включая 26 рисунков и 11 таблиц. Список штературы содержит 127 источников, в том числе - 50 на иностранных языках.

Благодарности. В получении некоторых экспериментальных данных принимали ,'частле сотрудники института Абдуллина И.Ш., Ступмн А.П., Фахретдинов А.Э., Иифтахов И.Р., за что им и многим своим коллегам-, проявившим неподдельный инте-эес к настоящей работе, автор выражает свою искреннюю признательность. Особую 5лагодарность автор испытывает к научному руководителю д.б.н. Р.Н.Чураеву и науч-чому консультанту д.б.н. Г.Р.Кудояровой и отчётливо сознаёт, что без их помощи, терпения и настойчивости эта работа никогда не была бы написана.

1. Объекты и методы исследования.

Штамм Chlorella pvrenoidosa Chick. 82 Т был выделен в Институте биохимии АН "ССР и в 1976 г. передан в Коллекцию культур одноклеточных водорослей Института

физиологии растений АН СССР, где он хранится под шифром С-52 (Владимирова, 1983). Был получен нами в Коллекции культур одноклеточных водорослей Института физиологии растений АН СССР в 1983 г. Он устойчив к бактериальному заражению. Важной характеристикой этого штамма является высокий температурный оптимум его роста и развития (36 °С), что упрощает процедуры проведения биологических испытаний и делает их более доступными за счёт снижения требований к. отводу тепла От источника света.

Питательные среды. В качестве жидкой питательной среды использовали минеральную среду Тамия следующего состава (г/л): КМ03 - 5; КН2Р04 - 1,25; ?^504'7Н20 - 2.5; Ре504'7Н20 - 0,003, растворы микроэлементов А4 и А7 - по 1 мл/л, рН среды 5,3 -5,4 (Гродзинский, 1973). В качестве твёрдого субстрата применяли агаризованпую (1,5 %) среду Тамия. Хранение резервных штаммов осуществляли на косом агаре в холодильнике при температуре +6...10 °С и круглосуточном освещении 300...500 люкс. Маточную суспензионную периодическую культуру для проведения экспериментов выращивали в вортексном культиваторе и разводили по мере необходимости до требуемой в опыте концентрации клеток. Оборудование для выращивания культур хлореллы во время опытов описано в экспериментальной части. Оптическую плотность суспензии клеток оценивали на однолучевом спектрофотометре Эреко! 11 при длине волны 545 им, а также экспресс-методом, разработанным автором. Концентрации клеток подсчитывали под микроскопом в счётной камере Фукса - Розснталя по общеизвестной методике. Диаметр колоний на агаризоваиной среде находили под микроскопом с измерительной окулярной сеткой, калиброванной по объект-микрометру Концентрацию сухой биомассы (СБМ) определяли гравиметрически после суши биомассы клеток при 60 °С в течение 24 часов. Клетки отделяли от культуралыюГ среды центрифугированием при 8000 мин"1, 20 мин. Концентрацию глюкозы оценивали бензокаиновым методом (Когут, 1985) фотометрически при 470 им. Клетки предва рителыю разрушали в баллистическом дезинтеграторе со стеклянными микробуса\н конструкции Новатного (Ко\о1пу, 1964). Индекс роста культуры рассчитывали к;» отношение разности финишной и стартовой биомассы (прироста биомассы) к сё стар товой величине. Продуктивность вычисляли как отношение прироста биомассы I продолжительности культивирования. Удельную скорость роста подсчитывали ка!

тюшение продуктивности к стартовой концентрации клеток. Статистическую обра-ютку данных проводили общепринятыми методами (Плохинский, 1979, Лакии, 1990). ],ля вычислений и построения графиков пользовались ЭВМ-программой Excel 5.0.

2. Экспериментальная часть. 2.1. Разработка нестандартного оборудования и методов.

Роллерный биопеагетор РС-30 для выпащиваиия бноппоб хлореллы разрабо-ан автором для проведения рутинных экспериментов с большим числом повторно-:тей. Он обеспечивает высокую идентичность условий культивирования во всех 30 зиопробах. Это достигается тем, что источник света (и одновременно - тепла) расположен в центре установки, а вокруг него вращаются пробирки с биопробами.

Рис. А. Схема принципиальная роллерного биореактора РС-30.

Источник света I (КГМ-24-250) окружён светофильтром 2 (типа СЗС-26. который предохраняет биопробы от перегрева ИК-нзлученнем источника света) и прозрачной трубой 3, через которую вентилятор продувает воздух. Барабан 4 с пробирками для биопроб 5 опирается на ролики 6, один из которых вращает барабан. Все узлы помещены в теплоизолирующий корпус 7.

Таким образом, удаётся ликвидировать влияние неоднородности светового поля, распределения температуры и обеспечить одинаковое перемешивание клеток (Рис. I). Скорость вращения барабана 3 мин-'. Освещенность регулировали изменением режима питания лампы. Температуру барабана с пробирками стабилизировали на уровне 36 ± 0.5 °С путём изменения частоты вращения вентилятора, управляемого электронным терморегулятором. Благодаря перечисленным мерам коэффициент вариации для четырёх повториостей контрольного варианта опыта уменьшился в среднем до 1,72 ± 0,23 %, что приблизительно на порядок меньше по сравнению с традиционными методами выращивания биопроб.

Экспресс-метод определения оптической плотности разработан автором дл быстрого измерения биопроб в биореакторе РС-30 для культивироваиия растительны: клеток. Существующая методика определения на спектрофотометре Spekol 11 н слишком оперативна для такого количества измерений. Суть экспресс-метода заклю чается в замере оптической плотности практически непосредственно в культуралыю> сосуде с применением оригинального мутномера инфракрасного МИК-1. Мутноме| представляет собой пипетку с оттянутым концом в светонепроницаемом корпусе которая является одновременно измерительной ячейкой. Через нее проходит светово! поток от ИК-излучателя типа АЛ-106Б (^.изл. = 950 нм) и попадает на фотоприемпш типа ФДК-6, сигнал от которого через усилитель постоянного тока поступает на циф ровой вольтметр.

При измерениях наконечник пипетки опускали в пробирку с суспензией клеток резиновым баллоном засасывали ~1,5 мл суспензии клеток, регистрировали показами) и нажатием резинового баллона сбрасывали суспензию клеток обратно. Анализ калиб ровочной кривой мутномера МИК-1 показывает, что измеряемая им оптическая плотность действительно отражает изменения концентрации клеток в исследуемой суспензии (Рис. 2). А её среднее квадратичное отклонение прогноза кривой R2=0,9991 хорошо характеризует линейность зависимости оптической плотности от концснтрацш клеток.

Форма приведённой на этом же рисунке калибровочной кривой для Spekol 11 имеет существенное отклонение от линейной, обусловленное гетерогенностью измеряемой суспензии (Shibata, 1958).

Это отклонение компенсируется, на наш взгляд, тремя конструктивными отличиями МИК-1: 1) меньшим оптическим путём, 2) фокусирующими свойствами цилиндрической измерительной ячейки, 3) большей длиной волны измерительного света, которая становится соизмеримой с размерами клеток.

Рис. 2. Калибровочные кривые Spekol 11 (--) и мутномера МИК-1 { —).

'езультаты измерения оптическом плотности различных разведений маточной культуры леток хлореллы (концентрацию клеток определяли в счетной камере) на стандартном |ютометре Spekol 11 и на разработанном автором мутномере МИК-1.

Преимущества предлагаемого экспресс-метода заключаются в: ♦ повышении шеративности измерений, что немаловажно при высокой скорости роста культуры; ► линейной зависимости оптической плотности от концентрации клеток; ♦ высокой лабильности характеристик;* низкой стоимости оборудования.

Сравнение культиваторов по кривым роста проводили для уточнения их био-ехнологических возможностей и изучения особенностей ростовых характеристик, (ыращиваемых в них культур (Таблица 1).

Культиватор Вортексный Роллерный РС-30 Барботажный

Освещенность, люкс 6 500 25 000 10 000

Температура, °С 32...38 37 + 0,5 35 ± 2

Перемешивание 200 мин"1 3 мин"' 1 л/мин

Объём культуры, мл 250 • 5 400

Длительность опыта 290 часов 130 час 290 час

Установили, что вортексная культура характеризуется наименьшей скоростью, юста, но её ростовая кривая сохраняет линейность в Течение длительного периода

Рис. 3). Такой режим лучше всего подходит для выращивания маточной суспензии

/

леток.

Время инкубации, мае

Рис. 3. Кривые роста периодических суспензионных культур Chi. pyrenoidosa 82Т, выращиваемых в культиваторах различных типов.

В противоположность вортексной, барботажная культура достигает наибольшей скорости роста и характеризуегся максимальным накоплением биомассы. Однако это наиболее сложная по аппаратурному обеспечению и по обслуживанию культура, что ограничивает ее применение в массовых экспериментах с большим числом повторно-стей. Ростовая кривая роллерной культуры имеет короткую лаг-фазу и за пять суток культивирования переходит в фазу замедления роста. Это позволяет проводить опыт за одну рабочую пятидневную неделю.

Особенности кривых поста, построенных на основе различных физиологических характеристик представляют интерес в связи с тем, что они несут в себе богатейшую информацию об исследуемом объекте (Перт, 1978). Изучали одновременное изменение нескольких наиболее значимых физиологических характеристик хлореллы в барботажпом культиваторе. Обнаружены различия в ходе кривых, особенно на начальном этапе развития культуры (Рис. 4). Так, в первые 50 часов не наблюдалось изменения сухой биомассы. В то же время концентрация клеток существенно возросла. Очевидно, в этот период происходило деление клеток, не сопровождаемое накоплением биомассы. Затем рост концентрации клеток приостанавливается, а накопление сухой биомассы резко возрастает. На 150-м часе наблюдается схожая картина: на фоне интенсивного роста концентрации клеток происходит замедление накопления сухой биомассы, после чего наступает замедление роста концентрации клеток. Эти несоот-

-10-

ветствия двух кривых роста закономерны и обусловлены фазами клеточного цикла хлореллы. Обращает на себя внимание более плавный ход кривой оптической плотности, по сравнению с другими кривыми. Создается впечатление, что существует некий механизм, позволяющий регулировать изменение, прежде всего, этой характеристики, и направленный на оптимизацию поглощения света культурой в целом.

1

I

0,8

■л

я

1 0,6

п

0

1 0,4

I 0,2

О

о о

Рис. 4. Сопоставление кривых роста Chi. pyrenoidosa 82Т, построенных на основе трёх физиологических характеристик.

Таким образом, обнаружены различия в кривых роста по концентрации клеток, оптической плотности и сухой биомассы. Тем не менее, не смотря на обнаруженные несовпадения в их динамике, в конечном итоге все они достаточно адекватно отражают рост культуры клеток и. в определенных пределах, могут рассматриваться как взаимозаменяемые.

Влияние концентрации инокулята на постовые характеристики культуры клеток. Концентрация инокулята - важный показатель, знание которого необходимо при планировании эксперимента. Было изучено влияние исходной концентрации клеток на три наиболее распространённых характеристики культуры Chi. pyrenoidosa 82Т - продуктивность, индекс роста и удельная скорость роста (их расчёт описан в разделе Материалы и методы). Установлено, что в двойных логарифмических координатах все

- -Х- - - Оптнч. плотность —О—Конц. клеток —А—Сухая биомасса

0 50 100 150 200 250 300

Время инкубации, час

зависимости представляют собой прямые линии. При снижении концентрации иноку-лята в 10 и 100 раз наиболее чувствительной характеристикой является удельная скорость роста, которая возрастает при этом в 8 и 69 раз соответственно. Аналогичную обратно пропорциональную зависимость наблюдали и для индекса роста (увеличивается в 7 и 55 раз соответственно). Самый консервативный показатель по нашим данным - продуктивность. Он прямопропорционален концентрации инокулята и изменяется очень незначительно (в 1,2 и 1,5 раза соответственно). Одновременно это и наиболее важный показатель, т.к. входит в триаду основных экологических характеристик популяции (численность, биомасса, продуктивность) и имеет немаловажное хозяйственное значение.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что следует отводить серьёзное внимание выбору стартовой концентрации клеток в случаях, когда результаты опыта характеризуются удельной скоростью или индексом роста. При этом необходимо внимательно следить за равенством стартовых концентраций клеток в вариантах опыта.

2.2. Изучение влияния биологически активных факторов на морфофизиологические показатели штамма Chi. pyrenoidosa 82 Т.

Синтетический аукснн 2,4-Р по некоторым своим свойствам подобен природным стимуляторам роста (Федтке, 1985). Однако в относительно высокой концентрации это соединение способно ингибировать рост растений, на чём основано его использование в качестве гербицида (Калинин, 1987). В опытах с суспензионными культурами хлореллы нами обнаружены границы концентраций 2,4-D, при которых стимулирующий эффект переходит в ингибирующий. Анализ кривых роста показал (Рис. 5), что стимуляция скорости роста культуры клеток происходит до концентрации 5' 10"4 моль/л, а статистически достоверное ингибирование на 10 % наступает после повышения концентрации до 1'10"J моль/л.

Время ннкубацни, час

5. Влияние 2,4-D на кривую роста Chi. pyrenoidosa 82Т .

Этими опытами мы доказали, что штамм Chi. pyrenoidosa 82Т проявляет чувстви-ьность к ауксинподобным биологически активным химическим соединениям и >еделили границу концентрации, обеспечивающей стимулирующий эффект.

'Интенсивность фотосинтеза » дыхания - важная физиологическая характери-ка, для определения которой разработано много разнообразных методов. В наших тгах скорость выделения или потребления кислорода в суспензии клеток мы опре-яли наиболее оперативным и экономичным - амперометрическим методом с при-ieinieM кислородочувствительного электрода Кларка (Clarc et al., 1953). Для реали-ии метода автором была собрана установка, оригинальным узлом которой является зрительная ячейка объемом 1,5 мл. В качестве датчика использовали кислородный ктрод типа ОР9343 (Раделкис, ВНР). Ток электрода, являющийся мерой концентра-[ растворенного кислорода, после усиления поступал на самопишущий регистратор, тбровку электрода проводили по насыщенной кислородом воде, а для регистрации евого уровня кислород удаляли раствором дитионита натрия Na2S204 в концентра-[ 0,5 г/л. Измерения проводили по предложенной автором схеме (Рис. 6). В соответ-!ш с этой схемой роль контрольного и опытного вариантов выполняет одна и та же проба: до введения анализируемого химического соединения она является кон-льным, а после введения - опытным вариантом.

Рис. 6. Пример проведеппя опыта.

В опытах использовали маточную суспензию клеток хлореллы в концентрации около 15 млн кл/мл, выдержанную 40 мин в темноте. Включали запись, через 30...40 сек включали осветитель и ~2 минуты записывали динамику изменения концентрации кислорода, вводили 100 мкл раствора исследуемого соединения и продолжали запись еще ~2 минуты, затем выключали свет и записывали динамику дыхания в темноте.

3 4 5 Время, мин

Это способствует повышению воспроизводимости данных.

Действие диурона на фотосинтез и дыхание изучали с применением вышео1

санной установки для регистрации динамики изменений концентрации кислоро.

Выбор диурона обусловлен его широкой известностью в качестве классического иш

битора нециклического фотофосфорш

рования с хорошо изученным механ;

мом действия.

Воздействия диуроном проводил!

диапазоне концентраций от 310"8 до Г

5 моль/л. Установили, что при минима.

ной концентрации диурона происхох

угнетение фотосинтеза более, чем

шесть раз - с 30 до 4,8 мкм0ль02/(л'м1

(Рис. 7). Вблизи концентрации И

моль/л фотосинтетическое выделен

кислорода становится равным его г

Рис. 7. Влияние диурона на скорость ¡-лощению в процессе светового ды; выделения и поглощения кислорода

культурой СМ. ругепоШэа 82Т на ния> что приводит к нулевому балансу, свету ( + ) и в темноте (-•-). области больших концентраций диуро

поглощение кислорода всё более превалирует над его выделением. При этом след> отметить, что практически во всём изученном нами диапазоне концентраций диуро!

- 14-

ание п темноте остается па одинаковом уровне около 27 мкмоль02/(л'мин). И толь-при 10 мкмоль/л диурона наблюдается его угнетение, что хорошо согласуется с ными Воскресенской Н.П. и др. (1967), полученными для хлоропластов.

Влияние диурона на изменение концентрации клеток. Зависимость интенсив-ги фотосинтеза от концентрации является практически прямой физиологической шией на воздействие этого биологически активного фактора. Интересно было 1ить более отдалённую, опосредованную реакцию на тот же ингибитор фотосинте-выражающуюся одной из важнейших характеристик суспензионной культуры -пенносгыо клеток.

Контроль 0,1 1 10 100

Концентрация диурона, мкмоль/л

. 8. Влияние концентрации диурона на рост суспензионной культуры Chi. moidosa 82Т в разные сроки развития.

Одновременно культивировали восемь вариантов биопроб: контрольную без диу-

1 и 7 вариантов с нарастающей концентрацией диурона в ряду 0,1; 0,6; 1; 2; 6; 10;

1Кмоль/л. На основе полученных данных были построены концентрационные зави-

:>сти в координатах "доза - эффект" для культур разного возраста (Рис. 8). Анализ

/чепных зависимостей показывает, что в первые часы роста культур ингибирую-

эффект уже хорошо виден, далее, на 72-м и 96-м часах роста зависимость степени

■бирования от концентрации диурона становится ярко выраженной. Обращает на

внимание наличие локальных максимумов на кривых, соответствующих 24, 48, и

-15-

72 часам, а па 96-м часе роста концентрационная кривая приобретает максимум п 0,1 мкмоль/л диурона. превышающий концентрацию клеток в контроле. Это свщ тельствует о наличии эффекта стимуляции роста числа клеток в определённом диаг зоне концентраций диурона, что не противоречит литературным данным (Копанее др., 1988).

Полученные результаты свидетельствуют о наличии чувствительное изучаемого штамма хлореллы к типичному ингибитору диурону в широком диапазо концентраций. При этом они показывают, что чувствительность к токсиканту завис от возраста культуры.

Таким образом, в настоящем разделе проиллюстрировано налич чувствительности суспензионных культур Chi. pyrenoidosa 82Т к присутствию в пи тельной среде биологически активных веществ, способных влиять на рост растений следовательно, его пригодность как тест-объекта для изучения рострегулируюш химических факторов.

2.3. Проверка подхода к индикации мутагенности внешш

воздействий.

Для оценки частоты точковых мутаций нами предложен подход, заключающш в использовании способности растений, несущих мутантный ген psbA (Одинцо 1987), выживать на селективной питательной среде, содержащей ингибиторы фо-синтеза. С целью проверки предлагаемого подхода, клетки синхронной культуры х. реллы обрабатывали известными мутагенами химической и физической природы (ш розометилмочевиной и ультрафиолетовым излучением) в различные сроки развит культуры, приблизительно соответствующие синтетической (1), митотической (2) цитотомической (3) фазам клеточного цикла (Ваулина, 1966) и высевали в количсс 1 млн клеток на чашку Петри с агаризованной средой Тамия, содержащей 310'6 мол диурона. Культивировали на светоплощадке 9 суток, затем подсчитывали выживи: колонии. В контроле частота встречаемости выживших колоний составляла 4...20 н; млн посеянных клеток.

400 350

0 300

1 250

о 200 о

С 150 " 100 50 0

□ НИМ

□ УФП

CL

1 2 3 Фазы разпития культуры

. 9. Влияние нитрозометил-евины (НММ) и ультрафио-звого излучения (УФИ) на готу мутаций Chi. pyrenoidosa

Результаты исследований (Рис. 9) позволили нам установить, что: ♦ изучаемый штамм обладает чувствительностью к мутагенам химической и физической природы. Это проявляется в том, что воздействие мутагенов увеличивало количество выживших клеток на порядок и более. ♦ чувствительность клеток к мутагенным факторам существенно меняется в зависимости от фазы развития клеток. ♦ предлагаемый подход продуктивен и его можно рекомендовать для индикаци мутагенов в окружающей среде.

2.4. Модификация метода индикации гербицидной активности химических соединений.

Поиск новых химических соединений с гербицидной активностью продолжает ваться актуальной задачей и по сей день. Наиболее широко распространён метод, тентованный Ганцем Бёмом (Heinz Böhm) и др. в 1976 г, суть которого описывает-ормулой P=(X/XJ 100%, где Р- показатель биохимической активности; Х„ и Хк -юнтрации клеток микроводорослей в опытном и контрольном вариантах в конце гивирования. Чувствительность тест-объекта к токсиканту может меняться, что. ет па результаты испытаний. Поэтому для повышения воспроизводимости резуль-в нами была предложена модификация этого уравнения путем введения данных по онной пробе (A'j). Для этого в качестве эталонной пробы было предложено брать ;ство с известным токсическим действием в концентрации, близкой к ED50. Урав-le модифицированного нами метода выглядит следующим образом: n,=(X„-XJ/(Xj-XJ, где обозначения соответствуют вышеупомянутым. Для проверки его работоспособности испытывали соединения, уже прошедшие ггания в полевых условиях (Таблица 2).

- 17-

Таблш

Шифр вещества 29 48 49 75 97 <

Средний индекс активности 1,31 1,28 1,07 1,31 0,61 0

Результат деляночных испытаний" + + + + -

Процент прироста клеток (прототип) 63 53 63 51 92

* +: по результатам испытаний гербицид; -: не гербицид.

Как видно из таблицы, между данными, полученными с помощью традиционн способа (прототип) и результатами полевых испытаний были замечены противорс1 В то же время применение модифицированного метода (в таблице ему соответств средний индекс активности) позволило правильно дифференцировать все активны неактивные вещества и тем самым подтверждают работоспособность предложен! нами модификации.

2.5. Применение штамма Chi. pyrenoidosa 82 Т для изучения рострегулирующего действия плёнок Полисвета

Полимерные плёнки Полисветан для покрытия теплиц и парников способств) повышению урожайности растений до 30 % (Щелоков, 1986). Благодаря наличию в составе солей европия, они трансформируют ультрафиолетовую и синюю часть свс вого спектра в красную (615 нм) область (Kusnetsov et al., 1989), актиничпую . фотосинтеза и близкую к таковой для K-формы фитохрома. Одна из гипотез, объ няющих механизм действия плёнки, заключается в том, что урожай повышается счёт дополнительной энергии красного света. Она оказалась несостоятельной, т.к. результатам измерений энергия дополнительного красного света, составляет не бо 1 %, и её не достаточно для обнаруженного повышения урожая. В качестве альтер тивной гипотезы мы предположили, что действие плёнки носит регуляторный хар тер. Для проверки этой гипотезы мы использовали опыты с диуроном.

Изучение влияния диурона на пострегулирующее действие плёнки Полис тан. Известно (Глаголева и др. 1987), что хлорелла ассимилирует энергию свет: основном п>тём малоэффективного циклического фотофосфорилирования и тол! при определённых условиях вклад энергетически более эффективного нециклическ< пути переноса электронов существенно возрастает. Поскольку стимуляция этого in фотосинтеза (например, фитохромом) представляется нам наиболее вероятным ме

мом рострегулирующего действия пленки Полисветан, было интересно проследить :енение стимулирующего влияния плёнки при частичном подавлении диуроном иклического фотофосфорилирования. Из анализа кривых (Рис. 10) видно, что диу-[ подавлял рост клеток в варианте"Контроль + диурон" приблизительно на 30 % .

0,6

Ь

0

' = О

>Л

1 | 0,2

0 20 40 60 80

Время ннкубашш, час _

10. Влияние плёнки Полисветан и диурона на рост суспензионной 1ьтуры хлореллы, выращенной в биореакторе РС 30. Концентрация фона - 310 е моль/л

На этом основании можно было ожидать также 30 %-ного снижения скорости ла под влиянием диурона и в варианте "Полисветан+диурон". Однако, как видно из :унка, степень ипгибировапия оказалась выше ожидаемой, и под влиянием диурона шень оптической плотности в варианте "Полисветан + диурон" опустился до значе-I варианта "'Контроль + диурон". Таким образом, под влиянием диурона различия кду вариантами под плёнкой и контролем нивелировались. Это позволяет предпола-ь. что фотосистема-2, работу которой ингибирует диурон, может играть определен-э роль в механизме рострегулирующего действия плёнки Полисветан. Из литерагу-извесгно, что фитохром способен стимулировать фотосинтез. Поскольку спектр ¡излучения плёнки близок к спектру действия фитохрома, полученные нами резуль-. ы указывают на возможное участие фитохрома в механизме активации фотосинтеза ктений под плёнкой.

Таким образом, полученные нами результаты подтверждают справедливость ги-езы о регуляторном механизме действия на растения плёнки Полисветан.

■ Контроль

— —Контроль + диурон

-9— —Полисретан

-X- —Полисветан+диурон

Скрининг различных типов плёнок Полнсветан проводили с целью их кла сификации по рострегулирующему действию и выяснению влияния отдельных комп центов плёнок на их активность. Для скрининга использовали клоповые культуры О pyrenoidosa 82 Т на твёрдом субстрате в чашках Петри, которые накрывали свер кружками из испытываемых плёнок, что приближало модельный опыт к условн: теплицы или парника. Культивировали на светоплощадке 12 суток, затем измеря диаметры у 100 колоний в каждом варианте и вычисляли их средние квадратичт значения. Размеры колоний под различными вариантами плёнок варьировали от 245 530 мкм, уровень контроля составлял 410 мкм. По результатам классификации 061 ружили, что наиболее активными с точки зрения стимуляции роста хлореллы являк ся дипиридиловый и фенантролиновый комплексы с трисбензилбензоатом-, тринит] том- и теиоилтрифторацетатом европия в полиэтиленовой матрице. Добавление к н стабилизатора Т.622 незначительно снижает роетрегулирующую активность, но суи ствеино продлевает срок службы плёнок. Замена же полиэтилена, например, на coi лимер винилацетата, очень сильно снижает эту активность.

Таким образом, на примере изучения рострегулирующего действия плёнок По. светан, ещё раз продемонстрирована возможность использования штамма С pyrenoidosa 82Т в качестве тест-объекта для оценки биологической активности фак ров физической природы.

3. выводы

Лтамм зелёной водоросли Chi. pyrenoidosa 82Т проявляет чувствитель-гь к стимуляторам (2,4-Д, Полисветан), ингибиторам (диурон и др. герби-ы) роста, мутагенам (НММ, УФИ) химической и физической природы, позволяет рекомендовать его для применения в качестве тест-объекта в их логических испытаниях.

Чувствительность штамма Chi. pyrenoidosa 82Т к воздействующему фак-у зависит от фазы развития культуры. Для коррекции этих изменений дложено вводить в схему опыта эталонную пробу. Эффективность такой шфикации продемонстрирована на примере индикации гербицидной ак-ностн.

Доказана работоспособность методики оценки частоты точковых мутаций, ованной на способности растений, несущих мутантный ген psb А, расти на ектнвной питательной среде с диуроном. Предложенный подход повышает ■ективность, оперативность и экономичность методики. Осуществлена проверка предложенной в настоящей работе гипо'.езы о уляторном механизме рострегулирующего действия фототрансформирую-х плёнок типа Полисветан. Установлено, что под влиянием плёнки проис-шт активизация фотосинтеза.

Оригинальная аппаратура, разработанная автором, обеспечивает однород-;ть условий культивирования большого количества биопроб и оперативную истрацшо их оптической плотности, за счет чего повышается воспроизво-viocTb результатов и статистическая достоверность данных.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

Дедов A.B. О пути повышения эффективности светокультуры растений. // Мате-пы конференции. - Уфа, 1981. - С. 155 - 156.

2. Дедов Л.В. Структура гибкой биотехнологической линии. // Описания нау1 принципов устройства новых приборов и методики пользования ими. Пущино: HI 1990.-С. 18-29.

3. Дедов А.В. Автоматизированная установка для исследования культур фото; трофных микроорганизмов. // Второй съезд Всесоюзного съезда общества физио/ растений (Минск, 24 - 29 сент. 1990 г.): Тез. докл. -М.: 1992.-Ч. 2. - С. 62.

4. Дедов А.В. Устройство для культивирования и исследования суспензионных i тур клеток. А.с. № 1650693 СССР. БИ. 19 от 23.05.91.

5. Дедов А.В., Чураев Р.Н., Толстиков Г.А. и др. Способ индикации гербици активности веществ. А.с. № 1658090 СССР. БИ. 23 от 23.06.91.

6. Фахретдннов А.Э., Дедов А.В. Изучение рострегулирующего действия разли' типов полимерной пдёпки ПОЛИСВЕТАН // Изучение и рациональное использос природных ресурсов: Тез. докл. научной, конф. -Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1991-, 204-205.

7. Dedov A.V. A study of the physiological mechanism of the film "Polysvetan" actic crop yield: Abstracts 9th Congress of the Federation of European societies of Phisiology, Brno, Czech Republic, 3-8 July 1994 // Biologia Plantarum. -1994. 36(suppl.) - S. 310.

8. Дедов А.В. Устройство для быстрой экстракции хлорофиллов из клеток хлор //Тез. докл. X конференции по экстракции (Уфа, 14 - 18 ноября 1994 г.). - М., 19

9. Дедов А.В. Методы биотестирования в системе экологического мониторин Вторая научно-практическая конференция "Проблемы экологического монитор! (Уфа, 16 - 19 октября 1995.): Материалы конференции. -Уфа, 1995. -Ч.2.- С. 449 - 4

10. Dedov A.V. The comparison of Chlorella growth curves based on three physiolo

Penza state teachers training University. Annual Symposium Physical-Chemical bas , Plant Physiology (5 - 8 February, 1996). Abstracts. -Penza: Pushchino, 1996. - P. 64.

C. 227. '

characteristics. // Society of Plant Physiologists of the Russian Academy of Sciences (RS