Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование действия биоцидов на эколого-функциональное состояние микроводоросли Chlorella pyrenoidosa

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование действия биоцидов на эколого-функциональное состояние микроводоросли Chlorella pyrenoidosa"

на правах рукописи

Константиневская Светлана Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ БИОЦИДОВ (НА ПРИМЕРЕ ПОЛИГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНИДИНОВ) НА ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ВОДОРОСЛИ CHLORELLA PYRENOWOSA

ОЗ.вО.16. - экология 03.00.18. - гидробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2006

Работа выполнена на кафедре системной экологии Экологического факультета Российского университета дружбы народов.

ПаучниК руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты: доктор био л отческих наук кандидат биологических наук.

Ведущая организация : Мое конский государственный университет технологий и управления

Защита состоится к 26 » декабря 2006, г. в 14 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.203,17 при Российском университете дружбы народов но адресу:! 13093, ГСП, г. Москва, Подольское ш., 8/5, Экологический факулыет

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 11719В, ГСП, Москва, уд, Миклухо-Маклая, 6.

доктор биологических наук профессор Ю.П. Козлов доктор биологических наук ирси[№ссор С.Е. Плеханов

C.B. Котелевиев Г.Н. Сахаров

Автореферат разослан «_» ноября 2006 г.

Ученый ссретарь диссертационного совета ' ';:/'

¿г , -

доктор медицинских наук, профессор /уА.Я. Чижов

I. Общая характеристика работы.

Актуальность. В настоящее время на базе гуаиидшюв созданы препараты, имеющие фунгицндную, бактерпцн дну ю и гербицидаую активность (Boethling,. 1984); После разработки недорогого отечественного препарата полигексамет-иленгуакидииа ' (ПГМГ) (Гембицкий и др., ¡975) появилась возможность его широкого использования для улучшения качества очистки природных и сточных вод (В&йтцер, Минц, 1984; Кузнецов, 1988) и дезинфекции, материалов в разных отраслях промышленности (Бошщсеа, Патент, 1996; Александрова, 2002}- Наличие в макромолекуле ПГМГ полярной гуанидниовой и неполярной гексаметиленовой группировок обеспечивает ему свойства адгезиаа и поверхностно-активного вещества (ПАВ). Это заставляет рассматривать ПГМГ-нреиараты как возможный химический фактор'антропогенного загрязнения водной среды. Полимеры хорошо растворимы: в воде; 20%-ые водные растворы сохраняют биоцидиую активность свыше 5 лет. (Воинцееа. Поликарпов, 2006)

В литературе достаточно широко представлены результаты влияния ПГМГ на ги дроби oi поп, в частности, рыб, зоопланктон, простейших,, а также бактерий, вирусов. (Баркоеа, 1991; Гембицкий, 1993; Пантелеева, 1999; Скеорцоеа, 1975; Ефимов, Гембицкий, 2000; Кузнецов, 1990; Воинцева, Поликарпов, 2006).

Попадая в водоемы со сточными водами, техногенные соединения класса гуанидчков вовлекаются, подобно их природным аналогам, в естественный круговорот веществ. В связи с этим, исследование их взаимодействия с водорослями представляет особенный интерес, поскольку оно напрямую связано с возможностями самоочищения, а также с особенностями функционирования водорослей в. условиях загрязнения и реализации их продукционных свойств.

Однако, исследования воздействия полкгексаметиленгуанилинов на развитие и . функциональное состояние водорослей практически отсутствуют, механизмы альгииидного действия ПГМГ не исследованы. Показано лишь, что препарат токсичен для зеленых водорослей в концентрациях выше 2 мг/л (Кузнецов, 1990). Предполагаемый механизм действия объясняется физико-химической адсорбцией на поверхности клеток, диффузией и потерей клетками ионов К*. Существуют предварительные данные^ что

/

ПГМГ может оказывать действие »а транспорт электронов в фотосистеме 2 (ФС 2) зеленых водорослей (Данилина, 1993).

D последние десятилетия внедряются в практику мониторинга новые высокочувствительные методики биологического мониторинга (Шмыков, 2002). Среди них наряду с методами оценки характеристик флуоресценции хлорофилла (Маторин, Венедиктов, 1990), выделяется пока слабо разработанный метод изучения функционального состояния микроводорослей и их внешних мембрац ло поведению в полях переменного тока различной частоты {Озерова и 2005).

В настоящей работе представлены результаты исследования воздействии на эколого-фуикцнональиое состояние водоросли С. pyrenoidosa ПГМГ-гидрохлорида и П ГМГ-фосфзга. но изменениям электрических свойств, связанных с состоянием внешних мембран, а также на характеристики флуоресценции хлорофилла водоросли, которые связаны с продуктивностью.

Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование действия ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на э ко лого-функциональное состояние хлорококковой водоросли Chlorella pyrenoidosa, .4-39. путем оценки состояния внешних мембран с помощью элекггроспектроскоиии в широком диапазоне частот на переменном токе и функционирования фотосинтетического аппарата но флуоресценции хлорофилла.

D связи с этим были поставлены следующие задачи:

!. Оценить воздействие П ГМ Г-преп аратов на общее физиологическое состояние культуры микроводоросли С. pyrenoidosa.

2. Изучить основные электрические свойства водоросли С. pyrenoidosa при росте культур, используя объективные характеристики электроспектроскопии, отражающие функциональное состояние клеток.

3. Исследовать изменения электрических свойств суспензий клеток С. pyrenoidosa под влиянием ПГМГ-фосфзтз и ПГМГ- гндрохлорида в зависимости от их концентраций о широком диапазоне частот (I кГц - 10 МГц). .

4. Определить природу и специфику альгнцндной активности ПГМГ-прспаратов, возможные механизмы действия на функциональное состояние клеток С pyrenotdosa по результатам электроспектроскопии.

5. Выяснить характер влияния ПГМГ-препаратов на фотосинтетическую активность С. pyrenöidosa по изменениям характеристик флуоресценции хлорофилла.

Цаучная новизна. Показано, что в диапазоне частот от ,10 кГц до 10 МГц находится область дисперсии электропроводности, соответствующая ß-дисперсии. Определены основные электрические свойства клеток водоросли Chlorella в процессе развития кривой роста. Установлено, что при максимуме функциональной активности в экспоненциальную фазу роста культуры максимально активное сопротивление клеток, тангенс диэлектрических потерь.на низких частотах н крутизна дисперсии.

- впервые определены особенности электроспектроскоп ни культуры Chlorella, с применением импедансных диаграмм, что позволило определить- изменения сопротивления внутренней среды клетки, изменений фазового угла мембраны, связанного с избирательной проницаемостью и. уровнем функционирования транспортных процессов на мембране.

- . впервые с помощью метода электроспектроскопии на микроскопических водорослях предложены возможные механизмы действия биоцидов ПГМГ.

- показано, по данным быстрой и ЗФ хлорофилла, что даже краткосрочная инкубация клеток-водоросли с ПГМГ-препаратамн ингибирует фотосиптетическую активность клеток Chlorella, что связано с нарушениями в фотосинтетическом аппарате и может приводить к снижению продуцмонных свойств клеток.

Практическая значимость. - Практическое значение для целей биомониторннга; имеют результаты анализа электрических свойств клеток хлорококковых водорослей ирн действии ПГМГ-препаратов. Полученные данные по снижению эколого-функцнональной активности водоросли в связи с нарушением проницаемости внешних мембран клеток или частичном снижении фотосшгтетическоН активности можно использовать при дозировании препаратов при дезинфекционном использовании; расчетах норм сброса в водоемы.

- определение максимальной функциональной активности клеток в культурах хлорококкооых водорослей по показателям электроспектроскоиии может быть использовано при регулировании бнотехнологнческих циклов с использованием микроводорослей.

- практическое значение для массовой токсикометрии имеет способ определения состояния клеток водоросли на фиксированной низкой частоте по величине R^ не требующий специального оборудования и несложный в техническом отношении.

- результаты по методам изучения функционального состояния культур микроводорослей по электрическим и фотосинтетическим показателям могут быть использованы в учебных курсах студентов Вузов, обучающихся на кафедрах экологического профиля.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Ш Международном конгрессе "Слабые и сверхслабые ноля н излучения в биологии и медицине" (СПб., 2003); 2-Й Международной научной конференции "Биотехнология -охране окружающей среды* (Москва,, 2004); научной конференции. "Актуальные проблемы экологии и природопользования" (Москва, 2005); Всероссийской науч. конференции "Ресурсосберегающие водо- и почвоохранные биотех иолоши, основанные на использовании живых экосистем" (Казань, 2006); представлены на научных семинарах лаб. фнзико-химии биомембраи биологического факультета МГУ им. M.D. Ломоносова (Москва^ 2005), каф. системной экологии Экологического факультета РУДII (Москва, 2006).

Публикации. Но теме диссертации опубликовано б работ.

Структура диссертации традиционна: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты н обсуждение, заключение,, выводы, список литературы. Объем работы 112 стр., 40 рисунков, 5 таблиц, библиография 152 источников.

Объект н метода!. Объектом исследования служила аксспичная культура хлорококковой водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. DMMSU-S-39 из- коллекции кафедры микробиологии МГУ им, М, В, Ломоносова. Культуру С. pyrenoidosa

выращивали накопительным методом на среде Тамня в культуралышх сосудах с 250 мл среды при температуре 37°С, непрерывном освещении 40 Вт/м2 и барботаже воздухом. Плотность клеток при посеве - 1 млн/мл. Численность клеток определяли прямым счетом в камере Горяева. Мертвые клетки учитывали по (Пименоеа, Максимова,- ¡966).

Электрические свойства клеток С pyrenoidosa измерялись в диапазоне частот 10*-Шт Гц, Клетки отделяли от кулиуральиой среды: центрифугированием при 5500g в течение 15 мин с последующим фильтрованием через мембранные фильтры SYNPOR № S с размером пор 0,23 мкм {«Chcmaroh, Чехия). Затем плотность упаковки клеток доводили до 0,6-0,7 трехкратным центрифугировал нем. Полученную суспензию в объёме 1,0 мл помещали в стеклянную ячейку с платиновыми электродами площадью I сы1. Влияние ионного состава среды на величины R, и С, устраняли путем переноса клеток в раствор холннхлорида (2-гндроксиэтил три мети паммония хлорид), экв и молярный среде..

Измерения проводились на установке, состоящей из широкополосного. трансформаторного моста с индуктивно связанными плечами, позволяющий в диапазоне частот ЮМО' Гц раздельно регистрировать с точностью ± 1% активную и реактивцую составляющие в пределах 10-10* Ом и Ю'-Н)4 иФ соответственно {Перову 1971).. Измерения электрических свойств клеток водоросли С. pyrenoidosa проводили в области р-диеперсии по параллельной схеме замещения (Шван, ¡963). Из измеренных величин сопротивления К* и емкости С, суспензии клеток вычислялись величины тангенса угла потерь rgS для параллельной яквивалентной схемы замещения (tgS=; l/2nfC5S,; f — частота, на которой проводилось измерение) и коэффициента поляризации К„ (отношение R, на частоте 104 Гц к R, на частоте 107 Гц). Для Rlt С, и tgS определяли частотные зависимости этих параметров. Частотную зависимость емкостного сопротивления Хр л поляризационного сопротивления Rp в комплексной плоскости представляли в виде импедансной диаграммы {Cole, 1965), которую далее анализировали.

В экспериментах использовались отечественные ПГМГ-фосфат и Г1ГМГ-гидрохлорид с мол. массой 10000, которые вносились в среду в концентрациях 0,05-500

мг/л и 0,00 N100 мг/л соответственно. Концентрацию ПГМГ и среде контролировали но (Новиков и др., 1981).

Фотосиктетическую активность суспензии водоросли оценивали п олярограф и чес ки по скорости фотоиндуцировшшого выделения кислорода (СВК) клетками с помощью платинового закрытого электрода при освещенности 56 Вт/мг. Замедленную флуоресценцию (ЗФ) Хл измеряли с помощью цилиндрического фосфороскопа ^аккирсля. При регистрации параметров ЗФ измеряли амплитуду индукционного максимума (Ат), интенсивность стационарного уровня ЗФ (1С1), интенсивность ЗФ в присутствии днурона (Ю^М) - Iocmiio- Параметры быстрой флуоресценции водоросли измеряли с помощью импульсного флуориметрз(Лядсхий и др., ¡987), Относительный выход переменной флуоресценции, который характеризует эффективность восстановления QA в ФС 2 (Malki/i, Siderer, 1974), коррелирует с квантовым выходом выделения кислорода (Dcmmigr Bjorkmann. 1989) и восстановления COi (Baker et а!., 1989). рассчитывали как Fv/Fm, где F, = F„ - F„.

Опыты проводились не менее чем. в трехкратной биологической повтори ости. Данные представлены с ошибкой репрезентативности выборочной средней для малых выборок и 5% уровня значимости {Максимов. 1980; Плохинский, 1980), При обработке данных использовали программу «Microsoft Ехе!», для построения и обработки' импедансных диаграмм ("круга") использовали программы «CorelDROW И» и «OriginPro 7.5».

Результаты н обсуждение.

1. Изучение воздействия [1ГМГ-преиаратоп на рост культуры водоросли Chtoretia pyrenoidosa

Анализ влияния ПГМГ-фосфата и 11ГМГ-шяро хлорида в разных конистрациях на численность культуры водоросли С. pyrenoidosa в условиях длительной инкубации проводили и оптимальных для роста условиях. На 3 сутки роста в колбы с водорослью вносили ППМГ-фосфзт в концентрации 0,05; 0,5 и 5 мг/л и ПГМГ-гидрохлоркд в концентрациях 0,005; 0,05 н 0,5 мг/л. Численность клеток водоросли определяли на I, 3, 5, 7, 12 и 14-е сутки культивирования.

Кривые роста численности клеток при добавлении и ПГМГ-препаратов в разных, концентрациях отличались подавлением роста С. ругепоШоза [рис. ¡У В первые сутки опыта биоцндное действие как ПГМГ-фосфата, так и ПГМГ-гидрохлорнда почти не проявляется, что позволяет считать исследованные ПГМГ-препараты не остротоксичными. 0,05 мг/л

Максимальное подавление роста ПГМГ-фосфатом (29,6 % от контроля) наблюдали к 12-14 сут. - при концентрации биоцида 5 мг/л. Максимальное подавлеше роста численности клеток при культивировании с ПГМГ-гидрохлоридом наблюдалось начиная с 6 сут. и было максимально к 14 сут. культивирования. Для образца с концентрацией фогуцида 0,5 мг/л численность составила 16 % от контроля. При концентрации ПГМГ-фосфата 0,05 мг/л в период 3-12 сут. культивирования наблюдали стимуляцию роста численности клеток, которая достигала на 12 сут. опыта 122,6 % от' контроля, в отличие, от ПГМГ-гидро хлорида. Для обоих препаратов во всех исследованных концентрациях с 12 суток наблюдали подавление роста, что свидетельствует о том, что препараты эффективнее при увеличении времени контакта с клеткам» водоросли, а альгнцндная активность ПГМР-гидрохлорида в10 раз выше.

(вдкЛшЗ

Pite. I. Численность клеток водоросли в зависимости от концентрат«« ПГМГ-гидрохлорида в условиях культуры (длительного инкубирования с препаратом).

7. сутки

При концентрации ПГМГ-фосфата 0,05 мг/л ь период 3-12 суг. культивщювапня наблюдал и стимуляцию роста численности клеток, которая достигала на 12 сут. опыта 122,Л % от контроля, тогда как для ПГМГ-гидрохлорида в минимальной из исследованных концентрации 0,005 мг/л стимуляции не наблюдали и численность составляла 63,4 % от контроля. Для обоих препаратов во всех исследованных концентрациях с 12 суток наблюдали подавление роста, что свидетельствует о том, что препараты эффективнее при увеличении времени контакта с клетками водоросли, а альгицидная активность ПГМf-гидрохлорида в 10 роз выше.

Деградации ПГМГ-фосфата и НГМГ-ГИДрохлорнда при культивировании с водорослями. Анализ изменения содержания ПГМГ-npeiiаратоэ в средах с водорослями CJilorella (деградации ПГМГ-прспаратов) Проводили при их концентрациях 5 мг/л. Результаты анализов контролировали на 2, 4, б,. 10, 14 сут. При этом наблюдали снижение содержания в средах , с водорослью как ПГМГ-фосфата, так и ГГГМГ-гидрохлорида. После фазы резкого уменьшения на 4 сут. опыта, концентрация ПГМГ-препаратов устанавливалась на уровне: 1,25 мг/л для ПГМГ-фосфата и 0,51 мг/л для ПГМГ-гидрохлорнда и до конца опытов (14 суг.) не менялась.

2. Определение диэлектрических характеристик микро водорослей Chtorclia. pyrenoitlosa S-39 в условиях накопительной культуры.

При нарушении проницаемости мембран величина сопротивления клетки R начинает снижаться и в меньшей степени зависеть от частоты- При полной гибели клетка но ее электрическим параметрам не отличается от окружающей ее проводящей среды. Отношение величин Л, на частоте 10* Гц и на частоте иорядка 106 - 107Гц ноенг название коэффициента поляризации А'„, причем чем ниже уровень функционального состояния клетки, тем меньше значение величины этого коэффициента, Н зависимости от уровня метаболизма величина /£, колеблется в диапазоне от 2 до 15, а при гибели или начале необратимых повреждений значение стремится, к 1. Возможно также осуществлять оценку в линейной области дисперсионной кривой при помощи крутизны или коэффициента дисперсии К1( представляющего собой отношение сопротивлений в ей низко- и высокочастотных участках. Другой характеристикой состояния клеток

к

служит тангенс угла потерь (£5, который для параллельной эквивалентной схемы определяется формулой: tg5 =. 1/2яГС5Дщ где Г — частота, па которой проводилось измерение.

Определение электрических, свойств суспензии клеток водоросли проводили в диапазоне частот 1 кГц — 10 МГц. Измерения проводились по параллельной схеме замещения, в которой регистрировали сопротивление Н, и емкость суспензии клеток водоросли, из которых затем рассчитывались величавы хд, 8, коэффициенты поляризации К„ (отношение К* на частоте 10 кГц к К, на частоте 10 МГц) и дисперсии Кл (отношение К, на частоте 1 МГц к на частоте 5 МГц). Далее, путем перевода из параллельной в последовательную схему замещения, из измеренных величин I*, и С, рассчитывали численные значения поляризационного сопротивления Кр и определяли зависимости Хр от Кр, представляемые в виде импедансной диаграммы, которая имеет вид полуокружности са смещенным центром, что свидетельствует о наличии процессов нзбирагслыюй Проницаемости наружной мембраны клетки. Фазовый угол для живых клеток всегда меньше 90° (рис, 2),(Со1е,. 1968). Для Нй С, н определяли частотные зависимости этих параметров.

Анализ кривых зависимости <7, и С: на низких и высоких частотах показал, .что для суспензии клеток водоросли область дисперсии находится в диапазоне частот от 10 кГц до 10 МГц, с максимумом в области 500 кГц — I МГц, что соответствует положению Р-днсперсии. В процессе роста культуры измерялись электрические параметры в диапазоне частот I кГц-10 МГц на 3; 5; 7; 11 к 14 сут. С учетом измеренных величин сопротивления и емкости суспензии клеток вычислялись значения частотиых зависимостей (тангенс диэлектрических потерь) длк параллельной эквивалентной схемы замещения, К„ (Рис. 3) Путем перевода га параллельной в последовательную схему, из измеренных величин Я, и С, вычислялись 11р и С^ и далее строились зависимости Хр ог Я,, в виде импедансной диаграммы. Значения К* и суспензии клеток, полученные при измерениях на переменном токе в параллельной эквивалентной схеме, нересчитываются в последовательную схему по формулам:

где Ир, Ср, Хр соответственно активное сопротивление, емкость и реактивное сопротивление суспензии клеток в последовательной эквивалентной схеме. Из графика построенной имнедансной диаграммы, затем, определяли К: и Г^,,

Рис. 2.. Характерная нмпедансиая диаграмма Коула-Коула клеток С. ругепо1<1о$а (на рис. - экспоненциальная фаза) роста.

П

См

о

Рм - солротндямщ мам^рячн См - ймпкт яиембррнм Па - еаЦчД; шчйма» "ъмоиаштнико«" - ■Ну1р9НН9* (

Рис. 3. Эквивалентная электрическая схема суспензии клеток, примененная при электроспсктроскопин культуры С. ругепо'ьйоьа и анализе результатов.

Характерные кривые частотной зависимости величин К, и суспензии клеток микроводорослей по ходу культивирования в диапазоне р-дисперсии на низких и высоких частотах (1 кГц' — 10 МГц) указывают, что наиболее активными являются

клегки на 3-7 сут. культивирования. Зависимости величины суспензии клеток микроводорослей от срока культивирования, подтверждают это предположение, поскольку наиболее выраженные изменения значения в низкочастотном минимуме также отмечаются в фазу экспоненциального роста. Величина коэффициента поляризации, которая изменялась в процессе развития культуры от б до 2,2, также свидетельствуют в пользу высокой функциональной активности клеток па 3-7 сут.

Выраженная в период 3-7 сут. роста дисперсия электропроводности (зависимость К, от частоты), постепенно нивелируется и к 14 сут, исчезает. Сопротивление на низких частотах отражает степень непроницаемости клеток, т.е. способность поддерживать определенный градиент ионов на внешних мембранах. Электрические потери мембран клеток, связанные с процессами поляризации выражаются через тангенс угла потерь И свидетельствуют о том, что с возрастом культуры положение минимума смешается в область низких-частот (7 и 14 сут. - 1000 и 500 кГц соответственно). Такие данные указывают на увеличение проницаемости мембран клеток, начиная с 7' сут. Вышеуказанные параметры отражают состояние изучаемой-системы в целом при электроспектроскоп л и в поле переменного тока.. Учитываются проводящие и непроводящие свойства, обусловленные наличием клеток водоросли и культу рольной средой, без учета вклада в электрические свойства Км, С«, К; - по схеме {/»«:_ 3).

В переменном электрическом поле низкой частоты-характеристикой величины ионной проницаемости мембраны является активное сопротивление Существует три общих пути, но которым переменный электрический ток-проходит через суспензию клеток: а) через межклеточную жидкость; б) через межклеточную жидкость к клетке, затем через мембрану клетки благодаря ее проводимости (ионной проницаемости), через внутриклеточную жидкость, сквозь мембрану противоположной стороны и далее снова через межклеточ![ую жидкость; в) через межклеточную жидкость к клетке, затем через мембрану клетки благодаря ее емкости (ионной непроницаемости), через внутриклеточную жидкость, сквозь мембрану противоположной стороны и далее снова через межклеточную жидкость,

п

На высоких частотах емкость мембраны С„ уменьшается н с сопротивлением межклеточной жидкости Ещ последовательно включается сопротивление R* внутриклеточного содержимого, а емкость мембраны Сы их шунтирует, Ионная проницаемость мембраны также принимает с ловышетгием частоты все большее участие в прохождении электрического тока через клетку н на бесконечно высокой частоте, порядка десятков МГц, стремится к своему конечному значению. На частоте 10 МГц электрические параметры суспензии клеток определяются соотношением между числом проникающих через мембрану ионов и непроникающих, которые концентрируются по обе стороны мембраны. Если доля свободно проникающих, ионов связано с процессами пассивной проницаемости, то число непрон икающих ионов определяется работой систем активного транспорта клетки. Для определения соотношения между ионами проникающими к испроннкающимн через мембрану, измеренные величины R, и С, из параллельной эквивалентной электрической схемы замещения пересчитывают в последовательную, определяют реактивное сопротивление Хр и строят зависимость от R,

Полученный график пли нмпеданспая диаграмма имеет вид полуокружности, центр которой может принимаю, разные положения относительно осы абсцисс, а радиус, соединяющий точки пересечения с ней круга и центр окружности, образует угол <?, называемый фазовым углом мембраны. Так как в реальных условиях перенос ионов через мембрану клетки происходит как через пассивные, так и активные механизмы транспорта, то величины фазового угла <р клеточной мембраны находятся в пределах от 60° до 85°. Поскольку активный перенос. ионов через мембрану является энсргозависимым, то величина фазового угла <¡> является косвенным показателем состояния обмена веществ в клетке. На практике редко используется величина фазового угла <р, чаще всего применяют параметр а = 2<р/к, где я = 3,14, принимающий значения от 0 до 1,

Анализ импедансной диаграммы проводится следующим образом. Полуокружности, центр которого смещен относительно оси абсцисс, пересекает ее в цвух точках: на низких частотах - в точке равной сопротивлению межклеточной жидкости Rn, а на высоких - в точке, равной внутреннему сопротивлению клетки Rj,

Смещение центра полуокружности (параметр а) отражает состояние уровня обменных процессов в клетке, а Ло и соотношение пассивной н активной проницаемости мембраны. Изменения основных параметров, определяющие функциональное состояние культуры С. ругепо1(Ь}за в процессе развития (14-сут, опыта) показаны в табл. 1. Данные таблицы представлены в процентах, (за 100% принимали максимальные значепия показателей). Следовательно, рост и развитие культуры водоросли сопровождается изменением как активных, так и пассивных транспортых процессов через мембрану клеток, причем в определенные сутки культивирования активный перенос ионов преобладает над пассивной проницаемостью. Так происходит на 5-7 суг, тогда как на 3 и 11 сут уронень функцио кирования активных транспортных процессов минимален. Это свидетельствует об увеличении числа жизнеспособных клеток в культуре на 5-7 сут, что также подтверждается максимальными значениями в эти сроки коэффициента поляризации (жизнеспособности) К„. Вместе с тем» в период роста культуры с 3 по 5 сут наблюдается обратный процесс: активный рост клеток сопровождается их повышенной метаболической активностью и увеличение а*параметра, в результате чего происходит интенсивное накопление питательных веществ из окружающей среди, в том числе и ионов, находящее отражение в снижении сопротивления межклеточной среды и одновременном росте И*. ■ ■

Таблица 1. Изменения основных параметром, определяющие функциональное состояние культуры С, ругепаШоза в процессе развития (14-сут, опыт)

Время, сут. Активность ФС 2, % к„, % кГц), % а-параметр, %

3 56 48 60 83

5 100 70 100 100

7 83 100 73 93

11 78 59 55 61

14 30 43 26 55

3. Влияние пол иге кса ме"1 плен гу анилина на функциональное состояние водорослн СМогеИаругепоЫова по результатам эдектроспектроскопин.

Измерения электрических свойств клеток водоросли С. ругепо1<&>$а с 7 сут. культивирования проводили в области ^-дисперсии но параллельной схеме замещения. Из измеренных величии сопротивления Я, и емкости С* суспензии клеток вычислялись величины тангенса угла потерь tg5 для параллельной эквивалентной схемы замещения = ШяЮА,; Г- частота, на которой проводилось измерение) и коэффициента поляризации К. (отношение К, на частоте 10* Гц к К, на частше 107 Гц), Для 11,, С, н 158 определяли частотные зависимости этих параметров. Величины поляризационного. сопротивления 1Ц и емкостного сопротивления Хг суспензии клеток вычислялись из измеренных величин-Я, и Са при переводе из параллельной в последовательную . эквивалентную схему замещения. Частотную зависимость емкостного сопротивления Хр и поляризационного сопротивления в комплексной плоскости представляли в виде имледансиой диаграммы Коула-Коула (Сок, /Р&З).

ПГМГ-фосфат и ПГМГ- гидрохлорид (далее ПГМГ-хлорид) вносились в срсду в концентрациях 100;200; 500мг/лили50;75; 100мг/лсоответственно.

Анализ кривых зависимости от частоты (10 кГц-10 МГц) показал, что ¡присутствие в среде как ПГМГ-фосфата, так: и ПГМГ-хлорида вызывало изменение в характере кривой дисперсии, причем более выраженное на низких частотах; чем на. высоких. Это является свидетельством того, что и ПГМГ-фосфат, и ПГМГ-хдорид вызывали сравнимое увеличение проницаемости мембран клеток водоросли, несмотря на большую концентрацию ПГМГ-фосфата* чем ПГМГ- хлорида (рис. 4).

Характерные кривые частотной зависимости величины tgS для суспензии клеток водоросли на фоне присутствия. ПГМГ-фосфата и ПГМГ-хлорида также подтверждают большую альгицидную активность хлористого соединения, чем фосфорного. В случае ПГМГ-хлорида минимум на кривой частотной зависимости tgS смещен в высокочастотную область в больше, чем для ПГМГ-фосфата.

Из комплексной импедансной Диаграммы, построенной па результатам измерений, следует, что влияние ПГМГ-фосфагга сказалось в снижении, по сравнению с

и

ннтактными клетками суспензии, при цовышепии концентрации от 100 до 500 мг/л только величины сопротивления мембраны К„,. тогда как величина сопротивления внутреннего содержимого клеток П.В1| при этом оставалась неизменной. Величина фазового угла мембраны составляла 67е (73д для суспензии иитактиых клеток) н продолжала оставаться неизмепной при увеличении концентрации ПГМГ-фосфата в среде. Таким образом, можно полагать, что влиял не ПГМ1 -фосфата при использованных концентрациях сказывалось в повышении проницаемости мембран клеток водоросли, степень которого возрастала, с увеличением содержания ПГМГ-фосфата в среде без нарушения целостности клетки {рис. 5)..

Частота, кГц

Рис, 4. Частотная зависимость активного сопротивления (К*) суспензии клеток водорослей С.ругепоШояа 5-39 при изменении концентрации ПГМГ-хлорида в среде.

Принципиально иной характер влияния на мембрану клеток водоросли оказывал ПГМГ-хлорнд. Анализ импедансных.диаграмм при действии ИГМГ- хлорида а пределах

от 50 до 100 мг/л показал, что происходило как снижение величины сопротивления мембраны клеток так и величины внутреннего содержимого клеток Ка11. Величина фазового угла мембраны при этом варьировала от 82" (при 50 мг/л) до 63° {при 100 мг/л). Действие ПГМГ-хлорида на мембрану клеток водоросли сопровождалось снижением ей проницаемости при концентрации 50 мг/л, повышением проницаемости при 75 мг/л и дальнейшим частичным разрушении клетокпри концентрации 100 мг/л.

Г11Ж фосфи. 1 сух*

Рис, 5, Изменение импсдансной диаграммы Коула-Коула для суспензии клеток водорослей С, ругепоШоха 5-39 при изменении концентрации ПГМГ-фосфата»

Выявленный характер ' изменений функционального состояния клеточиой мембраны позволяет рассматривать ■ ПГМГ-хлорид как обладающего большим повреждающим действием на мембраны клеток водоросли, чем ПГМГ- фосфат.

Биоциды ПГМГ имеют, свойства ПАВ. В настоящее время принята модель действия на биологические мембраны ПАВ, согласно которой его ион или молекула сорбируясь на мембране, внедряется в нее своей липофнльной частью, п результате чего прочность мембраны резко падает н она разрушается. Существенную роль в устойчивости клеток к действию ПАВ играет «электростатическое экранирование», обусловленное наличием заряженных функциональных групп на поверхности клетки.

Это повышает устойчивость клеточной стен к н к повреждающему действию ПАВ. Рассматривая с этих позиций различия о механизме действия ПГМГ-фосфата и ПГМГ-хлорндз, можно полагать, что они обусловлены неодинаковым защитным эф<|>ектов фосфатных.и хлористых групп ПАВ, причем влияние последних выражено меньше.

4. Измерения электрических свойств клеток Chlorella на фиксированной частоте в низкочастотной области при токе н ко метрик биоцидов ПГМГ-

Изучение электрических свойств микроводорослей в целях биотестирования или токсикометрии требует эффективных методологических подходов к анализу полученных результатов. Выполненные исследования показали, что наиболее плодотворным следует считать измерение частотной зависимости электрических параметров. Методические сложности заставляют создавать более простые методы измерения и анализа результатов. К.таким методическим приёмам следует отнести измерения электрических свойств на фиксированной частоте электрического тока, позволяющие однозначно провести оценку действия, различных токсикантов на клетки микроводоросли. Измерения электрических свойств на фиксированной частоте в низкочастотной области (порядка 1 кГц) нашло свой применение при определении объемной концентрации клеток в суспензии (Fricke, 1925). В своих исследованиях V. Pliquett, используя метод изме(>еиия электрических свойств па фиксированной частоте, изучал характер действии токсических веществ на животных объектах (Пликет. 1973).

Однако, измерениям электрических свойств суспензий клеток на фиксированной низкой частого свойственны неконтролируемые ошибки, связанные с перемешиванием суспензии, поверхностной проводимостью клеток, их деформацией при высоких н спонтанной седиментацией при низких концентрациях. В дополнении к этому, внутреннее сопротивление клетки R, при определенном соотношении с сопротивлением межклеточной среды R« также ограничивает точность и достоверность измерений. Все эти погрешности в значительной степени ограничивают использование измерений электрических свойств на фиксированной низкой частоте, снижая тем самым точность метода.

Совершенствование методики измерений на фиксированной частоте 100 кГц позволило оценить кинетику изменения электрических свойств клеток печени мышей при действии температуры , и радиации (Пояивода, 1969). Подобные исследования для клеток микроводорослей ие проводились, что явилось причиной поиска значений оптимальных частот для измерения их электрических свойств и показателей.

о1 кГц

концентрация (1ГМГ фосфата, мг/л. .

Рис. 6. Частотная зависимость активного сопротивления (Л,) суспензии клеток водорослей С. ругепоШоха 8-39 при изменении концентрации ПГМГ фосфата в среде.

В этих целях в исследуемом диапазоне частот были построены зависимости основных показателей электрических свойств клеток С. ругепаик>т~ от концентрации ПГМГ-хлорида и ПГМГ- фосфата.. В качестве, основных-показателей электрических свойств были выбраны величины Я,, С, и Анализ полученных данных показал, что. наиболее оптимальным параметром следует считать величину активного сопротивления И„ измеренного на частоте 100 кГц {рис. б). Линейная зависимость изменения величины К* от* концентрации, наблюдающаяся как для ПГМГ-хлорида, так и ПГМГ-фосфата на

частоте 100 кГц, позволяет рассматривать как наиболее оптимальный и технически несложный методический приём для биотестпрования пли токсикометрии.

5. Влияние ПГМГ на фотосннтстичсскне характеристики культуры водоросли СШогеНа ругепоШха.

На водоросли С. ругепо1^ха Б-39 было нсследовано действие ПГМГ-гидрохлорида (ПГМГ'Хлорнда) на параметры быстрой и замедленной флуоресценции (ЗФ) хлорофилла. При концентрациях ПГМГ от 10^ до 10" мг/л при непосредстве!том внесении н измерительную ячейку, препарат не влиял на относительный выход переменной флуорссценнции, величина отношения ЕЛ7,,, оставалась высокой (0,75-0,85). Суточная инкубация водоросли на слабом свету в присутствии ШМ Г-хлор »да в концентрации выше 10"2 мг/л вызывала ипактивацию ФС 2, судя по снижению Иигибировэние фотосинтеза, определяемого по скорости фотон ндуцироеанного выделения кислорода клетками водоросли, на 50% наблюдали уже при содержании препарата 0,2 мг/л (при 1-сут. инкубирования). В отличие от параметров быстрой флуоресценции, скорости выделения кислорода, стационарный уровень ЗФ значительно уменьшался даже при кратковременной инкубации клеток водоросли с ПГМГ-клоридом. При его концентрации 10"1 мг/л интенсивность стационарной ЗФ подавлялась па 30-40%, а дальнейшее увеличение концентрации приводило к монотонному снижению уровня ЗФ до 0. Несмотря на то, что при кратковременном воздействии при высоких концентрациях ПГМГ-хлорид почти не влиял на активность ФС 2, интенсивность ЗФ существенно снижалась даже при низких концентрациях. Изменения параметров ЗФ в присутствии 111'МГ-хлорнда свидетельствуют о росте энергнзации фогосннтетнческих мембран. Поскольку это происходило на фоне уменьшения нециклического потока электронов в электроитрансортиок цепи (скорость выделения кислорода падала), то оно может быть связано с замедлением потребления ЛТФ в результате торможения темповых процессов фотосинтеза.

Таким образом, при кратковременном воздействии низких концентраций ПГМГ-хлорида (10"3-10"' мг/л) в клетках водоросли происходило изменение световых реакций

фотосинтеза, а частности изменялась скорость транспорта электронов на акцепторной части ФС 2 и усиливалась знергизация тнлакоидных мембран хлоропласта.

3'-

И V 0.?

£ 0.8

14 М

13

и ел

Ы-

Й 0.5

в

в. 04

й

0.3

02

0.1

оо

14*1

10» 2

Кдикевтрадия ПГМГ, жЬ.'. .

Рис. 7- Изменеие параметров ЗФ- при кратковременной (5 мин.) инкубации хлореллы с ПГМГ-хлоридом: II- стационарный уровень ЗФ (1сг), 2 — интенсивность ЗФ в ■ присутствии диурона, 3 - показатель энергизацн и фотосинтетических мембран (Аи/1^,),

При содержании ПГМГ выше 10"' мг/л резко усиливалось иигибирование фотосинтеза и происходило уменьшение эффективного размера свегособирающей антенны ФС 2. Суточная инкубация хлореллы в присутствии ПГМГ вызывала необратимую деструкцию ФС 2 и, очевидно, всего ФА. При изучении активности веществ токсикантов следует учитывать, что первичные реакции фотосинтеза, являющиеся частью и пусковым механизмом всей разветвленной системы метаболизма фотоскнтезирующих организмов, значительно более чувствительны, чем реакции темпового метаболизма.

6. Основные выводы,

I. При действии биоцидов ПГМГ во всех исследованных концентрациях наблюдали подавление роста численности культуры С. ругепоШоза с 6-12 сут. развития, которое зависело от времени контакта с клетками. При концентрации ИГМГ-фосфата

0,03 мг/л и период 3-12 сут. культивирования наблюдали стимуляцию роста численности клеток, которая достигала на 12 сут. 122,6 % от контроля. Для ПГМГ-гндрихлорида даже при 0,005 мг/л стимуляции не наблюдали и численность составила 63,4 % от контроля, а для максимальной 0,5 мг/л -16 %. Альшцидная активность ШМГ-гндрохлорида в 10 раз выше, чем НГМГ-фосфата..

2. Анализ кривых зависимости С, и С, на низких и высоких частотах показал, что для растущей культуры С, ругепогЛова область дисперсии находится в диапазоне частот от 10 кГц до 10 МГц, с максимумом в области 500 кГц — 1 МГц, что соответствует положению р-дисперсии. Кривые частотной зависимости (1 кГц - 10 М Гц) величины К,, и tg$ указывают, что наиболее активными яаляются клетки с 3 по 7 суг. Это подтверждает величина Кш которая изменялась при развитии культуры от 6 до 2,2.

3. Развитие культуры водоросли сопровождается изменением активных и пассивных транспортных процессов через мембраны клеток, причем на 5-7 сут активный перенос ионов преобладает над пассивной проницаемостью, С 3 по 5 сут интенсивный рост клеток сопровождается их повышенной метаболической активностью и увеличением а-парамстра, в результате чего происходит активное накопление ионов, что отражается в снижении До и одновременном роете Я,.

4. Анализ кривых зависимости Н, от частоты {10 кГц-10 МГц) показал, что присутствие в среде СЫогеНа как ПГМГ-фосфата, так и ПГМГ-хлорида в концентрациях 100- 500 мг/л или 50-100 мг/л соответственно вызывало изменение в характере кривой дисперсии, особенно на низких частотах, что означает увеличение проницаемости мембран клеток. Частотные зависимости величины 1£Й для суспензии клеток в присутствии биоцидов 11ГМГ указывают на большую альгицидную активность хлористого соедш[ения.

5. № анализа комплексной импедансной диаграммы следует, что влияние ПГМГ-фосфата сказалось в снижении, при росте концентрации от 100 до 500 мг/л только величины Ям, тогда как величина К) прн этом не менялась. Величина фазового угла мембраны составляла 67° против 73° в контроле независимо от концентрации. Влияние

ПГМГ-фосфэта сказывалось в повышении проницаемости мембран клеток водоросли. . Степень влияния возрасталас увеличением его ко1ще!гграцнн.

6. 11ГМГ-хлорид, вызывал снижение величины RUr а также R| Величина фазового угла мембраны варьировала от 82я (при 50 мг/л) до 63° (при 100 мг/л). ПГМГ-хлорид приводил к снижению проницаемости мембран при 50 мг/л и частичному разрушению клегок при 100 мг/л. Как. ПАВ, ПГМГ-биоциды могут избирательно влиять на проницаемость путем изменения транспортных процессов. Различия в действия ПГМГ-фосфага и 1II "МГ-хлорида, возможно, обусловлены неодинаковым защитным эффектом функциональных групп, причем влияние гидрохлорида менее выражено.

7, Анализ полученных зависимостей основных показателей (R,, С, и tgS) электрических свойств клеток Chlorella от концентрации биоцидов показал, что наиболее оптимальным параметром следует считать величину R,, на фиксированной частоте 100 кГц. Линейная зависимость изменения величины Rs от концентрации биоцидов ПГМГ на 100 кГц, позволяет рассматривать данный методический приЕм как адекватный для биотестнрования или токсикометрии. .

S. При кратковременном воздействии-низких концентраций ПГМГ-гядрохлорида (10'Мо"1 мг/л) в клетках водоросли изменялась скорость транспорта электронов на акцепторной части ФС 2 и усиливалась энергнзация шяакокдных мембран. При содержании биоцида выше 10"' мг/л резко усиливалось ингибированне фотосинтеза « происходило уменьшение эф(|>ективного размера светособирающей антенны ФС 2. Суточная инкубация Chlorella с ПГМГ вызывала необратимую деструкцию ФС 2 и, очевидно, всего ФА.

Список публикаций по теме диссертации.

Г. Озерова Е.С., Константиновская С.В., Плеханов O.E. Электроспекгроскопня хлорококковых водорослей в оценке их функционального состояния при действии пеитахлорфенола // Ш Международный конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине»/Тез. докл. - СПб.,2003.-Т.U-C.73.

2. Константиновская СБ., Плеханов CJZ^ Чемерис Ю.К. Влияние полнгексаметиленгуанидина на фотосиитетическую активность клегок водоросли

Chlorella // 2 Международная научная конференция «Биотехнология - охране окружающей среды» / Тез, докл. — М., 2004. -Т.1.— С.116.

3. Озерова Е.С., Констшгпшовская С.В., Перов Ю.Ф., Плеханов С.Е. Электрические свойства клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa // Вестник РУДН, Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2005.- № 1(11). - С.13-18

4. Константииовская С.В., Плеханов С.Е. Влияние биоцид:lux препаратов на свойства гндробионтов // Актуальные проблемы экологии и природопользования / Сб. научных трудов РУДН. - М., 2005. - В.7. - 4.2. - С.8-9.

5. Озерова Е.С., Копстангиновская С.ВЧ Кероа Ю.Ф., Ьрзтковская JI.E., Плеханов С.Е. Анаши электрических свойств суспензия клеток водоросли Chlorella pjrenoidosa S-39 с помощью импедансных диаграмм // Вестник РУДН. Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2006. - Ла1(13) — С. 20-28.

6. Константнновская С. В., Брагковская Л.Б., Плеханов С.Е. Действие пол иалки ленту анилинов на электрические свойства клеток водоросли хлореллы // Ресурсосберегающие водо- и почвоохранные биотехнологии, основанные па использовании живых экосистем / Вссрос. конф. - Казань, 19-21.05.20С6, Казанский гос. те*н. ун-т. - 2006. С.21-26.

Константинов екая Светлана Викторовна Исследование действия биоцидов (на примере лолигексамстнлснгуанндина) на эколого-фунациональное состояние водоросли Chloreila pyrcno'utoaa Электрические свойства акссничиой культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa в процессе развития были подробно исследован« в диапазоне частот от I0J до 10т Гц, где в области частот 1 КГц -10 МГц для них обнаружена ß-дисперсия. По результатам электроспектроскопии в переменном токе в диапазоне частот 103 - 107 Гц культуры водоросли Chlorella, действие ПГМГ-фосфата и ПГМГ-гидрохлорида вызывало увеличение проницаемости мембран клеток водоросли. Анализ имнедапсиых диаграмм показал, что ПГМГ-хлорид в 10 раз более токсичен но сравнекшо С ПГМГ-фосфагом. При кратковременном воздействии низких (до 0,1 мг/л) концситрацинй ПГМГ-

гидрохлорида происходило снижение скорости выделения кислорода клетками CMorella и усиливалась эпергизацня мембран хяоропластов. 24-час. инкубация водоросли с ПГМГ при 50 мг/л вызывали полное подавление фотосинтеза. Следовательно, биоциды ПГМГ могут вызывать снижение продуктивности водоросли.

(Constantinnvskaya Svetlana Viktorovn»

The investigation of biocides influence the eco-fuActional stale of alga Chlorelta pyrenoMosa (on an example of polybexaraethylenguanidinium).

The electric properties of alga CMorella pyrenoidosa in a wide frequency range and the analysis of the date for an. evaluation of functional state of axenic cultures during its development were determined. The presence оf ^-dispersion was fixed in range of 1 kHz-10 МШ. The increase of permeability of membranes have been observed for -whole cells of Chlorelta in the presence of. [*HMG-hydrochloride and PIIMG-pliosphate by clectrospectrqscopyat frequency range 10*—10? IIz. Analysis of impedance diagrams showed that PHMG-hydrochloride has 10 times higher alglcidic activity than PHMG-phosphate. It was revealed that inhibition of light-induced (^ release by cells sharply decreased in die presence of PHMG-hudrochlorid in concentrations higher, than 10"2 mg/1, The full inhibition of photosynthesis occurred at concentration PHMG-hydrochloride more than 10 mg/1 after 24-hours incubation. The alglcidic action of PHMG on alga Chiorella may induce the decreasing of productivity.

Отпечатано в ООО «0ргсервис-2000» Подписано в печать2.2.. (%>г Объем п.л.

Формат 60x90/16. Тираж /00 экз. Заказ № <?2/У/~ Ь7 115419, Москва, Орджоникидзе, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Константиновская, Светлана Викторовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Классификация и свойства флокулянтов.

2.2. Физико-химические свойства гуанидинов.

2.3. Биоцидные свойства ПГМГ и его производных.

2.4. Биоцидные свойства ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГфосфата.

2.5. Диэлектрические свойства биологических объектов (общие положения).

2.6. Электроспектроскопия.

2.7. Изучение функционального состояния клеток водорослей по флуоресценции хлорофилла.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объект исследования.

3.2. Методы исследования.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Первичное изучение взаимодействия клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa и ПГМГ-препаратов.

4.1.1. Изменения кривой роста культуры Chlorella pyrenoidosa при действии ПГМГ-фосфата и ПГМГ-гидрохлорида.

4.1.2. Деградация ПГМГ-фосфата и ПГМГ-гидрохлорида в присутствии водоросли.

4.2. Особенности электроспектроскопии водоросли Chlorella pyrenoidosa.

4.2.1. Электриские свойства клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa.

4.2.2. Изучение диэлектрических характеристик микроводоросли

Chlorella pyrenoidosa S-39 в процессе развития культуры.

4.2.3. Использование импедансных диаграмм для анализа состояния клеток культуры Chlorella pyrenoidosa S-39 при действии высокотоксичных веществ.

4.2.4. Влияние полигексаметиленгуанидинов (ПГМГ-фосфата и

ПГМГ-гидрохлорида) на функциональное состояние клеток Chlorella по диэлектрическим параметрам.

4.2.5. Измерения электрических свойств клеток Chlorella на фиксированной частоте в низкочастотной области (для практических целей).

4.3. Влияние ПГМГ на фотосинтетические характеристики культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование действия биоцидов на эколого-функциональное состояние микроводоросли Chlorella pyrenoidosa"

Рост антропогенных загрязнений в окружающей среде может прямо или косвенно сопровождаться либо адаптацией экологических систем к новым условиям существования, либо их деградацией.

Своевременное обнаружение деградации водных экосистем, обусловленной воздействием антропогенных факторов, а также химический и биологический мониторинг, возможно, позволит своевременно предсказать и избежать как первичных нарушений в трансформации вещества и энергии, так и отдаленные последствия действия загрязнений.

В настоящее время создается и производится много флокулянтов. Наиболее распространенными являются полиакриламиды. К другому классу относятся соединения группы гуанидинов. Наши знания о влиянии этих веществ на водоемы ограничены. Гуанидины и их производные, в частности полигексаметиленгуанидины (ПГМГ), разрешены для использования Минздравом РФ в качестве дезинфицирующих средств в быту, медицинских, фармацевтических, пищевых, сельскохозяйственных и кожевенных учреждениях, при чрезвычайных ситуациях, а также в качестве дезинфицирующих добавок в питьевую воду вместо хлора. Как правило, ПГМГ используются в качестве водорастворимых солей - ПГМГ-гидрохлорида (ПГМГ-хлорида) и ПГМГ-фосфата и композиционным составам, включающим ПГМГ в качестве действующего вещества (Кузнецов, 2002).

В настоящее время освоен промышленный выпуск ПГМГ и его производных (Федорова, 2004; Кошелева, 2005; Гембицкий, 1998; Скворьрва, 1975; Дез средства, Справочник 1998; гигиенический сертификат №19.ФЦ.03.940.П254781Д7 от 27.06.97; Усатенко, Суржик, 1999). Гуанидины обладают высокой физиологической активностью (фунгицидной, бактерицидной, гербицидной) (Кузнецов, 2002). Такой широкий спектр свойств гуанидинов и доступность их в настоящее время, в связи с возможностями отечественного производства, обуславливает интерес к ним, как к возможному фактору загрязнения окружающей среды, в частности водной.

Токсичность ПГМГ-гидрохлорида не привлекает должного внимания ввиду отсутствия ее для теплокровных животных, а также отсутствия цвета и запаха, (санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.01.03.249. П.07289.03.1 от 13.03.01; www.intercid.ru, 2004; Хаширова, 2002), нелетучести, хорошей растворимости в воде, устойчивости при хранении. К тому же, ПГМГ не вызывают аллергию у людей, обесцвечивание тканей и коррозию оборудования (Данилина, 1993).

При борьбе с патогенной микрофлорой, ПГМГ одновременно подавляет микрофлору экосистем. Уже в небольших концентрациях ПГМГ может быть опсен для микроорганизмов, в частности для микроводорослей. Водоросли являются первым звеном трофической цепи водных экосистем, основным источником вновь синтезированного органического вещества. (Усатенко, Суржик, 1999) К тому же, планктонные водоросли, в частности хлорококковые, играют большую роль в биологической очистке стоков (Афанасьева, Телитченко, 1980; Костяев, 1972).

Биоцидные свойства ПГМГ и расширяющиеся масштабы его использования заставляют оценивать возможные последствия его попадания в стоки и, следовательно, в водоемы. Возможные пути действия ПГМГ на бактерии рассматриваются как физико-химический процесс адсорбции на поверхности клеток, диффузии через мембрану и нарушение проницаемости (Кузнецов, 1990).

В литературе достаточно широко представлены результаты влияния ПГМГ на гидробионтов, в частности, рыб, рачков, простейших, а также бактерий, вирусов (Баркова, 1991; Гембицкий, 1998; Пантелеева, 1999; Скворцоеа, 1975; Ефимов, Гембицкий, 2000; Кузнецов, 1990; Воинцева, Поликарпов, 2006) При этом, исследования воздействия полигексаметиленгуанидинов на развитие и функциональное состояние водорослей практически отсутствуют.

Перспективным направлением изучения функционального состояния одноклеточных водорослей является поведение клеток при прохождении через нее переменного электрического тока в зависимости от его частоты. При этом регистрируются и анализируются диэлектрические свойства в широком диапазоне частот. В общем случае диэлектрические свойства определяются двумя основными параметрами клеток - сопротивлением R (проводимостью а), и емкостью С (диэлектрической проницаемостью е), величины которых зависят от частоты электрического поля и состояния внешних мембран (Шван, 1963; Grimmes, Martinsen, 2005; Pethig, Kell, 1987). В отличие от микроэлектроднх методов, измерение электрических параметров не повреждает клетки, что позволяет изучать целые клетки без нарушения их структуры. Зависимость электрических свойств от частоты позволяет путем выбора соответствующих диапазонов измерений и исследуемых параметров провести детальный анализ функциональных характеристик клеток водорослей и их внешних мембран.

В связи с этим, в настоящей работе представлены результаты изучения электрических свойств одноклеточной водоросли Chlorella pyrenoidosa при воздействии на нее ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата.

Исследование направлено на объективную оценку функционального состояния клеток и последствий действия ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на главный барьер проницаемости и определения возможных механизмов воздействия на водоросли, которые являются основой функционирования водных экосистем. Проницаемость клеток растений связана с энергообеспечением клетки, а АТФ является связующим звеном между фотосинтетическими реакциями и транспортными процессами в мембранной системе (Альварес, 1982; Spanswick, 1972). В работе представлены также результаты воздействий ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на фотосинтетические характеристики водоросли Chlorella pyrenoidosa, в частности, на активность фотосистемы II (ФС II), которая в значительной степени определяет первичную продукцию (Baker et al., 1989; Oquistetal., 1982; Krall, Gerald, 1992; Маторин, 1993).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Экология", Константиновская, Светлана Викторовна

6. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. При действии биоцидов ПГМГ во всех исследованных концентрациях наблюдали подавление роста численности культуры С. pyrenoidosa с 6-12 сут. развития, которое зависело от времени контакта с клетками При концентрации ПГМГ-фосфата 0,05 мг/л в период 3-12 сут. культивирования наблюдали стимуляцию роста численности клеток, которая достигала на 12 сут. 122,6 % от контроля. Для ПГМГ-гидрохлорида даже при 0,005 мг/л стимуляции не наблюдались и численность составила 63,4 % от контроля, а для максимальной 0,5 мг/л -16 %. Альгицидная активность ПГМГ-гидрохлорида в 10 раз выше, чем ПГМГ-фосфата.

2. Анализ кривых зависимости Gs и Cs на низких и высоких частотах показал, что для растущей культуры C.pyrenoidosa область дисперсии находится в диапазоне частот от 10 кГц до 10 МГц, с максимумом в области 500 кГц - 1 МГц, что соответствует положению (3-дисперсии. Кривые частотной зависимости (1 кГц - 10 МГц) величины Rs, и tg5 указывают, что наиболее активными являются клетки с 3 по 7 сут. Это подтверждает величина Кп, которая изменялась при развитии культуры от 6 до 2,2.

3. Развитие культуры водоросли сопровождается изменением активных и пассивных транспортных процессов через мембраны клеток, причем на 5-7 сут активный перенос ионов преобладает над пассивной проницаемостью, С 3 по 5 сут интенсивный рост клеток сопровождается их повышенной метаболической активностью и увеличением а-параметра, в результате чего происходит активное накопление ионов, что отражается в снижении R0 и одновременном росте Rj.

4. Анализ кривых зависимости Rs от частоты (10 кГц-10 МГц) показал, что присутствие в среде Chlorella как ПГМГ-фосфата, так и ПГМГ-хлорида в концентрациях 100- 500 мг/л или 50-100 мг/л соответственно вызывало изменение в характере кривой дисперсии, особенно на низких частотах, что означает увеличение проницаемости мембран клеток. Частотные зависимости величины tg8 для суспензии клеток в присутствии биоцидов ПГМГ указывают на большую альгицидную активность хлористого соединения.

5. Из анализа комплексной импедансной диаграммы следует, что влияние ПГМГ-фосфата сказалось в снижении, при росте концентрации от 100 до 500 мг/л только величины RM, тогда как величина Rj при этом не менялась. Величина фазового угла мембраны составляла 67° против 73° в контроле независимо от концентрации. Влияние ПГМГ-фосфата сказывалось в повышении проницаемости мембран клеток водоросли, степень которого возрастала с увеличением концентрации.

6. ПГМГ-хлорид, вызывал снижение величины RM, а также Rj. Величина фазового угла мембраны варьировала от 82° (при 50 мг/л) до 63° (при 100 мг/л). ПГМГ-хлорид приводил к снижению проницаемости мембран при 50 мг/л и частичному разрушению клеток при 100 мг/л. Как ПАВ, ПГМГ-биоциды могут избирательно влиять на проницаемость путем изменения транспортных процессов. Различия в действии ПГМГ-фосфата и ПГМГ-хлорида, видимо, обусловлены неодинаковым защитным эффектом функциональных групп, причем влияние гидрохлорида менее выражено.

7. Анализ полученных зависимостей основных показателей (Rs, Cs и tgS) электрических свойств клеток Chlorella от концентрации биоцидов показал, что наиболее оптимальным параметром следует считать величину Rs, на фиксированной частоте 100 кГц. Линейная зависимость изменения величины Rs от концентрации биоцидов ПГМГ на 100 кГц, позволяет рассматривать данный методический приём как адекватный для биотестирования или токсикометрии.

8. При кратковременном воздействии низких концентраций ПГМГ-гидрохлорида (Ю'МО"1 мг/л) в клетках водоросли изменялась скорость транспорта электронов на акцепторной части ФС 2 и усиливалась энергизация тилакоидных мембран. При содержании биоцида выше 10"1 мг/л резко усиливалось ингибирование фотосинтеза и происходило уменьшение эффективного размера светособирающей антенны ФС 2. Суточная инкубация Chlorella с ПГМГ вызывала необратимую деструкцию ФС 2 и, очевидно, всего ФА.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полигексаметиленгуанидины (ПГМГ) имеют широкий спектр биоцидиого действия и используются во многих отраслях промышленности. Гербицидные свойства ПГМГ, расширяющиеся масштабы его использования обуславливает интерес к нему, как к возможному фактору загрязнения водной среды. Мономеры и полимеры гуанидинов из-за присутствия функциональных групп способны к различным модификациям. Благодаря полимерной природе они обладают катионными поверхностно-активными свойствами и в процессах подготовки воды служат одновременно катионным флокулянтом и биоцидом.

Существенно, что полигексаметиленгуанидин относится к классу катионных полиэлектролитов. В связи с тем, что в его химической формуле гуанидиновые группировки чередуются с шестью метиленовыми, он имеет свойство дифильности. Таким образом, макромолекула ПГМГ представляет собой сбалансированную систему, в которой гуанидиновая группировка несет положительный заряд и обеспечивает бактерицидные свойства; анион оказывает влияние на степень делокализации положительного заряда и тем самым контролирует токсичность; гексаметиленовая цепочка способствует перераспределению электронной плотности в макромолекуле и, кроме того, регулирует гидрофильно-гидрофобный баланс молекулы.

Попадая в водоемы со сточными водами эти соединения, подобно их природным аналогам, вовлекаются в естественный круговорот веществ. В связи с этим, исследование их взаимодействия на фотосинтезирующие организмы представляет особенный интерес, поскольку оно напрямую связано с продуктивностью, возможностями самоочищения, а также с особенностями функционирования организмов в условиях загрязнения.

При действии биоцидов ПГМГ во всех исследованных концентрациях наблюдали подавление роста численности культуры С. pyrenoidosa с 3-6 суток развития, что свидетельствует о том, что препараты эффективнее при увеличении времени контакта с клетками водоросли, а альгицидная активность ПГМГ-гидрохлорида в 10 раз выше, чем ПГМГ-фосфата.

К числу наиболее перспективных методов исследования относится пока мало изученное поведение клеток водоросли при прохождении через них электрического тока в зависимости от его частоты, то есть оценка их электрических свойств. Анализ кривых зависимости Gs и Cs на низких и высоких частотах показал, что для суспензии клеток водоросли область дисперсии находится в диапазоне частот от 10 кГц до 10 МГц, с максимумом в области 500 кГц - 1 МГц, что соответствует положению (3-дисперсии. Кривые частотной зависимости (1 кГц - 10 МГц) величины Rs, и tg5 суспензии клеток микроводорослей в процессе культивирования указывают, что наиболее высокий уровень функциональной активности и жизнеспособности у клеток культуры Chlorella в экспоненциальную фазу роста.

Рост и развитие культуры водоросли сопровождается изменением как активных, так и пассивных транспортных процессов через мембрану клеток, причем на 5-7 сут активный перенос ионов преобладает над пассивной проницаемостью, а на 3 и 11 сут уровень функционирования активных транспортных процессов минимален. В период роста культуры с 3 по 5 сут наблюдается обратный процесс: активный рост клеток сопровождается их повышенной метаболической активностью и увеличением а-параметра, в результате чего происходит интенсивное накопление питательных веществ из окружающей среды, в том числе и ионов, находящее отражение в снижении сопротивления межклеточной среды R0 и одновременном росте R;.

Результаты измерений частотной зависимости (10 кГц-10 МГц) сопротивления Rs суспензии в присутствии в среде биоцидов ПГМГ показали, что присутствие в среде как ПГМГ-фосфата, так и ПГМГхлорида вызывало изменение в характере кривой дисперсии, причем более выраженное на низких частотах, чем на высоких. Это является свидетельством того, что и ПГМГ-фосфат, и ПГМГ-хлорид вызывали однонаправленное и сравнимое изменение проницаемости мембран клеток водоросли, несмотря на большую концентрацию ПГМГ-фосфата, чем ПГМГ- хлорида. Характерные кривые частотной зависимости величины tgS для суспензии клеток водоросли на фоне присутствия биоцидов также подтверждают большую альгицидную активность хлористого соединения, чем фосфорного.

Комплексная импедансная диаграмма Коула-Коула, построенная по результатам измерений, представлена на рис. 8. Из нее следует, что влияние ПГМГ-фосфата сказалось в снижении, по сравнению с интактными клетками суспензии, при повышении концентрации от 100 до 500 мг/л только величины сопротивления мембраны RM, тогда как величина сопротивления внутреннего содержимого клеток RBH при этом оставалась неизменной. Величина фазового угла мембраны составляла 67° (73° для суспензии интактных клеток) и продолжала оставаться неизменной при увеличении концентрации ПГМГ-фосфата в среде. Таким образом, можно полагать, что влияние ПГМГ-фосфата при использованных в экспериментах концентрациях сказывалось в повышении проницаемости мембран клеток водоросли без нарушения целостности клетки, степень которого возрастала с увеличением содержания ПГМГ-фосфата в среде.

Принципиально иной характер влияния на мембрану клеток водоросли оказывал ПГМГ-хлорид. Анализ зависимости импедансных диаграмм от концентрации в среде ПГМГ-хлорида в пределах от 50 до 100 мг/л показал, что его действие приводило как к снижению величины сопротивления мембраны клеток RM, так величины внутреннего содержимого клеток RBH. Величина фазового угла мембраны при этом варьировала от 82° (при 50 мг/л) до 63° (при 100 мг/л).

На основании полученных результатов при измерении электрических свойств водоросли были выявлены возможные механизмы действия ПГМГ-фосфата и ПГМГ-гидрохлорида, как поверхностно-активных веществ (ПАВ), на мембраны клеток водоросли, избирательно влияющих на проницаемость клеточных мембран, когда включение ПАВ в мембраны эффективно изменяет транспортные процессы. Ион или молекула ПАВ, сорбируясь на мембране, внедряется в нее своей липофильной частью, в результате чего прочность мембраны резко падает и она разрушается. Способность ПАВ солюбилизировать липидные компоненты мембраны в первую очередь связана с концентрацией действующего вещества. В том случае, когда концентрация ПАВ достаточна для конформационных изменений и дестабилизации мембраны, наступает лизис клетки. При этом мембраны дезинтегрируются, перестраиваясь в смешанные мицеллы, содержащие ПАВ-липидные и ПАВ-белковые комплексы.

Рассматривая с этих позиций различия в механизме действия ПГМГ-фосфата и ПГМГ-хлорида, можно полагать, что они обусловлены неодинаковым защитным эффектов фосфатных и хлористых групп ПАВ, причем влияние последних выражено существенно меньше. Другим не менее важным аспектом действия ПАВ на клетки при более низких концентрациях является их влияние на процессы метаболизма, которые связаны с транспортом веществ, реакций окислительного фосфорилирования и фотосинтеза. Выявленный характер изменений функционального состояния клеточной мембраны позволяет рассматривать ПГМГ-гидрохлорид как обладающего большим повреждающим действием на мембраны клеток водоросли, чем ПГМГ-фосфат.

Проницаемость клеток растений связана с энергообеспечением клетки, а АТФ является связующим звеном между фотосинтетическими реакциями и транспортными процессами в мембранной системе. В связи с этим, в работе представлены также результаты воздействий ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на фотосинтетические характеристики водоросли Chlorella pyrenoidosa, в частности на активность ФС 2, которая определяет, в основном, первичную продукцию.

При развитии культуры C.pyrenoidosa в контроле в экспоненциальную фазу (Fv/Fm), который отражает активность ФС 2, СВК были максимальны на 3-5 сут. и после 7 сут. снижались. При кратковременном воздействии низких концентраций ПГМГ (10"3-10"' мг/л) в клетках водоросли происходило изменение световых реакций фотосинтеза, в частности изменялась скорость транспорта электронов на акцепторной части ФС 2 и усиливалась энергизация тилакоидных мембран хлоропластов. При содержании ПГМГ выше 10"1 мг/л резко усиливалось ингибирование фотосинтеза и происходило уменьшение эффективного размера светособирающей антенны ФС 2. Суточная инкубация хлореллы в присутствии ПГМГ вызывала необратимую деструкцию ФС 2 и, очевидно, всего ФА. При изучении биологической активности веществ антропогенного происхождения следует учитывать, что первичные реакции фотосинтеза, являющиеся частью и пусковым механизмом всей разветвленной системы метаболизма фотосинтезирующих организмов, значительно более чувствительны, чем реакции темнового метаболизма.

Следовательно, при изучении биологической активности веществ антропогенного происхождения следует учитывать, что первичные реакции фотосинтеза, являющиеся частью и пусковым механизмом всей разветвленной системы метаболизма микроводорослей, значительно более чувствительны, чем реакции темнового метаболизма. Затем функциональное состояние клеток водоросли С. pyrenoidosa при действии биоцидов типа биоцидов ПГМГ определяется энергозависимыми процессами, управляющими проницаемостью внешних клеточных мембран, как это следует из данных электроспектроскопии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Константиновская, Светлана Викторовна, Москва

1. Гольд фельд М.Г., Карапетян Н.В. Физико-химические основы действия гербицидов // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Биологическая химия. Т. 30. М., 1989. 164 с.

2. Горбунова М.П. Альгология. М.: Высш.школа. 1991. 256 с.

3. Г р е н к о в а Т. А. (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского), Шереметьева С.

4. B. (ИИ «Инкраслав», РБ), К р у ц К. Г. (ООО «Дельтасепт», Россия), Проблема борьбы с внутрибольничными инфекциями, журнал "Поликлиника", № 4, 2005, стр. 28 http://www.poliklin.ru/article200504a06

5. Жуков Ю. А., Т а р у с о в Б. Н., Высокочастотная электродная поляризация и её влияние на измерение ёмкости биологических материалов, Биофизика, Т. 12, вып.6, 1967, с. 1106-1107. Кагава Ясуо, 1985, Биомембраны, Москва, Высшая школа

6. К е л л Д. Б., Принципы и возможности спектроскопии электрического адмиттанса //

7. К л я ч к о В .А ., А п е л ь ц и н И .Э Очистка природных вод, Москва, изд-во

8. Изд-во МГУ. 1988.320с. Либерман Е.А. Переносчики ионов через биологические мембраны //

9. Максимов В. Н., Многофакторный эксперимент в биологии, Москва, изд. МГУ, 1980, с. 279

10. П л и к е т Ф. Определение пассивных электрических свойств биологических объектов

11. Поливода Б.И. Изучение действия гамма-лучей и температуры на клетки с помощью автоматического импедансметра. Автореф. Дис. канд. биол. наук. -М., 1969 а.-21с.

12. П о л ы н о в В.А. Оценка физиологического состояния байкальского фитопланктона.

13. Тарусов Б.Н., Веселовский В. А., Сверхслабое свечение растений и ихприкладное значение, Москва 1978. Тихонов А.Н. Трансформация энергии в хлоропластах энергопреобразующих органеллах растительной клетки // Соросовский образоват. журн. N 4. 1996. С. 2432.

14. Телитченко М .М МГУ, каф. Гидробиологии, Отчет по договору №01 -60/91

15. Нобелевская премия 1992. Флоренс А. Т., Биологическое значение мицеллобразования, Мицеллообразование, солюбилизация и микроэмульсии, под ред. Миттела К., Москва, изд. «Мир», 1980, с.42-62

16. Хаширова С.Ю., Новые гуанидинсодержащие биоцидные полимеры, Автореферат на степень кандидата наук, РХТУ им. Д.И. Менделеева, Москва. 2002,

17. Хименко J1 .Л., Каменщиков А.Л., Способы получения, строение, принципы действия синтетических флокулянтов, учебное пособие Пермского Государственного Университета, Пермь, 1998, с. 4-9.

18. Химическая Энциклопедия,Изд. «СоветскаяЭнциклопедия»,т. 1, 1992.

19. X и п п е л ь А. Р., Диэлектрики и волны. Москва: ИЛ, 1960, с. 438

20. Ш в а н и Г Спектроскопия биологических веществ в поле переменного тока // Электроника и кибернетика в биологии и медицине. М.: Изд-во Иностранной литературы, 1963,- С.71-108.

21. Шувалов В. А., Литвин Ф. Ф., О механизме длительного послесвечения листьев растений и запасании энергии в реакционных центрах, Мол. Биол. 3, № 1.59-72, 1969.

22. Шувалов В.А. Первичное преобразование световой энергии при фотосинтезе. М.: Наука. 1990. 207 с.

23. Я г л о в а Л. Г., Электропроводимость биологических систем, Биофизика, Под. ред. Б.Н.Тарусова и О.Р.Кольс, Москва, изд. «Высшая школа», 1968, с. 186-210.

24. Anderson J.M. Cytochrome b/f complex: Dynamic molecular organization, function and acclimation. Photosynth. Res. 1992. V. 34. P. 341-357.

25. В e n e 11 J. Protein phosphorylation in green plant chloroplasts// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 281-311.

26. Bielawsky J., Thompson Т.Е., Lehninger A.L. The effect of 2,4-dinitrophenol on the electrical resistance of phospholipid bilayer membrane // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1966. Vol.24. N. 6.-P.943 -947.

27. Bernhardt J., P a u 1 у H., 1974, Dielectric measurements of Nitellopsis obtusa cells with intracellular electrodes, Radiat. Environm. Biophys., Vol.11, № 1, p.91-100.

28. Blinks L. R., The direct current resistance of Nitella, J. Gen. Physiol., Vol.13, № 4, 1930, p.495-508.

29. Bordi F., CamettI C., di Biasie A., Passive electrical properties of biological cell membranes determined from Maxwell-Wagner conductivity dispersion measurements, Bioelectrochem. Bioenerg., Vol.22, №2.1989, p.135-144.

30. Boethling R. S., Environmental fate and toxicity in waste water treatment of quaternary ammonium surfactants, Water Res. 8, № 9,1984,1061-1076

31. Charles W.Einolf,JR., Edwin L. Carstensen, Passive electrical properties of microorganisms, Studies of the protoplasts of Micrococcus Lysodeikticus, Biophysical Journal, v. 9, 1969, p. 634-643

32. Charles W. E i n о 1 f, J R ., and Edwin L. Carstensen, Low-frequency dielectric dispersion of bacteria, Biophysical Journal, Volume 13,1973, p. 8-13

33. С h i t n i s P.R., Thornber J.P. The major light-harvesting complex of photosystem II; aspects of its molecular and cell biology. //Photlsynth. Res. 1988. V. 16. P. 41-63.

34. Cole К. S., Membranes, Ions and Impulses. Berkely and Los Angeles, Univ. of California Press, 1968

35. Curtis H. J., С о 1 e K. S., Transverse electric impedance of Nitella, Ibid., Vol.21, 1938, p.198-201.

36. Demmig В., В j о г к m а п О., Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77 K) and photonyield of O2 evolution in leaves of higher plants, Planta, V. 171, N.2, 1989, p. 171-184.

37. D a v e у Ch. L., D a v e у H. M., К e 1 1 D. В., On the dielectric properties of cell suspensions at high volume fractions // Bioelectrochem. Bioenerg. V.28. № '/2, 1992, p.319.

38. Edwin L. Carstensen,H.A. С 0 x , J R ., W. B. Mercer,L.A.Natal e, Passive electrical properties of microorganisms, Conductivity of Esherichia coli and Micrococcus lysodeikticus, Biophysical Journal, v. 5, 1965, p. 289-300

39. Edwin L. Carstensen, 1967, Passive electrical properties of microorganisms, II. Resistance of the bacterial membrane, Biophysical Journal, v. 7, p. 493-503

40. Edwin L. Carstensen,R.E.Marquis, Passive electrical properties of microorganisms, III. Conductivity of isolated bacterial cell walls, Biophysical Journal, v. 8, 1968, p. 536-548

41. F a 1 к 0 w s к i P.G., К i e f e r A. Chlorophyll a fluorescence in phytoplankton: relationship to photosynthesis and biomass // J. Plankton Res. 1985. V. 7. N 5. P. 715-731.

42. Firstenberg-Eden R., E d e n G., , Impedance Microbiology. Research Studies Press: Letchworth, 1984, P. 170.

43. Firstenberg-Eden R., Zindulls J., Electrochemical changes in media due to microbial growth, J. Microbiol. Methods, Vol.2, 1984, p.103-115.

44. Fork D.C., Herbert S.K. Electron transport and photophospholation by photosystem I in vivo in plants and cyanobacteria//Photosynth. Res. 1993. V. 36. P. 149-168.

45. F r i с к e H., The electric capacity of suspensions with special reference to blood, J. Gen. Physiol., Vol.8,1925, p.137-152.

46. Friedman A.L., A 1 b e r t e R.S. A diatom light-harvesting comole. Purification and characterization // Plant. Physiol. 1984. V. 76 (2). P. 483-489.

47. Govindjee O.D., A m e s z J., F о с к D. Light emission by plants and bacter. //Orlando. Acad. Press. 1986. 650 p.

48. G r i m m e s S., M a r t i n s e n O. G., Cole electrical impedance model a critique andan alternative, IEEE Trans. Biomed. Eng., V 52, № 1, 2005, p. 132-155

49. Grimnes S., M a r 11 n s e n O.G., Bioimpedance and Bioelectricity Basics, New York. Academic, p2000,. 237

50. Harris С. M., Todd R. W., В u n g a r d S. J., Dielectric permittivity of microbial suspensions at radio frequencies: a novel method for the real-time estimation of microbial biomass, Enzyme and Microbial Technology, Vol.9, № 3,1987, p.181-186.

51. Hause L. L., К 0 m о r 0 w s к i R. A., G а у 0 n F., Elecrtode and electrolyte impedance in the detection of bacterial growth, IEEE Trans. Biomed. Eng., Vol.28, № 5, 1981, p.403-410.

52. Herman P. S h w a n , Harold J. Morowitz, Electrical properties of the membranes of the pleuropneumonia-like organism A 5969, Biophysical Journal , v.2, 1962, p. 395-407

53. Koji Asa mi, Tohry Yamaguchi, Dielectric spectroscopy of plant protoplasts,

54. Pentachloropheno 1/Environmental Health Criteria; 71. World Health

55. Permeability. J.B.Lippincott: Philadelphia and London. 1922, Stewart G. N., The changes produced by the growth of bacteria in the molecular concentration and electrical conductivity of culture media, J. Exp. Med., Vol.4, 1899, p.235-243.

56. Wright C. A., Crofts A. R., Delayed fluorescence and the hight-energy state of chloroplasts, Eur. J. Biochem., 19, 1971, p. 386-397