Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнология этанола из ржи с применением мультиэнзимной композиции

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнология этанола из ржи с применением мультиэнзимной композиции"

На правах рукописи

Яковлева Светлана Федоровна

Биотехнология этанола из ржи с применением мультиэнзимной композиции

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 9 гидр 2С72

Воронеж 2012

005012822

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Корнеева Ольга Сергеевна (ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»)

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор,

заведующей кафедрой Бирюков Валентин Васильевич (ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет инженерной экологии»)

кандидат технических наук, доцент Зуева Наталья Владимировна (ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»)

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт пищевой биотехнологии» Россельхозакадемии, г. Москва

Защита состоится 4 апреля 2012 года в'-3 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.035.06 при ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, г. Воронеж, проспект Революции, 19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий».

Автореферат разослан 2 марта 2012 года.

Ученый секретарь

совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций, д.б.н.

Г.П.Шуваева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проблема получения этанола всегда остается актуальной в связи с его широкой востребованностью. При разработке новых и совершенствовании существующих биотехнологий важно без значительных материальных затрат повысить качество и выход конечного продукта, снизить потери сырья и энергозатраты. В последние годы в качестве зернового сырья, перерабатываемого на этанол, широко используется рожь, что объясняется ее способностью расти на почвах, непригодных для выращивания пшеницы, неприхотливостью к условиям произрастания, стабильной урожайностью, возможностью к возделыванию в различных областях РФ.

Однако, в отличие от пшеницы, рожь достаточно проблемное сырье для его биотехнологической переработки, что связано с ее химическим составом. Высокое содержание р-глюканов и пентозанов увеличивает вязкость развариваемой массы, потерю сбраживаемых углеводов на стадии воднс-тепловой обработки, требует снижения концентрации сухих веществ (СВ) сусла до 13,5 - 14,5%, что увеличивает себестоимость готового продукта. В связи с этим, наиболее актуальным направлением в биотехнологии этанола из ржи является применение более совершенных схем водно-тепловой обработки сырья с использованием высокоэффективных ферментных препаратов, действующих на некрахмалистые полисахариды, с целью сокращения расхода амилолитических ферментов, теплоэнергоресурсов, увеличения производительности технологического оборудования и выхода спирта. Данной проблемой занимались ученые Устинников Б.А., Римарева J1.B. Востриков C.B. и др.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является интенсификация технологии этанола из ржи путем применения мульти-энзимной композиции (МЭК) на стадии водно-тепловой обработки сырья. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- выбор эффективного ферментного препарата (ФП) для гидролиза ге-мицеллюлозной фракции ржаного сырья;

- очистка и изучение физико-химических свойств р-глюканазы и кси-ланазы, входящих в комплексный препарат Брюзайм BGX;

- определение субстратной специфичности ферментов МЭК с целью обоснования его использования в биотехнологии этанола для гидролиза некрахмальных полисахаридов;

- оптимизация условий проведения водно-тепловой обработки и осаха-ривания ржаного замеса при использовании мультиэнзимного комплекса;

- исследование динамики изменения метаболической активности дрожжей при сбраживании ржаного сусла;

- разработка эффективной биотехнологии этанола из ржи на основе применения мультиэнзимной композиции.

Научная новизна. Впервые получены высокоочищенные Р-глюканаза и ксиланаза, входящие в состав комплексного ферментного препарата Брюзайм ЕЮХ, изучены их физико-химические свойства и субстратная специфичность. Установлено, что Р-глюканаза гидролизует Р-1,3-1,4-глюкозидные связи, а ксиланаза - р-1,4-гликозидные связи в молекуле субстрата, на основании чего научно обоснована целесообразность применения ФП Брюзайм ЕЮХ для гидролиза гемицеллюлозной фракции ржаного сырья.

Установлены основные закономерности изменения вязкости ржаных замесов от параметров их водно-тепловой обработки и влияния МЭК.

Оптимизированы условия проведения водно-тепловой обработки и оса-харивания ржаного замеса при использовании мультиэнзимного комплекса.

Определена динамика метаболической активности дрожжей при сбраживании ржаного сусла.

Научная новизна технических решений подтверждена патентом РФ «Способ получения этилового спирта» №2344175 от 18 июня 2007г.

Практическая значимость работы. Разработана биотехнология этанола из ржи с использованием МЭК на стадии водно-тепловой обработки ржаных замесов, позволяющая увеличить содержание глюкозы в сусле на 34,7% по сравнению с контролем, повысить выход спирта на 1,4 дал/т усл. крахмала, сократить продолжительность процесса брожения на 10-12 ч. и уменьшить содержание примесей в зрелой бражке на 10%.

Даны рекомендации по снижению дозировки а -амилазы и глюкоамила-зы при использовании мультиэнзимного комплекса на стадии водно-тепловой обработки ржаных замесов. Предложенная технология апробирована в условиях ООО «Зернопродукт» Тульской области.

Экономический эффект при внедрении данной биотехнологии на заводе производительностью 3000 дал. абсолютного алкоголя в сутки составит 10360,9 тыс.рублей в год.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались: на научных конференциях в Воронежской государственной технологической академии (с 2007 по 2010 г); VI международной научно - технической конференции «Техника и технология

пищевых производств» (г. Могилев, Беларусь, 2007); VIII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии» (1СГТУ, Казань, 2007); IX международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Kl ТУ, Казань, 2008,); научно - практической конференции «Актуальные проблемы развития технологии и производства продуктов питания» (ВГАУ, Воронеж, 2008); всероссийской научной и научно-технической конференций «Современные промышленные технологии» ( Нижний Новгород, 2009).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 18 работ, в том числе пять в изданиях, рекомендованных ВАК и 1 патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, трех экспериментальных глав, выводов, списка использованных источников и приложений. Работа содержит 143 страниц машинописного текста, 29 таблицы, 52 рисунка. Библиография включает 137 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследования.

ГЛАВА I. Обзор литературы. Проведен аналитический обзор данных литературы, касающихся ферментов ксиланаз и ß-глюканаз, их физико-химических свойств, способов выделения и очистки.

Проанализирован зарубежный и отечественный опыт применения ферментов в технологии этанола из проблемного сырья.

ГЛАВА II. Объекты, материалы и методы исследований. Представлена характеристика объектов исследований, описаны условия постановки эксперимента и методы определения изучаемых показателей.

Осноеным объектом исследований служил комплексный ферментный препарат Брюзайм BGX фирмы « Diadic International Inc.» (USA), полученный путём глубинного культивирования микромицета Trichoderma lorgibranchiatóm и содержащий активные ß-глюканазу иксиланазу.

При водно-тепловой и ферментативной обработке замеса использовали ферментные препараты Ликвамил 1200C и Глюкозим Л400С+ («Diadic International Inc.»,USA), Брюзайм BGX, GC-106 (« Genencor Internation Inc.», USA).

В качестве сырья для получения спирта использовали рожь, крахмалистостью 53 %,содержание белка 10,5%, гемицеллюлозы 9,8%,

р- глюкана 1,7%, влажностью 14,5 %. Использовали помол со степенью измельчения 75 - 76% и 95 - 96 %. Степень измельчения помола определяли просеиванием полученной муки через сито с диаметром отверстий 1мм.

Ксиланазную активность определяли по количеству редуцирующих Сахаров, образовавшихся в результате ферментативного гидролиза ксилана. В качестве субстрата использовали растворимый ксилан («Sigma», США). Редуцирующие сахара определяли методом Сомоджи - Нельсона. Определение р-глюканазной активности проводили глюко-зооксидазным методом. Активность ферментов определялась следующими методами: глюкоамклазы-глюкозооксидазным, а-амилазы-йодометрическим, протеазы -метод Ансона.

Определение общего количества белка проводили по методу Ло-ури, используя калибровочный график, построенный по бычьему сывороточному альбумину. Оптическую плотность определяли на ФЭК при длине волны 750 нм.

Содержание белка в высокоочшценных препаратах определяли на спектрофотометре по поглощению при длине волны 280 и 260 нм, крахмали-стость - методом Эверса, влажность - методом ускоренного высушивания.

Очистку ферментов осуществляли путем осаждения органическим растворителем, гель-фильтрацией на сефадексе G-25, ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрацией на сефадексе G-150.

Молекулярную массу ферментов определяли методом гель-фильтрации с использованием сефадекса G-150.

Кинетические характеристики р-глюканазы и ксиланазы изучали на высокоочшценных препаратах.

Исследования реологических характеристик ржаных замесов проводили на ротационном вискозиметре «Реотест-2».

Аминный азот определяли методом формольного титрования, редуцирующие сахара - методом Сомоджи - Нельсона, растворимые не-сброженные углеводы и нерастворенный крахмал в фильтрате бражки -колориметрическим антроновым методом. Содержание спирта в бражке определяли путем перегонки на перегонной установке.

В работе применяли метод математического планирования экспериментов - центральное композиционное ротатабельное планирование. Определение оптимальных режимов проводили методом неопределенных множителей Лагранжа и симплекс-методом.

Вычисления проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Statistica 7.0 и Maple 11.

ГЛАВА Ш. Выделение и очистка р-глюканазы и ксиланазы и исследование их физико-химических свойств

С целью повышения степени биоконверсии всех составных частей зерна необходимо подобрать специальные мультиэнзимные системы целевого назначения. В связи с этим изучали эффективность воздействия биопрепаратов, расщепляющих некрахмалистые полисахариды, на вязкость ржаного замеса. Исследовапи влияние ФП Шеарзим 500Л, ВискоСтар 150Л и Брюзайм ВОХ ( в дозировке 0,1 см3/ кг крахмала) на вязкость ржаного замеса.

Максимальное значение вязкости в контрольном образце (без ферментов) составляло около 20 Па-с (1 = 65 °С). Минимальная вязкость (11,5 Па-с) наблюдалась в случае применения ферментного препарата Брюзайм ВвХ. Ферментные препараты Шеарзим 500Л и ВискоСтар 150Л менее эффективны для данного вида сырья, поэтому последующие исследования проводились с использованием препарата Брюзайм ВвХ.

Для исследования физико-химических свойств фермента необходимо иметь очищенный ферментный препарат. С этой целью нами разработана схема выделения и очистки ферментного препарата, включающая следующие стадии: осаждение органическим растворителем, гель-фильтращпо на сефадексе 6-25, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрацию на сефадексе О-150. Использование многостадийной очистки позволяет повысить долю активного белка в общей массе препарата.

25

20

о

45

о

40 50 60 70 80

Температура, оС

Рис. 1 Влияние температуры на вязкость ржаных замесов при скорости нагрева 1,0 °С/мин: 1 - контроль; 2 - Шеарзим 500Л; 3 - Виско Стар 150Л; 4 - Брюзайм.

;

л

; 1

г

«■«««■о 2

В результате разработанной схемы очистки были получены вы-сокоочищенная р-глюканаза с удельной активностью 369,5 ед/мг белка и степенью очистки 57,7 и ксиланаза с удельной активностью 5676,4 ед/мг белка и степенью очистки 53,1. Молекулярная масса р-глюканазы составила 112,2 кДа, а ксиланазы - 91,2 кДа. Данные очистки р-глюканазы и ксиланазы представлены в таблицах 1,2.

Таблица 1

Получение очищенной Р-глюканазы

Стадии очистки Объём, см3 Общий белок, мг Активность Степень очистки Выход по активности, %

Общая, ед Удельная, ед/мг

Концентрированный препарат 20 449 2875 6,4 1 100

Осаждение этанолом 4 110,6 1382,9 12,5 1,95 •18,1

Сефадекс С-25 3 5,7 149,5 26,1 4,06 5,2

ДЭАЭ-целлюлоза 3 0,89 132,3 148,4 23,1 4,6

Сефадекс в-150 3 0,29 106,4 369,5 57,7 3,7

Таблица 2 Получение очищенной ксиланазы

Стадии очистки Объём, см3 Общий белок, мг Активность Степень очистки Выход по активности, %

Общая, ед Удельная, ед/мг

Концентрированный препарат 20 449 48000 106,9 1 100

Осаждение этанолом 4 110,6 17143, 6 155,0 1,45 35,7

Сефадекс 0-25 3 5,7 2304,0 404,2 3,8 4,8

ДЭАЭ-целлюлоза 3 1,3 1872,0 2394 22,4 3,9

Сефадекс 0-150 3 0,26 1488,0 5676,4 53,1 3,1

Влияние физико-химических факторов на активность р-глюканазы и ксиланазы ФП Брюзайм ВСХ. Изучение оптимального рН -действия р-глюканазы и ксиланазы ферментного препарата Брюзайм ВСХ проводили при рН 2 - 7 (рис. 2).

Кривая зависимости имеет колоколообразный вид с максимумом активности ксиланазы при рН 5,5, р-глюканазы при рН 4,8. Дальнейшее увеличение рН среды приводило к резкой инактивации ферментов.

о 2

4

6

рН

Рис 2. Влияние рН на активность ферментов: 1 - р-глюканазы;

2 - ксиланазы

Определение оптимальной температуры действия ксиланазы и р-гшоканазы проводили в диапазоне 30 - 70 °С (рис. 3).

Из рис. 3 видно, что активность ферментов увеличивается с повышением температуры до определенного максимума, соответствующего оптимуму действия ферментов, который для ксиланазы составил 50 °С, для р - глюканазы 56 °С, а затем резко падает, что свидетельствует об инактивации ферментов.

100 80

< 20 0

30 40 50 60 70

Температура, ОС

Рис. 3. Влияние температуры на активность ферментов: 1 -ксиланаза; 2 - р - глюканазы.

Таким образом, установлено, что оптимум действия ксиланазы: температура 50 °С, рН 5,5; оптимум действия р-глюканазы: температура 56 °С, рН 4,8. Эффективным диапазоном действия ферментного препарата Брюзайм ЕЮХ следует считать: температуру 50-55 °С, рН 5,0-5,5.

Термо- и рН стабильность ферментов является важной характеристикой в технологии ферментных препаратов и их использовании в биотехнологии на различных стадиях технологического процесса. Данные характеристики р-глюканаз и ксиланаз изучены недостаточно, поэтому исследование этих величин заслуживает особого внимания.

Исследовали стабильность р-глюканазы и ксиланазы при выдерживании ферментного препарата в 0,1М фосфатно-цитратном буфере с различными значениями рН от 4.0 до 7.0. Ферментный препарат выдерживали при температурах от 30 до 70°С в течение 1 часа и определяли остаточную активность. Влияние температуры на стабильность [3-глюканазы и ксиланазы представлены на рис. 4 и 5 соответственно.

0 Г. ... .... Г ... . ... г ... ■

20 30 40 50 60 70

Температура, ОС Рис. 4 - Влияние рН и температуры на стабильность Р-глюканазы.

Установлено, что р-глюканаза наиболее стабильна при рН 5.0. Остаточная активность при 50°С составила 97,5%, при 60°С - 89,5%, при 70°С - 57,3 %. Ксиланаза наиболее стабильна при рН 6.0. Остаточная активность при 50°С составила 95,6%, при 60°С - 79,6%, при 70°С - 44,5%, Исследовали кинетику кислотной и термической инактивации р-глюканазы и ксиланазы ферментного препарата Брюзайм BGX .

При исследовании кинетики кислотной и термической инактивации растворы ферментов выдерживали в фосфатно-цитратном буфере в диапазоне рН от 3,0 до 7,0, в интервале температур 30-65°С. Растворы

100

инкубировались при указанных условиях, и через определенные промежутки времени определялась активность ферментов.

100

<

о

20 30 40 50 60 70

Температура, ОС

Рисунок 5 - Влияние температуры и рН на стабильность ксиланазы.

Остаточная активность р-глюканазы прирН 5,0 составила: 71,2% при 40°С через 72 часа; 92,5% при 50°С через 8 часов; 55,5% при 60°С через 6 часов.

Остаточная активность ксиланазы при при рН 6,0 составила: 42,4% при 40°С через 72 часа; 72,4% при 50°С через 8 часов; 226,8% при 60°С через 6 часов. Повышение температуры до 60 °С приводило к резкому снижению активности обоих ферментов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемые нами ферменты, входящие в состав ферментного препарата Брюзайм ВвХ, проявляют достаточно высокую устойчивость к низким значениям рН и повышенным температурам, что делает перспективным применение его в биотехнологии.

Изучение субстратной специфичности ферментов препарата Брюзайм ВвХ. В табл. 3 проведены результаты исследования субстратной специфичности р-глюканазы. Из таблицы видно, что исследуемый фермент не расщепляет а - гликозидные связи и не действует на сахариды, содержащие только р - 1,3 или р - 1,4 гликозидные связи. Вместе с тем фермент катализирует гидролиз р-глюкана и лихенина, в которых остатки глюкозы соединены чередующимися р - 1,3 и Р - 1,4-гликозидными связями, причем активность при действии на лихенин немного ниже, чем при действии на р-глюкан.

Таблица 3

Действие Р - глюканазы на некоторые поли - и дисахариды

Субстрат Тип связи Относительная активность р -глюканазы, %

Ячменный р - глюкан В-1,3; В-1,4 100,0

Лихенин В- 1,3; В-1,4 92,5

Дрожжевой Р - глюкан В-1,3; В-1,6 0,0

Ламинарии В- 1,3 0,0

Ыа-КМЦ В-1,4 0,0

Целлобиоза В-1,4 0,0

Крахмал а- 1,4; а- 1,6 0,0

Мальтоза а-1,4 0,0

Условно ксиланазы микроорганизмов могут быть разделены на ферменты, гидролизующие субстраты до ксилозы и ксилоолигосахари-дов, и на ферменты, гидролизующие субстраты только до ксилоолиго-сахаридов, среди которых основным продуктом является ксилобиоза.

При определения конечных продуктов гидролиза ксилана ксила-назой с использованием метода гель-хроматографии было установлено, что с увеличением продолжительности гидролиза в составе гидролизата уменьшалось содержание ксилана, увеличивалось содержание ксило-олигосахаридов со степенью полимеризации больше трех, также накапливалось небольшое количество ксилозы. Таким образом, ферментный препарат Брюзайм ВвХ способен расщеплять гемицеллюлозные фракции зерна ржи, что делает перспективным его использование при переработке проблемного сырья.

ГЛАВА IV. Применение мультиэнзимной композиции на стадии водно-тенловой обработки ржаных замесов

В спиртовом производстве вязкость зерновых замесов играет определяющую роль в процессе водно-тепловой обработки зерна, поскольку подвижность замеса определяет возможность использования вторичного пара и величину расхода электроэнергии на перемешивание и транспортирование замеса. Вязкость зерновых замесов обусловлена наличием в зерновом сырье крахмала, белка, гемицеллюлоз. Величина вязкости зависит от крупности помола зерна, гидромодуля замеса, скорости повышения температуры и от количества задаваемых на разжижение ферментов. На величину вязкости зернового замеса особенно влияет способ водно-тепловой обработки.

Приготовление замеса осуществляли путем смешивания измельченного зерна с водой температурой 50-55 °С в соотношении 1:3-1:3,5. В качестве источника термолабильной а-амилазы использовали ферментный препарат Ликвамил 1200C в дозировке 0,5 - 1,0 ед. АС/г крахмала. В качестве источника протеаз - протеолитический ферментный препарат GC-106 в количестве 0,2 ед. ПС/г крахмала. Комплексный препарат Брюзайм BGX в количестве 0,02 - 0,03 ед. ß-ГкС/г крахмала. Ферментные препараты вносили в замес, проводили ферментативную обработку в течение 40 мин при температуре 55-60 °С. Затем замес подогревали до температуры 75 °С при скорости нагрева 1,0 и 2,5 °С/мин. В процессе нагревания при каждом повышении температуры на 5 °С фиксировали значение вязкости.

Также нами было изучено влияние степени измельчения сырья и гидромодуля на вязкость ржаных замесов при скорости нагрева 1,0 и 2,5 °С/мин.

Установлено, что максимальное значение вязкости для помолов с различной степенью измельчения достигается при разных температурах. Для помола со степенью измельчения 95-96 % пик вязкости при температуре 62 °С составил 28 Пас., а для помола 75-76 % - 20 Пас соответствовал температуре 65 °С.

Чем мельче крупка, тем выше доступ воды и теплоты к биополимерам зерна, тем быстрее повышается вязкость

При увеличении гидромодуля вязкость замеса снижается. При скорости нагрева 2,5 °С/мин вязкость замеса на 40-50% выше, чем при скорости нагрева 1,0°С/мин. Максимум вязкости смещался в сторону более высоких температур. Наибольшее значение вязкости для помола со степенью измельчения 95 - 96 %, наблюдалось при температуре 62 °С, а для помола 75- 76 % - при 65 °С.

Исследование влияния дозировки ферментного препарата Брюзайм BGX показало, что с увеличением дозировки ФП вязкость замеса уменьшается. С целью экономии ферментного препарата в дальнейших исследованиях применяли дозировку препарата 0,02 единица ß - ГкС/г крахмала, т.к. при дозировке 0,03 ед ß - ГкС/г существенного снижения вязкости не наблюдалось.

Ферменгный препарат Ликвамил 1200C значительно снижает вязкость замеса (рисунок 6) на 56 и 72 % при дозировке фермента 0,5 и 1,0 ед. АС/г крахмала соответственно. Кроме того, при применении этого фермента пик максимальной вязкости сдвигался.в сторону меньших температур и соответствовал 60 "С. Снижение вязкости замеса происхо-

дало за счет деструкции цепей крахмала а-амилазой до декстринов и небольшого количества Сахаров.

Реологические свойства замеса также зависят от количества белка. При нагреве замеса белки набухают и наряду с крахмалом повышают вязкость. Ферментный препарат протеазы ЄС-ІОб позволяет снизить вязкость ржаного замеса по сравнению с контролем на 17,5 % (рисунок 6). Снижение вязкости обусловлено гидролизом белков протеазой до пептидов и аминокислот.

25 20

$5

С

§10

о

40 50 60 70 80 Температура, оС

Рисунок 6 - Влияние температуры на вязкость ржаных замесов при скорости нагрева 1,0 °С/мин: 1 - контроль; 2 - Ликвамил (1,0 ед.

АС/г крахмала); 3 - вС-Шб (0,2 ед. ПС/г крахмала); 4 - Ликвамил (0,5 ед. АС/г крахмала), Брюзайм ВОХ (0,02 единиц Р - ГкС/г крахмала), ОС-106 (0,2 ед. ПС/г крахмала), 5 - Ликвамил (0,5 ед. АС/г крахмала).

Совместное действие мульттнзимного комплекса снижает вязкость ржаного замеса на 78 % по сравнению с контролем (рисунок 6), что позволяет нагревать замес до высокой температуры и выдерживать его в течение времени, которое необходимо по технологическому регламенту, перерабатывать высококонцентрированные замесы, снизить расход теп-лоэнергореурсов, увеличить производительность спиртового завода.

Изучение динамики накопления массовой доли сухих и редуцирующих веществ в замесе в процессе водно-тепловой обработки ржаного замеса покащало, что внесение на стад™ водно-тепловой обработки ферментов дополнительного действия приводит к увеличению массовой

доли сухих и редуцирующих веществ в замесе. Применение дополнительных ферментов повышает атакуемость крахмала а - амилазой, в результате разрушения белковой и гемицеллюлозной матрицы окружающей гранулы крахмала.

В результате математической обработки экспериментальных данных методом полного факторного эксперимента 24 с применением центрального композиционного ротатабельного униформпланирования получено уравнение регрессии 2-го порядка, адекватно описывающее процесс механико - ферментативной обработки замеса, подтверждающее оптимально выбранные условия.

Для определения оптимального режима водно-тепловой обработки использовали метод неопределенных множителей Лагранжа, в результате было установлено, что максимальное накопление сухих веществ в замесе составляет 16,6 % и достигается при продолжительности 2,1 ч. и следующих дозировках ферментных препаратов: Ликвамил 1200С - 0,57 ед. АС/г крахмала, Брюзайм ВвХ - 0,021 ед. Р - ГкС/г крахмала, йС- 106- 0,205 ед. ПС/г крахмала.

ГЛАВА 5. Исследование влияния мультпэнзимной композиции на процесс оеахарнвания и брожения

В производстве этилового спирта стадия осахаривания является одной из основных. От эффективности проведения данного процесса в значительной мере зависит полнота выбраживания декстринов и крахмала, качество и выход конечного продукта, количество производственных потерь.

Осахаривание разваренной массы, полученной при оптимальном режиме водно-тепловой обработки, проводили ферментным препаратом глюкоамштазы Глюкозим Л - 400 С+ из расчета 6,0 ед. ГлС на г крахмала. В качестве контроля использовали разваренную массу, полученную с использованием только ферментного препарата Ликвамил 1200С в дозировке 1,0 ед. АС на г крахмала. Осахаривание проводили при температурах 50-65 °С и рН 4,0-5,5 в течение 120 мин. рН разваренной массы регулировали путем внесение в нее 15% серной кислоты. Каждые 30 минут отбирали пробы для определения глюкозы. Динамика накопления глюкозы в сусле в зависимости от дозировки глюкоамилазы представлена на рис. 7.

При использовании мультиэнзимного комплекса наблюдалось увеличение содержания глюкозы на 34,7 %, по сравнению с контролем. Увеличение степени гидролиза крахмала можно объяснить тем, что он

становится более доступным для действия глюкоамилазы за счет растворения белковых и гемицеллюлозных оболочек.

Из рис. 7 видно, что применение мультиэнзимного комплекса позволяет сократить расход глюкоамилазы до 4,0 ед ГлС на г крахмала, вместо 6,0 ед ГлС на г крахмала в контроле.

0 30 60 90

Продолжительность, мин

Рисунок 7 - Динамика накопления глюкозы в процессе осахаривания в зависимости от дозировки глюкоамилазы при температуре 60 °С и рН 4,5 ед ГлС на г крахмала: 1 - 4,0; 2 - 5,0; 3 - 6,0; 4 - контроль.

Расчет констант скорости реакции гидролиза крахмала при осаха-ривании разваренной массы показал, что при использовании мультиэнзимного комплекса скорость гидролиза крахмала почти в два раза выше, чем в контроле. Это свидетельствует о том, что предлагаемые условия водно-тепловой обработки позволяют снизить вязкость разваренной массы, способствуют подготовке крахмала к осахариванию, увеличивая атакуемость молекул крахмала глюкоамилазой.

Оптимизацию технологических режимов процесса осахаривания проводили методом полного факторного эксперимента 24 с применением центрального композиционного ротатабельного униформпланирова-ния эксперимента. Характеристика ржаного сусла, полученного при оптимальных условиях осахаривания разваренной массы, представлена в

таблице 4, из которой видно, что по основным показателям опытный образец превосходил контрольный.

Таблица 4

Показатели ржаного сусла

Показатели Контроль Опыт

Массовая доля сухих веществ, % 16,6 17,1

Содержание редуцирующих веществ, г/100 см3 14,0 14,8

Содержание глюкозы, г/100 см3 8,6 12,1

Содержание аминного азота, мг/100 см"* 29,3 48,2

Доброкачественность по РВ, % 84,3 86,5

Кислотность, град 0,31 0,31

Вязкость, Па-с 1,8 1,3

Полученное сусло было использовано для постановки бродильных проб с совместным применением дополнительных ферментов (Брюзайм ЕЮХ и вС-Юб) и без них (контроль).

Дрожжи вносили в количестве 10 % от объема сусла. Сбраживание сусла дрожжами БассЬаготусез сегеу1з1ае расы XII продолжалось трое суток при температуре 28...30 °С. Об интенсивности брожения судили по количеству выделившегося в единицу времени углекислого газа.

Характер брожения наглядно иллюстрирует рис. 8. Как видно из графика, при сбраживании сусла можно выделить три периода. Первый период (возбраживание) - протекает 6 - 8 ч в контроле и 3 - 4 ч в опыте. В это время идет интенсивное размножение дрожжей, нарастает их биомасса и наблюдается медленное брожение - превращение Сахаров в спирт и углекислоту. Сокращение продолжительности возбраживания в опыте в два раза по сравнению с контролем, возможно, связано с более сбалансированным составом питательной среды для дрожжей в опытных образцах сусла.

Во втором периоде - главном брожении происходит быстрое сбраживание основной части Сахаров, содержащихся в сусле, и интенсивное накопление спирта. Период главного брожения в опытных образцах продолжался 24 - 26 ч, тогда как в контроле 26 - 28 ч, при этом в опыте сбраживалось до 90% Сахаров, содержащихся в сусле, в контроле - всего 75 - 80% Сахаров.

В третьем периоде - дображивании происходит доосахаривание декстринов и непрогидрализованного ферментами, содержащимися в бражке до появления сбраживаемых Сахаров, крахмала, с последующим

сбраживанием образующихся Сахаров в спирт и углекислоту. Продолжительность этого периода зависит от активности ферментов бражки и культуры дрожжей, поэтому от того, насколько активными остались ферменты и дрожжи, будет зависеть продолжительность процесса доб-раживания.

1,6

1'М §1,2 1

;0,8

Б

!3

§0,6 СО

¡0,4

¥ §0,2 о К

1

/

; /1

// 1

7/

7/

12 24 36 48 Продолжительность брожения, ч

60

72

Рисунок 8 - Кинетика процесса сбраживания ржаного сусла: 1 - контроль, 2 - опыт

Общая продолжительность брожения в контрольной пробе составила 68 - 70 ч, в опытной пробе 50 - 52 ч. Брожение в опытной пробы протекает более интенсивно, чем в контрольной пробе. Это объясняется тем, что при использовании комплекса ферментов, содержащего протес-литический фермент, происходит гидролиз белкового комплекса зерна ржи до пептидов и аминокислот, в результате сусло обогащается дополнительным азотистым питанием. Дрожжевые клетки, выращенные на сусле, обогащенном азотом аминокислот, обладают большей физиологической и бродильной активностью. В опытном образце степень гидролиза крахмала выше, чем в контрольном, тем самым сокращается продолжительность стадии дображивания, а в целом и весь процесс брожения.

При внесении дрожжей в сусло их концентрация падает почти в 10 раз. Во время возбраживания биомасса дрожжей накапливается очень быстро (рис.9) и почти достигает первоначальной концентрации.

Причем накопление биомассы дрожжей в опыте идет более интенсивно, чем в контроле. К 36 часам брожения концентрация дрожжей в опытном образце достигает 115млн. клеток/см3, а в контроле 90 млн.клеток/см3.

—♦—1 —Ш—2

Рисунок 9 - Динамика накопления биомассы дрожжей при сбраживании ржаного сусла: 1 - контроль, 2 -опыт

По окончании срока брожения в полученной бражке определяли объемную долю спирта и рассчитывали его выход, а также определяли содержание растворимых несброженных углеводов и нерастворенного крахмала. Полученные данные приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Показатели зрелой б) эажки

Показатели Контроль Опыт

Объемная доля спирта, % об. 7,8 8,5

Содержание растворимых несброженных углеводов, г/100см3 0,45 0,25

Содержание нерастворенного крахмала, % 0,1 0,04

Нарастание титруемой кислотности, ° 0,19 0,15

Выход спирта, дал/т условного крахмала 65,4 66,8

Продолжительность брожения, ч 68,0 • 50,0

Из таблицы видно, что в опытном образце наблюдалось увеличение выхода спирта по сравнению с контролем, на 1,4 дал /т условного крахмала. Эго объясняется тем, что при использовании комплекса фер-

ментов происходит более полный и глубокий гидролиз крахмала, уменьшается количество вторичных продуктов за счет наиболее полного сбражива ния углеводов с уела и высокой бродильной активности дрожжей. Обогащение сусла свободными аминокислотами, за счет действия протеолитических ферментов на белки ржи, способствует сокращению расхода сахара на построение биомассы дрожжей, и соответственно, ведет к увеличению образования этилового спирта.

Применение ферментных препаратов, действующих на некрахмалистые полисахариды, приводит к увеличению выхода спирта за счет гидролиза ß - глюкана ржаного сырья до глюкозы.

Определение содержания примесей в отгонах зрелой бражки га-зохроматографическим методом показало, что в опытном образце, по сравнению с контролем, снижается содержание ацетальдегида, этилаце-тата, метанола, пропанола и изопропанола, а несколько увеличивается содержание изобутанола и изоамилола. Общее количество примесей в опытном образце на 10% меньше, чем в контроле, что в дальнейшем облегчает ректификацию и позволяет получить готовую продукцию более высокого качества. Снижение содержания примесей связано с созданием благоприятных условий для развития дрожжевых клеток и сокращения продолжительности брожения.

На основе полученных экспериментальных данных разработана технологическая схема интенсивной технологии получения этанола на основе применения МЭК. Согласно этой схеме, водно-тепловую обработку ржаного замеса предлагается проводить в четыре этапа: температура 50 - 55°С - 20 мин, температура 55 - 60°С - 40 мин, температура 70 - 75°С - 60 мин, далее нагревают до температуры 95 - 100°С и выдерживают 30 мин. Для осуществления данной технологической схемы дополнительно требуется установка аппарата гидродинамической и ферментативной обработки.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Эффективным ферментным препаратом для гидролиза гемицеллюлозной фракции ржаного сырья является Брюзайм BGX, позволяющий снизить вязкость ржаного замеса на 40%, что связано с гидролизом ксилана и ß-глюкана до низкомолекулярных фракций.

2. Оптимальными параметрами действия ферментного препарата Брюзайм BGX являются температура 50-55° С и pH 5.0-5.5. Ферменты, входящие в состав препарата Брюзайм BGX, обладают достаточной кислотной и термической стабильностью: при температуре 70 С остаточ-

ная активность ß-глюканазы составляет 57%, ксиланазы - 44%, что свидетельствует о целесообразности его применения при механико-ферментативной обработке сырья.

3. Установлено, что водно-тепловую обработку сырья по предложенной технологии следует проводить при следующих параметрах: дозировка а-амилазы - 0,57% ед АС/г крахмала, протеазы - 0,205 ед ПС/г крахмала, Брюзайм BGX - 0,021 ед рГлС/г крахмала, продолжительность процесса - 2,1 ч. Оптимальными параметрами процесса осахари-вания являются: дозировка глюкоамилазы -2,1 ед ГлС/г крахмала, температура 60,8° С, продолжительность - 1,95 ч. Предложенная технология позволяет интенсифицировать процесс получения этилового спирта из ржи.

4. Показана целесообразность снижения дозировки а-амилазы и глюкоамилазы при использовании мультиэнзимного комплекса на стадии водно-тепловой обработки. Установлено, что применение композиции биопрепаратов на этой стадии увеличивает содержание глюкозы в сусле на 34,7 %.

5. Снижение продолжительности брожения на 10-12 ч обусловлено повышением метаболической активности дрожжей, которая объясняется присутствием в сусле дополнительного азотистого питания за счет действия протеаз.

6. Предлагаемая биотехнология этанола из ржи позволяет увеличить выход спирта на 1,4 дал /т условного крахмала, сократить продолжительность брожения до 50 - 52 ч и уменьшить общее содержание примесей в зрелой бражке на 10%.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Получение этилового спирта из ржи с использованием мультиэн-зимной композиции. [Текст] / С.ФЛковлева, А.Н.Яковлев, О.С.Корнеева // Биотехнология. — 2011, № 6, С. 63-69.

2. Влияние мультиэнзимного комплекса на вязкость ржаных замесов [Текст]/ А.Н. Яковлев, A.A. Смирных, М.А. Бушин, С.Ф. Яковлева, Ю.Н. Филатова // Производство спирта и ликероводочных изделий. -2007. -№1, С. 17-18.

3. Влияние протеолитического ферментного препарата на процесс осахаризания и спиртового брожения [Текст]/ А.Н. Яковлев, C.B. Вос-триков, М.А. Бушин, С.Ф. Яковлева // Хранение и переработка сельхоз-сырья. - 2007. - №8, С.52-53.

4. Интенсификация переработки ржи на этанол с использованием мультиэнзимного комплекса [Текст]/ А.Н. Яковлев, О.С.Корнеева, C.B. Востриков, С.Ф.Яковлева // Производство спирта и ликероводоч-ных изделий. - 2009. - №4, С. 12-14.

5. Влияние мультиэнзимного комплекса на вязкость ячменных замесов [Текст]/ А.Н. Яковлев, С.В.Востриков, О.С. Корнеева, С.Ф. Яковлева // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2009. - №9, С.46 - 47.

Патенты

1. Способ получения этилового спирта [Текст]: Патент RU № 23444175 С12Р 7/06/ С.В.Востриков, А.Н. Яковлев, М.А. Бушин, О.С. Корнеева, С.Ф. Яковлева. - опубл. 20.01.2009, Бюл. № 2.

Статьи и материалы конференций

1. Яковлев А.Н. Использование ферментных препаратов на стадии водно-тепловой обработки при переработки ржи в этанол [Текст]/ А.Н. Яковлев, О.С. Корнеева, С.Ф. Яковлева// Материалы VI международной научной конференции студентов и аспирантов «Техника и технология пищевых производств» / Могилевский гос. унив. продовольствия - Могилев, 2007,-С. 90.

2. Яковлев А.Н. Использование комплекса ферментных препаратов в процессе переработки ржи в этанол [Текст]/ А.Н. Яковлев, О.С. Корнеева, С.Ф. Яковлева// Материалы VIII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии»: тез. докл. - Казань, 2007. - С. 202.

3. Яковлев А.Н. Интенсификация переработки ржи в этанол [Текст]/ А.Н. Яковлев, О.С.Корнеева, С.ФЛковлева // Материалы XLV отчетной научной конференции за 2006 год: в Зч. / Воронеж, гос. тех-нол. акад. - Воронеж, 2007. - Ч. 1. - С. 133.

4. Яковлева С.Ф. Влияние температуры и рН на активность ксила-назы и (3-глюканазы [Текст]/С.Ф.Яковлева, О.С.Корнеева, А.Н.Яковлев // Организация и регуляция физиолого - биологических процессов/ Воронеж, гос. унив. - Воронеж, ООО «Центрально-Черноземное книжное издательство», 2008. - Вып. 10. - С. 295 - 298.

5. Яковлева С.Ф. Влияние температуры и рН на активность ксила-назы [Текст]/С.Ф.Яковлева, О.С.Корнеева, А.НЛковлев // Материалы IX Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» : тез. докл. - Казань, 2008. - С. 164.

6. Яковлева С.Ф. Интенсификация переработки проблемного сырья в этанол [Текст]/С.Ф.Яковлева, О.С.Корнеева, А.Н.Яковлев // Материалы Международной научно - технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука образование и производство»/ Воронеж, гос. технол. акад. - Воронеж, 2008 - С . 153.

7. Яковлев А.Н. Ксиланаза и р - глюканаза ферментного препарата Брюзайм BGX [Текст]/ А.Н. Яковлев, О.С.Корнеева, С.Ф.Яковлева // Материалы XLVI отчетной научной конференции за 2007 год: в Зч. / Воронеж, гос. технол. акад. - Воронеж, 2008. - 4.1. - С .125.

8. Яковлев А.Н. Влияние температуры и рН на активность Р~ глюканазы [Текст]/ А.Н. Яковлев, С.Ф. Яковлева, Е.М. Лобанова, М.Г. Сысоева // Материалы научно - практической конференции «Актуальные проблемы развития технологии и производства продуктов питания» / ВГАУ. - Воронеж: «Истоки», 2008. - С. 35

9. Применение комплексных ферментных препаратов при переработке зернового сырья в этанол [Текст] / Т.И. Фурсова, С.Ф. Яковлева, О.С. Корнеева, А.Н. Яковлев // Материалы всероссийских научных и научно-технических конференций ВНТК «Современные промышленные технологии»/ Нижний Новгород, 2009, - С. 16.

10. Яковлев А.Н. Очистка и физико-химические свойства р - глюканазы [Текст]/ А.Н. Яковлев, О.С.Корнеева, С.Ф.Яковлева // Материалы XLVII отчетной научной конференции за 2008 год: в Зч. / Воронеж, гос. технол. акад. - Воронеж, 2009. - 4.1. - С .189 - 190.

11. Яковлев А.Н. Влияние основных технологических факторов на процесс осахаривания разваренной массы [Текст]/ А.Н. Яковлев, С.Ф.Яковлева // Материалы XLVIII отчетной научной конференции за 2009 год: в Зч. / Воронеж, гос. технол. акад. - Воронеж, 2010. - 4.1. -С .192.

12. Яковлев А.Н. Влияние МЭК на процесс осахаривания [Текст]/ А.Н.Яковлев, С.Ф.Яковлева// Материалы XLIX отчетной конференции за 2010 год: в Зч. / Воронеж, гос. технол. акад. - Воронеж, 2011. - 4.1. -С. 206.

2.3

Подписано в печать 28.02. 2012. Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ К» 36

ФГБОУВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУВПО «ВГУИТ») Отдел полиграфии ФГБОУВПО «ВГУИТ» Адрес университета и отдела полиграфии: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Яковлева, Светлана Федоровна, Воронеж

61 12-5/2884

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ФГБОУ ВПО ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

На правах руюбписи

Яковлева Светлана Федоровна

БИОТЕХНОЛОГИЯ ЭТАНОЛА ИЗ РЖИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МУЛЬТИЭНЗИМНОЙ КОМПОЗИЦИИ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор О.С. Корнеева

Воронеж - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................5

ГЛАВА I. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................8

1.1 Характеристика сырья спиртового производства....................................8

1.1.1 Химический состав ржи..............................................................................................8

1.1.2 Структура крахмала ржи............................................................................................10

1.1.3 Целлюлоза зерна ржи..................................................................................................11

1.1.4 Гемицеллюлозы зерна ржи....................................................................................13

1.2 Характеристика ферментов, применяемых в спиртовом производстве для конверсии биополимеров зерна................................................................................16

1.2.1 Амилолитические ферменты........................................................................................16

1.2.2 Протеолитические ферменты................................................................................................18

1.2.3 Ксиланаза..................................................................................................................................19

1.2.3.1 Продуценты эндо-1,4-(3-ксиланаз..................................................................19

1.2.3.2 Выделение и очистка препаратов эндо-1,4-(3-ксиланаз..........21

1.2.3.3 Физико-химические свойства эндо-1,4-|3-ксиланаз....................22

1.2.3.4 Субстратная специфичность действия эндо-1,4-0-ксиланаз..................................................................................................................................................................26

1.2.4 Р-глюканаза..........................................................................................................................................27

1.2.4.1 Продуценты (3 - глюканазы..............................................................................27

1.2.4.2 Выделение и очистка Р-глюканаз................................................................29

1.2.4.3 Физико-химические свойства р-глюканаз............................................30

1.2.4.4 Субстратная специфичность действия Р-глюканаз......................32

1.3 Применение гемицеллюлаз при производстве спирта....................................35

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................38

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................38

2.1 Объекты исследований....................................................................................................................38

2.2 Гель-фильтрация и ионообменная хроматография................................................39

2.3 Определение молекулярной массы фермента методом гель-фильтрации 40

2.4 Определение активности ферментов......................................................................................40

2.4.1 Определение ксиланазной активности............................................................40

2.4.2 Определение ß-глюканазной активности....................................................41

2.4.3 Определение глюкоамилазной активности................................................43

2.4.4 Определение амилолитической активности..............................................43

2.4.5 Определение протеолитической активности..........................................43

2.5 Определение количества белка................................................................................................44

2.6 Определение крахмалистости методом Эверса........................................................44

2.7 Определение ß-глюкана в зерне............................................................................................45

2.8 Определение пентозанов..............................................................................................................45

2.9 Определение влажности..................................................................................................................45

2.10 Приготовление и анализ замеса, сусла и бражки..................................................45

2.11 Определение вязкости ржаных замесов........................................................................46

2.12 Определение содержания аминного азота в сусле..............................................46

2.13 Определение содержания редуцирующих Сахаров..........................................46

2.14 Определение содержание глюкозы....................................................................................47

2.15 Определение содержания растворимых несброженных углеводов и 47 нерастворенного крахмала в бражке..............................................

2.16 Определение титруемой кислотности............................................................................47

2.16 Определение титруемой кислотности............................................................................47

2.17 Определение содержания спирта в бражке..............................................................47

2.18 Математическая обработка экспериментальных данных..................................48

ГЛАВА III. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ß - ГЛЮКАНАЗЫ И КСИ-ЛАНАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЯ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ............................................................................................................................................................49

4.1 Выделение и очистка ß - глюканазы и ксиланазы..................................................49

3.2 Определение молекулярной массы ß-глюканазы и ксиланазы..................55

3.3 Влияние pH и температуры на активность ферментов......................................56

3.4 Кислотная и термическая инактивация ß - глюканазы и ксиланазы... 58

3.5 Изучение субстратной специфичности (3-глюканазы..................... 73

3.6 Изучение субстратной специфичности ксиланазы........................ 74

ГЛАВА IV. ПРИМЕНЕНИЕ МЭК НА СТАДИИ ВТО ПРИ ПЕРЕРА- 77 БОТКЕ ПРОБЛЕМНОГО СЫРЬЯ.................................................

4.1 Изучение вязкостных характеристик зерновых замесов.................. 77

4.2 Изменение вязкости ржаного замеса на стадии водно-тепловой подготовки...........................................................................................................................................79

4.3 Изменение массовой доли сухих и редуцирующих веществ в замесе на стадии водно-тепловой подготовки................................................................................87

4.4 Оптимизация процесса водно-тепловой обработки..............................................92

ГЛАВА IV. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МЭК НА ПРОЦЕСС ОСА-

ХАРИВАНИЯ И БРОЖЕНИЯ............................................................................................................102

5.1 Влияние МЭК на процесс осахаривания........................................................................102

5.1.1 Влияние основных технологических факторов на процесс осахаривания......................................................................................................................................................102

5.1.2 Кинетика гидролиза крахмала..............................................................................107

5.1.3 Оптимизация процесса осахаривания............................................................110

5.2 Влияние МЭК на процесс брожения ржаного сусла............................................120

5.2.1 Кинетика процесса брожения................................................................................120

5.2.2 Показатели зрелой бражки........................................................................................125

5.2.3 Накопление примесей в зрелой бражке........................................................126

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................128

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ................................................................129

ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................................................................144

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Проблема получения этанола всегда остается актуальной в связи с его широкой востребованностью. При разработке новых и совершенствовании существующих биотехнологий важно без значительных материальных затрат повысить качество и выход конечного продукта, снизить потери сырья и энергозатраты. В последние годы в качестве зернового сырья, перерабатываемого на этанол, широко используется рожь, что объясняется ее способностью расти на почвах, непригодных для выращивания пшеницы, неприхотливостью к условиям произрастания, стабильной урожайностью, возможностью к возделыванию в различных областях РФ.

Однако, в отличие от пшеницы, рожь достаточно проблемное сырье для его биотехнологической переработки. Это связано с ее химическим составом. Высокое содержание (3-глкжанов и пентозанов увеличивает вязкость развариваемой массы, потерю сбраживаемых углеводов на стадии водно-тепловой обработки, требует снижения концентрации сусла до 13,5 - 14,5% СВ, что увеличивает себестоимость готового продукта. В связи с этим, наиболее актуальным направлением в биотехнологии этанола из ржи является применение более совершенных схем водно-тепловой обработки сырья с использованием высокоэффективных ферментных препаратов, действующих на некрахмалистые полисахариды с целью сокращения расхода амилолитических ферментов, теплоэнергоресурсов, увеличения производительности технологического оборудования и выхода спирта. Данной проблемой занимались ученые Устинников Б.А., Римарева Л.В. Востриков C.B.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является интенсификация технологии этанола из ржи путем применения мультиэнзимной композиции на стадии водно-тепловой обработки сырья. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- выбор эффективного ферментного препарата для гидролиза гемицеллю-лозной фракции ржаного сырья;

- очистка и изучение физико-химических свойств Р-глюканазы и ксила-назы ферментного препарата Брюзайм ВвХ;

- определение субстратной специфичности ферментов МЭК для обоснования его использования в биотехнологии этанола на стадии водно-тепловой обработки;

- оптимизация условий проведения водно-тепловой обработки и осаха-ривания ржаного замеса при использовании мультиэнзимного комплекса;

- исследование динамики изменения метаболической активности дрожжей при сбраживании ржаного сусла;

- разработка эффективной биотехнологии этанола из ржи.

Научная новизна Впервые получены высокоочищенные (3-глюканаза и ксиланаза, входящие в состав комплексного ферментного препарата Брюзайм В ОХ, изучены их физико-химические свойства и субстратная специфичность. Установлено, что Р-глюканаза гидролизует |3-1,3-1,4-глюкозидные связи, а ксиланаза - (3-1,4-гликозидные связи в молекуле субстрата, на основании чего научно обоснована целесообразность применения ФП Брюзайм ВвХ для гидролиза гемицеллюлозной фракции ржаного сырья.

Установлены основные закономерности изменения вязкости ржаных замесов от параметров их водно-тепловой обработки и влияния МЭК.

Оптимизированы условия проведения водно-тепловой обработки и оса-харивания ржаного замеса при использовании мультиэнзимного комплекса.

Определена динамика метаболической активности дрожжей при сбраживании ржаного сусла.

Научная новизна технических решений подтверждена патентом РФ «Способ получения этилового спирта» №2344175 от 18 июня 2007г.

Практическая значимость

Разработана биотехнология этанола из ржи с использованием МЭК на стадии водно-тепловой обработки ржаных замесов, позволяющая увеличить содержание глюкозы в сусле на 34,7% по сравнению с контролем, повысить выход спирта на 1,4 дал/т усл. крахмала, сократить продолжительность процесса брожения на 10-12 ч. и уменьшить содержание примесей в зрелой бражке на 10%).

Даны рекомендации по снижению дозировки а-амилазы и глюкоамила-зы при использовании мультиэнзимного комплекса на стадии водно-тепловой обработки. Предложенная технология апробирована в условиях ООО «Зернопродукт» Тульской области.

Экономический эффект при внедрении данной биотехнологии на заводе производительностью 3000 дал. а. а. (абсолютного алкоголя) в сутки составит 10360,9 тыс. рублей в год.

ГЛАВА I. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика сырья спиртового производства

За последние годы значительно изменился состав зернового сырья, перерабатываемого на этиловый спирт. Наиболее широкое распространение получила рожь, в связи с ее невысокой требовательностью к условиям произрастания. Она может расти на маломощных, кислых, обедненных почвах, непригодных для выращивания пшеницы. Кроме того, рожь способна давать стабильные урожаи независимо от погодных условий, а неприхотливость позволяет возделывать ее в различных областях России. Благодаря этому рожь уже много лет занимает лидирующее место в нашей стране по засевным площадям и широко используется в отраслях агропромышленного комплекса, включая спиртовое производство [14,50].

Кроме того, наиболее актуальным и перспективным направлением в совершенствовании технологии этанола становится эффективное использование всех высокомолекулярных полимеров зернового сырья для его экономии и повышения выхода конечного продукта [34,36].

В отличие от пшеницы рожь является трудносбраживаемым сырьем, что связано с ухудшенными реологическими свойствами разваренной массы. Традиционно производственники для предотвращения увеличения вязкости массы и ее налипания на стенках технологического оборудования и коммуникациях стараются смешивать проблемное сырье с пшеницей в различных соотношениях, либо поддерживают низкие концентрации осахаренного сусла (13,5-14,5 % СВ). Перспективно применение цитолитических ферментов [14].

1.1.1 Химический состав ржи

Рожь - травянистое однолетнее растение семейства злаковых. Плод -продолговатая зерновка, сжатая с боков. Это голозерная культура, то есть зерна свободные, не сросшиеся с цветочной оболочкой. Химический состав ржи зависит от различных факторов: почвенно-климатических условий вы-

ращивания, сортовых особенностей, использованных при выращивании удобрений и др.

Традиционно сырье для спиртовой промышленности оценивают с точки зрения содержания в зерне основного сбраживаемого компонента - крахмала. Однако, при разработке новых технологий такой подход не может в полной мере охарактеризовать сырье, особенно если предполагают его комплексное применение [33].

Зерно злаков имеет принципиально одинаковое строение и состоит из частей, различных по химическому составу и физиологическому назначению: зародыша, эндосперма, алейронового слоя и оболочек. Соотношение частей зерна ржи представлено в таблице 1.1 [47].

Таблица 1.1

Соотношение частей зерна ржи

Культура Содержание в зерновке, %

зародыша эндосперма алейронового слоя оболочек

Рожь 2,5-3,5 73,0-79,0 8,5-12,0 10,0-11,0

Зародыш характеризуется концентрированием в нем свободных Сахаров и белков зерна. Алейроновый слой, состоящий из одного ряда клеток с утолщенными стенками, прилегающий к семенной оболочке и отделяющий ее от эндосперма, богат белком, липидами и зольными веществами. В оболочках зерна сосредоточена значительная часть некрахмалистых полисахаридов сырья, таких, как клетчатка, гемицеллюлозы [17].

Одной из особенностей ржи является высокая активность амилолити-ческих ферментов. Однако, в классической биотехнологии этанола не создают условия оптимальные для действия ржаных амилаз (температура 50-55 °С, pH 4,7-5,0), так как температура быстро поднимается до 80-85 °С. Опытным путем установлено, что активность амилолитических ферментов зерна ржи составляет 7,92 ед. АС/г зерна [15].

1.1.2 Структура крахмала ржи

Крахмал - растительный полисахарид с очень сложным строением. Это двухкомпонентное соединение, состоящее на 13-30% амилозы и 70-85%) ами-лопектина. В крахмале зерна ржи на долю амилопектина приходится 77 %, остальные 23 % составляет амилоза.

Оба компонента неоднородны, их молекулярная масса колеблется в широких пределах и зависит от природы крахмала. Амилоза - это неветвя-щийся полимер, в котором остатки глюкозы соединены а - 1,4 - гликозидной связью; степень полимеризации около 2000. Амилоза практически не обладает восстанавливающей способностью, так как в каждой молекуле амилозы имеется только одна свободная альдегидная группа.

Молекула амилозы представляет собой растянутую спираль, а в каждый виток входит 3 остатка глюкозы. В растворе спираль сжимается за счет увеличения витка, в котором уже участвует 6 остатков глюкозы. При вхождении молекул йода в спираль амилозы возникает характерный синий цвет.

. Амилопектин имеет большую молекулярную массу, чем амилоза, и более сложное строение. Это ветвящийся полисахарид. Предполагается, что амилопектин ветвится дихотомически, т. е. число концевых звеньев всегда на единицу больше числа звеньев, дающих ветвление. А сумма этих чисел дает общее число звеньев по всей цепи.

Молекула амилопектина - одна из самых крупных молекул, её молекулярная масса около 5*108 Д. Ветвление гликозидной цепи осуществляется с помощью а- 1,6 - связей, количество которых составляет 4-5 % от суммы а - 1,4 - и а - 1,6- связей в амилопектине. В состав амилопектина входит от 0,012 до 0,111%) фосфора, который, по-видимому, присоединяется к шестому углеродному атому в глюкозном остатке. Амилоза и амилопектин в растениях формируются в крахмальные зерна - гранулы, средний размер которых 3050 мкм. В зерне ржи, перерабатываемой на спирт, содержится 52 - 60 % крахмала.

Крахмал на 96 - 98 % состоит из полисахаридов, в небольшом количестве найдены белки, высокомолекулярные жирные кислоты, адсорбированные на крахмальных зернах, минеральные кислоты - фосфорная и кремниевая [10,11].

Кроме того, в природе гранулы растворимого крахмала входят в органическую полимерную связь в эндосперме злаковых, состоящую из цепей р-глюканов и пентозанов, каждая их которых связана с другими посредством протеинов (рис. 1.1) [16].

Верил «сракм&аш п««»***»*

Рис. 1.1 Структура эндосперма зерна

Технологическая сложность при переработке проблемного зерна представляют некрахмалистые пол