Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические основы выращивания клеточной культуры стефании гладкой (STEPHANIA GLABRA (ROXB)MIERS), как продуцента алкалоида стефарина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические основы выращивания клеточной культуры стефании гладкой (STEPHANIA GLABRA (ROXB)MIERS), как продуцента алкалоида стефарина"

'0 0 3

ВСЕСОЮЗНЫЙ НДУЧИО-ИССЛЕдаАТЕЛШШЙ ПРОЕКТНО-

коиструкторский институт пгашддиой биохимии

На правах рукописи

СЛВИНЛ ТАТЬЯНА АЛЕКСЕЕВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВЫРЛПЦЙВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ СТЕФАНИИ ГЛАДКОЙ ( ваялшлл аъша '(нохв)мшлз ) ,КЛК ПРОДУЦЕНТА АЛКАЛОИДА СТЕФАРИНА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Научло-чроингодстгенном оОи-дииении "Всесоюзный институт лекьрстъенимх ряеть-нш1."

Научный рукояодитель:

кандидат сельскохоляйстгеншл' пнук !<"П>>|- ■.). Г,

Официальные оппоненты:

доктор технических наук Строго! С.;., кандидат биологических нь,ук ¡1осон Д.М.

Ведущая организация: НПО " йЮТЕХШЮГИЯ "

Защита состоится часов

на заседании специализированного совета Д 098.09.01 во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии ( '125299, Москва ,ул.Клары Цеткин , д. 4/6 ).

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии. Автореферат разослан

V /? « си£С^Щ ,1992г.

Ученый секретарь специализированного совбта, кандидат биологических наук

И.И.Гусева

»лтченамй

; - | введение

свдч^'туаль110сть райоты> Распространенность заболеваний нервной и сердечно-сосудистой систем требует поиска псе но них лекарственных средств, обладающих значительным .эффектом и широким спектром действия. В медицине в настоящее время ншкел широкое применение ".овый оригинальный препарат антихолинэстеразного действия - сте-маглабрин сульфат, применяемый для лечения таких заболеваний как сирингомиелия, боковой амиотрофический склероз, параличи и парезы лицевого нерва, а также других заболеваний периферической нервной системы. Недавно установлено такие, что применение стефаг-лабрина --.ченьшает трофические расстройства д ен ер виро ванных конечностей, способствует более полной и ранней регенерации поврежденных нервов.

Стефаглабрин-сульфат относится к фитопрепаратам, получаемы.! только из растительного сырья. Основой его служит алкалоид сте-фарин, источником которого является субтропическое растение -стефания гладкая (з'/ьр/ю/мг/ <у/айга произрастающая

н субтропических областях Индии, 1Ситал, Японии, Бирмы и Вьетнама. 3 отих регионах стефания содержит евьгае 4% суммы алкалоидов, в том числе алкалоид стефарин - не более 20% от суммы.

Опыты по интродукции этого растения в -Советских влажных суб-¿роииках не привели к желаег.зму результату - в получаемом сырье алкалокд стефарин отсутствовал. Таким образом, вопрос об отечественном сырьо остается открытым и поэтому па производство сте-¿аглабрпна сульфата используется импортное сырье.

Многие из этих трудностей можно преодолеть, используя б качестве исходного новый вид (Ъитосцрья - клеточную биомассу лскор-

ственных растений, выращиваемую на искусственной питательной среде. Однако,получение такого сырья в свою очередь имеет ряд проблем. Решению части их и посвящена настоящая работа. Актуальность ее определяется необходимостью получения растительных ¡теток и тканей, которые служат источником физиологичоски активных веществ, находящих широкое применение в медицинской практике.

Цель и задачи исследований. Целью данного исследования является разработка биотехнологических основ выращивания клеточной культуры стефании гладкой для последующего использования ее в качестве сырья при получении алкалоида стефарина.

Поставленная цель достигается решением следующих задач: I. Создание высокоцродуктивного штамма клеток стефании гладкой -

продуцента алкалоида стефарина. Z. Отработка условий культивирования клеток в суспензии (объем и возраст ннокулюма, исходное рН питательной среды, оптимальный коэффициент массопередачи).

3. Оптимизация питательной среды для культивирования клеток стефании гладкой.

4. Разработка способа культивирования клеток в ферментаторе.

На защиту выносятся следугацие положения:

1. Штамм стефании гладкой, отличающийся повышенным содержанием стефарина.,

2. Оптимальный состав питательной среды, служащий для выращивания полученного штамма.

3. Условия культивирования ткани стефании гладкой в колбах на качалке и. в лабораторном ферментаторе.

|' -лиг-' човиача. Впервые введена с клеточную суспензионную

'.. с" .кань стефании гладкой, характеризующаяся высоким содержанием изохинолинового алкалоида - стефарина. Определены мо]х1о-физиологические характеристики полученной ткани.

Изучено рлияш1с ряда технологических показателен (объем и возраст посадочной ткани, рН питательной среды, коэффициент массо-передочи) на рост и алкалоидную проективность клеток стефании гладкой в суспензии.

Изучена зависимость некоторых процессов первичного и вторичного- синтезов от изменения таких компонентов питательной среды, как минеральные соли, углеводы, витамины л регуляторы роста.

Отработаны условия, выращивания клеточной культуры стефании гладкой в лабораторном ферментаторе.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований составлены лабораторные регламенты на производство сухой биомассы культуры клеток стенании гладкой и но производство сульфата стефаглабрина из культуры ткани стефании- гладкой.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, ,1з которнх одно авторское свидетельство..

.'гробани" работ»-', й&теркзлч дисссртакионнсЯ работ;-: докладывались на У1 (1584г.) и IX (1985:0 'конференциях цолоднх ученых и специалистов ЗИЛ? ("осква1.

Структура и обт-ем работ'-'. Диссертация состоит из .впедення, обзора данных литературы, 6 глав экспериментальном части, заключения, выводов и списка литература. Ее материал изложен на 163 -страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 31 рисунок;

библиография включает 150 названий, из которых 56 на русском языке.

МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служил штамм культуры ткани стефании гладкой, полученный в ВИЛРе из клубня интактного растения в 1962 г. Получение первичного каллуса проводили из ¡слубня, как наиболее алкалоидосодержащего органа,растения. Иростерилизованные 0,раствором сулемы кусочки клубня помещали в пробирки на поверхность агаризованной питательной среды,в состав которой входили мащзосоли и микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуга, сахароза 35?, витамины Стаба и регуляторы роста - киметин, НУК. по 1,0 нг/Аи 2,4Д - 0,5 мг/л. Культивирование проводили в термостатной комнате в темноте при температуре 26°С. Образовавшийся каллус переносили в жидкую питательную среду того же состава с исключением из нее агара и с некоторым изменением количественного содержания регуляторов роста. Полученную таким образом суспензионную культуру выращивали в колбах объемом 500 мл на подвесной качалке с эллиптической траекторией качания, совершающей в минуту 98-100 оборотов. Условия культивирования: темнота, температура +26°С. Соотношение инокулюма и объема заполнения колб составляло 1/10. Возраст посадочной ткшш соответствовал 13-15 суткам.

Морфо -<Х'И з и олргиче с ни о нее л едо палия. Степень ахрегированно-сти суспензии оценивали по отношению числа агрегатов в установивший условно фракциях к суше агрегатов всех фракций, выра-аенному в ."

Жизнеспособность клеток суспензии определяли, как процентное отношение неокрашенных клеток к окрашенным. Поело обработки суспензии 0,5% водным раствором !срасителя Эванса голубого.

Накопление биомассы оценивали по Бесу высушенных клеток, вычислял среднее значение из 3-5 повторностей и выражали в граммах на 1л.среды.

Концентрацию клеток подсчитывали в камере иукса - Розенталя после мацерации ткани 2С$ хромовой кислотой. Среднюю величину числа клеток определяли из 12 препаратов для каждого определения. Расиет проводили на I мл. суспензии.

Ростовой индекс определяли, как 'отношение массы ткани в момент определения: к массе ткани, внесенной при пересадке.

Абсолютную скорость роста (поглощения) определяли, как величину прироста (потребления) за какой-либо промежуток времени (час, сутки), отнесенную к единице времени.

Логарифмическую скорость роста определяли по формуле:

д£г? X (п & -¡±- _ -¡л— где : ;<г - масса ткани в данное

А ~Ь ' ■ время

- масса ткали с начальный момент времени

г» - начальный момент времени

¿г - конечный момент времени

Дыхательную активность находили по формуле:

А ПОЛЬ

где - скорость потребления кислорода X ГЧ X - масса ткани

Определение скорости потребления кислорода проводили иоляро-

графическим методом (Васильев Ь'.Н. и др., 1975 г.).

Биохимические исследования. Определение элементов минерального питания азота, фосфора, калия прогодили по методу, разработанному во ВШ1И лекарственных растопи!! (Фоменко К.П. и др. 1971 г.).

Определенно содержания сахарозы с питательном субстрате -фенольным методом (Плешков Б.П. 1976 г.).

Определенно количества алкалоида стефарина - методом, разработанным в лаборатории биотехнологии ВЯЛР (Давыденков В.Н. и др. 1988 г.).

Масштабирование процесса. Определение массообменных характеристик сосудов (колб,лабораторных ферментаторов) осуществляли методом статической дегазации (Васильев H.H. и др. 1975 г., Рамм В.В., 1966 г.). Клеточную суспензию выращивали в ферментаторе "АНКУМ-2М" вместимостью 14 л.

Приготовление питательной среди. Для приготовления питательной среди использовали 'макросоли и микросолн по Мурасиге и Скугу, витамины по прописи Стаба, хелаткое железо, сахарозу и регуляторы' роста: нафтинуксусную и 2,4-дихлорфенок^иуксуснуп кислоты, , кинзтин.

Планирование экспериментов и методы статистической обработки.

Планирование экспериментов осуществляли с использованием методов полного факторного эксперимента (Доспехов Б.Л. 1979 г.), ■ крутого восхождения и последовательного преодоления лимитирующих • факторов (Ашмарин И.П. 1975). Оптимизацию гштательного субстрата / по макросолям проводили с использованием триангулярньЕс матриц гЧВахьщстров Д.Б. 1982,.1951 г.).

При статистическом анализе данных экспериментов использовали дисперсионный, корреляционный и регрессионный методы оценки (определяли средние значения, стандартные отклонения, ошибки средних, критерии Стыодента, йишера, НСР, коэффициенты регрессии и корреляции).

Использование математической модели обратимого разновесного автокаталитического роста (Васильев H.A. и др. 1975 г.) позволило нам определить запас субстрата в питательной среде, коэффициенты метаболизма веществ, коэффициент полезного использова-• ния питательного субстрата.

РЕЗУЛЬТАТ!» ИССЛЕДОВАНИЙ.

Получение высокопродуктивного штамма клеток стенании гладкой -

продуцента алкалоида стегёаркна и его характеристика.

По морфологическим показателям из полученной суспензии было выделено двенадцать клеточных линий, различавшихся между собой, как по качественному, так и количественному содержанию алкалоидов. Наиболее продуктивная по стефарину линия была оставлена для проведения с нею дальнейшей работы. Таким образом, нами получена хорошо растущая суспензионная культура меток стефании гладкой, обладающая способностью синтезировать алкалоид стефарин.

С целью установления оптимальных значений возраста и величины посадочного материала были испытаны пнокулкмы в возрасте от 5 до 35 суток с интервалом в 5 суток и в .объемах 1/20, 1/10, 1/6 части от объема питательной среды (табл.1). Было установлено, что лучшими для пересева культуры являются объемы инокулюма, составляющие I/o часть от объема питательной среды в возрасте от 10 до 20 суток,

' Таблица I

Нарастание биомассы стефании гладкой в зависимости от объема и возраста генокулюма (г/л среды)

Объем генокулюма (часть ст объема среды Возраст инпкулю: 1а (сутки)

5 Ь : 15 20 25 : 30 ЗЬ

1/20 5,8+0,47 10,6+0,33 6,1+0,52 5,1+0,17

6,7+0,56 ~ 3,3+0,63 ~ 5,0+0,23

1/10 10,7+0,53 12,9+0.62 12,1+0,49 7,7+0,37

13,0+0,66 ~ 6,9+0,61 " 7,4+0,31

1/6 12,9+0,48 13,9*0,45 13,9+0,36 0,7*0,29

" 13,4+0,52 ~ 9,3*0,13 "" 7,8+0,28

' Шр0,95 = °'?7

и 1/10 часть от объема питательной среды в возрасте от 10 до 15 суток. Более ранние и более поздние сроки взятия инокулюма в этих объемах давали худшие результаты. Что же касается объема,, равного 1/20 части от объема питательной среды, то,независимо от возраста посадочной ткани, он не обеспечивал высокого конечного нарастания биомассы.

Анатомо-морфологическое изучение ткани показало, что в суспензионной массе ткани преобладают пятнадцати-пятидесятикле-точные агрегаты (47%). На долю единичных клеток приходится всего 4$; на двух - пятиклеточные агрегаты - 24$; шести - десяти-клеточные - 1%\ и. на агрегаты, включающие более пятидесяти клеток - 8$. По структуре мелкие агрегаты состояли в основном из одинаковых по размерам округлых клеток, которые непрочно связывались между собой,» при легком нажиме или интенсивном встряхивании агрегаты распадались на более мелкие или вообще на одиночные

¡слетки. Это позволяет предполагать, что последнее обстоятельство может приводить к изменению приведенного выше процентного состава суспензии.

С целью получения общей картины роста суспензионной культуры стефании гладкой изучали нарастание биомассы в динамике (каждые пять суток в течение 60 дней) по двум критериям: сухой массе ткани и количеству клеток в мл.среды (плотности). Было установлено, что накопление биомассы и увеличение концентрации клеток характеризуются $ - образными кривыми (рисЛ). Продолжительность лаг-фазы составляла 2-3 суток, затем вес биомассы и количество клеток непрерывно возрастали, вплоть до 24-26 суток роста. В последующие сутки рост .биомассы приостанавливался и к 28-30 суткам выращивания наступал, период стационара. Если учитывать по сухому весу, то данный период у суспензионной культуры весьма продолжительный и составлял примерно 15 суток; начало деградации отмечалось только на 44-46 день. Если же ориентироваться па показатель роста, подсчитанный путем учета клеточной плотности суспензии, то стационарная фаза практически не была выражена: 'после интенсивного роста почти сразу следовала фаза гибели.

Прослеживалась четкая зависимость образования вторичных веществ от периодов развития биомассы. Невысокое в начале культивирования содержание стефарина с ростом ткани постепенно возрастало и к концу периода регулярного роста увеличивалось почти • вдвое. С выходом культуры па стационар количество алкалоида продолжало возрастать и на 35-40 сутки достигало самого наивысшего значения. Это соответствовало середино периода равновесия, когда культура закапчивала ростовые процессы (рис. I). Алкалоид

Рис. 1. Рост суспензионной культуры стефании гладкой

стефарин в основном накапливался б биомассе; в культуральной жидкости были обнаружены только его следовые количества.

Оптимизация состава питательной среды. В соответствие с

• поставленной задачей по оптимизации состава питательной среды для роста суспензионной культуры стефании гладкой была прове-

• дена работа с использованием методов математического планирования экспериментов.

I. Регуляторы роста.

• Испытывалксь три регулятора роста: два с ауксиновой активностью (2,4-дихлорфеноксйуксусная и нафтилуксусная кислоты) и один с цитокининовой активностью (кинетин).

II

10

Ч

t. \

г- S

г> i

г.

К [ 6

се о 5-

Lj

с.

>i

LÎ

о О

3

г

о L.

il

rA'l il!/К г/i-V М'-'.'Г «"¡-'г «ш/. /¡;//г /(С/>

чип

Рис.2. Диаграмма роста культуры тканей стефалии гладкой п зависимости от изменения состава гормоноп в питательной среде.

Было установлено (рис.2), что существенной для поддержания роста культуры из всех изучаемых эффекторов оказалась 2,4-Д. Исключение ее из питательного субстрата сопровождалось снижением нарастания биомассы почти в три раза. Эффекторы НУК и кинетпи, как d сочетании, так и каждый в отдельности, были неспособными-стимулировать рост ткали. Отмечено, что ЛУК оказалась синергпс-тон по отношению к 2,4-Д.

Ла алкалоидную продуктивность культуры изучаемые эффекторы, как в сочетании, так и калздый в отдельности, существенного влпя-

ния не оказывали.

Следовательно, для поддержания интенсивности роста культуры стефании оказались необходимыми регуляторы роста 2,4-Д и НУК, кинетин мог быть исключен из питательного субстрата.

При изучении влияния различных концентраций (от 0 до I мг/л) представленных выше эффекторов, было установлено, что активный рост культуры и наивысшая ее алкалоидная продуктивность наблюдались при внесении в питательный субстрат НУК в количестве Т,0-0,5 мг/л и 2,4-Д - 1,0 мг/л.

2. Витамины.

Изучалось влияние на рост и алкалоидную продуктивность ткани витаминов, входящих в пропись Стаба (за исключением биотина и холинхлорида): тиамин, рибофлавин, никотиновая кислота, пири-доксин, Са-пантотенат, цианокобалашн и фолиевая кислота.

Для проведения эксперимента использовали метод последовательного преодоления лимитирующих факторов с использованием пол-

<

лого фактохлюго эксперимента.

Проведенные исследования позволили установить, что из всех витаминов ростетимулирующим действием обладал только Са-пантотенат. Рост ткани на средах, лишенных его, практически отсутствовал. Синтетическая активность ткани возрастала только -под влиянием тнашна или гшридоксина - данные витамины оказались •взаимозаменяемыми.

Таким образом, из всех витаминов, предлагаемых прописью Стаба,'для успешных роста и алкалоидной продуктивности клеточной '.культурш в питательную среду необходимо вносить только два -Са-пантотенат и тиамин или шгрпдоксин. Оптимальными концентрациями

данных веществ экспериментально были установлены их количества по 2 мг на I л. среды.

3. Макросоли.

Суспензионная культура стефании гладкой изначально была получена на питательной среде, в состав которой входили макросоли по прописи Мурасиге и Скуга (табл. 2).

Таблица 2

Содержание макросолей в питательном субстразе

Макросоли : Пропись Мурасиге и Скуга : Измененное содержание : : солей, мг/л

170 234

370 ' 850

330 64

1900 1800

1650 1700

Однако оставалось неясным: насколько соотношение компонентов, составляющих набор макросолей, являлось оптимальным для роста культуры клеток стефании гладкой. С целью поиска необходимого оптимума этого соотношения была проведена серия экспериментов с использованием метода систематических вариантов (определение оптимальных соотношений мезду элементами минерального питания с использованием двух-, трехкоординатньк сеток-матриц) (Вахмистров Д.Б. 1982 г.).

Как видно из приведенных выше прописей, изучению подвергались пять элементов - азот, фосфор, калий, кальций и магний. Для упрощения постановки эксперимента было решено разбить изучаемые элементы по группами учетом их количественного содеряа-

шя в питательном субстрате во избежание действие "лимитирующего фактора". 3 первую группу вошли магний, кальций и фосфор. Постановка эксперимента методом триангулгфиых матриц, в котором концентрации веществ изменялись во всем возможном диапазоне от 4-96% до 96-4%, позволила установить оптимальное значение их тройного соотношения. Причем были определены оптимумы,как для роста ткани, так и для производства ею алкалоида стефарина (рис.3).

Рис.3. Графическое определение оптимума тройного соотношения Са:М«у:Р в питательной среде для роста биомассы и синтеза ею алкалоида стефарина. А-рост ткани (Са:Мд:Р»35:30:35) В-содержаше стефарина ' (Са:Нд:Р = 12:58:30).

ЮО

100-ас

Исследования показали, что полученные оптимумы различались только по долевому содержанию Са и М^. в тройном соотношении. ' При этом, для накопления алкалоида доли Са и Р были не существенны, основное влияние на этот показатель оказывала доля М^ . Для нарастания биомассы наиболее существенной была дол'й фосфора.

Для дальнейшей работы нами рекомендовалось использовать ' соотношение элементов, равное: Са: М.^ :Р»Ю:60:30 ат.% от их . суммы, оптимальность которого'доказана математически.

Во вторую группу элементов были включены азот и калий. В ; опыте, варианты которого располагались в декартовых координатах, концентрация элементов так же варьировала во всем возможном

диапазоне от 96-4$ до 4-96%. Было установлено, что рост ткани, а также синтез ею алкалоида стефарина стимулировались при достаточно широком варьировании относительного содержания элементов азота и калия, т.е. в пределах от 25:75% до 75:25%. Математический анализ полученных данных позволил определить общий то двум показателям продуктивности биомассы оптимум - азот:калий» 75:25 ат.%.

В итоге было определено общее соотношение всех пяти элементов, составляющих основу макросолей,и отработана их суммарная концентрация, оптимальная для суспензионной культуры по росту и по синтезу ею стефарина. В таблице I представлены оптимальные концентрации солей, которые мы рекомендуем вносить в питательную среду для выращивания клеточной культуры стефании гладкой.

4. Углеводы.

В качестве единственного источника углевода в экспериментах предлагались сахара, представляющие разные группы": моносахара - глюкоза,ксилоза; дисахара - сахароза, мальтоза; .

сахароспиртп - маннит, сорбит-; полисахара! - растворимый крахмал.

' Изучалась возможность замены сахарозы пищевым сахаром.

Все сахара вносились в питательный субстрат в концентрации 5%. Масса ткани (г/л) и содержание стефарина определялись после 'первого и пятого субкультивирования (таб.3).

По отношению ткани стефании гладкой к источникам углевода, последние были разделены на 3 группы. К первой группе отнесли сахарозу и глюкозу и пищевой сахар. На средах с этими источника-

ми углевода наблюдалось активное и устойчивое нарастание биомассы, причем,ткань легко усваивала ггредлагаемый ей углевод сразу же по перенесении на среду, содержащую его.

Таблица 3

Влияние различных источников углеводного питания на рост и алкалоидную продуктивность суспензионной клеточной культуры стефании гладкой

Вид углевода : Масса ткали гр/л :Содержание стефарина,%

:1-й пассаж :5- -й пассаж :1-й пассаж:5- -й пассаж

сахароза 23,3 21,8 0,60 0,62

пищевой сахар глюкоза 23,4 20,3 22,0 21,5 0,65 0,77 0,61 0,20

галактоза 2,6 14,2 - 0,10

мальтоза 5,8 4,6 - -

ксилоза 3,4 14,7 , 0,20 0,16

маннит 2,4 ткань погибла 0,06 —

сорбит 3,3 0,20 -

крахмал растворим. ' 5,1 0,14 -

Сахара второй группы - ксилоза, мальтоза и галактоза, в меньшей степени стимулировали рост ткани, причем,последний становился стабильным только после определенного лисла субкультивирований. На средах с остальными сахарами (3 группа) рост ткани практически отсутствовал.

Следует отметить, что при замене в среде сахарозы на, мальтозу в ткани, давно потерявшей способность к морфогенезу, были обнаружены случаи образования эмбриоидов.

Содержание в ткани алкалоида стефарина также варьировало

в широких пределах в зависимости от вводимого в питательную среду сахара (табл.2). Сахароза и пищевой сахар оказались теми углеводами, которые способствовали максимальному накоплению алкалоида стефарина. Таким образом, была доказана возмокнооть использования в качестве источника углевода - пищевого сахара.

Установлено, что сахарозу или пищевой сахар необходимо вносить в питательную среду в количествах - 50 г/л (табл.4).

Таблица 4

Влияние концентраций пищевого сахара на рост и алкалоидную продуктивность суспензионной культуры стефании гладкой

1Соцентра^ия углевода, :Масса ткани, г/л :Содержание стефарина, :% от сух.массы ткани

3,0 14,3+0,80 •0,55

4,0 17,7+0,83 0,53

5,0 23,7+0,69 0,63

7,Ь 27,9+0,92 - 0,46

10,0 16,3+0,83 0,14

,IICPUi95 - 1,067 г - 0,02655

Концентрации этих источников углевода в 30 г/л и в 100 г/л являлись критическими, поскбльку нарастание биомассы и содержание в пей стефарина в этих случаях значительно снимались. Отмечена весьма интересная особенность культуры ткани стефании использовать для своей жизнедеятельности пятичленный сахар -ксилозу. Последнее свидетельствует о специфическом наборе ферментов углеводного метаболизма, свойственно!.'! этой культуре.

5. Характеристика роста и алкалоидной продуктивности ткани на оптимизированной питательной среде.

Анализ динамики роста и биосинтетической активности клеточной суспензии, растущей на среде оптимального состава, показал, что интенсивность этих процессов значительно возросла (рис.4).

Рис.4. Кривые роста суспензионной культуры стефални и накопления в ней алкалоида сгефарина.

1 - на неоптимпзироваипой среде

2 - на оптимизированной среде :

Рост биомассы начинался сразу после пересева и продолкался около 8-9 суток, в последующие дни он постепенно замедлялся и в конечном итоге увеличение биомассы прекращалось. Весь

цикл, соединивший в себе ускорение и замедление роста биомассы, длился около 14-16 суток вместо 24-26 - на среде неоптимального состава.

Максимальное накопление алкалоида стефарина приходилось на момент максимального нарастания биомассы, так же на 14-16 сутки.

Таким образом, изменением,как качественного, так и количественного состава питательной среды, нал удалось:в 2-2,5 раза повысить прирост биомассы; в 3,0-3,5 раза увеличить продуктивность ткани по алкалоиду-стефарину (т/день); на 10-12 суток сократить цикл выращивания ткани. Последнее является особенно важным, поскольку сокращение цикла выращивания позволило, во-первых,повысить продуктивность процесса в расчете на конечный продукт, а во-вторых, существенно снизить вероятность инфицирования клеточной культуры, опасность которого весьма высока при выращивании биомассы в ферментаторах.

Изучение- поглощения отдельных компонентов питательного ■ субстрата суспензионной культурой стефании гладкой

Для более детального изучения некоторых- аспектов жизнедеятельности на оптимальной-среде было изучено потребление из питательного субстрата кислорода, углеводного компонента и основных элементов минерального питания; азота,фосфора,калия, а также связь этих процессов с характером роста биомассы цри ' субкультивировании. Были отмечены: усиление скорости потребления кислорода и поглощения питательных веществ из питательного раствора в первые фазы роста, а затем стабилизация и

о

снижение этих показателейузаключительные фазы (рис.5).

возраст ткани , сутки

Рис. 5. Поглощение азота,фосфора,калия,сахарозы и кислорода суспензионной культурой стефалии гладкой из питательного субстрата.

На основании анализа связи процессов роста и алкалоидной продукции со скоростью поглощения кислорода и метаболизмом минеральных макросолей и углевода, стало возможным веделить в жизни ткани три основных периода, из которых в практических 'целях важны только два первых. Первый период (8-10 дней) характеризовался активным дыханием, усиленным поглощением из питательного субстрата сахарозы и минеральных солей, уменьшением (в расчете на единицу биомассы) азота, фосфора и калия в ткани. Биомасса усиленно нарастала. Второй период (до 14-16 дня) отмечался падением интенсивности всех перечисленных выше процессов и к концу этого периода содержание в среде и минеральных солей,и сахарозы достигало минимума, тем не менее, усиливалось и достигало максимума накопление тканью алкалоида стефарина. Для третьего периода было характерно отсутствие нарастания биомассы, падение содержания в ткани стефарина, стабилизация на низком уровне цроцессов поглощения питательных веществ и дыхания. .

Анализ полученных результатов с использованием математической модели обратимого равновесного автокаталитического роста позволил определить такие величины, характеризующие процессы выращивания культуры, как коэффициент массопередачи кислорода (исходя из величины дыхательной активности и равный 17 ч коэффициент полезного использования питательного

субстрата (0,86-0,98), запас питательного субстрата (21-25). Полученные данные дают информацию о физиологическом состоянии культуры, что позволит в дальнейшем подойти к регуляции процессов роста клеток и синтеза ими продуктов метаболизма. Эти

данные так же необходимы цри разработке основ масштабирования процессов выращивания и разных его способов.•

Определение начальных значений рН питательного раствора, оптимальных для роста суспензионной культуры-стефании

гладкой

Исследования по влиянию начальных значений рН питательного раствора проводились с суспензионной культурой стефании гладкой, растущей на среде нового состава. Определяли накопление биомассы и количество стефарина в ней в зависимости от начального значения рН среды (от 4 до 8 ед., с интервалом в 0,5 ед.). Кислотность среды доводилась до нужных значений добавлением 0,1 н едкого натрия и соляной кислоты.

Полученные данные показали, что суспензионная культура стефании сохраняла свои ростовые свойства в диапазоне начальных значений рН от 4 до 7,5 ед. (табл.4).

Таблица 4

Накопление биомассы стефании гладкой и содержание в ней стефарина в зависимости от начального значения рН питательной среды

Начальное рН среды значение¡Масса ткани г/л :Содержание :фарина,% сте-:Конечное значение рН питательной среды

4,0 19,74 ■ 1,00 6,10.

4,5 19,56 0,92 6,10 ■

5,0 20,44 0,90 6,06 •'

5,5 20,00 0,93 6,07

6,0 19,90 . ' 0.80 6,07 '

6,5 19,50 0,79 6,09'

7,0 19,50 0,74 6,03

7,5 19,00 0,78 6,00

8,0 18,30 0,76 '6,00

НОР,

0,95

1.4 г

0,053%

Что касается биосинтеза, то высокая продукция стефарина тканью сохранялась при более низких значениях рН среды: отмечалась тенденция к снижению содержания алкалоида

с возрастанием начального значения рН среды от 4 до 8 ед. Отмечен тот факт, что на 15 сутки роста культуры во всех вариантах опыта значения рН питательного раствора почти выравнивались и колебались в пределах 6,0-6,1 ед. рН.

Воспроизведение роста клеток стефании гладкой в лабораторном ферментаторе и отработка режимов культивирования в нем

Известный по литературе опыт с клетками растений показал, что успех масштабирования процесса их выращивания в значительной степени зависит от возможности воспроизводства в аппаратах большого объема того коэффициента массопередачи по кислороду, который обеспечивал оптимальные условия выращивания в исходном аппарате. При таком подходе сущность нашей работы пс • изучению возможности масштабирования процесса культивирования клеточной суспензии стефании заключалась в определении опти- . мальных условий газового массообмена при культивировании культуры в колбах на качалке п ориентация на полученные результаты при' переносе объекта в ферментатор.

На первом этапе этой работы было определено накопление биомассы и содержание в ней алкалоида стефарина в зависимости от условий газового массообмена, причем,различия в этих условиях создавались за счет разного объема заполнения колб.

Оптимальны.«! оказались те условия, которым соответствовали коэффициенты массопередачи по кислороду от 30 до 15 ч При

значениях последнего, выходящих за указанные пределы, продуктивность ткани снижалась.

На втором этапе подбирались оптимальные условия путем испытания различных типов мешалок, скоростей перемешивания и аэрирования в лабораторном ферментаторе типа "ЛНКШ-2М", вместимостью - 14,0 л л рабочим объемом - 9 л. Испытывались мешалки типа: открытая турбинная с прямыми лопастями;-то же, но с лопастями наклоненный под углом 45°; трехлопастная парусная мешалка с боковыми кромками лопастей; загнутыми в сторону, цротивоположную направлению .вращения.

Анализ полученных данных показал, что все три вида мешалок обеспечивали в одних и тех же режимах аэрирования (от 22 до 15 л/(л.ч ) , цри оборотах от 100 до 130 об. в мин. необходимую величину коэффициента массопередачи кислорода.

Следующим этапом исследования являлось сравнительное изучение периодического процесса культивирования клеток стефании ' на качалке в колбах и в ферментаторе "АНКУМ-2М", снабженном разными типами перемешивающих устройству оптимальных условиях массообмена кислорода.

Клетки ещ-щквдлись в течение 14-17 суток при температура 2б+1°С. Посевная концентрация составляла а? ¡¿,0 до 5,0 г/л сухой массы. Число оборотов перемешивающих устройств - 130135 об/мин. Расход воздуха увеличивали в динамике от 1,5-2,5 ■ л/(л.ч ) до 12-17 л/(л.ч ) во избежание образования активной пены, выброса суспензии и т.п. . ' •

Установлено, что характер накопления биомассы клеток в колбах и ферментаторе, оснащенном турбинной мешалкой с наклон-

ними лопастями и парусной мешалкой, идентичны. При применении турбинной напалки с 6~м прямыми лопастями выход биомассы в ферментаторе оказался ниме, чем в колбах. Зто объясняется наиболее выраженным травкирукгяим эффектом мешалки данного типа, по сравнению, с другими испытываемыми конструкциями. Жизнеспособность в данном случае снижалась до по сравнении с 70-905? при ис-

пытании других переме'пипахулих устройств. Для полной характеристики физиологического состояния культуры, оптимальности условий ее вцратшвания, а также оценки адекватности различных условий культивирования клеток, были использованы параметры роста и метаболизма культуры, рассчитанные на основании систематической . модели обратимого равновесного автокаталитического роста (табл.5).

Таблица 5

Параье'хры роста и метаболизма клеток стефании гладкой ■при выращивании в колбах на качалке и з ферментаторе' . "АПКУМ-2М" с различной конструкцией переме.ииваю:пего устройства"

Тип культиватора

Йаксвиаль-: Содержание: Козф|<-х -: КогэфТ:-т

ная масса :стеггарина :испсльзо- :г:етабол. кислор.

■ г/л- •; • % ;ста°уб': "°ль/г 10"2 '

колба

22,0

С,60

Ь,0

турбина с лппастя 15 ,С и. 6;; С ,71 _ 4,0 ,

турбина с наклонч'.'мп лспасттн 19 .0 т,о 0,81 5,44

паругна -мешалка Г:0 .0 4,67

нт

от

Значения параметров, представленных в таблицах, хорошо согласуются с результатами, полученными ранее при культивировании клеток стефании в колбах на качалке.

Проведенные исследования позволили нам подобрать условия для ■и./более эффективного глубинного выращивания ткани. Они в основном сводились к тому, что ткань культивировалась на сп ^.визированной среде по основным компонентам, ■ ? ч ста:;.. - „,:.•;, с исходным значением pH в пределах от 4 до 7 ед.; в сосудах на качалке или в лабораторных ферментаторах при Н^ - 15-32 ч"1. Количество иноку-люма составляло Т0%. При этом рост ткаш завершался на 14-16 сутки с выходом биомассы 18-20 г/л. Содержание в ткани алкалоида сте-

*

фар'.ла достигало 0,8-1,05? от сухой массы ткани.

ВЫВОДЫ

1. Штамм клеточной культуры стефании гладкой,.полученный в результате проделанной работы (¿д -6), отличаясь от имевшегося' ранее (Sj -К) более высокими темпами нарастания биомассы и более выс :ой алкалоидной продуктивностью, явился подходящим материалом для совершенствования условий выращивания.

2. Наилучшие результаты по накоплению биомассы и продукции стефарина получены 'при использовании йнокулгомй в возрасте 10-20 суток, объемом I/I0-I/6 от объма среды.

3. Удовлетворительный рост ткани и продукция ею стефарина возможны в диапазоне начальных значений pH питательной ейеды от 4-х до 6-и единиц. _ '

4. В результате оптимизации минеральной основы питательной среды была установлена необходимость изменения соотношения макросолей, -входящих в пропись Мурасиге и Скуга.

5. 'Наилучшим источником углеводного питания является сахароза или пищевой сахар в концентрации Ь%.

о. Длп активного роста ткани необходимо присутствие в питательной среде НУК в концентрации 0,5-1,0 мг/л; 2,4Д в концентрации

0.1 мг/л, Са-пантотената и тиамина в концентрациях по 2,0 мг/л.

7. Поглощение суспензионной культурой кислорода, сахарозы, азота, фосфора и калия наиболее активно происходит в первую половину периода регулярного роста, причем, коэффициенты использования этих веществ достаточно высоки (80-90$).

8. Оптимальным для роста ткани и накопления ею стефарина, независимо от типа культивационного сосуда, является коэффициент массопередачи по кислороду в пределах 15-30 .

9. Рост и метаболизм клеток, культивируемых в колбах на качалке и в лабораторном ферментаторе АНЮТ-2М идентичны, что доказывает возможность выращивания'суспензионной культуры стефании в ферментаторах малого объема. ■

10. Результаты работы использованы при составлении инструкции по культивированию клеток стефании гладкой в лабораторном' ферментаторе, при составлении лабораторного регламента на производство сухой биомассы культуры клеток стефайии гладкой, при составлении лабораторного регламента на производство сульфата стефа-глабрина из культуры ткани стефании гладкой.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Попов Ю.Г., Шаин С.С., Савина Т.А., Щавлинский.А.Н., Юдин A.C. Вопросы оптимизации питательной среды при глубинном культивировании ткани стефании гладкой. Сб.научных трудов ВИЛР.М. 1983, с.185-191.

2. Савина Т.А. Некоторые вопросы углеводного питания культуры ткани стефании гладкой. "Тр.6 Конф.мол.ученых ВНИИ лекарственных растений, Москва, нояб. 1583". 1984,.с. 136-144.

3. Савина Т.Л. Изучение поглощения азота,фосфсра,калия суспензионной культурой стефании гладкой. Тр. IX Конф.мол.ученых ВНИИ лекарственных растений,Москва, 1989.

4. Л.С. 1482193, СССР,МКИ4 С 12 № 5/00 Штамм культивируемых клеток растеши Stephania glabra(iioxb)Uiers -цродуцент сте-фарина. Попов Ю.Г.,Шаин С.С.,0сипова Е.Л,Савина Т.Л. ,Давы-денков В.Н.Фадеева И.И. № 4299001/31-13; заявлено 24.07.1987г.

5. Davydenkov V.K.,Savina 1'.A'.,Popov ïu.tt. ,Tolkaohoy O.N. Biosuntetio activity, study of Stephania glabra cell lines.

5 Intern.conf. on chemistry and. biotechnology active natural produots.1989,Varna,BulRaria.Conference proceedings,V I, p 449 -451.

Подписано к печати 24.01.9?.3ак. 106 тир.100

КМП НПО "ВИЛР'